多孔菌抗sars病毒活性物质粗提物的制备方法
专利名称：多孔菌抗sars病毒活性物质粗提物的制备方法
技术领域：
本发明涉及真菌抗病毒活性物质的提取方法，尤其涉及真菌中多孔菌(Polyporales)抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法。
背景技术：
关于多孔菌活性物质提取物的制备方法，经检索到的相关专利有中国专利申请号为99112556.8灰树花发酵液多糖提取方法，02136517.2灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法，89105471一种云芝糖肽(PSP)的生产方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工艺，96109095中国灵芝保健饮料，92111030灵芝营养保健液及其制法，93103116灵芝口服液等专利，这些专利内容大多以提取多糖为主要目的，其中属于多孔菌的，只有灰树花、云芝和灵芝三种，其制备的活性物质提取物具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等药效，但对于抗病毒作用鲜有报道，而对于抗SARS病毒的报道更是没有检索到。
发明内容本发明要解决的问题是，针对上述多孔菌活性物质提取物的制备方法以及其制备的活性物质提取物的药理作用所存在的不足，提供一种多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法。利用本发明的方法提取的多孔菌粗提物对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用，且该方法具有工艺简便、产量高、成本低的特点。
本发明的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，有三种制备形式其一为直接从多孔菌发酵全液包括菌丝体与澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；其二为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得菌丝体中分离出抗SARS病毒活性物质；其三为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；上述多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法由以下步骤组成(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液放于容器内，调整其pH值为8～12，置60～120℃下加热30～240分钟，之后冷却、以180～200目的筛网过滤多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液，收集滤液，滤渣以其4～8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1～2遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6Kg/cm2，真空度为0.02～0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/30；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积4～8倍的醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，5～10分钟后，静置24～48小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000～6000r/min离心15～30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在50～70℃温度条件下干燥12～36小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即为多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物。
上述步骤(1)所述的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液是指灰树花(Grifolafrondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganoderma capense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的发酵全液或菌丝体或澄清液或其多菌株混合的集合体。
即，步骤(1)所述的多孔菌发酵全液是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一或其混合的发酵液与菌丝体的集合体。
步骤(1)所述的多孔菌发酵后澄清液是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的发酵后澄清液或多菌株发酵后澄清液的集合体。
步骤(1)所述的多孔菌发酵所得菌丝体是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一发酵所得菌丝体或多菌株发酵所得菌丝体的集合体。
其中，步骤(1)所述的pH值为10～12。
其中，步骤(1)所述加热温度是90～100℃。
其中，步骤(1)所述加热时间是120～240分钟。
其中，步骤(2)所述的减压浓缩条件是，温度50～60℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.04～0.06Mpa。
其中，步骤(3)所述的醇溶液是甲醇或乙醇，浓度为60～95％。
其中，步骤(3)所述醇析的时间为24～36小时。
其中，步骤(5)所述的收集物干燥用真空干燥，其条件为真空度0.02～0.06Mpa，温度50～70℃，时间15～36小时。
其中，步骤(6)所述的粉碎是采用200目的中药粉碎机对收集物进行粉碎。
采用本发明的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，具有工艺简便、产量高、成本低的特点。该方法采用真菌中多孔菌的发酵液、菌丝体及子实体进行活性物质提取，大大降低了灰树花子体及菌丝人工培养的难度、降低了原料成本、生产成本，增加了产量，提高了产率。
采用本发明的方法提取的多孔菌粗提物，经军事医学科学院微生物流行病研究所体外抗SARS病毒药物初筛试验，结果显示对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。
所作体外抗SARS病毒药物初筛试验的具体方法如下I、实验材料1、细胞VetoE6细胞(非洲绿猴肾细胞)
2、病毒SARS病毒，BJ-01株3、培养液含10％胎牛血清的DMEM培养液II、实验条件生物安全三级实验室III、实验步骤1、CPE法测定病毒对VeroE6细胞半数毒性浓度(TCID50)2、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度3、药物的最大无毒浓度对SARS病毒的药效测定IV、实验结果1、病毒的TCID50为10-7。
2、药物取5个浓度即1000、500、250、125和62.5ug/m1进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为125ug/ml。
3、取125ug/ml药液，做4个复孔，观察对SARS病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示该浓度药物对SARS病毒有完全抑制作用。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌灰树花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株发酵全液2000ml，放于3000ml容器内，调整其pH值为10，置100℃下加热120分钟，之后冷却至30℃、以180目的筛网过滤多孔菌发酵全液，收集滤液，滤渣以其6倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度60℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.04Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积5倍的95％的乙醇并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，8分钟后，静置24小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心15分钟，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在60℃温度条件下的置鼓风干燥箱内干燥24小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即得多孔菌发酵液抗SARS病毒活性物质粗提物4.57克，该抗SARS病毒活性物质粗提物的颜色为棕色、光密度在波长520nm时为1.1、pH为7.0。
实施例2将300L混有灰树花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株、薄树灵芝(Ganodermacapense)ATCC76613菌株的发酵全液，通过移液管道移到提取罐中，调整发酵全液pH至12左右，向提取罐夹套通蒸汽升温，当温度升至90℃时，计时，维持4小时后停止升温，向夹套内打入循环水降温。当温度降到60℃左右，将提取液通过二次200目的筛网过滤后移到浓缩罐内，进行减压浓缩，浓缩温度控制在50℃，真空度为0.06Mpa罐压控制在0.6Kg/cm2，浓缩时加入消泡剂(豆油)0.5斤/300L，当提取液浓缩到10L左右时，将其移到醇提罐内，并加入95％得甲醇60L，轻轻搅拌，搅拌速度为60r/min，5分钟以后，静置醇析，36小时以后，将上清液通过管道移至废液罐内贮放，沉淀物放出后进行离心，离心采用低速大容量离心机，转速为5000r/min，时间控制在20分钟，离心后将离心沉淀物放在不锈钢盘内进行真空干燥，干燥时真空度为0.05Mpa，温度控制在60℃之间，24小时以后，将提取物取出，用200目的中药粉碎机粉碎后，称重量为1260克，该抗SARS病毒活性物质粗提物的颜色为棕色、光密度在波长520nm时为1.0、pH为7.2。
实施例3(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌灰树花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株发酵所得菌丝体1350克，灵芝(Ganoderma lucidum)的发酵后澄清液1000ml，放于3000ml容器内，调整其pH值为11，置95℃下加热180分钟，之后冷却至37℃、以180目的筛网过滤多孔菌发酵全液，收集滤液，滤渣以其6倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/30；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积5倍的95％的乙醇并不断搅拌，搅拌速度为80r/min，8分钟后，静置24小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心15分钟，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在60℃温度条件下的置鼓风干燥箱内干燥30小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即得多孔菌发酵液抗SARS病毒活性物质粗提物4.13克，该抗SARS病毒活性物质粗提物的颜色为棕色、光密度在波长520nm时为1.2、pH为7.1。
实施例4采用实施例1的方法提取的多孔菌发酵液抗SARS病毒活性物质粗提物，以VetoE6细胞(非洲绿猴肾细胞)、SARS病毒(BJ-01株)、含10％胎牛血清的DMEM培养液为实验材料，以CPE法测定病毒对VeroE6细胞半数毒性浓度(TCID50)、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度、药物的最大无毒浓度对SARS病毒的药效测定等实验方法，进行体外抗SARS病毒药物初筛试验，实验结果如下1、病毒的TCID50为10-7。
2、药物取5个浓度即1000、500、250、125和62.5ug/ml进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为125ug/ml。
3、取125ug/ml药液，做4个复孔，观察对SARS病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示该浓度药物对SARS病毒有完全抑制作用。
权利要求
1.一种多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，有三种制备形式；其一为直接从多孔菌发酵全液包括菌丝体与澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；其二为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得菌丝体中分离出抗SARS病毒活性物质；其三为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；上述多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法由以下步骤组成(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液放于容器内，调整其pH值为8～12，置60～120℃下加热30～240分钟，之后冷却、以180～200目的筛网过滤多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液，收集滤液，滤渣以其4～8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1～2遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6Kg/cm2，真空度为0.02～0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/30；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积4～8倍的醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，5～10分钟后，静置24～48小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000～6000r/min离心15～30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在50～70℃温度条件下干燥12～36小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即为多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物。
2.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的发酵全液或菌丝体或澄清液或其多菌株混合的集合体。
3.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的pH值为10～12。
4.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述加热温度是90～100℃。
5.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述加热时间是120～240分钟。
6.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的减压浓缩条件是，温度50～60℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.04～0.06Mpa。
7.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的醇溶液是甲醇或乙醇，浓度为60～95％。
8.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述醇析的时间为24～36小时。
9.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的收集物干燥用真空干燥，其条件为真空度0.02～0.06Mpa，温度50～70℃，时间15～36小时。
10.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的粉碎是采用200目的中药粉碎机对收集物进行粉碎。
全文摘要
本发明公开一种多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其方法包括多孔菌发酵全液或发酵后澄清液或菌丝体经过加热过滤、减压浓缩、醇析、离心分离、收集物干燥、收集物粉碎等步骤。本发明的方法提取的多孔菌粗提物对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用，且该方法具有工艺简便、产量高、成本低的特点。
文档编号A61P11/00GK1486741SQ0313898
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月5日 优先权日2003年8月5日
发明者宋爱荣, 隋方功, 赵晨, 田雪梅 申请人:莱阳农学院
技术领域：
本发明涉及真菌抗病毒活性物质的提取方法，尤其涉及真菌中多孔菌(Polyporales)抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法。
背景技术：
关于多孔菌活性物质提取物的制备方法，经检索到的相关专利有中国专利申请号为99112556.8灰树花发酵液多糖提取方法，02136517.2灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法，89105471一种云芝糖肽(PSP)的生产方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工艺，96109095中国灵芝保健饮料，92111030灵芝营养保健液及其制法，93103116灵芝口服液等专利，这些专利内容大多以提取多糖为主要目的，其中属于多孔菌的，只有灰树花、云芝和灵芝三种，其制备的活性物质提取物具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等药效，但对于抗病毒作用鲜有报道，而对于抗SARS病毒的报道更是没有检索到。
发明内容本发明要解决的问题是，针对上述多孔菌活性物质提取物的制备方法以及其制备的活性物质提取物的药理作用所存在的不足，提供一种多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法。利用本发明的方法提取的多孔菌粗提物对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用，且该方法具有工艺简便、产量高、成本低的特点。
本发明的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，有三种制备形式其一为直接从多孔菌发酵全液包括菌丝体与澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；其二为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得菌丝体中分离出抗SARS病毒活性物质；其三为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；上述多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法由以下步骤组成(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液放于容器内，调整其pH值为8～12，置60～120℃下加热30～240分钟，之后冷却、以180～200目的筛网过滤多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液，收集滤液，滤渣以其4～8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1～2遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6Kg/cm2，真空度为0.02～0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/30；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积4～8倍的醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，5～10分钟后，静置24～48小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000～6000r/min离心15～30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在50～70℃温度条件下干燥12～36小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即为多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物。
上述步骤(1)所述的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液是指灰树花(Grifolafrondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganoderma capense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的发酵全液或菌丝体或澄清液或其多菌株混合的集合体。
即，步骤(1)所述的多孔菌发酵全液是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一或其混合的发酵液与菌丝体的集合体。
步骤(1)所述的多孔菌发酵后澄清液是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的发酵后澄清液或多菌株发酵后澄清液的集合体。
步骤(1)所述的多孔菌发酵所得菌丝体是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一发酵所得菌丝体或多菌株发酵所得菌丝体的集合体。
其中，步骤(1)所述的pH值为10～12。
其中，步骤(1)所述加热温度是90～100℃。
其中，步骤(1)所述加热时间是120～240分钟。
其中，步骤(2)所述的减压浓缩条件是，温度50～60℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.04～0.06Mpa。
其中，步骤(3)所述的醇溶液是甲醇或乙醇，浓度为60～95％。
其中，步骤(3)所述醇析的时间为24～36小时。
其中，步骤(5)所述的收集物干燥用真空干燥，其条件为真空度0.02～0.06Mpa，温度50～70℃，时间15～36小时。
其中，步骤(6)所述的粉碎是采用200目的中药粉碎机对收集物进行粉碎。
采用本发明的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，具有工艺简便、产量高、成本低的特点。该方法采用真菌中多孔菌的发酵液、菌丝体及子实体进行活性物质提取，大大降低了灰树花子体及菌丝人工培养的难度、降低了原料成本、生产成本，增加了产量，提高了产率。
采用本发明的方法提取的多孔菌粗提物，经军事医学科学院微生物流行病研究所体外抗SARS病毒药物初筛试验，结果显示对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。
所作体外抗SARS病毒药物初筛试验的具体方法如下I、实验材料1、细胞VetoE6细胞(非洲绿猴肾细胞)
2、病毒SARS病毒，BJ-01株3、培养液含10％胎牛血清的DMEM培养液II、实验条件生物安全三级实验室III、实验步骤1、CPE法测定病毒对VeroE6细胞半数毒性浓度(TCID50)2、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度3、药物的最大无毒浓度对SARS病毒的药效测定IV、实验结果1、病毒的TCID50为10-7。
2、药物取5个浓度即1000、500、250、125和62.5ug/m1进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为125ug/ml。
3、取125ug/ml药液，做4个复孔，观察对SARS病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示该浓度药物对SARS病毒有完全抑制作用。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌灰树花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株发酵全液2000ml，放于3000ml容器内，调整其pH值为10，置100℃下加热120分钟，之后冷却至30℃、以180目的筛网过滤多孔菌发酵全液，收集滤液，滤渣以其6倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度60℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.04Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积5倍的95％的乙醇并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，8分钟后，静置24小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心15分钟，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在60℃温度条件下的置鼓风干燥箱内干燥24小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即得多孔菌发酵液抗SARS病毒活性物质粗提物4.57克，该抗SARS病毒活性物质粗提物的颜色为棕色、光密度在波长520nm时为1.1、pH为7.0。
实施例2将300L混有灰树花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株、薄树灵芝(Ganodermacapense)ATCC76613菌株的发酵全液，通过移液管道移到提取罐中，调整发酵全液pH至12左右，向提取罐夹套通蒸汽升温，当温度升至90℃时，计时，维持4小时后停止升温，向夹套内打入循环水降温。当温度降到60℃左右，将提取液通过二次200目的筛网过滤后移到浓缩罐内，进行减压浓缩，浓缩温度控制在50℃，真空度为0.06Mpa罐压控制在0.6Kg/cm2，浓缩时加入消泡剂(豆油)0.5斤/300L，当提取液浓缩到10L左右时，将其移到醇提罐内，并加入95％得甲醇60L，轻轻搅拌，搅拌速度为60r/min，5分钟以后，静置醇析，36小时以后，将上清液通过管道移至废液罐内贮放，沉淀物放出后进行离心，离心采用低速大容量离心机，转速为5000r/min，时间控制在20分钟，离心后将离心沉淀物放在不锈钢盘内进行真空干燥，干燥时真空度为0.05Mpa，温度控制在60℃之间，24小时以后，将提取物取出，用200目的中药粉碎机粉碎后，称重量为1260克，该抗SARS病毒活性物质粗提物的颜色为棕色、光密度在波长520nm时为1.0、pH为7.2。
实施例3(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌灰树花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株发酵所得菌丝体1350克，灵芝(Ganoderma lucidum)的发酵后澄清液1000ml，放于3000ml容器内，调整其pH值为11，置95℃下加热180分钟，之后冷却至37℃、以180目的筛网过滤多孔菌发酵全液，收集滤液，滤渣以其6倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/30；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积5倍的95％的乙醇并不断搅拌，搅拌速度为80r/min，8分钟后，静置24小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心15分钟，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在60℃温度条件下的置鼓风干燥箱内干燥30小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即得多孔菌发酵液抗SARS病毒活性物质粗提物4.13克，该抗SARS病毒活性物质粗提物的颜色为棕色、光密度在波长520nm时为1.2、pH为7.1。
实施例4采用实施例1的方法提取的多孔菌发酵液抗SARS病毒活性物质粗提物，以VetoE6细胞(非洲绿猴肾细胞)、SARS病毒(BJ-01株)、含10％胎牛血清的DMEM培养液为实验材料，以CPE法测定病毒对VeroE6细胞半数毒性浓度(TCID50)、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度、药物的最大无毒浓度对SARS病毒的药效测定等实验方法，进行体外抗SARS病毒药物初筛试验，实验结果如下1、病毒的TCID50为10-7。
2、药物取5个浓度即1000、500、250、125和62.5ug/ml进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为125ug/ml。
3、取125ug/ml药液，做4个复孔，观察对SARS病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示该浓度药物对SARS病毒有完全抑制作用。
权利要求
1.一种多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，有三种制备形式；其一为直接从多孔菌发酵全液包括菌丝体与澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；其二为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得菌丝体中分离出抗SARS病毒活性物质；其三为先将多孔菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得澄清液中分离出抗SARS病毒活性物质；上述多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法由以下步骤组成(1)加热过滤取经液体发酵的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液放于容器内，调整其pH值为8～12，置60～120℃下加热30～240分钟，之后冷却、以180～200目的筛网过滤多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液，收集滤液，滤渣以其4～8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1～2遍，再收集滤液；(2)减压浓缩离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6Kg/cm2，真空度为0.02～0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/30；(3)醇析在浓缩滤液中，加入量为其体积4～8倍的醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，5～10分钟后，静置24～48小时进行醇析；(4)离心分离醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000～6000r/min离心15～30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；(5)收集物干燥将上述收集的离心沉淀物，在50～70℃温度条件下干燥12～36小时；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即为多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物。
2.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的多孔菌发酵全液或菌丝体或澄清液是指灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的发酵全液或菌丝体或澄清液或其多菌株混合的集合体。
3.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的pH值为10～12。
4.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述加热温度是90～100℃。
5.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述加热时间是120～240分钟。
6.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的减压浓缩条件是，温度50～60℃，压力0.5Kg/cm2，真空度为0.04～0.06Mpa。
7.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的醇溶液是甲醇或乙醇，浓度为60～95％。
8.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述醇析的时间为24～36小时。
9.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的收集物干燥用真空干燥，其条件为真空度0.02～0.06Mpa，温度50～70℃，时间15～36小时。
10.如权利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的粉碎是采用200目的中药粉碎机对收集物进行粉碎。
全文摘要
本发明公开一种多孔菌抗SARS病毒活性物质粗提物的制备方法，其方法包括多孔菌发酵全液或发酵后澄清液或菌丝体经过加热过滤、减压浓缩、醇析、离心分离、收集物干燥、收集物粉碎等步骤。本发明的方法提取的多孔菌粗提物对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用，且该方法具有工艺简便、产量高、成本低的特点。
文档编号A61P11/00GK1486741SQ0313898
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月5日 优先权日2003年8月5日
发明者宋爱荣, 隋方功, 赵晨, 田雪梅 申请人:莱阳农学院
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