一种人工组织工程化的生物角膜的制作方法
专利名称：一种人工组织工程化的生物角膜的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于构建组织工程化生物角膜的构建载体。
组织工程学是一门运用工程学与生命科学的原理和方法，它通过不同的组织构建方式使细胞与载体结合，构成具有特定的三维结构和生物活性的人工组织或器官，用于替代或修复人体的病损器官和组织，达到恢复组织形态与功能的目的。标志着医学将超越组织和器官移植的旧模式，进入人工制造组织和器官的时代，通过组织工程手段构建人工组织工程化生物角膜将解决或缓解此供需矛盾。通过组织工程构建组织的必需原料是构建载体和种子细胞。
目前制约组织工程化生物角膜研究的瓶颈是构建载体，由于角膜独特的生理和光学特性，要求用于构建生物角膜基质必须具有(1)适合细胞生长和粘附的微环境；(2)稳定的角膜厚度和角膜曲率，以维持屈光度稳定；(3)高透明度；(4)适度地强度和弹性；(5)良好的神经支配。否则，将影响生物角膜的临床应用和效果。
但是目前构建角膜或与角膜类似的组织工程化组织的载体高分子材料和胶原均不能满足上述要求1)以高分子材料为载体构建的角膜不但透明差，而且不能建立角膜神经支配，如Mimami等(1993)用人工合成基质构建的三维牛角膜，就是由于人工基质的缺陷(不透明和抗拉力弱)，不能用于移植(Mimami Y，et al.Reconstruction of cornea in three-dimensionalcollagen gel matrix culture.Invest Ophthalmol Vis Sci.1993；34(7)2316.)。研究也发现聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)类等材料的透明度和稳定性差，需要进一步改进，若用于构建组织工程化生物角膜需要进一步改进(商庆新、胡晓洁、曹宜林组织工程技术构建角膜基质层的实验研究，中华眼科杂志，2001，37252)。
2)胶原合成基质载体构建的角膜强度更差。Griffith等(1999)利用转基因技术建立“永生化”细胞系在实验室成功重组了功能、结构与正常角膜相似的生物角膜，被“science”杂志誉为人类角膜生物组织工程和组织移植中的最大突破和里程碑(Griffith M，et al.Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.Science 1999；286(5447)2169-72.)，也是由于强度不够，未能进行动物实验，离临床应用的要求相差就更远了，另外由于胶原易被胶原酶消化，因此不稳定，进而影响角膜的光学性能和移植细胞的长期存活。
正常的角膜基质是角膜细胞正常附着和长期存活的基础，健康的角膜缘基质形成了稳定的细胞“龛”，支持了角膜缘干细胞正常分化和增殖，这是高分子材料和胶原载体所不具备的优势。Lange等(1993)用牛Descemet′s膜为载体将角膜内皮细胞移植到新西兰白兔，所有植片保持透明12-17天(Lange-TM，et al.Corneal endothelial celltransplantation using Descemet′s membrane as a carrier.J-Cataract-Refract-Surg.1993；19(2)232-5.)，Bohnke等(1998，1999)用Descemet′s膜为载体，也成功地将人和猪角膜内皮细胞移植到人眼(Bohnke-M，et al.Detection of neurone-specific enolase in long-termcultures of human corneal endothelium.Graefes Arch Clin ExpOphthalmol.1998；236(7)522-6.及Bohnke-M，et al.Transplantation ofcultured adult human or porcine corneal endothelial cells onto humanrecipients in vitro.Part IIEvaluation in the scanning electron microscope.Cornea.1999；18(2)207-13.)。自1994年开始，我们对异种角膜基质免疫原性、移植后角膜神经恢复、植床组织学变化、移植后不同时期角膜透明度、屈光度和厚度变化等方面进行了系列研究，结果发现角膜基质的免疫原性很低，异种移植后角膜基质的厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入，角膜知觉大部恢复，上皮细胞粘附牢固，细胞间和细胞与基质问生理连接正常，将猴角膜基质植入人角膜层间，已维持透明近10年，表明利用异种角膜基质是目前最理想的构建角膜载体。
构建技术方面，目前国内外构建组织工程化生物角膜的主要方法是气-液界面和三维立体培养，Zieske等(1994)报道重组的三维角膜移植后，细胞有半桥粒、锚纤维和连续的基底膜形成，α烯醇酶和K3的分布与正常角膜缘完全相同(Zieske JD，et al.Basement membraneassembly and differentiation of cultured corneal cellsimportance ofculture environment and endothelial cell interaction.Exp Cell Res.1994；214621-33.)。Engelmann等(1999)分别取得猪和人内皮细胞达3,450/mm2和1,850/mm2的最大终密度(Engelmann K，et al.Transplantation of adult human or porcine comeal endothelial cells ontohuman recipients in vitro.Part ICell culturing and transplantationprocedure.Cornea.1999；18199-206.)。
本发明所述的人工组织工程化生物角膜，按照以下方法制备取新鲜、脱细胞处理或保存后的异种角膜基质，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞后，在其表面分别种植相应细胞，构建成为具有正常角膜结构的人工组织工程化生物角膜。另外，使用显微板层角膜切削刀、微型角膜车床或激光切削加工上述异种角膜基质可以制作成为具有不同屈光度的角膜基质片，用作构建生物角膜的载体。
本发明的主要发明点在于以角膜基质为载体，制得的人工组织工程化生物角膜，免疫原性很低，可以用于异种移植，移植后角膜基质的厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入，角膜知觉大部恢复，上皮细胞贴附牢固，细胞间和细胞与基底膜间生理连接正常。
利用新鲜、脱细胞处理或保存后的异种角膜基质，如猪、羊、猫、猴、牛、马、驴等动物类或鱼类的角膜基质，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞后，在其表面分别种植相应细胞，构建成为具有正常角膜结构的人工组织工程化生物角膜。加工上述异种角膜基质，使其具有不同的外部形状(根据临床需要的角膜形状加工)和获得不同的屈光度(屈光度可从-40D～+40D)后，可用于构建人工组织工程化生物角膜。下面是本发明专利的最佳实施例子实施例子1取新鲜异种角膜，利用Dispase II消化法除去其前后表面的上皮细胞和内皮细胞，以此异种角膜基质片为载体，以同种异体角膜缘细胞和“永生化”内皮细胞为种子细胞，利用微重力联合气液界面法使种子细胞与异种角膜基质载体紧密附着，形成前表面为5～7层上皮细胞，后表面为单层内皮细胞的生物角膜，进行动物实验，根据移植后免疫、组织学恢复、视光学改变、手术方法等方面的研究观察结果，改进和完善构建和移植方法。
实施例子2取干燥或冷冻保存的异种角膜，用激光消融除去异种角膜前后表面的上皮细胞和内皮细胞，然后使用显微板层角膜切削刀、激光或微型角膜车床加工，使其具有一定的屈光度，以此异种角膜基质片为载体，以诱导分化的胚胎干细胞源性角膜上皮细胞、角膜内皮细胞为种子细胞，利用微重力和气液界面法构建生物角膜。
新构建出的生物角膜内皮细胞的密度达到2000个细胞/mm2以上，角膜上皮细胞达到5~7层。具有免疫原性低、细胞结构和功能正常，移植后厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入、角膜知觉大部恢复，上皮细胞贴附牢固，细胞间和细胞与基底膜间生理连接正常。
实施例子3用激光消融除去异种角膜前后表面的上皮细胞和内皮细胞，使用显微板层角膜切削刀、激光或微型角膜车床加工，使其具有一定的屈光度，同时或单纯在其前后表面涂布隔水材料(如交联的硅化合物等，要求材料与角膜基质表面粘附性好、涂层透明度高，特别是具有与眼球良好的组织相容性和稳定性)，使隔水材料在角膜基质表面交联，用于活体移植。
权利要求
1.一种人工组织工程化的生物角膜，按照以下方法制备取新鲜、脱细胞处理或保存后的同种异体或异种角膜基质，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞后作为载体，在其表面分别种植相应细胞，构建成为具有正常角膜结构的人工组织工程化生物角膜。
2.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于所述的同种异体或异种角膜经酶消化法或激光消融法处理，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞，成为单纯含有显微胶原板层的角膜基质载体。
3.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于制做角膜基质载体的角膜可以是含有基质细胞的新鲜角膜，也可以是经过保存处理过的不含角膜基质细胞的角膜。
4.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于角膜基质经显微板层角膜切削刀和微型角膜车床加工制作成为具有不同屈光度的角膜基质镜片，用作构建生物角膜的载体。
5.按权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于在载体表面种植的细胞是同种异体角膜缘细胞、角膜内皮细胞和诱导分化的胚胎干细胞源性角膜细胞。
6.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于细胞种植的方法采用微重力、气液界面法、三微构建法或联合构建法。
7.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于可以同时或单纯在制做的角膜基质载体前后表面涂布隔水材料。
全文摘要
本发明公开了一种人工组织工程化的生物角膜。本发明利用同种异体或异种角膜基质为载体，在其上面种植培养细胞后构建组织工程化生物角膜。该载体可以不加工或预加工后使用。使用该载体构建角膜具有免疫原性很低，移植后厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入、角膜知觉大部恢复，上皮细胞贴附牢固，细胞间和细胞与基底膜间生理连接正常的特点。
文档编号A61F2/14GK1473551SQ0314011
公开日2004年2月11日 申请日期2003年8月7日 优先权日2003年8月7日
发明者王智崇, 葛坚, 陈冬 申请人:中山大学中山眼科中心
技术领域：
本发明涉及一种用于构建组织工程化生物角膜的构建载体。
组织工程学是一门运用工程学与生命科学的原理和方法，它通过不同的组织构建方式使细胞与载体结合，构成具有特定的三维结构和生物活性的人工组织或器官，用于替代或修复人体的病损器官和组织，达到恢复组织形态与功能的目的。标志着医学将超越组织和器官移植的旧模式，进入人工制造组织和器官的时代，通过组织工程手段构建人工组织工程化生物角膜将解决或缓解此供需矛盾。通过组织工程构建组织的必需原料是构建载体和种子细胞。
目前制约组织工程化生物角膜研究的瓶颈是构建载体，由于角膜独特的生理和光学特性，要求用于构建生物角膜基质必须具有(1)适合细胞生长和粘附的微环境；(2)稳定的角膜厚度和角膜曲率，以维持屈光度稳定；(3)高透明度；(4)适度地强度和弹性；(5)良好的神经支配。否则，将影响生物角膜的临床应用和效果。
但是目前构建角膜或与角膜类似的组织工程化组织的载体高分子材料和胶原均不能满足上述要求1)以高分子材料为载体构建的角膜不但透明差，而且不能建立角膜神经支配，如Mimami等(1993)用人工合成基质构建的三维牛角膜，就是由于人工基质的缺陷(不透明和抗拉力弱)，不能用于移植(Mimami Y，et al.Reconstruction of cornea in three-dimensionalcollagen gel matrix culture.Invest Ophthalmol Vis Sci.1993；34(7)2316.)。研究也发现聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)类等材料的透明度和稳定性差，需要进一步改进，若用于构建组织工程化生物角膜需要进一步改进(商庆新、胡晓洁、曹宜林组织工程技术构建角膜基质层的实验研究，中华眼科杂志，2001，37252)。
2)胶原合成基质载体构建的角膜强度更差。Griffith等(1999)利用转基因技术建立“永生化”细胞系在实验室成功重组了功能、结构与正常角膜相似的生物角膜，被“science”杂志誉为人类角膜生物组织工程和组织移植中的最大突破和里程碑(Griffith M，et al.Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.Science 1999；286(5447)2169-72.)，也是由于强度不够，未能进行动物实验，离临床应用的要求相差就更远了，另外由于胶原易被胶原酶消化，因此不稳定，进而影响角膜的光学性能和移植细胞的长期存活。
正常的角膜基质是角膜细胞正常附着和长期存活的基础，健康的角膜缘基质形成了稳定的细胞“龛”，支持了角膜缘干细胞正常分化和增殖，这是高分子材料和胶原载体所不具备的优势。Lange等(1993)用牛Descemet′s膜为载体将角膜内皮细胞移植到新西兰白兔，所有植片保持透明12-17天(Lange-TM，et al.Corneal endothelial celltransplantation using Descemet′s membrane as a carrier.J-Cataract-Refract-Surg.1993；19(2)232-5.)，Bohnke等(1998，1999)用Descemet′s膜为载体，也成功地将人和猪角膜内皮细胞移植到人眼(Bohnke-M，et al.Detection of neurone-specific enolase in long-termcultures of human corneal endothelium.Graefes Arch Clin ExpOphthalmol.1998；236(7)522-6.及Bohnke-M，et al.Transplantation ofcultured adult human or porcine corneal endothelial cells onto humanrecipients in vitro.Part IIEvaluation in the scanning electron microscope.Cornea.1999；18(2)207-13.)。自1994年开始，我们对异种角膜基质免疫原性、移植后角膜神经恢复、植床组织学变化、移植后不同时期角膜透明度、屈光度和厚度变化等方面进行了系列研究，结果发现角膜基质的免疫原性很低，异种移植后角膜基质的厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入，角膜知觉大部恢复，上皮细胞粘附牢固，细胞间和细胞与基质问生理连接正常，将猴角膜基质植入人角膜层间，已维持透明近10年，表明利用异种角膜基质是目前最理想的构建角膜载体。
构建技术方面，目前国内外构建组织工程化生物角膜的主要方法是气-液界面和三维立体培养，Zieske等(1994)报道重组的三维角膜移植后，细胞有半桥粒、锚纤维和连续的基底膜形成，α烯醇酶和K3的分布与正常角膜缘完全相同(Zieske JD，et al.Basement membraneassembly and differentiation of cultured corneal cellsimportance ofculture environment and endothelial cell interaction.Exp Cell Res.1994；214621-33.)。Engelmann等(1999)分别取得猪和人内皮细胞达3,450/mm2和1,850/mm2的最大终密度(Engelmann K，et al.Transplantation of adult human or porcine comeal endothelial cells ontohuman recipients in vitro.Part ICell culturing and transplantationprocedure.Cornea.1999；18199-206.)。
本发明所述的人工组织工程化生物角膜，按照以下方法制备取新鲜、脱细胞处理或保存后的异种角膜基质，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞后，在其表面分别种植相应细胞，构建成为具有正常角膜结构的人工组织工程化生物角膜。另外，使用显微板层角膜切削刀、微型角膜车床或激光切削加工上述异种角膜基质可以制作成为具有不同屈光度的角膜基质片，用作构建生物角膜的载体。
本发明的主要发明点在于以角膜基质为载体，制得的人工组织工程化生物角膜，免疫原性很低，可以用于异种移植，移植后角膜基质的厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入，角膜知觉大部恢复，上皮细胞贴附牢固，细胞间和细胞与基底膜间生理连接正常。
利用新鲜、脱细胞处理或保存后的异种角膜基质，如猪、羊、猫、猴、牛、马、驴等动物类或鱼类的角膜基质，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞后，在其表面分别种植相应细胞，构建成为具有正常角膜结构的人工组织工程化生物角膜。加工上述异种角膜基质，使其具有不同的外部形状(根据临床需要的角膜形状加工)和获得不同的屈光度(屈光度可从-40D～+40D)后，可用于构建人工组织工程化生物角膜。下面是本发明专利的最佳实施例子实施例子1取新鲜异种角膜，利用Dispase II消化法除去其前后表面的上皮细胞和内皮细胞，以此异种角膜基质片为载体，以同种异体角膜缘细胞和“永生化”内皮细胞为种子细胞，利用微重力联合气液界面法使种子细胞与异种角膜基质载体紧密附着，形成前表面为5～7层上皮细胞，后表面为单层内皮细胞的生物角膜，进行动物实验，根据移植后免疫、组织学恢复、视光学改变、手术方法等方面的研究观察结果，改进和完善构建和移植方法。
实施例子2取干燥或冷冻保存的异种角膜，用激光消融除去异种角膜前后表面的上皮细胞和内皮细胞，然后使用显微板层角膜切削刀、激光或微型角膜车床加工，使其具有一定的屈光度，以此异种角膜基质片为载体，以诱导分化的胚胎干细胞源性角膜上皮细胞、角膜内皮细胞为种子细胞，利用微重力和气液界面法构建生物角膜。
新构建出的生物角膜内皮细胞的密度达到2000个细胞/mm2以上，角膜上皮细胞达到5~7层。具有免疫原性低、细胞结构和功能正常，移植后厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入、角膜知觉大部恢复，上皮细胞贴附牢固，细胞间和细胞与基底膜间生理连接正常。
实施例子3用激光消融除去异种角膜前后表面的上皮细胞和内皮细胞，使用显微板层角膜切削刀、激光或微型角膜车床加工，使其具有一定的屈光度，同时或单纯在其前后表面涂布隔水材料(如交联的硅化合物等，要求材料与角膜基质表面粘附性好、涂层透明度高，特别是具有与眼球良好的组织相容性和稳定性)，使隔水材料在角膜基质表面交联，用于活体移植。
权利要求
1.一种人工组织工程化的生物角膜，按照以下方法制备取新鲜、脱细胞处理或保存后的同种异体或异种角膜基质，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞后作为载体，在其表面分别种植相应细胞，构建成为具有正常角膜结构的人工组织工程化生物角膜。
2.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于所述的同种异体或异种角膜经酶消化法或激光消融法处理，除去角膜内皮细胞和角膜上皮细胞，成为单纯含有显微胶原板层的角膜基质载体。
3.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于制做角膜基质载体的角膜可以是含有基质细胞的新鲜角膜，也可以是经过保存处理过的不含角膜基质细胞的角膜。
4.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于角膜基质经显微板层角膜切削刀和微型角膜车床加工制作成为具有不同屈光度的角膜基质镜片，用作构建生物角膜的载体。
5.按权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于在载体表面种植的细胞是同种异体角膜缘细胞、角膜内皮细胞和诱导分化的胚胎干细胞源性角膜细胞。
6.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于细胞种植的方法采用微重力、气液界面法、三微构建法或联合构建法。
7.按照权利要求1所述的人工组织工程化生物角膜，其特征在于可以同时或单纯在制做的角膜基质载体前后表面涂布隔水材料。
全文摘要
本发明公开了一种人工组织工程化的生物角膜。本发明利用同种异体或异种角膜基质为载体，在其上面种植培养细胞后构建组织工程化生物角膜。该载体可以不加工或预加工后使用。使用该载体构建角膜具有免疫原性很低，移植后厚度、屈光度保持不变，自体神经可以长入、角膜知觉大部恢复，上皮细胞贴附牢固，细胞间和细胞与基底膜间生理连接正常的特点。
文档编号A61F2/14GK1473551SQ0314011
公开日2004年2月11日 申请日期2003年8月7日 优先权日2003年8月7日
发明者王智崇, 葛坚, 陈冬 申请人:中山大学中山眼科中心
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