抗SARS病毒的特异性抗体IgY及制备方法与含有该抗体的组合物及用途的制作方法
专利名称：抗SARS病毒的特异性抗体IgY及制备方法与含有该抗体的组合物及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性抗体IgY的制备和应用，特别是抗SARS病毒的特异性抗体IgY及制备方法与含有该抗体的抗SARS组合物及用途。
背景技术：
非典型性肺炎(又称严重急性呼吸系统综合症，Severe Acute RespiratorySyndrome，缩写SARS)于2003年初在全球多个国家和地区爆发和扩散，引起各国政府和人民的广泛关注。2003年4月16日，世界卫生组织(WHO)正式宣布一种人类过去从未发现的新型冠状病毒为SARS的病原体。经初步研究表明，该SARS冠状病毒主要是经呼吸道传播。目前对这一新的烈性传染性病毒除用体外常规消毒灭菌、防卫隔离等措施外，对机体还没有特异性预防方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗SARS病毒特异性IgY及其制备方法，使该抗体的生产成本降低、可规模化生产且周期短、抗体效价高。同时，提供以本发明的IgY作为有效成份制备的抗SARS病毒的组合物，并将该组合物应用于制造预防、诊断和治疗SARS的任意剂型，包括喷雾剂、口服剂及诊断制剂等。
本发明所述的抗SARS病毒的特异性抗体IgY，它是用SARS病毒抗原免疫下蛋鸡，从鸡蛋黄中分离纯化制得的特异性抗体IgY。
本发明所述的一种抗SARS病毒的特异性抗体IgY的制备方法，包括SARS病毒抗原制备、免疫母鸡、IgY的提取等，以灭活SARS病毒或其基因工程疫苗作为抗原，用水稀释法、盐析法、CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析、PS6FF疏水层析柱层析提取IgY。
本发明所述的抗SARS病毒特异性IgY的制备方法如下所述病毒抗原悬液的制备将SARS冠状病毒，接种于Vero单层细胞瓶内，放37℃温箱内培养，待细胞病变明显(++++)时，收获病毒液，于取出无菌试验和病毒滴度样品后，加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过0.05％，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过0.01％。
病毒滴度用EMEM将病毒悬液作10倍递增稀释为104～10-8，然后将各SARS冠状病毒的稀释液分别接种于Vero单层细胞微置培养板。每种稀释度各接种4孔细胞，200μl/孔。同时作不加病毒的细胞对照。放入37℃，5％CO2温箱内培养。每日在倒置显微镜下观察细胞病变，并作详细记录。至第7天最后判定结果。按Reed-Muench累积法计算SARS病毒的TCID50(半数组织培养特感染量/0.2ml)。
灭活试验将灭活处理病毒悬液置于4℃，透析24h后，接种Vero细胞，每ml样品接种不少于是3m2细胞片，置培养病毒的温度下培育14天，不得有细胞病变出现。
本发明应用了新型正电荷脂质体-DC胆固醇(2.5mg/ml)为免疫佐剂，使用前将其病毒悬液混合，DC-胆固醇终浓度达到1.6mg/ml。
SARS病毒抗原，将灭活病毒悬液，5～10倍稀释，与脂质体或福氏佐剂混合，制得免疫用的病毒抗原。
每次取上述灭活本病毒抗原1.0ml含佐剂，对母鸡进行皮下或肌肉注射，分别于0，14和21天注射免疫；也可取灭活本病毒抗原2.5～5ml，对每鸡翅静脉注射，可分别于0，7，21天进行免疫。
收集免疫鸡蛋，取出蛋黄，搅拌均匀，加入6～7倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值至5.0～5.3，在3～5℃温度下，搅拌过夜，高速离心，30分钟，取其上清液，再用50％饱合硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次，以ELISA检测抗体活性，采用SDS-PAGE法测定纯度，Lowry法测定蛋白浓度。本发明IgY纯度达97％，产量18.0mg/ml。
将经水稀法、盐析法提取的抗SARS病毒IgY再进行CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析。用pH5.5、10～50mM PBS平衡，用含0.5M NaCl、pH5.5磷酸缓冲液进行洗脱，流速10～500cm/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集，收集0.03～0.1M NaCl蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性。将有抗体活性蛋白洗脱液进一步经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(PS6FF)疏水层析柱层析。用含1M硫酸铵pH5.0、25mM PBS溶液平衡，流速10～500cm/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集，用10～50mM、pH5.5、PBS缓冲液洗脱，收集80％～100％B液蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性。收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗SARS病毒IgY纯品。
IgY中和实验将纯化特异性IgY用EMEM作2倍递增稀释之后，分别与待感染SARS冠状病毒(TCID100)37℃温育2h。在试验前1～2天，将Vero传代细胞株接种于96孔细胞培养板，放37℃，5％CO2温箱培育，使其生长成均匀致密的单层细胞。试验时取出，倒去细胞培养液，用Hanks液洗一次。用微量加样器取上述IgY抗-病毒混合液，分别加入细胞培养板孔内，每种抗体病毒混合物分别加2孔，每孔0.2ml。同时做阳性抗体(IgY)对照(1∶2)，细胞对照及SARS冠状病毒对照。将细胞培养板放入37℃，5％CO2温箱内培养。每日在倒置显微镜下观察结果，共观察3～5天。至病毒对照各孔细胞病变明显(++～++++)，阳性抗体对照孔及细胞对照孔正常，即可判定结果。以待检特异性IgY抗体最高稀释度仍能抑制细胞病变出现，即为中和抗体效价。本发明IgY中和抗体效价≥1∶128。
本发明IgY制备技术生产成本低、周期短、抗体效价高、稳定，对SARS病毒有较强特异中和活性，而且作用迅速。
本发明所述的一种抗SARS的组合物，含有所述的抗SARS病毒的特异性抗体IgY作为有效成分。
本发明所述的一种抗SARS的组合物的用途，该抗SARS的组合物应用于制造预防、诊断和治疗SARS的任意剂型的制剂。
本发明所述的所述的抗SARS的组合物为液体，装入小型携带式喷雾罐中，可进行呼吸道、口腔喷雾使用。
用本发明抗SARS病毒特异性IgY作为有效特异成份可制备多种组合物，应用于预防、诊断、治疗SARS疾病。如以本发明抗SARS病毒特异性IgY作为主要成份和一定比例的蒸馏水，天然薄荷脑、甜味剂、食用香精及苯甲酸钠制备的组合物，可将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用，具有使用安全、方便，IgY发挥作用特异、快速、预防效果好等特点，能有效预防SARS病毒经呼吸道感染的发生。
本发明所述的一种抗SARS的组合物的用途，所述的抗SARS的组合物应用于制备预防SARS的食品、饮料和保健品。
研究表明，人体消化道也是SARS病毒的感染途径之一。将本发明所述的抗SARS的组合物制备成食品、饮料和保健品，可以达到预防、减少消化道感染率的效果。
具体实施例方式
本发明将通过以下实施例作进一步的描述一、抗SARS-IgY的制备实施例1在P3条件下，将SARS冠状病毒种与Vero细胞数按一定比例接种，放37℃，CO2温箱培养，7天后，收集病毒液，进行病毒滴度测定，过滤纯化，甲醛灭活，灭活安全实验后，获得灭活SARS病毒悬液(TCID50为10-6.67)。然后与一定量指质体佐剂混合，制得灭活SARS病毒抗原。
于蛋鸡皮下免疫的注射，每点0.25ml，每只蛋鸡1ml，免疫时间为0天，14天，21天，三次免疫。于第一次免疫20天后，开始收集鸡蛋。在溶器中放入蛋黄，搅拌均匀后，加入6～7倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值5.0～5.3，4℃搅拌过夜(12小时)。8000rpm离心30分钟，取上清液，获得粗分离的IgY。经50％饱和硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次，获得纯化的IgY，如需要可用阳离子层析柱层析、疏水层析柱层析进一步提取，并以ELISA试剂盒检测各蛋白的抗体效价。用0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥。
实施例2将具有良好预防作用的SARS病毒基因工程疫苗，于蛋鸡肌肉免疫注射，每只蛋鸡1ml，免疫时间为0，14，21天，共三次免疫。于第一次免疫20天后，开始收集鸡蛋，搅拌均匀，加入6～7倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值5.0～5.3，4℃搅拌过夜。8000rpm离心30分钟，取上清液，获得粗分离的IgY，经50％饱和硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次，获得纯化的IgY，并以ELISA试剂盒检测各蛋白的抗体活性，用0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥。
二、抗SARS组合物产品的制备实施例3含抗SARS特异性IgY喷雾剂的制备取本发明IgY2.0，天然薄荷脑0.10g，苯甲酸钠0.10g，甜味剂0.5g，食用香精0.4ml。将天然薄荷加入100ml的蒸馏水中，60℃溶化；其它固体成份溶解于450ml蒸馏水不，然后将各种溶解的液体混合均匀，用蒸馏水定容至1000ml。分装于小型携带式喷雾罐中，可有效预防SARS病毒经呼吸道感染的发生。
实施例4诊断用检测SARS病源的制剂和方法用本发明特异性IgY抗体制备检测SARS病源的主要制剂组成为具有抗SARS病毒特异性IgY抗体包被的微孔板，酶标记抗SARS病毒特异性抗体HRP—抗SARS-IgY。前者工作浓度为1∶300～3000；后者工作浓度为1∶300～1500。其方法包括以下步骤将用本发明特异性IgY抗体包被于固相载体上，洗涤、封板后，加入待检样品(如血清、唾液)，然后加入酶标记特异性抗体HRP-抗SARS-IgY，洗涤后加入底物显色液显色，加终止液终止反应，比色判定结果。本制剂具有检测特异、操作简单、快速、实用，适合各基层医疗单位使用。
实施例5含抗SARS IgY的酸乳和冰淇淋的生产将根据实施例1或2方案生产的鸡蛋黄分离出来，按5％的比例加入到酸乳和冰淇淋的配方中，制成含有抗SARSIgY的食品，通过食用来预防、减少消化道感染率。
实施例6含抗SARS IgY的牛奶的生产将根据实施例1或2方案生产的鸡蛋黄分离出来，按5％的比例加入到牛奶中，制成含有抗SARS IgY的饮料，通过饮用来预防、减少消化道感染率。
实施例7含抗SARS病毒IgY蛋黄粉胶囊将上述实施例1或2方案生产的鸡蛋黄分离出来，收集起来离心，进行冷冻干燥，制成蛋黄粉，装入胶囊，作为口服的保健品，通过服用来预防、减少消化道感染率。
权利要求
1.抗SARS病毒的特异性抗体IgY，其特征在于它是用SARS病毒抗原免疫下蛋鸡，从鸡蛋黄中分离纯化制得的特异性抗体IgY。
2.一种抗SARS病毒的特异性抗体IgY的制备方法，包括SARS病毒抗原制备、免疫母鸡、IgY的提取等，其特征在于以灭活SARS病毒或其基因工程疫苗作为抗原，用水稀释法、盐析法、CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析、PS6FF疏水层析柱层析提取IgY。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的水稀释法提取IgY粗品时，用6～7倍体积蒸馏水搅拌稀释蛋黄，调节pH值至5.0～5.3，在4℃温度下，搅拌12～24小时，常规离心20～30分钟。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的盐析法选用50％饱和硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析的洗脱液为0.5M NaCl、pH5.5的磷酸缓冲液。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的PS6FF疏水层析柱层析的洗脱液为10～50mM、pH5.5的PBS缓冲液洗脱。
7.一种抗SARS的组合物，其特征在于含有如权利要求1所述的抗SARS病毒的特异性抗体IgY作为有效成分。
8.一种抗SARS的组合物的用途，其特征在于权利要求7所述的抗SARS的组合物应用于制备预防、诊断和治疗SARS的任意剂型的制剂。
9.根据权利要求8所述的抗SARS的组合物的用途，其特征在于所述的抗SARS的组合物为液体，装入小型携带式喷雾罐中，可进行呼吸道、口腔喷雾使用。
10.一种抗SARS的组合物的用途，其特征在于权利要求7所述的抗SARS的组合物应用于制备预防SARS的食品、饮料和保健品。
全文摘要
本发明提供了用灭活的SARS病原体冠状病毒或其基因工程疫苗作为抗原，脂质体作为佐剂，免疫蛋鸡，以生产含有抗SARS抗原体的特异性抗体－IgY以及用上述抗体制备用于预防SARS的喷雾剂、口服制剂及诊断用制剂。本发明同时提供了用水稀释法、盐析法、CM－Sephadex C－50阳离子层析柱层析、PS6FF疏水层析柱层析从蛋黄中分离、提取IgY工艺和检测方法。本发明提供的IgY和含有该IgY的组合物，具有生产成本低、抗体效价高，抗体理化性质稳定，对SARS冠状病毒具有较强的免疫中和活性及使用安全，发挥效力迅速等特点，可有效地预防SARS及冠状病毒引起的其它疾病的发生。
文档编号A61P31/00GK1488645SQ0313971
公开日2004年4月14日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者孔祥平, 刘光泽, 易学瑞, 佟明华, 杨联萍, 李茹冰, 曾平鲁 申请人:中国人民解放军空军广州医院肝病研究所, 中国人民解放军空军广州医院肝病研究
技术领域：
本发明涉及特异性抗体IgY的制备和应用，特别是抗SARS病毒的特异性抗体IgY及制备方法与含有该抗体的抗SARS组合物及用途。
背景技术：
非典型性肺炎(又称严重急性呼吸系统综合症，Severe Acute RespiratorySyndrome，缩写SARS)于2003年初在全球多个国家和地区爆发和扩散，引起各国政府和人民的广泛关注。2003年4月16日，世界卫生组织(WHO)正式宣布一种人类过去从未发现的新型冠状病毒为SARS的病原体。经初步研究表明，该SARS冠状病毒主要是经呼吸道传播。目前对这一新的烈性传染性病毒除用体外常规消毒灭菌、防卫隔离等措施外，对机体还没有特异性预防方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗SARS病毒特异性IgY及其制备方法，使该抗体的生产成本降低、可规模化生产且周期短、抗体效价高。同时，提供以本发明的IgY作为有效成份制备的抗SARS病毒的组合物，并将该组合物应用于制造预防、诊断和治疗SARS的任意剂型，包括喷雾剂、口服剂及诊断制剂等。
本发明所述的抗SARS病毒的特异性抗体IgY，它是用SARS病毒抗原免疫下蛋鸡，从鸡蛋黄中分离纯化制得的特异性抗体IgY。
本发明所述的一种抗SARS病毒的特异性抗体IgY的制备方法，包括SARS病毒抗原制备、免疫母鸡、IgY的提取等，以灭活SARS病毒或其基因工程疫苗作为抗原，用水稀释法、盐析法、CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析、PS6FF疏水层析柱层析提取IgY。
本发明所述的抗SARS病毒特异性IgY的制备方法如下所述病毒抗原悬液的制备将SARS冠状病毒，接种于Vero单层细胞瓶内，放37℃温箱内培养，待细胞病变明显(++++)时，收获病毒液，于取出无菌试验和病毒滴度样品后，加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过0.05％，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过0.01％。
病毒滴度用EMEM将病毒悬液作10倍递增稀释为104～10-8，然后将各SARS冠状病毒的稀释液分别接种于Vero单层细胞微置培养板。每种稀释度各接种4孔细胞，200μl/孔。同时作不加病毒的细胞对照。放入37℃，5％CO2温箱内培养。每日在倒置显微镜下观察细胞病变，并作详细记录。至第7天最后判定结果。按Reed-Muench累积法计算SARS病毒的TCID50(半数组织培养特感染量/0.2ml)。
灭活试验将灭活处理病毒悬液置于4℃，透析24h后，接种Vero细胞，每ml样品接种不少于是3m2细胞片，置培养病毒的温度下培育14天，不得有细胞病变出现。
本发明应用了新型正电荷脂质体-DC胆固醇(2.5mg/ml)为免疫佐剂，使用前将其病毒悬液混合，DC-胆固醇终浓度达到1.6mg/ml。
SARS病毒抗原，将灭活病毒悬液，5～10倍稀释，与脂质体或福氏佐剂混合，制得免疫用的病毒抗原。
每次取上述灭活本病毒抗原1.0ml含佐剂，对母鸡进行皮下或肌肉注射，分别于0，14和21天注射免疫；也可取灭活本病毒抗原2.5～5ml，对每鸡翅静脉注射，可分别于0，7，21天进行免疫。
收集免疫鸡蛋，取出蛋黄，搅拌均匀，加入6～7倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值至5.0～5.3，在3～5℃温度下，搅拌过夜，高速离心，30分钟，取其上清液，再用50％饱合硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次，以ELISA检测抗体活性，采用SDS-PAGE法测定纯度，Lowry法测定蛋白浓度。本发明IgY纯度达97％，产量18.0mg/ml。
将经水稀法、盐析法提取的抗SARS病毒IgY再进行CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析。用pH5.5、10～50mM PBS平衡，用含0.5M NaCl、pH5.5磷酸缓冲液进行洗脱，流速10～500cm/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集，收集0.03～0.1M NaCl蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性。将有抗体活性蛋白洗脱液进一步经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(PS6FF)疏水层析柱层析。用含1M硫酸铵pH5.0、25mM PBS溶液平衡，流速10～500cm/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集，用10～50mM、pH5.5、PBS缓冲液洗脱，收集80％～100％B液蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性。收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗SARS病毒IgY纯品。
IgY中和实验将纯化特异性IgY用EMEM作2倍递增稀释之后，分别与待感染SARS冠状病毒(TCID100)37℃温育2h。在试验前1～2天，将Vero传代细胞株接种于96孔细胞培养板，放37℃，5％CO2温箱培育，使其生长成均匀致密的单层细胞。试验时取出，倒去细胞培养液，用Hanks液洗一次。用微量加样器取上述IgY抗-病毒混合液，分别加入细胞培养板孔内，每种抗体病毒混合物分别加2孔，每孔0.2ml。同时做阳性抗体(IgY)对照(1∶2)，细胞对照及SARS冠状病毒对照。将细胞培养板放入37℃，5％CO2温箱内培养。每日在倒置显微镜下观察结果，共观察3～5天。至病毒对照各孔细胞病变明显(++～++++)，阳性抗体对照孔及细胞对照孔正常，即可判定结果。以待检特异性IgY抗体最高稀释度仍能抑制细胞病变出现，即为中和抗体效价。本发明IgY中和抗体效价≥1∶128。
本发明IgY制备技术生产成本低、周期短、抗体效价高、稳定，对SARS病毒有较强特异中和活性，而且作用迅速。
本发明所述的一种抗SARS的组合物，含有所述的抗SARS病毒的特异性抗体IgY作为有效成分。
本发明所述的一种抗SARS的组合物的用途，该抗SARS的组合物应用于制造预防、诊断和治疗SARS的任意剂型的制剂。
本发明所述的所述的抗SARS的组合物为液体，装入小型携带式喷雾罐中，可进行呼吸道、口腔喷雾使用。
用本发明抗SARS病毒特异性IgY作为有效特异成份可制备多种组合物，应用于预防、诊断、治疗SARS疾病。如以本发明抗SARS病毒特异性IgY作为主要成份和一定比例的蒸馏水，天然薄荷脑、甜味剂、食用香精及苯甲酸钠制备的组合物，可将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用，具有使用安全、方便，IgY发挥作用特异、快速、预防效果好等特点，能有效预防SARS病毒经呼吸道感染的发生。
本发明所述的一种抗SARS的组合物的用途，所述的抗SARS的组合物应用于制备预防SARS的食品、饮料和保健品。
研究表明，人体消化道也是SARS病毒的感染途径之一。将本发明所述的抗SARS的组合物制备成食品、饮料和保健品，可以达到预防、减少消化道感染率的效果。
具体实施例方式
本发明将通过以下实施例作进一步的描述一、抗SARS-IgY的制备实施例1在P3条件下，将SARS冠状病毒种与Vero细胞数按一定比例接种，放37℃，CO2温箱培养，7天后，收集病毒液，进行病毒滴度测定，过滤纯化，甲醛灭活，灭活安全实验后，获得灭活SARS病毒悬液(TCID50为10-6.67)。然后与一定量指质体佐剂混合，制得灭活SARS病毒抗原。
于蛋鸡皮下免疫的注射，每点0.25ml，每只蛋鸡1ml，免疫时间为0天，14天，21天，三次免疫。于第一次免疫20天后，开始收集鸡蛋。在溶器中放入蛋黄，搅拌均匀后，加入6～7倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值5.0～5.3，4℃搅拌过夜(12小时)。8000rpm离心30分钟，取上清液，获得粗分离的IgY。经50％饱和硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次，获得纯化的IgY，如需要可用阳离子层析柱层析、疏水层析柱层析进一步提取，并以ELISA试剂盒检测各蛋白的抗体效价。用0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥。
实施例2将具有良好预防作用的SARS病毒基因工程疫苗，于蛋鸡肌肉免疫注射，每只蛋鸡1ml，免疫时间为0，14，21天，共三次免疫。于第一次免疫20天后，开始收集鸡蛋，搅拌均匀，加入6～7倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值5.0～5.3，4℃搅拌过夜。8000rpm离心30分钟，取上清液，获得粗分离的IgY，经50％饱和硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次，获得纯化的IgY，并以ELISA试剂盒检测各蛋白的抗体活性，用0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥。
二、抗SARS组合物产品的制备实施例3含抗SARS特异性IgY喷雾剂的制备取本发明IgY2.0，天然薄荷脑0.10g，苯甲酸钠0.10g，甜味剂0.5g，食用香精0.4ml。将天然薄荷加入100ml的蒸馏水中，60℃溶化；其它固体成份溶解于450ml蒸馏水不，然后将各种溶解的液体混合均匀，用蒸馏水定容至1000ml。分装于小型携带式喷雾罐中，可有效预防SARS病毒经呼吸道感染的发生。
实施例4诊断用检测SARS病源的制剂和方法用本发明特异性IgY抗体制备检测SARS病源的主要制剂组成为具有抗SARS病毒特异性IgY抗体包被的微孔板，酶标记抗SARS病毒特异性抗体HRP—抗SARS-IgY。前者工作浓度为1∶300～3000；后者工作浓度为1∶300～1500。其方法包括以下步骤将用本发明特异性IgY抗体包被于固相载体上，洗涤、封板后，加入待检样品(如血清、唾液)，然后加入酶标记特异性抗体HRP-抗SARS-IgY，洗涤后加入底物显色液显色，加终止液终止反应，比色判定结果。本制剂具有检测特异、操作简单、快速、实用，适合各基层医疗单位使用。
实施例5含抗SARS IgY的酸乳和冰淇淋的生产将根据实施例1或2方案生产的鸡蛋黄分离出来，按5％的比例加入到酸乳和冰淇淋的配方中，制成含有抗SARSIgY的食品，通过食用来预防、减少消化道感染率。
实施例6含抗SARS IgY的牛奶的生产将根据实施例1或2方案生产的鸡蛋黄分离出来，按5％的比例加入到牛奶中，制成含有抗SARS IgY的饮料，通过饮用来预防、减少消化道感染率。
实施例7含抗SARS病毒IgY蛋黄粉胶囊将上述实施例1或2方案生产的鸡蛋黄分离出来，收集起来离心，进行冷冻干燥，制成蛋黄粉，装入胶囊，作为口服的保健品，通过服用来预防、减少消化道感染率。
权利要求
1.抗SARS病毒的特异性抗体IgY，其特征在于它是用SARS病毒抗原免疫下蛋鸡，从鸡蛋黄中分离纯化制得的特异性抗体IgY。
2.一种抗SARS病毒的特异性抗体IgY的制备方法，包括SARS病毒抗原制备、免疫母鸡、IgY的提取等，其特征在于以灭活SARS病毒或其基因工程疫苗作为抗原，用水稀释法、盐析法、CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析、PS6FF疏水层析柱层析提取IgY。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的水稀释法提取IgY粗品时，用6～7倍体积蒸馏水搅拌稀释蛋黄，调节pH值至5.0～5.3，在4℃温度下，搅拌12～24小时，常规离心20～30分钟。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的盐析法选用50％饱和硫酸铵沉淀一次，再用33％饱和硫酸铵沉淀一次。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的CM-Sephadex C-50阳离子层析柱层析的洗脱液为0.5M NaCl、pH5.5的磷酸缓冲液。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的PS6FF疏水层析柱层析的洗脱液为10～50mM、pH5.5的PBS缓冲液洗脱。
7.一种抗SARS的组合物，其特征在于含有如权利要求1所述的抗SARS病毒的特异性抗体IgY作为有效成分。
8.一种抗SARS的组合物的用途，其特征在于权利要求7所述的抗SARS的组合物应用于制备预防、诊断和治疗SARS的任意剂型的制剂。
9.根据权利要求8所述的抗SARS的组合物的用途，其特征在于所述的抗SARS的组合物为液体，装入小型携带式喷雾罐中，可进行呼吸道、口腔喷雾使用。
10.一种抗SARS的组合物的用途，其特征在于权利要求7所述的抗SARS的组合物应用于制备预防SARS的食品、饮料和保健品。
全文摘要
本发明提供了用灭活的SARS病原体冠状病毒或其基因工程疫苗作为抗原，脂质体作为佐剂，免疫蛋鸡，以生产含有抗SARS抗原体的特异性抗体－IgY以及用上述抗体制备用于预防SARS的喷雾剂、口服制剂及诊断用制剂。本发明同时提供了用水稀释法、盐析法、CM－Sephadex C－50阳离子层析柱层析、PS6FF疏水层析柱层析从蛋黄中分离、提取IgY工艺和检测方法。本发明提供的IgY和含有该IgY的组合物，具有生产成本低、抗体效价高，抗体理化性质稳定，对SARS冠状病毒具有较强的免疫中和活性及使用安全，发挥效力迅速等特点，可有效地预防SARS及冠状病毒引起的其它疾病的发生。
文档编号A61P31/00GK1488645SQ0313971
公开日2004年4月14日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者孔祥平, 刘光泽, 易学瑞, 佟明华, 杨联萍, 李茹冰, 曾平鲁 申请人:中国人民解放军空军广州医院肝病研究所, 中国人民解放军空军广州医院肝病研究
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