海洋硫酸多糖20001的制造方法及其应用的制作方法
专利名称：海洋硫酸多糖20001的制造方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋硫酸多糖类物质20001的制造方法及其应用。
背景技术：
病毒感染性疾病是目前严重危害人类健康的一类常见病，临床缺乏高效防治药物。许多天然多糖和化学修饰多糖对各种有膜病毒具有明显的抑制作用，其作用与多糖的结构、取代基团、分子量、溶解度、粘度等有关，由于糖工程药物研究开发中一些关键技术问题没有得到解决，因此进入临床应用多糖类病毒抑制剂寥寥无几。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋硫酸多糖类物质20001的制造方法，并把该产品用于制备抗病毒剂，以满足现有技术的上述需求。
一种制造海洋硫酸多糖类物质20001的方法，其过程是褐藻酸经酸降解，分离纯化，硫酸化修饰，膜分离，获得分子量为4000左右的海洋硫酸多糖20001。
将海洋硫酸多糖20001用于制备抗病毒剂。
本发明的优点是提供了一种硫酸多糖类物质20001的制造方法，该物质用于制备抗病毒剂，在抗病毒方面能得到广泛的应用。
具体实施例方式一种制造海洋硫酸多糖20001(以下简称20001)的方法将海藻酸用水配成2％的均匀胶液。加入硫酸，在100℃水浴中搅拌冷凝回流4-6个小时，将水解混合物在3000rpm条件下离心40分钟后，弃去上清液，得到的沉淀加入5％的Na2CO3水溶液溶解，然后将此溶液边搅拌边加入酸液，调节pH值至一定范围，有絮状沉淀，3000rpm离心40分钟，得到的上清液加入95％乙醇使其浓度达30％，溶液分层除去沉淀，上清液加乙醇使其浓度达70％，沉淀部分用甲酰胺溶解，加定量的氯磺酸及PAB-A酸原料，反应6-8个小时后用乙醇沉淀，沉淀物配为10％的水溶液，用NaOH溶液调节pH值为7.0将硫酸化物转化为钠盐，用分子量为3000的分离膜纯化，以除去盐和小分子，然后再用分子量为5000的分离膜除去大分子物，得到分子量在3000-4000的硫酸化物溶液，喷雾干燥即得成品20001。
本发明的海洋硫酸多糖类物质20001的抗病毒活性是通过其体内外对流感病毒和呼吸道合胞病毒的抑制作用证实的。20001抗流感病毒的体外研究采用的是MDCK细胞，对MDCK细胞进行扩增培养，并对其接种流感病毒。将本发明的多糖物质20001加入上述细胞中，培养一段时间后，用MTT法测定，根据公式计算各项指标，评价其体外抗病毒活性。20001抗流感病毒的体内研究，是将小鼠分为空白组、病毒组、阳性药组与试验药20001组，除空白组外，均感染流感病毒。给药一段时间后，部分取肺组织，显微镜下观察，对肺部病变程度分级。剩余部分继续喂养，记录其死亡率，并作病理学观察，评价其体内抗病毒活性。
20001抗呼吸道合胞病毒的体外研究采用的是HeLa细胞，对HeLa细胞进行扩增培养，并对其接种流感病毒，将多糖物质20001加入上述细胞中，每日观察其病变情况，并用公式进行计算，评价其体外抗病毒活性。20001抗呼吸道合胞病毒的体内研究，是将小鼠分为空白组、病毒组、阳性药组与试验药20001组，除空白组外，均感染呼吸道合胞病毒。给药一段时间后，取小鼠血清与肺组织，测定抗体滴度，观察肺部病变。评价其体内抗病毒活性。
下面分别通过20001体内外抗流感病毒的作用进一步说明本发明产品的抗病毒活性。
(一)20001体外抗流感病毒的作用取100μl A/鲁防-9/93(H3N3)病毒液以100个TCID50量接种于96孔板孔内单层细胞上，分别加入40μg/ml的病毒唑及5.56、1.12、0.22μg/ml的20001 100μl，37℃ 5％CO2孵箱培养，每日观察病变，3天换相同浓度的药液，连续7d。病毒对照组细胞出现病变达90％以上时，换新培养液200μl/孔，MTT(5mg/ml)20μl，37℃ 5％CO2孵箱培养4h，1000rpm离心10min，弃上清，加二甲基亚砜∶乙醇(1∶1)150μl，15min后，用酶标仪570nm比色，读取OD值，结果见表1，20001可以明显升高OD值，保护细胞免受病毒损伤。
表1.20001体外抗病毒作用(x±s)组别 浓度(μg/ml) OD细胞对照-1.128±0.009病毒对照-0.226±0.005###20001 0.22 0.241±0.0091.12 0.716±0.040***5.56 0.925±0.060***病毒唑 40 0.663±0.026***与细胞对照组比较###p＜0.001 与病毒组比较***P＜0.001根据OD值，计算半数有效浓度(IC50)为3.45μg/ml。
(二)20001体内抗流感病毒的作用取雄性昆明种小鼠，体重18～20g，随机分为7组，第1组为正常对照组；第2组为病毒对照组；均灌服0.1ml生理盐水；第3～6组为20001药物组，分别灌服15、30、60和120mg/kg。第7组为病毒唑组，肌肉注射病毒唑30mg/kg，每日1次，连续给药6d。在第5d各组动物于末次给药45min后取10只(1/2)处死，取右肺组织用福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，梯度乙醇脱水，二甲苯透明化处理，HE染色，光学显微镜下检查组织病理变化，结果表明， 20001在60、120mg/kg时可明显保护小鼠肺组织免受病毒损伤(表2)。
表2.20001对流感病毒感染小鼠肺组织病理改变的影响(第5天)(n＝10)病变分级组别 剂量(mg/kg)x±s0级 I级 II级 III级正常对照 - 10 00 0 0病毒组 - 003 7 2.7±0.48320001 15 451 0 2.4±0.69930 253 0 2.1±0.87660 033 4 1.1±0.738***120 014 5 0.7±0.675***病毒唑30 003 7 2.7±0.483与病毒组比较***p＜0.001剩余动物于给药6d后停药，继续喂养2周后处死，记录动物死亡数，用COX回归计算生命延长％，并做病理学检查，结果见表3、4，20001可以减轻动物由流感病毒感染引起的病理损害，降低死亡率，延长生存时间。
表3.20001对停药后14d感染小鼠存活率的影响(n＝10)组别 剂量(mg/kg)死亡率％平均寿命95％可信限延长生命率％正常对照组 - 0病毒组 - 80 7 5-914.220001 1570 9 6-11 57.143040 11 8-13 71.426030 12 10-14 100120 014病毒唑 3080 8 6-10 28.5
表4.20001对停药后14d感染小鼠肺组织病理学改变的影响(n＝10)病变分级组别 剂量(mg/kg)x±s0级 I级 II级 III级正常对照组 - 10 00 0 0病毒组 - 044 2 1.8±0.7892000115342 1 1.1±0.99430532 0 0.7±0.82360730 0 0.3±0.458***120 000 0 0***病毒唑 30244 0 1.2±1.178与病毒组比较***p＜0.001注均值计算方法0级＝3，I级＝1，II级＝2，III级＝3。每组以各级动物数与各级所代表的数字相乘，结果相加。除以总动物数即得。
下面再通过20001体内外抗呼吸道合胞病毒的作用进一步说明本发明产品的抗病毒活性。
(一)20001体外抗呼吸道合胞病毒作用取100ul RSV毒液以100个TCID50量接种于96孔板单层细胞上，同时分别加入100ul不同浓度的药物，使每孔药20001物浓度成80、16、3.2ug/ml的20001，37℃ 5％CO2孵箱培养，每日观察病变，3天换相同浓度的药液，连续7d。结果病毒对照组细胞出现病变达90％以上，20001在80ug/ml细胞受到100％、16ug/ml细胞受到90％、3.2ug/ml细胞受到40％保护(表1)，将数据代入公式计算药物的半数有效浓度为4.42ug/ml。
表1. 20001体外抗呼吸道合胞病毒作用药物稀释度(ug/ml)细胞对照病毒对照 80 163.2病毒抑制率％100 0 100 9040(二)20001体内抗呼吸道合胞病毒的作用取雄性BALB/C小鼠，随机分为7组，第1组为正常对照组；第2组为病毒对照组；均灌服0.1ml生理盐水；第3～6组为20001药物组，分别灌服15、30、60和120mg/kg。第7组为病毒唑组，肌肉注射病毒唑30mg/kg，每日1次，连续给药8d，于末次给药45min后眼动脉取血，分离血清，测定病毒特异性抗体滴度；取左肺组织用于滴定病毒毒力和检测病毒抗体，取右肺组织用福尔马林固定，做病理检查。结果表明，20001 60和120mg/kg可完全抑制病毒在小鼠肺组织内增殖，15和30mg/kg也可明显抑制病毒的复制(表2)；并可明显升高RSV感染小鼠血清特异病毒抗体的水平(表3)，显著降低RSV引起的小鼠肺组织的炎性损伤(表4)，抑制RSV在小鼠肺组织内繁殖，表明20001具有明显的体内抗呼吸道合胞病毒的作用。
表2.20001对RSV感染小鼠肺组织内病毒含量的影响(n＝10，x±S)组别 剂量(mg/kg) X病毒组 -6.3456±0.61920001 15 4.30±1.76*30 2.55±1.50***60 0***120 0***病毒唑 30 4.632±1.3122*与病毒组比较*p＜0.05，***p＜0.001注，X＝Lg几何均数表3. 20001对RSV感染小鼠血清病毒抗体水平的影响(OD值)(n＝10，x±s)组别 剂量 血清稀释度(mg/kg) 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800正常组- 0.05±0.01 0.03±0.02 0.01±0.01 0.01±0.005病毒组- 0.65±0.08###0.31±0.05###0.17±0.02###0.12±0.0320001 15 0.54±0.16 0.84±0.07***0.26±0.04***0.15±0.03***30 0.60±0.11 0.68±0.09***0.25±0.04***0.15±0.02***60 0.73±0.10 1.00±0.10***0.48±0.14***0.24±0.05***1200.74±0.07 1.06±0.06***0.48±0.07***0.29±0.05***病毒唑30 0.37±0.05 0.21±0.05 0.11±0.02 0.08±0.03与正常对照组比较###p＜0.001；与病毒组比较***p＜0.001
表4.20001对RSV感染小鼠肺组织病理改变的影响(n＝10，x±S)剂量 肺组织病变动物数组别 均值(mg/kg) 0级 I级 II级 III级正常组 - 10 00 0 0病毒组 - 002 8 2.8±0.4220001 15 013 6 2.5±0.7130 024 4 2.2±0.7960 730 0 0.3±0.48***120910 0 0.1±0.32***病毒唑 30 014 5 2.4±0.70与病毒组比较***p＜0.00权利要求
1.一种海洋硫酸多糖20001的制造方法，其特征是褐藻酸用硫酸降解，分离纯化，硫酸化修饰，膜分离。
2.将海洋硫酸多糖20001用于制备抗病毒剂。
全文摘要
一种制造海洋硫酸多糖20001的方法，其特征是褐藻酸经酸降解，分离纯化，硫酸化修饰，膜分离，获得分子量为4000左右的硫酸多糖物质20001。并将该海洋硫酸多糖20001用于制备抗病毒剂。本发明的优点是提供了一种硫酸多糖类物质20001的制造方法，该物质用于制备抗病毒剂，在抗病毒方面能得到广泛的应用。
文档编号A61K31/734GK1486992SQ03138969
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月4日 优先权日2003年8月4日
发明者耿美玉, 辛现良, 管华诗, 李静 申请人:中国海洋大学
技术领域：
本发明涉及一种海洋硫酸多糖类物质20001的制造方法及其应用。
背景技术：
病毒感染性疾病是目前严重危害人类健康的一类常见病，临床缺乏高效防治药物。许多天然多糖和化学修饰多糖对各种有膜病毒具有明显的抑制作用，其作用与多糖的结构、取代基团、分子量、溶解度、粘度等有关，由于糖工程药物研究开发中一些关键技术问题没有得到解决，因此进入临床应用多糖类病毒抑制剂寥寥无几。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋硫酸多糖类物质20001的制造方法，并把该产品用于制备抗病毒剂，以满足现有技术的上述需求。
一种制造海洋硫酸多糖类物质20001的方法，其过程是褐藻酸经酸降解，分离纯化，硫酸化修饰，膜分离，获得分子量为4000左右的海洋硫酸多糖20001。
将海洋硫酸多糖20001用于制备抗病毒剂。
本发明的优点是提供了一种硫酸多糖类物质20001的制造方法，该物质用于制备抗病毒剂，在抗病毒方面能得到广泛的应用。
具体实施例方式一种制造海洋硫酸多糖20001(以下简称20001)的方法将海藻酸用水配成2％的均匀胶液。加入硫酸，在100℃水浴中搅拌冷凝回流4-6个小时，将水解混合物在3000rpm条件下离心40分钟后，弃去上清液，得到的沉淀加入5％的Na2CO3水溶液溶解，然后将此溶液边搅拌边加入酸液，调节pH值至一定范围，有絮状沉淀，3000rpm离心40分钟，得到的上清液加入95％乙醇使其浓度达30％，溶液分层除去沉淀，上清液加乙醇使其浓度达70％，沉淀部分用甲酰胺溶解，加定量的氯磺酸及PAB-A酸原料，反应6-8个小时后用乙醇沉淀，沉淀物配为10％的水溶液，用NaOH溶液调节pH值为7.0将硫酸化物转化为钠盐，用分子量为3000的分离膜纯化，以除去盐和小分子，然后再用分子量为5000的分离膜除去大分子物，得到分子量在3000-4000的硫酸化物溶液，喷雾干燥即得成品20001。
本发明的海洋硫酸多糖类物质20001的抗病毒活性是通过其体内外对流感病毒和呼吸道合胞病毒的抑制作用证实的。20001抗流感病毒的体外研究采用的是MDCK细胞，对MDCK细胞进行扩增培养，并对其接种流感病毒。将本发明的多糖物质20001加入上述细胞中，培养一段时间后，用MTT法测定，根据公式计算各项指标，评价其体外抗病毒活性。20001抗流感病毒的体内研究，是将小鼠分为空白组、病毒组、阳性药组与试验药20001组，除空白组外，均感染流感病毒。给药一段时间后，部分取肺组织，显微镜下观察，对肺部病变程度分级。剩余部分继续喂养，记录其死亡率，并作病理学观察，评价其体内抗病毒活性。
20001抗呼吸道合胞病毒的体外研究采用的是HeLa细胞，对HeLa细胞进行扩增培养，并对其接种流感病毒，将多糖物质20001加入上述细胞中，每日观察其病变情况，并用公式进行计算，评价其体外抗病毒活性。20001抗呼吸道合胞病毒的体内研究，是将小鼠分为空白组、病毒组、阳性药组与试验药20001组，除空白组外，均感染呼吸道合胞病毒。给药一段时间后，取小鼠血清与肺组织，测定抗体滴度，观察肺部病变。评价其体内抗病毒活性。
下面分别通过20001体内外抗流感病毒的作用进一步说明本发明产品的抗病毒活性。
(一)20001体外抗流感病毒的作用取100μl A/鲁防-9/93(H3N3)病毒液以100个TCID50量接种于96孔板孔内单层细胞上，分别加入40μg/ml的病毒唑及5.56、1.12、0.22μg/ml的20001 100μl，37℃ 5％CO2孵箱培养，每日观察病变，3天换相同浓度的药液，连续7d。病毒对照组细胞出现病变达90％以上时，换新培养液200μl/孔，MTT(5mg/ml)20μl，37℃ 5％CO2孵箱培养4h，1000rpm离心10min，弃上清，加二甲基亚砜∶乙醇(1∶1)150μl，15min后，用酶标仪570nm比色，读取OD值，结果见表1，20001可以明显升高OD值，保护细胞免受病毒损伤。
表1.20001体外抗病毒作用(x±s)组别 浓度(μg/ml) OD细胞对照-1.128±0.009病毒对照-0.226±0.005###20001 0.22 0.241±0.0091.12 0.716±0.040***5.56 0.925±0.060***病毒唑 40 0.663±0.026***与细胞对照组比较###p＜0.001 与病毒组比较***P＜0.001根据OD值，计算半数有效浓度(IC50)为3.45μg/ml。
(二)20001体内抗流感病毒的作用取雄性昆明种小鼠，体重18～20g，随机分为7组，第1组为正常对照组；第2组为病毒对照组；均灌服0.1ml生理盐水；第3～6组为20001药物组，分别灌服15、30、60和120mg/kg。第7组为病毒唑组，肌肉注射病毒唑30mg/kg，每日1次，连续给药6d。在第5d各组动物于末次给药45min后取10只(1/2)处死，取右肺组织用福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，梯度乙醇脱水，二甲苯透明化处理，HE染色，光学显微镜下检查组织病理变化，结果表明， 20001在60、120mg/kg时可明显保护小鼠肺组织免受病毒损伤(表2)。
表2.20001对流感病毒感染小鼠肺组织病理改变的影响(第5天)(n＝10)病变分级组别 剂量(mg/kg)x±s0级 I级 II级 III级正常对照 - 10 00 0 0病毒组 - 003 7 2.7±0.48320001 15 451 0 2.4±0.69930 253 0 2.1±0.87660 033 4 1.1±0.738***120 014 5 0.7±0.675***病毒唑30 003 7 2.7±0.483与病毒组比较***p＜0.001剩余动物于给药6d后停药，继续喂养2周后处死，记录动物死亡数，用COX回归计算生命延长％，并做病理学检查，结果见表3、4，20001可以减轻动物由流感病毒感染引起的病理损害，降低死亡率，延长生存时间。
表3.20001对停药后14d感染小鼠存活率的影响(n＝10)组别 剂量(mg/kg)死亡率％平均寿命95％可信限延长生命率％正常对照组 - 0病毒组 - 80 7 5-914.220001 1570 9 6-11 57.143040 11 8-13 71.426030 12 10-14 100120 014病毒唑 3080 8 6-10 28.5
表4.20001对停药后14d感染小鼠肺组织病理学改变的影响(n＝10)病变分级组别 剂量(mg/kg)x±s0级 I级 II级 III级正常对照组 - 10 00 0 0病毒组 - 044 2 1.8±0.7892000115342 1 1.1±0.99430532 0 0.7±0.82360730 0 0.3±0.458***120 000 0 0***病毒唑 30244 0 1.2±1.178与病毒组比较***p＜0.001注均值计算方法0级＝3，I级＝1，II级＝2，III级＝3。每组以各级动物数与各级所代表的数字相乘，结果相加。除以总动物数即得。
下面再通过20001体内外抗呼吸道合胞病毒的作用进一步说明本发明产品的抗病毒活性。
(一)20001体外抗呼吸道合胞病毒作用取100ul RSV毒液以100个TCID50量接种于96孔板单层细胞上，同时分别加入100ul不同浓度的药物，使每孔药20001物浓度成80、16、3.2ug/ml的20001，37℃ 5％CO2孵箱培养，每日观察病变，3天换相同浓度的药液，连续7d。结果病毒对照组细胞出现病变达90％以上，20001在80ug/ml细胞受到100％、16ug/ml细胞受到90％、3.2ug/ml细胞受到40％保护(表1)，将数据代入公式计算药物的半数有效浓度为4.42ug/ml。
表1. 20001体外抗呼吸道合胞病毒作用药物稀释度(ug/ml)细胞对照病毒对照 80 163.2病毒抑制率％100 0 100 9040(二)20001体内抗呼吸道合胞病毒的作用取雄性BALB/C小鼠，随机分为7组，第1组为正常对照组；第2组为病毒对照组；均灌服0.1ml生理盐水；第3～6组为20001药物组，分别灌服15、30、60和120mg/kg。第7组为病毒唑组，肌肉注射病毒唑30mg/kg，每日1次，连续给药8d，于末次给药45min后眼动脉取血，分离血清，测定病毒特异性抗体滴度；取左肺组织用于滴定病毒毒力和检测病毒抗体，取右肺组织用福尔马林固定，做病理检查。结果表明，20001 60和120mg/kg可完全抑制病毒在小鼠肺组织内增殖，15和30mg/kg也可明显抑制病毒的复制(表2)；并可明显升高RSV感染小鼠血清特异病毒抗体的水平(表3)，显著降低RSV引起的小鼠肺组织的炎性损伤(表4)，抑制RSV在小鼠肺组织内繁殖，表明20001具有明显的体内抗呼吸道合胞病毒的作用。
表2.20001对RSV感染小鼠肺组织内病毒含量的影响(n＝10，x±S)组别 剂量(mg/kg) X病毒组 -6.3456±0.61920001 15 4.30±1.76*30 2.55±1.50***60 0***120 0***病毒唑 30 4.632±1.3122*与病毒组比较*p＜0.05，***p＜0.001注，X＝Lg几何均数表3. 20001对RSV感染小鼠血清病毒抗体水平的影响(OD值)(n＝10，x±s)组别 剂量 血清稀释度(mg/kg) 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800正常组- 0.05±0.01 0.03±0.02 0.01±0.01 0.01±0.005病毒组- 0.65±0.08###0.31±0.05###0.17±0.02###0.12±0.0320001 15 0.54±0.16 0.84±0.07***0.26±0.04***0.15±0.03***30 0.60±0.11 0.68±0.09***0.25±0.04***0.15±0.02***60 0.73±0.10 1.00±0.10***0.48±0.14***0.24±0.05***1200.74±0.07 1.06±0.06***0.48±0.07***0.29±0.05***病毒唑30 0.37±0.05 0.21±0.05 0.11±0.02 0.08±0.03与正常对照组比较###p＜0.001；与病毒组比较***p＜0.001
表4.20001对RSV感染小鼠肺组织病理改变的影响(n＝10，x±S)剂量 肺组织病变动物数组别 均值(mg/kg) 0级 I级 II级 III级正常组 - 10 00 0 0病毒组 - 002 8 2.8±0.4220001 15 013 6 2.5±0.7130 024 4 2.2±0.7960 730 0 0.3±0.48***120910 0 0.1±0.32***病毒唑 30 014 5 2.4±0.70与病毒组比较***p＜0.00权利要求
1.一种海洋硫酸多糖20001的制造方法，其特征是褐藻酸用硫酸降解，分离纯化，硫酸化修饰，膜分离。
2.将海洋硫酸多糖20001用于制备抗病毒剂。
全文摘要
一种制造海洋硫酸多糖20001的方法，其特征是褐藻酸经酸降解，分离纯化，硫酸化修饰，膜分离，获得分子量为4000左右的硫酸多糖物质20001。并将该海洋硫酸多糖20001用于制备抗病毒剂。本发明的优点是提供了一种硫酸多糖类物质20001的制造方法，该物质用于制备抗病毒剂，在抗病毒方面能得到广泛的应用。
文档编号A61K31/734GK1486992SQ03138969
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月4日 优先权日2003年8月4日
发明者耿美玉, 辛现良, 管华诗, 李静 申请人:中国海洋大学
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