牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用的制作方法
专利名称：牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛磺酸在制药上的新用途，特别涉及牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用。
背景技术：
放疗和化疗至今仍是临床上用于治疗恶性肿瘤的主要方法。大量的临床实例也表明，放化疗对于恶性肿瘤细胞具有十分显著的杀伤和抑制作用，但是放化疗所产生的毒副作用也是十分明显的，放射线和化学制剂在杀死肿瘤细胞的同时，也会损伤人体的正常细胞，尤其是抑制骨髓造血系统，使白细胞和血小板数量下降，损害人体的免疫系统，导致肿瘤患者对其它疾病的抵抗力下降，出现头发脱落、食欲不振等各种毒副反应。大家都知道，白细胞，特别是其中的中性粒细胞有强大的吞噬能力，能消灭病原体，是人体抵御感染的一道防线。目前临床上人们所关心的多为升高患者体内白细胞的数量。虽然白细胞数量增加了，但新生白细胞的吞噬功能和淋巴细胞转化功能较低，防御能力较差。因此，增强患者白细胞的功能，是提高肿瘤治疗效果的有效途径。
牛磺酸是动物体内含量很高的一种含硫氨基酸，它具有复杂的生物学功能，如抗氧化、抗炎、膜稳定、抑制神经传递及调节渗透压、细胞内Ca++的移动和心血管活动等作用。具有抗心、肝和神经组织缺氧/再氧及氧自由基损伤作用。根据中国药典(2000年版)，它主要作为解热镇痛、保肝利胆药物应用于临床，其主要适应症是急慢性肝炎、脂肪肝、胆囊炎、上呼吸道感染、风湿性关节炎和疼痛等，药理作用包括保肝利胆、清热解毒、消炎镇痛、抗惊厥、抗风湿及降压、强心和抗心律失常等。但目前尚未见将牛磺酸作为一种新的增强白细胞功能药物的报道。
近年来，虽然有一些文献报道了牛磺酸与人体免疫系统方面相关的文章和试验，但大都局限于动物试验。专利查询国内外均未见有关牛磺酸用于增强白细胞功能的报道。
发明内容本发明为了克服以上不足，提供了一种利用牛磺酸来制备增强白细胞功能的药物。
本发明的内容为牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用。
本发明的牛磺酸可以为水溶性注射液、悬浊液或乳化液。
本发明的牛磺酸最佳用量为1-15mg/kg.d。
1).本发明的药物的适用症主要适用于由于如下原因造成的患者体内白细胞功能下降①由某些理化因素如经常接触X线、放射性物质、苯及某些有机溶剂等；②因各种实体肿瘤经常性放疗或化疗；③某些疾病(如伤寒、病毒性肝炎)；④多种血液病(如白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等)；⑤因SARS病毒及其它病毒感染而造成的白细胞功能低下和免疫能力降低；⑥严重感染及原因不明者。
2).本发明药物的用法与用量静脉滴注。一次5ml(300mg)，一日一次，以两周为一个疗程，或遵医嘱。临用前与250ml(或500ml)的5％或10％葡萄糖溶液混匀后使用。
牛磺酸是记载在中国药典2000版上的一种成药，因此可以根据牛磺酸的国家药品标准，根据患者的实际病情，采用相应的制剂，以及不同的用法与用量，也可以与合适的药用载体或稀释剂适当组合制成药品。以上均属于本发明的保护范围。
3).本发明药物的剂型本发明药物可制成注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖注射液等的水溶性溶剂或植物油、丙二醇等非水性溶剂的溶液、悬浊液或乳化液，必要时也可适当加入溶解辅助剂、等渗剂、悬浊化剂、乳化剂、稳定剂、保存剂等常用的添加剂。因此，可以制成1～10ml的针剂。也可以做成葡萄糖输液、生理盐水输液等250ml或500ml制剂形式。
4).本发明药物的机理研究牛磺酸为人体条件必需氨基酸，也是组织中含量最丰富的自由氨基酸之一。血中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞富含牛磺酸，其含量占全部游离氨基酸的50％～70％，表明它与免疫功能密切相关。
正常人外周血白细胞总数为4.0～10.0×109/L，中性粒细胞约占60％～70％。中性粒细胞是人体防御系统的重要组成部分，具有活跃的变形运动和吞噬功能，并依靠这种功能，消除体内的细菌或异物，杀灭肿瘤细胞等，中性粒细胞在血液的非特异性细胞免疫系统中起着十分重要的作用。
牛磺酸是人体的必需氨基酸，当机体缺乏牛磺酸时，会引起一系列的免疫功能异常，其肝脏缩小变硬，镜检可见B细胞区受损，B细胞缺陷或调节异常。白细胞数量下降，多核白细胞与单个核细胞的比值降低，另外中性粒细胞的功能也明显降低，吞噬葡萄球菌的速度和数量明显低于对照组。而Wistar大鼠饮用含牛磺酸的水3周后，其中性粒细胞内牛磺酸浓度明显上升，吞噬埃希氏大肠杆菌的能力增强，且杀菌时释放的髓过氧化物的浓度大大提高，通过荧光偏光消解法测定中性粒细胞膜的流动性的稳定性皆增强。患高血脂血症大鼠中性粒细胞膜中脂类水平较高，因此降低了其杀菌功能，而用牛磺酸(470mg/kg·d)治疗40d后，其中性粒细胞的杀菌能力增强，这说明牛磺酸在机体中性粒细胞的防御机制中起着重要的作用。
虽然体外培养淋巴细胞在无牛磺酸培养基中能够存活和增殖，但随着胞内牛磺酸的逐步耗尽，细胞的存活力和增殖率均下降；而加入牛磺酸后细胞内牛磺酸含量恢复，增殖率也升高，且牛磺酸浓度和细胞增殖间有剂量——反应关系，并且在0.1mol/L时达到最大值，此浓度恰相当于正常营养的人血浆中牛磺酸的浓度。牛磺酸可使DBA/2小鼠脾脏细胞DNA合成增加，但并不能使胸腺细胞DNA合成增加，因而推测有可能只能使成熟的T、B细胞增殖。对于牛磺酸改善T细胞增殖，还有学者认为与提高细胞内钙离子有浓度有关。牛磺酸除能促进淋巴细胞增殖外，还能使新生儿单个核细胞合成IgG、IgM增加；动物实验也表明，牛磺酸可促进鼠形成特异性抗体，而且此作用是依赖巨噬细胞的，一旦巨噬细胞被除去，则牛磺酸刺激B细胞产生抗体的量即明显降低。
牛磺酸增强白细胞功能的作用机理如下(1)牛磺酸对淋巴细胞有保护作用和促进其增殖作用。牛磺酸可以对抗外来因素对细胞的损害，防止细胞肿胀变形，从而减少了细胞的死亡。牛磺酸是通过现两条途径来实现对细胞膜的保护作用，一是通过其分子中的氨基与有害的因子相互作用，二是抵抗Na+、Cl-等渗透性离子和水的转移；牛磺酸改善T细胞的增殖可能是通过提高细胞内钙离子的浓度而实现的。(2)中性粒细胞中含有大量的牛磺酸，中性粒细胞和单核细胞中存在着大量的髓过氧化物酶(MPO)，形成溶酶体中的MPO/H2O2/可氧化的卤化物系统，此系统具有很强的抗细菌、真菌和病毒的作用。牛磺酸可以与由此系统中产生的次氯酸反应，形成较稳定的氯化牛磺酸，从而清除次氯酸的氧化作用，使细胞免受攻击。(3)牛磺酸可以诱导小鼠巨噬细胞产生白细胞介素-1，而且此白细胞介素-1具有生物活性，可以促进DBA/2小鼠胸腺细胞的增殖，从而支持了巨噬细胞在抗体产生中的作用。此外牛磺酸还能被中性粒细胞释放到胞外的组织液及血液中，保护组织细胞和血细胞免受卤化物氧化剂的杀伤。
临床和实验研究均表明，许多经过放化疗治疗的肿瘤病人均有免疫功能低下，特别是细胞免疫功能低下的症状，而且，随着肿瘤在体内的生长，机体体液的免疫功能也随之降低。从肿瘤病人瘤组织、腹水及血清中均可分离到分子量为103～8×106的含蛋白质98％以上的抑制因子，这种抑制因子除能抑制巨噬细胞趋化反应外，尚能抑制细胞及体液免疫反应，这是引起肿瘤机体免疫反应低下的重要因素之一。通过实验发现，牛磺酸能激活和增强小鼠网状内皮系统的吞噬能力，其廓清碳素颗粒的速率牛磺酸组为对照组的2.87倍，校正廓清速率也明显高于对照组(P＜0.01)。HC50测定可反映机体体液免疫功能的强弱，表明外周血中IgM水平的高低，牛磺酸组HC50明显高于对照组(P＜0.01)，动物抑瘤实验结果表明，牛磺酸对移植性S180肉瘤小鼠平均延长生存17天，肿瘤生长抑制率为42.26％，而牛磺酸与化疗药物环磷酰胺同时使用的抑瘤率为100％，接种瘤细胞后，小鼠生存至61天无一死亡，也无肉眼可见肿块生长，说明牛磺酸可显著增强机体的免疫功能。
牛磺酸对小鼠受60Co-γ射线的辐射损伤也有一定的防护作用。电离辐射损伤可使组织细胞产生氧化自由基，而牛磺酸能有效地清除γ射线损伤所产生的氧化自由基，抑制组织细胞的脂质过氧化反应。河北医科大学的张凤云等研究也发现，牛磺酸能明显提高60Co-γ射线照射小鼠的存活率和外周血白细胞数，并能降低微核率，说明牛磺酸对受辐照的小鼠有明显的保护作用，同时具有一定的抗突变能力。
此外，牛磺酸可以明显减弱由自然杀伤细胞介导的重组白介素-2(rIL-2)活化的内皮细胞毒性而不降低rIL-2抗肿瘤反应；同时降低淋巴因子活化杀伤细胞介导的内皮细胞溶解。牛磺酸还可以促进白细胞介素1的产生，从而使γ-干扰素的生产增加。
非典型肺炎(SARS)具有较强的传染性，并存在扩散的危险，根据诺贝尔医学奖获得者Behring的研究，疾病的产生与人体自身免疫系统是否健全有关，人体自身免疫功能失调，免疫力下降是最核心、最本质的因素。儿童和老年人的免疫力相对低下，可能更容易感染病毒。而增强免疫力能帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病，有保护机体不受损害的防御能力。中国疾病预防控制中心副研究员卢承前就提出，牛磺酸可以构成防治非典的一道防线，减轻病毒侵入时产生的发烧等症状。牛磺酸能促进免疫系统淋巴细胞的生长繁殖，还能清热、镇痛，缓解人体自身因抵御病毒而启动自动调节防御系统产生的症状——发烧。这就“均衡营养免疫三防线”的第三步。当人体受到病毒严重侵害时，牛磺酸发挥作用，进而增强人体的抵抗力以上结果都说明，牛磺酸具有免疫促进作用，它能保护淋巴细胞并促使其增殖，能够使白细胞的数量增加，并提高白细胞特别是中性粒细胞的吞噬功能，提高肿瘤患者的免疫功能，是一种很好的免疫佐剂。
5).本发明药物的药效学研究1材料与方法1.1材料1.1.1受试药物牛磺酸注射液为无色透明溶液，含量60mg/ml，由济南开发区保法药物研究所提供，批号030101。试验前以无菌生理盐水配成相应浓度的溶液供试验用。
1.1.2动物 昆明种小鼠，18-22g，♀♂各半，由山东大学实验动物中心提供。动物合格证号980101，饲料由山东大学实验动物中心提供。
1.1.3试剂及仪器 注射用环磷酰胺(粉针剂)，上海华联制药有限公司出品。RPMI1640，美国GIBCO公司；刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)，购自华美试剂公司；二甲基亚砜(DMSO，分析纯)，天津市博迪化工有限公司。印度墨汁北京市西中化工厂；自动酶标读数仪、二氧化碳培养箱。
1.2方法1.2.1对环磷酰胺所致的免疫低下小鼠的影响1.2.1.1模型制备及动物分组、给药剂量小鼠随机分为8组，每组12只，♀♂各半，分别为牛磺酸注射液5个剂量组(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)、甘露聚糖肽注射液组(2.5mg/kg)、模型对照组、空白对照组，其中模型对照组、空白对照组给予等容量的注射用生理盐水。各组小鼠尾静脉(iv)给药，连续7日，第8日进行实验。给药后第3天除空白对照组外，其余动物均一次性腹腔注射(ip)环磷酰胺(100mg/kg)造成免疫低下模型。
1.2.1.2对非特异性免疫功能的影响——碳粒廓清法实验时每鼠尾静脉注射稀释均匀的印度墨汁0.05ml/10g体重，于1和5min后，分别从眼眶静脉取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，摇匀，在680nm处测定两次所取血样的光密度值(OD值)。处死小鼠，取肝、脾、胸腺、瘤块称重。按下式计算 OD1为1分钟所取血样的光密度 OD5为5分钟所取血样的光密度 1.2.1.3对体液免疫功能的影响模型制备、动物分组及给药剂量同1.2.1.1，于给药第4天用5％的新鲜鸡血红细胞(CRBC)0.2ml/只，继续给药。于末次给药次日处死动物，摘取脾脏，用PH7.2的PBS制成5×106脾细胞悬液。取脾细胞悬液1ml、0.2％CRBC1ml及10％豚鼠血清1ml混合，37℃温育1小时，离心取上清液在413nm处测光密度OD值。
1.2.1.4对中性粒细胞吞噬功能及白细胞数量的影响模型制备、动物分组及给剂量同1.2.1.1，实验时每鼠取抗凝血分成两份一份为20ul按常规进行白细胞计数；一份为40ul，加入已灭活处理的葡萄球菌菌液20ul充分混匀。置于铺有湿纱布的有盖容器内，在37℃温箱中温育30min。取1小滴混合液置于洁净无油污的玻片推成薄片。晾干后，无水甲醇固定2～3min。吉姆萨-瑞氏染液10min。置油镜下观察。随机计数100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的中性粒细胞数，对有吞噬作用的中性粒细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。
1.2.1.5对淋巴细胞转化功能的影响(MTT法)模型制备、动物分组及给剂量同1.2.1.1。实验时处死小鼠，无菌条件下取脾脏置于洁静平皿中，用注射器针芯在100目不锈钢网上研碎过滤，用Hanks液洗涤，用含10％小牛血清RPMI1640培养液调细胞浓度为5×106个/ml。加入96孔平底培养板，每孔100μl，同时每孔加入10μg/ml的ConA 100ul。阴性对照孔以完全培养液代替ConA，每鼠设实验与对照各3孔，置37℃、5％CO2孵育培养68h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心去上清液，每孔加150μl DMSO溶解结晶，在酶联免疫检测仪上于490nm处测定OD值，计算刺激指数(SI)。
刺激指数(SI)＝试验孔OD值(阴性对照孔OD值)/空白对照孔OD值。
1.2.2对60Coγ所致的免疫低下小鼠的影响1.2.2.1模型制备及动物分组、给药剂量取小鼠80只，随机分为8组，每组12只，♀♂各半，分别为牛磺酸注射液5个剂量组(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)、甘露聚糖肽注射液组(2.5mg/kg)、模型对照组、空白对照组，其中模型对照组、空白对照组给予等容量的注射用生理盐水。各组小鼠尾静脉(iv)给药，连续7日，第8日进行实验。给药后第3天除空白对照组外，其余动物用60Coγ射线4Gy一次性全身照射造成免疫低下模型。
1.2.2.2对非特异性免疫功能的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，实验时每鼠尾静脉注射稀释均匀的印度墨汁0.05ml/10g体重，于1和5min后，分别从眼眶静脉取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，摇匀，在680nm处测定两次所取血样的光密度值(0D值)。处死小鼠，取肝、脾、胸腺称重。计算方法同1.2.1.2。
1.2.2.3对体液免疫功能的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，于给药第4天用5％的新鲜鸡血红细胞(CRBC)0.2ml/只，继续给药。于末次给药次日处死动物，摘取脾脏，用PH7.2的PBS制成5×106脾细胞悬液。取脾细胞悬液1ml、0.2％CRBC1ml及10％豚鼠血清1ml混合，37℃温育1小时，离心取上清液在413nm处测光密度OD值。
1.2.2.4对中性粒细胞吞噬功能及白细胞数量的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，实验时每鼠取抗凝血分成两份一份为20ul按常规进行白细胞计数；一份为40ul，加入已灭活处理的葡萄球菌菌液20ul充分混匀。置于铺有湿纱布的有盖容器内，在37℃温箱中温育30min。取1小滴混合液置于洁净无油污的玻片推成薄片。晾干后，无水甲醇固定2～3min。吉姆萨-瑞氏染液10min。置油镜下观察。随机计数100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的中性粒细胞数，对有吞噬作用的中性粒细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。数据处理方法同1.2.1.4。
1.2.2.5对淋巴细胞转化功能的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，实验时处死小鼠，无菌条件下取脾脏置于洁静平皿中，用注射器针芯在100目不锈钢网上研碎过滤，用Hanks液洗涤，用含10％小牛血清RPMI1640培养液调细胞浓度为5×106个/ml。加入96孔平底培养板，每孔100μl，同时每孔加入10μg/ml的ConA 100ul。阴性对照孔以完全培养液代替ConA，每鼠设实验与对照各3孔，置37℃、5％CO2孵育培养68h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心去上清液，每孔加150μl DMSO溶解结晶，在酶联免疫检测仪上于490nm处测定OD值，计算刺激指数(SI)。数据处理方法同1.2.1.5。
1.3统计学处理检测数值均以x±s表示，各组间数值比较采用t检验。
2结果2.1对环磷酰胺所致的免疫低下小鼠的影响2.1.1对非特异性免疫功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg、25mg/kg剂量组与模型组比较，廓清指数、吞噬指数均明显增高，其差别有显著性意义(p＜0.01)。对体重未见明显影响(p＞0.05)，但可明显增加免疫器官重量，其差别有意义(p＜0.05)。见表1、2。
表1 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影响(x±s)
组别剂量(mg/kg) 动物数(只) K值 α值空白对照组 - 12 0.040±0.009 6.54±0.93模型对照组 - 11 0.021±0.007 4.41±0.75甘露聚糖肽注射液2.5 12 0.031±0.013*5.01±0.76*牛磺酸注射液200 11 0.027±0.015 4.69±0.63牛磺酸注射液100 12 0.028±0.010 4.73±0.48牛磺酸注射液50 12 0.039±0.009**5.68±0.91**牛磺酸注射液25 12 0.034±0.011**5.33±0.83*牛磺酸注射液12.512 0.029±0.012 4.89±0.68注模型组与牛磺酸注射液(200mg/kg)各有一只动物亡。
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表2 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠体重、脾、胸腺指数的影响(x±s)组别 剂量 动物数 体重(g) 脾指数 胸腺指数空白对照组—— 12 26.23±2.39 3.94±0.94 2.48±0.47模型对照组—— 12 21.28±2.48 2.48±0.41 1.64±0.68甘露聚糖肽注射液 2.5mg/kg 12 22.10±2.93 2.88±0.43 2.09±0.31牛磺酸注射液 200mg/kg 12 21.80±2.12 2.42±0.70 1.85±0.31牛磺酸注射液 100mg/kg 12 21.68±2.57 2.60±0.56 1.89±0.24牛磺酸注射液 50mg/kg 12 21.82±1.52 3.01±0.40 2.21±0.36牛磺酸注射液 25mg/kg 12 21.90±1.16 2.78±0.37 2.10±0.33牛磺酸注射液 12.5mg/kg12 21.18±2.04 2.70±0.35 1.98±0.42注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.1.2对体液免疫功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg、25mg/kg剂量组与模型组比较，其差别有显著性意义(p＜0.01)。提示牛磺酸注射液50mg/kg、25mg/kg剂量组可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠体液免疫功能。结果见表3表3 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠体液免疫功能的影响(x±s)组别剂量(mg/kg) 动物数(只) OD值空白对照组 -12 0.412±0.076模型对照组 -12 0.236±0.021牛磺酸注射液200 12 0.247±0.032牛磺酸注射液100 12 0.252±0.054牛磺酸注射液50 12 0.335±0.079**牛磺酸注射液25 12 0.313±0.068**牛磺酸注射液12.5 12 0.253±0.065甘露聚糖肽注射液2.5 12 0.294±0.060*注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.1.3对中性粒细胞吞噬功能、白细胞数量的影响结果提示牛磺酸注射液50mg/kg剂量组可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠中性粒细胞吞噬功能，与模型组比较有意义(p＜0.05)。50mg/kg、25mg/kg剂量组均可增加白细胞数量，差别有意义(p＜0.05)。结果见表4。
表4 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠中性粒细胞吞噬功能、白细胞数量的影响(x±s)动物数 白细胞数量组别剂量(mg/kg)吞噬率(％)吞噬指数(只) (109个/L)空白对照组 - 10 69.22±7.92 3.47±0.59 9.64±1.0252模型对照组 - 10 47.29±3.77 2.85±0.24 4.23±0.38牛磺酸注射液200 10 46.21±4.26 2.78±0.34 4.52±0.57牛磺酸注射液100 10 44.63±4.31 2.14±0.31 4.38±0.81牛磺酸注射液50 10 58.23±2.53** 3.16±0.13**5.73±0.64牛磺酸注射液25 10 50.18±4.82* 2.35±0.36**5.44±0.87牛磺酸注射液12.510 45.36±2.55 2.94±0.42 5.36±0.58甘露聚糖肽注射液2.5 10 56.44±3.13* 2.68±0.41**6.82±1.052.1.4对淋巴细胞转化功能的影响牛磺酸注射液100mg/kg、50mg/kg剂量组可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠淋巴细胞增殖转化功能，与模型组比较有意义(p＜0.05)。
表5 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响组别 剂量(mg/kg)动物数(只)刺激指数(SI)空白对照组 -10 2.17±0.29模型对照组 -10 1.12±0.19牛磺酸注射液200 10 1.23±0.28牛磺酸注射液100 10 1.26±0.34牛磺酸注射液50 10 1.95±0.38*牛磺酸注射液25 10 1.67±0.21牛磺酸注射液12.5 10 1.41±0.23甘露聚糖肽注射液2.5 10 1.73±0.25*2.2对60Coγ所致的免疫低下小鼠的免疫功能的影响2.2.1对非特异性免疫功能的影响牛磺酸注射液100mg/kg、50mg/kg剂量组可明显提高60Coγ所致的免疫低下小鼠的碳粒廓清指数，增加免疫器官重量(50mg/kg，脾指数)，其差别有意义(p＜0.05)，对体重未见明显影响(p＞0.05)。
表6 对60Coγ所致免疫低下荷瘤小鼠非特异性免疫功能的影响(x±s)
组别 剂量 动物数 廓清指数 吞噬指数空白对照组 ——12 0.0431±0.0085 7.01±0.87模型对照组 ——11 0.0324±0.0085 5.95±0.53甘露聚糖肽注射液 2.5mg/kg 12 0.0422±0.0104*6.33±0.97牛磺酸注射液 100mg/kg 12 0.0417±0.0112*6.08±0.74牛磺酸注射液 50mg/kg 12 0.0456±0.0082** 6.52±0.69*牛磺酸注射液 25mg/kg 12 0.0403±0.0137 6.29±0.85注模型组有一只动物死亡。与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01表7 对60Coγ所致免疫低下荷瘤小鼠体重、瘤重、脾、胸腺指数的影响(x±s)组别 剂量 动物数 体重(g) 脾指数 胸腺指数空白对照组 —— 12 26.18±2.39 3.94±0.94 2.48±0.47模型对照组 —— 11 21.03±2.48 2.48±0.41 1.59±0.44甘露聚糖肽注射液 2.5mg/kg 12 22.10±2.93 2.88±0.43 2.09±0.31牛磺酸注射液 100mg/kg 12 21.68±2.57 2.60±0.56 1.81±0.24牛磺酸注射液 50mg/kg12 21.92±1.52 3.11±0.40* 2.25±0.36*牛磺酸注射液 25mg/kg12 21.41±1.16 2.78±0.37 2.06±0.33注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.012.2.2对体液免疫功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg、100mg/kg剂量组可明显提高60Coγ照射所致免疫低下小鼠的体液免疫功能，与模型组相比有意义(p＜0.05)。
表8 对60Coγ所致免疫低下小鼠体液免疫功能的影响组别 剂量(mg/kg)动物数(只)OD空白对照组 - 120.396±0.059模型对照组 - 120.197±0.038甘露聚糖肽注射液 2.5120.279±0.041*牛磺酸注射液 100120.286±0.036*牛磺酸注射液 50 120.319±0.063**牛磺酸注射液 25 120.237±0.028注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2.3对中性粒细胞吞噬功能、白细胞数量的影响牛磺酸注射液50mg/kg、100mg/kg剂量组可明显提高60Coγ所致的免疫低下小鼠的中性粒细胞的吞噬功能，增加白细胞数量，与模型对照组相比较其差别有意义(50mg/kg，p＜0.05)。
表9 对60Coγ所致免疫低下小鼠中性粒细胞、白细胞数量吞噬功能的影响剂量 动物数白细胞数量(109组别吞噬率(％) 吞噬指数(mg/kg) (只) 个/L)空白对照组-12 67.3±5.64.06±0.67 9.41±2.13模型对照组-12 42.3±5.12.14±0.49 3.83±1.49甘露聚糖肽注射液 2.5 12 51.4±5.7* 3.08±0.58* 6.51±2.35**牛磺酸注射液 100 12 50.6±6.7* 3.16±0.45* 4.62±2.16牛磺酸注射液 50 12 59.2±5.9** 3.53±0.33**5.93±1.84**牛磺酸注射液 25 12 46.1±7.92.65±0.47 5.04±1.26*注与模型组比较*P＜0 05，**P＜0.012.2.4对脾淋巴细胞转化功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg剂量组可明显提高60Coγ所致免疫低下小鼠淋巴增殖细胞转化功能。
表10 对60Coγ所致免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响组别 剂量(mg/kg)动物数(只)刺激指数(SI)空白对照组 - 122.33±0.45模型对照组 - 121.34±0.53甘露聚糖肽注射液 2.5121.92±0.48*牛磺酸注射液 100121.96±0.62*牛磺酸注射液 50 122.07±0.46**牛磺酸注射液 25 121.87±0.39*注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.013、讨论牛磺酸是人及动物体内一种含硫的氨基酸，对维持人和动物正常生理功能具有十分重要的作用。有关研究表明其具有保护淋巴细胞并可促进增殖产生抗体的作用，还可促进巨噬细胞产生白细胞介素，与中性粒细胞的吞噬功能密切相关，在机体防御中起重要的作用。以上实验结果表明，牛磺酸注射液可明显增加环磷酰胺、60Coγ照射所致的免疫功能低下小鼠的碳粒廓清速度、增加白细胞的数量及免疫器官(脾、胸腺)的重量、提高血清溶血素抗体含量、增强中性粒细胞的吞噬功能和脾淋巴细胞的转化功能。说明牛磺酸可明显提高免疫功能低下患者的免疫能力和升高其白细胞的功能，是一种很好的免疫佐剂。
具体实施方式
1实施例1取牛磺酸配成水溶性针剂，5ml(含牛磺酸400mg)/支，与250ml5％葡萄糖溶液混匀后静脉滴注。每日一次。
2实施例2取牛磺酸加入到5％的葡萄糖溶液中，250ml(含牛磺酸500mg)/瓶，混匀后静脉滴注。每日一次。
3实施例3取牛磺酸与丙二醇及乳化剂等混合成乳液，10ml(含牛磺酸400mg)/支，与生理盐水混匀后，静脉滴注，每日一次。
4实施例4强白能注射液，主要成份为牛磺酸，规格5ml∶300mg。临用前与250ml5％葡萄糖溶液混匀后静脉滴注，每日一次，以两周为一个疗程，或遵医嘱。
5实施例5强白能输液，主要成份为牛磺酸，规格250ml∶300mg。静脉滴注，每日一次，两周一个疗程。
6实施例6强白能注射液，主要成份为牛磺酸，规格5ml∶300mg。肌肉注射，每日一次，两周一个疗程。
权利要求
1.牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用。
2.根据权利要求1所述的牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用，其特征在于所述的牛磺酸为水溶性注射液、悬浊液或乳化液。
3.根据权利要求1或2所述的牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用，其特征在于所述的牛磺酸用量为1-15mg/kg.d。
全文摘要
本发明涉及牛磺酸在制药上的新用途，特别涉及牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用，本发明的牛磺酸可以为水溶性注射液、悬浊液或乳化液，牛磺酸最佳用量为1－15mg/kg.d。牛磺酸注射液可明显增加环磷酰胺文档编号A61P7/00GK1528282SQ03139080
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者于保法 申请人:济南开发区保法药物研究所
技术领域：
本发明涉及牛磺酸在制药上的新用途，特别涉及牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用。
背景技术：
放疗和化疗至今仍是临床上用于治疗恶性肿瘤的主要方法。大量的临床实例也表明，放化疗对于恶性肿瘤细胞具有十分显著的杀伤和抑制作用，但是放化疗所产生的毒副作用也是十分明显的，放射线和化学制剂在杀死肿瘤细胞的同时，也会损伤人体的正常细胞，尤其是抑制骨髓造血系统，使白细胞和血小板数量下降，损害人体的免疫系统，导致肿瘤患者对其它疾病的抵抗力下降，出现头发脱落、食欲不振等各种毒副反应。大家都知道，白细胞，特别是其中的中性粒细胞有强大的吞噬能力，能消灭病原体，是人体抵御感染的一道防线。目前临床上人们所关心的多为升高患者体内白细胞的数量。虽然白细胞数量增加了，但新生白细胞的吞噬功能和淋巴细胞转化功能较低，防御能力较差。因此，增强患者白细胞的功能，是提高肿瘤治疗效果的有效途径。
牛磺酸是动物体内含量很高的一种含硫氨基酸，它具有复杂的生物学功能，如抗氧化、抗炎、膜稳定、抑制神经传递及调节渗透压、细胞内Ca++的移动和心血管活动等作用。具有抗心、肝和神经组织缺氧/再氧及氧自由基损伤作用。根据中国药典(2000年版)，它主要作为解热镇痛、保肝利胆药物应用于临床，其主要适应症是急慢性肝炎、脂肪肝、胆囊炎、上呼吸道感染、风湿性关节炎和疼痛等，药理作用包括保肝利胆、清热解毒、消炎镇痛、抗惊厥、抗风湿及降压、强心和抗心律失常等。但目前尚未见将牛磺酸作为一种新的增强白细胞功能药物的报道。
近年来，虽然有一些文献报道了牛磺酸与人体免疫系统方面相关的文章和试验，但大都局限于动物试验。专利查询国内外均未见有关牛磺酸用于增强白细胞功能的报道。
发明内容本发明为了克服以上不足，提供了一种利用牛磺酸来制备增强白细胞功能的药物。
本发明的内容为牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用。
本发明的牛磺酸可以为水溶性注射液、悬浊液或乳化液。
本发明的牛磺酸最佳用量为1-15mg/kg.d。
1).本发明的药物的适用症主要适用于由于如下原因造成的患者体内白细胞功能下降①由某些理化因素如经常接触X线、放射性物质、苯及某些有机溶剂等；②因各种实体肿瘤经常性放疗或化疗；③某些疾病(如伤寒、病毒性肝炎)；④多种血液病(如白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等)；⑤因SARS病毒及其它病毒感染而造成的白细胞功能低下和免疫能力降低；⑥严重感染及原因不明者。
2).本发明药物的用法与用量静脉滴注。一次5ml(300mg)，一日一次，以两周为一个疗程，或遵医嘱。临用前与250ml(或500ml)的5％或10％葡萄糖溶液混匀后使用。
牛磺酸是记载在中国药典2000版上的一种成药，因此可以根据牛磺酸的国家药品标准，根据患者的实际病情，采用相应的制剂，以及不同的用法与用量，也可以与合适的药用载体或稀释剂适当组合制成药品。以上均属于本发明的保护范围。
3).本发明药物的剂型本发明药物可制成注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖注射液等的水溶性溶剂或植物油、丙二醇等非水性溶剂的溶液、悬浊液或乳化液，必要时也可适当加入溶解辅助剂、等渗剂、悬浊化剂、乳化剂、稳定剂、保存剂等常用的添加剂。因此，可以制成1～10ml的针剂。也可以做成葡萄糖输液、生理盐水输液等250ml或500ml制剂形式。
4).本发明药物的机理研究牛磺酸为人体条件必需氨基酸，也是组织中含量最丰富的自由氨基酸之一。血中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞富含牛磺酸，其含量占全部游离氨基酸的50％～70％，表明它与免疫功能密切相关。
正常人外周血白细胞总数为4.0～10.0×109/L，中性粒细胞约占60％～70％。中性粒细胞是人体防御系统的重要组成部分，具有活跃的变形运动和吞噬功能，并依靠这种功能，消除体内的细菌或异物，杀灭肿瘤细胞等，中性粒细胞在血液的非特异性细胞免疫系统中起着十分重要的作用。
牛磺酸是人体的必需氨基酸，当机体缺乏牛磺酸时，会引起一系列的免疫功能异常，其肝脏缩小变硬，镜检可见B细胞区受损，B细胞缺陷或调节异常。白细胞数量下降，多核白细胞与单个核细胞的比值降低，另外中性粒细胞的功能也明显降低，吞噬葡萄球菌的速度和数量明显低于对照组。而Wistar大鼠饮用含牛磺酸的水3周后，其中性粒细胞内牛磺酸浓度明显上升，吞噬埃希氏大肠杆菌的能力增强，且杀菌时释放的髓过氧化物的浓度大大提高，通过荧光偏光消解法测定中性粒细胞膜的流动性的稳定性皆增强。患高血脂血症大鼠中性粒细胞膜中脂类水平较高，因此降低了其杀菌功能，而用牛磺酸(470mg/kg·d)治疗40d后，其中性粒细胞的杀菌能力增强，这说明牛磺酸在机体中性粒细胞的防御机制中起着重要的作用。
虽然体外培养淋巴细胞在无牛磺酸培养基中能够存活和增殖，但随着胞内牛磺酸的逐步耗尽，细胞的存活力和增殖率均下降；而加入牛磺酸后细胞内牛磺酸含量恢复，增殖率也升高，且牛磺酸浓度和细胞增殖间有剂量——反应关系，并且在0.1mol/L时达到最大值，此浓度恰相当于正常营养的人血浆中牛磺酸的浓度。牛磺酸可使DBA/2小鼠脾脏细胞DNA合成增加，但并不能使胸腺细胞DNA合成增加，因而推测有可能只能使成熟的T、B细胞增殖。对于牛磺酸改善T细胞增殖，还有学者认为与提高细胞内钙离子有浓度有关。牛磺酸除能促进淋巴细胞增殖外，还能使新生儿单个核细胞合成IgG、IgM增加；动物实验也表明，牛磺酸可促进鼠形成特异性抗体，而且此作用是依赖巨噬细胞的，一旦巨噬细胞被除去，则牛磺酸刺激B细胞产生抗体的量即明显降低。
牛磺酸增强白细胞功能的作用机理如下(1)牛磺酸对淋巴细胞有保护作用和促进其增殖作用。牛磺酸可以对抗外来因素对细胞的损害，防止细胞肿胀变形，从而减少了细胞的死亡。牛磺酸是通过现两条途径来实现对细胞膜的保护作用，一是通过其分子中的氨基与有害的因子相互作用，二是抵抗Na+、Cl-等渗透性离子和水的转移；牛磺酸改善T细胞的增殖可能是通过提高细胞内钙离子的浓度而实现的。(2)中性粒细胞中含有大量的牛磺酸，中性粒细胞和单核细胞中存在着大量的髓过氧化物酶(MPO)，形成溶酶体中的MPO/H2O2/可氧化的卤化物系统，此系统具有很强的抗细菌、真菌和病毒的作用。牛磺酸可以与由此系统中产生的次氯酸反应，形成较稳定的氯化牛磺酸，从而清除次氯酸的氧化作用，使细胞免受攻击。(3)牛磺酸可以诱导小鼠巨噬细胞产生白细胞介素-1，而且此白细胞介素-1具有生物活性，可以促进DBA/2小鼠胸腺细胞的增殖，从而支持了巨噬细胞在抗体产生中的作用。此外牛磺酸还能被中性粒细胞释放到胞外的组织液及血液中，保护组织细胞和血细胞免受卤化物氧化剂的杀伤。
临床和实验研究均表明，许多经过放化疗治疗的肿瘤病人均有免疫功能低下，特别是细胞免疫功能低下的症状，而且，随着肿瘤在体内的生长，机体体液的免疫功能也随之降低。从肿瘤病人瘤组织、腹水及血清中均可分离到分子量为103～8×106的含蛋白质98％以上的抑制因子，这种抑制因子除能抑制巨噬细胞趋化反应外，尚能抑制细胞及体液免疫反应，这是引起肿瘤机体免疫反应低下的重要因素之一。通过实验发现，牛磺酸能激活和增强小鼠网状内皮系统的吞噬能力，其廓清碳素颗粒的速率牛磺酸组为对照组的2.87倍，校正廓清速率也明显高于对照组(P＜0.01)。HC50测定可反映机体体液免疫功能的强弱，表明外周血中IgM水平的高低，牛磺酸组HC50明显高于对照组(P＜0.01)，动物抑瘤实验结果表明，牛磺酸对移植性S180肉瘤小鼠平均延长生存17天，肿瘤生长抑制率为42.26％，而牛磺酸与化疗药物环磷酰胺同时使用的抑瘤率为100％，接种瘤细胞后，小鼠生存至61天无一死亡，也无肉眼可见肿块生长，说明牛磺酸可显著增强机体的免疫功能。
牛磺酸对小鼠受60Co-γ射线的辐射损伤也有一定的防护作用。电离辐射损伤可使组织细胞产生氧化自由基，而牛磺酸能有效地清除γ射线损伤所产生的氧化自由基，抑制组织细胞的脂质过氧化反应。河北医科大学的张凤云等研究也发现，牛磺酸能明显提高60Co-γ射线照射小鼠的存活率和外周血白细胞数，并能降低微核率，说明牛磺酸对受辐照的小鼠有明显的保护作用，同时具有一定的抗突变能力。
此外，牛磺酸可以明显减弱由自然杀伤细胞介导的重组白介素-2(rIL-2)活化的内皮细胞毒性而不降低rIL-2抗肿瘤反应；同时降低淋巴因子活化杀伤细胞介导的内皮细胞溶解。牛磺酸还可以促进白细胞介素1的产生，从而使γ-干扰素的生产增加。
非典型肺炎(SARS)具有较强的传染性，并存在扩散的危险，根据诺贝尔医学奖获得者Behring的研究，疾病的产生与人体自身免疫系统是否健全有关，人体自身免疫功能失调，免疫力下降是最核心、最本质的因素。儿童和老年人的免疫力相对低下，可能更容易感染病毒。而增强免疫力能帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病，有保护机体不受损害的防御能力。中国疾病预防控制中心副研究员卢承前就提出，牛磺酸可以构成防治非典的一道防线，减轻病毒侵入时产生的发烧等症状。牛磺酸能促进免疫系统淋巴细胞的生长繁殖，还能清热、镇痛，缓解人体自身因抵御病毒而启动自动调节防御系统产生的症状——发烧。这就“均衡营养免疫三防线”的第三步。当人体受到病毒严重侵害时，牛磺酸发挥作用，进而增强人体的抵抗力以上结果都说明，牛磺酸具有免疫促进作用，它能保护淋巴细胞并促使其增殖，能够使白细胞的数量增加，并提高白细胞特别是中性粒细胞的吞噬功能，提高肿瘤患者的免疫功能，是一种很好的免疫佐剂。
5).本发明药物的药效学研究1材料与方法1.1材料1.1.1受试药物牛磺酸注射液为无色透明溶液，含量60mg/ml，由济南开发区保法药物研究所提供，批号030101。试验前以无菌生理盐水配成相应浓度的溶液供试验用。
1.1.2动物 昆明种小鼠，18-22g，♀♂各半，由山东大学实验动物中心提供。动物合格证号980101，饲料由山东大学实验动物中心提供。
1.1.3试剂及仪器 注射用环磷酰胺(粉针剂)，上海华联制药有限公司出品。RPMI1640，美国GIBCO公司；刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)，购自华美试剂公司；二甲基亚砜(DMSO，分析纯)，天津市博迪化工有限公司。印度墨汁北京市西中化工厂；自动酶标读数仪、二氧化碳培养箱。
1.2方法1.2.1对环磷酰胺所致的免疫低下小鼠的影响1.2.1.1模型制备及动物分组、给药剂量小鼠随机分为8组，每组12只，♀♂各半，分别为牛磺酸注射液5个剂量组(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)、甘露聚糖肽注射液组(2.5mg/kg)、模型对照组、空白对照组，其中模型对照组、空白对照组给予等容量的注射用生理盐水。各组小鼠尾静脉(iv)给药，连续7日，第8日进行实验。给药后第3天除空白对照组外，其余动物均一次性腹腔注射(ip)环磷酰胺(100mg/kg)造成免疫低下模型。
1.2.1.2对非特异性免疫功能的影响——碳粒廓清法实验时每鼠尾静脉注射稀释均匀的印度墨汁0.05ml/10g体重，于1和5min后，分别从眼眶静脉取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，摇匀，在680nm处测定两次所取血样的光密度值(OD值)。处死小鼠，取肝、脾、胸腺、瘤块称重。按下式计算 OD1为1分钟所取血样的光密度 OD5为5分钟所取血样的光密度 1.2.1.3对体液免疫功能的影响模型制备、动物分组及给药剂量同1.2.1.1，于给药第4天用5％的新鲜鸡血红细胞(CRBC)0.2ml/只，继续给药。于末次给药次日处死动物，摘取脾脏，用PH7.2的PBS制成5×106脾细胞悬液。取脾细胞悬液1ml、0.2％CRBC1ml及10％豚鼠血清1ml混合，37℃温育1小时，离心取上清液在413nm处测光密度OD值。
1.2.1.4对中性粒细胞吞噬功能及白细胞数量的影响模型制备、动物分组及给剂量同1.2.1.1，实验时每鼠取抗凝血分成两份一份为20ul按常规进行白细胞计数；一份为40ul，加入已灭活处理的葡萄球菌菌液20ul充分混匀。置于铺有湿纱布的有盖容器内，在37℃温箱中温育30min。取1小滴混合液置于洁净无油污的玻片推成薄片。晾干后，无水甲醇固定2～3min。吉姆萨-瑞氏染液10min。置油镜下观察。随机计数100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的中性粒细胞数，对有吞噬作用的中性粒细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。
1.2.1.5对淋巴细胞转化功能的影响(MTT法)模型制备、动物分组及给剂量同1.2.1.1。实验时处死小鼠，无菌条件下取脾脏置于洁静平皿中，用注射器针芯在100目不锈钢网上研碎过滤，用Hanks液洗涤，用含10％小牛血清RPMI1640培养液调细胞浓度为5×106个/ml。加入96孔平底培养板，每孔100μl，同时每孔加入10μg/ml的ConA 100ul。阴性对照孔以完全培养液代替ConA，每鼠设实验与对照各3孔，置37℃、5％CO2孵育培养68h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心去上清液，每孔加150μl DMSO溶解结晶，在酶联免疫检测仪上于490nm处测定OD值，计算刺激指数(SI)。
刺激指数(SI)＝试验孔OD值(阴性对照孔OD值)/空白对照孔OD值。
1.2.2对60Coγ所致的免疫低下小鼠的影响1.2.2.1模型制备及动物分组、给药剂量取小鼠80只，随机分为8组，每组12只，♀♂各半，分别为牛磺酸注射液5个剂量组(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)、甘露聚糖肽注射液组(2.5mg/kg)、模型对照组、空白对照组，其中模型对照组、空白对照组给予等容量的注射用生理盐水。各组小鼠尾静脉(iv)给药，连续7日，第8日进行实验。给药后第3天除空白对照组外，其余动物用60Coγ射线4Gy一次性全身照射造成免疫低下模型。
1.2.2.2对非特异性免疫功能的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，实验时每鼠尾静脉注射稀释均匀的印度墨汁0.05ml/10g体重，于1和5min后，分别从眼眶静脉取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，摇匀，在680nm处测定两次所取血样的光密度值(0D值)。处死小鼠，取肝、脾、胸腺称重。计算方法同1.2.1.2。
1.2.2.3对体液免疫功能的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，于给药第4天用5％的新鲜鸡血红细胞(CRBC)0.2ml/只，继续给药。于末次给药次日处死动物，摘取脾脏，用PH7.2的PBS制成5×106脾细胞悬液。取脾细胞悬液1ml、0.2％CRBC1ml及10％豚鼠血清1ml混合，37℃温育1小时，离心取上清液在413nm处测光密度OD值。
1.2.2.4对中性粒细胞吞噬功能及白细胞数量的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，实验时每鼠取抗凝血分成两份一份为20ul按常规进行白细胞计数；一份为40ul，加入已灭活处理的葡萄球菌菌液20ul充分混匀。置于铺有湿纱布的有盖容器内，在37℃温箱中温育30min。取1小滴混合液置于洁净无油污的玻片推成薄片。晾干后，无水甲醇固定2～3min。吉姆萨-瑞氏染液10min。置油镜下观察。随机计数100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的中性粒细胞数，对有吞噬作用的中性粒细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。数据处理方法同1.2.1.4。
1.2.2.5对淋巴细胞转化功能的影响模型制备及动物分组、给药剂量同1.2.2.1，实验时处死小鼠，无菌条件下取脾脏置于洁静平皿中，用注射器针芯在100目不锈钢网上研碎过滤，用Hanks液洗涤，用含10％小牛血清RPMI1640培养液调细胞浓度为5×106个/ml。加入96孔平底培养板，每孔100μl，同时每孔加入10μg/ml的ConA 100ul。阴性对照孔以完全培养液代替ConA，每鼠设实验与对照各3孔，置37℃、5％CO2孵育培养68h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心去上清液，每孔加150μl DMSO溶解结晶，在酶联免疫检测仪上于490nm处测定OD值，计算刺激指数(SI)。数据处理方法同1.2.1.5。
1.3统计学处理检测数值均以x±s表示，各组间数值比较采用t检验。
2结果2.1对环磷酰胺所致的免疫低下小鼠的影响2.1.1对非特异性免疫功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg、25mg/kg剂量组与模型组比较，廓清指数、吞噬指数均明显增高，其差别有显著性意义(p＜0.01)。对体重未见明显影响(p＞0.05)，但可明显增加免疫器官重量，其差别有意义(p＜0.05)。见表1、2。
表1 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影响(x±s)
组别剂量(mg/kg) 动物数(只) K值 α值空白对照组 - 12 0.040±0.009 6.54±0.93模型对照组 - 11 0.021±0.007 4.41±0.75甘露聚糖肽注射液2.5 12 0.031±0.013*5.01±0.76*牛磺酸注射液200 11 0.027±0.015 4.69±0.63牛磺酸注射液100 12 0.028±0.010 4.73±0.48牛磺酸注射液50 12 0.039±0.009**5.68±0.91**牛磺酸注射液25 12 0.034±0.011**5.33±0.83*牛磺酸注射液12.512 0.029±0.012 4.89±0.68注模型组与牛磺酸注射液(200mg/kg)各有一只动物亡。
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表2 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠体重、脾、胸腺指数的影响(x±s)组别 剂量 动物数 体重(g) 脾指数 胸腺指数空白对照组—— 12 26.23±2.39 3.94±0.94 2.48±0.47模型对照组—— 12 21.28±2.48 2.48±0.41 1.64±0.68甘露聚糖肽注射液 2.5mg/kg 12 22.10±2.93 2.88±0.43 2.09±0.31牛磺酸注射液 200mg/kg 12 21.80±2.12 2.42±0.70 1.85±0.31牛磺酸注射液 100mg/kg 12 21.68±2.57 2.60±0.56 1.89±0.24牛磺酸注射液 50mg/kg 12 21.82±1.52 3.01±0.40 2.21±0.36牛磺酸注射液 25mg/kg 12 21.90±1.16 2.78±0.37 2.10±0.33牛磺酸注射液 12.5mg/kg12 21.18±2.04 2.70±0.35 1.98±0.42注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.1.2对体液免疫功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg、25mg/kg剂量组与模型组比较，其差别有显著性意义(p＜0.01)。提示牛磺酸注射液50mg/kg、25mg/kg剂量组可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠体液免疫功能。结果见表3表3 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠体液免疫功能的影响(x±s)组别剂量(mg/kg) 动物数(只) OD值空白对照组 -12 0.412±0.076模型对照组 -12 0.236±0.021牛磺酸注射液200 12 0.247±0.032牛磺酸注射液100 12 0.252±0.054牛磺酸注射液50 12 0.335±0.079**牛磺酸注射液25 12 0.313±0.068**牛磺酸注射液12.5 12 0.253±0.065甘露聚糖肽注射液2.5 12 0.294±0.060*注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.1.3对中性粒细胞吞噬功能、白细胞数量的影响结果提示牛磺酸注射液50mg/kg剂量组可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠中性粒细胞吞噬功能，与模型组比较有意义(p＜0.05)。50mg/kg、25mg/kg剂量组均可增加白细胞数量，差别有意义(p＜0.05)。结果见表4。
表4 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠中性粒细胞吞噬功能、白细胞数量的影响(x±s)动物数 白细胞数量组别剂量(mg/kg)吞噬率(％)吞噬指数(只) (109个/L)空白对照组 - 10 69.22±7.92 3.47±0.59 9.64±1.0252模型对照组 - 10 47.29±3.77 2.85±0.24 4.23±0.38牛磺酸注射液200 10 46.21±4.26 2.78±0.34 4.52±0.57牛磺酸注射液100 10 44.63±4.31 2.14±0.31 4.38±0.81牛磺酸注射液50 10 58.23±2.53** 3.16±0.13**5.73±0.64牛磺酸注射液25 10 50.18±4.82* 2.35±0.36**5.44±0.87牛磺酸注射液12.510 45.36±2.55 2.94±0.42 5.36±0.58甘露聚糖肽注射液2.5 10 56.44±3.13* 2.68±0.41**6.82±1.052.1.4对淋巴细胞转化功能的影响牛磺酸注射液100mg/kg、50mg/kg剂量组可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠淋巴细胞增殖转化功能，与模型组比较有意义(p＜0.05)。
表5 对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响组别 剂量(mg/kg)动物数(只)刺激指数(SI)空白对照组 -10 2.17±0.29模型对照组 -10 1.12±0.19牛磺酸注射液200 10 1.23±0.28牛磺酸注射液100 10 1.26±0.34牛磺酸注射液50 10 1.95±0.38*牛磺酸注射液25 10 1.67±0.21牛磺酸注射液12.5 10 1.41±0.23甘露聚糖肽注射液2.5 10 1.73±0.25*2.2对60Coγ所致的免疫低下小鼠的免疫功能的影响2.2.1对非特异性免疫功能的影响牛磺酸注射液100mg/kg、50mg/kg剂量组可明显提高60Coγ所致的免疫低下小鼠的碳粒廓清指数，增加免疫器官重量(50mg/kg，脾指数)，其差别有意义(p＜0.05)，对体重未见明显影响(p＞0.05)。
表6 对60Coγ所致免疫低下荷瘤小鼠非特异性免疫功能的影响(x±s)
组别 剂量 动物数 廓清指数 吞噬指数空白对照组 ——12 0.0431±0.0085 7.01±0.87模型对照组 ——11 0.0324±0.0085 5.95±0.53甘露聚糖肽注射液 2.5mg/kg 12 0.0422±0.0104*6.33±0.97牛磺酸注射液 100mg/kg 12 0.0417±0.0112*6.08±0.74牛磺酸注射液 50mg/kg 12 0.0456±0.0082** 6.52±0.69*牛磺酸注射液 25mg/kg 12 0.0403±0.0137 6.29±0.85注模型组有一只动物死亡。与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01表7 对60Coγ所致免疫低下荷瘤小鼠体重、瘤重、脾、胸腺指数的影响(x±s)组别 剂量 动物数 体重(g) 脾指数 胸腺指数空白对照组 —— 12 26.18±2.39 3.94±0.94 2.48±0.47模型对照组 —— 11 21.03±2.48 2.48±0.41 1.59±0.44甘露聚糖肽注射液 2.5mg/kg 12 22.10±2.93 2.88±0.43 2.09±0.31牛磺酸注射液 100mg/kg 12 21.68±2.57 2.60±0.56 1.81±0.24牛磺酸注射液 50mg/kg12 21.92±1.52 3.11±0.40* 2.25±0.36*牛磺酸注射液 25mg/kg12 21.41±1.16 2.78±0.37 2.06±0.33注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.012.2.2对体液免疫功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg、100mg/kg剂量组可明显提高60Coγ照射所致免疫低下小鼠的体液免疫功能，与模型组相比有意义(p＜0.05)。
表8 对60Coγ所致免疫低下小鼠体液免疫功能的影响组别 剂量(mg/kg)动物数(只)OD空白对照组 - 120.396±0.059模型对照组 - 120.197±0.038甘露聚糖肽注射液 2.5120.279±0.041*牛磺酸注射液 100120.286±0.036*牛磺酸注射液 50 120.319±0.063**牛磺酸注射液 25 120.237±0.028注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2.3对中性粒细胞吞噬功能、白细胞数量的影响牛磺酸注射液50mg/kg、100mg/kg剂量组可明显提高60Coγ所致的免疫低下小鼠的中性粒细胞的吞噬功能，增加白细胞数量，与模型对照组相比较其差别有意义(50mg/kg，p＜0.05)。
表9 对60Coγ所致免疫低下小鼠中性粒细胞、白细胞数量吞噬功能的影响剂量 动物数白细胞数量(109组别吞噬率(％) 吞噬指数(mg/kg) (只) 个/L)空白对照组-12 67.3±5.64.06±0.67 9.41±2.13模型对照组-12 42.3±5.12.14±0.49 3.83±1.49甘露聚糖肽注射液 2.5 12 51.4±5.7* 3.08±0.58* 6.51±2.35**牛磺酸注射液 100 12 50.6±6.7* 3.16±0.45* 4.62±2.16牛磺酸注射液 50 12 59.2±5.9** 3.53±0.33**5.93±1.84**牛磺酸注射液 25 12 46.1±7.92.65±0.47 5.04±1.26*注与模型组比较*P＜0 05，**P＜0.012.2.4对脾淋巴细胞转化功能的影响牛磺酸注射液50mg/kg剂量组可明显提高60Coγ所致免疫低下小鼠淋巴增殖细胞转化功能。
表10 对60Coγ所致免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响组别 剂量(mg/kg)动物数(只)刺激指数(SI)空白对照组 - 122.33±0.45模型对照组 - 121.34±0.53甘露聚糖肽注射液 2.5121.92±0.48*牛磺酸注射液 100121.96±0.62*牛磺酸注射液 50 122.07±0.46**牛磺酸注射液 25 121.87±0.39*注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.013、讨论牛磺酸是人及动物体内一种含硫的氨基酸，对维持人和动物正常生理功能具有十分重要的作用。有关研究表明其具有保护淋巴细胞并可促进增殖产生抗体的作用，还可促进巨噬细胞产生白细胞介素，与中性粒细胞的吞噬功能密切相关，在机体防御中起重要的作用。以上实验结果表明，牛磺酸注射液可明显增加环磷酰胺、60Coγ照射所致的免疫功能低下小鼠的碳粒廓清速度、增加白细胞的数量及免疫器官(脾、胸腺)的重量、提高血清溶血素抗体含量、增强中性粒细胞的吞噬功能和脾淋巴细胞的转化功能。说明牛磺酸可明显提高免疫功能低下患者的免疫能力和升高其白细胞的功能，是一种很好的免疫佐剂。
具体实施方式
1实施例1取牛磺酸配成水溶性针剂，5ml(含牛磺酸400mg)/支，与250ml5％葡萄糖溶液混匀后静脉滴注。每日一次。
2实施例2取牛磺酸加入到5％的葡萄糖溶液中，250ml(含牛磺酸500mg)/瓶，混匀后静脉滴注。每日一次。
3实施例3取牛磺酸与丙二醇及乳化剂等混合成乳液，10ml(含牛磺酸400mg)/支，与生理盐水混匀后，静脉滴注，每日一次。
4实施例4强白能注射液，主要成份为牛磺酸，规格5ml∶300mg。临用前与250ml5％葡萄糖溶液混匀后静脉滴注，每日一次，以两周为一个疗程，或遵医嘱。
5实施例5强白能输液，主要成份为牛磺酸，规格250ml∶300mg。静脉滴注，每日一次，两周一个疗程。
6实施例6强白能注射液，主要成份为牛磺酸，规格5ml∶300mg。肌肉注射，每日一次，两周一个疗程。
权利要求
1.牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用。
2.根据权利要求1所述的牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用，其特征在于所述的牛磺酸为水溶性注射液、悬浊液或乳化液。
3.根据权利要求1或2所述的牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用，其特征在于所述的牛磺酸用量为1-15mg/kg.d。
全文摘要
本发明涉及牛磺酸在制药上的新用途，特别涉及牛磺酸在制备增强白细胞功能药物上的应用，本发明的牛磺酸可以为水溶性注射液、悬浊液或乳化液，牛磺酸最佳用量为1－15mg/kg.d。牛磺酸注射液可明显增加环磷酰胺文档编号A61P7/00GK1528282SQ03139080
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者于保法 申请人:济南开发区保法药物研究所
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