酸性成纤维细胞生长因子及其突变体的聚乙二醇修饰物的制作方法
专利名称：酸性成纤维细胞生长因子及其突变体的聚乙二醇修饰物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类用聚乙二醇修饰的酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)及其突变体的修饰产物。
一、发明背景1.酸性成纤维细胞生长因子酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是一种对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子，研究表明，aFGF的生物学效应包括(1)参与新生血管的形成。aFGF对血管内皮细胞有较强的趋化作用和促增殖作用，并刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白溶解酶原激活物(t-PA)，进一步降解基底膜，同时诱导毛细血管内皮细胞形成管腔样结构；(2)促进表皮细胞的增殖。体内体外实验表明，在烧伤创面应用aFGF后，免疫组化染色及显微镜观察显示，aFGF组的表皮细胞和全厚层皮肤组织的DNA含量高于生理盐水对照组，S期细胞数也明显高于对照组，表明aFGF可促进表皮细胞的有丝分裂，，从而促进表皮细胞的增殖，加速创面的愈合；(3)aFGF对中胚层及神经外胚层细胞的分化有明显的刺激作用。神经细胞的分裂受aFGF的调节，分裂过程中出现轴突突起生长出生长锥、神经递质合成、递质小泡的转运等神经元特征。
(4)参与血管张力与血压调节给动物注射FGF，可显示出扩张血管和降压效应。FGF的降压效应有3个特点a.有或无肝素作为载体时均表现出降压作用，但血中一定浓度的肝素盐能增加其降压效果；b.FGF诱导的降压反应包括快相与慢相两个阶段，ATP敏感的K+通道可能在早期(快相)血压下降中起一定作用；c.从中枢(脑室内)给予FGF无降压作用，亦不影响从外周静脉血给予FGF的降压效应。FGF诱导的降压效应可能是它能诱导内皮细胞释放松驰因子(EDRF)，进而产生血管扩张效应有关。因此有人认为FGF的这一药理作用有可能给高血压的治疗带来突破。
(5)aFGF对缺血性损伤保护作用FGF能显著减少脑缺血导致的海马神经元死亡率；可防止再灌注损伤中心肌细胞外和线粒体内钙的沉积，减轻组织水肿，降低毛细血管损伤率以及肌酸磷酸激酶(CK)的释放；对急性肢体缺血性损伤，FGF除能显著减轻组织水肿外，还能部分恢复组织活力，减少细胞内钙依赖性ATP酶以及脱氢酶类的损失。其抗缺血损伤效应机制可能包括A.FGF降低血管阻力，有助于开放小动脉与毛细血管而减少组织缺血后的“无再灌流(no reflow)”现象；B.FGF有助于开放K+-ATP通道，促进内皮细胞分泌释放血浆纤维蛋白溶酶原激活物(PA)，进而有助于清除心血管系统的栓塞；C.FGF能调节细胞Ca2+浓度，有助于维持Ca2+依赖性ATP酶的活性，减少自由基的产生。
(6)对神经系统的作用实验表明，许多神经元受慢性神经退化变性疾病的影响，如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)，影响运动神经元；帕金森疾病，影响黑质中的神经元；早老性痴呆，影响基底前脑副交感神经元。这些神经元中都有大量的aFGF分布，aFGF可作为自分泌神经营养因子，感受细胞质膜哪怕是瞬间的渗漏，并立即启动修复，促进神经细胞的迁移和纤溶酶激活剂的释放，增加髓磷脂相关蛋白和类脂的含量，改变神经细胞的典型的细胞进程和细胞膜结构，使神经元免受神经退化变性疾病的影响。
aFGF能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活，使神经元成活时间增加和其轴突延长。Koshinaga等研究了脊髓损伤后aFGF的表达情况后，发现前角运动神经元的aFGF含量增加，表明机体自身产生大量aFGF，在脊髓损伤的自我修复和再生中起作用，这是机体的一种自我保护机制。
此外，aFGF还具有调节摄食过程，调节激素分泌、诱导促甲状腺激素的释放，同时也增加靶细胞对这种激素的敏感性等非促分裂效应。
aFGF广泛的生物学活性表明其在医疗上具有良好的应用前景。但是，作为一类蛋白质药物，它也存在稳定性差、体内半衰期短、可能产生免疫反应等缺点。尽管在发现FGF后国内外对其进行了大量研究，但迄今为止只有我国批准碱性成纤维细胞生长因子作为外用药物用于外伤、溃疡治疗。
对aFGF结构与功能的研究表明，人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)的氨基酸序列中有三个半胱氨酸残基(Cys)，分别位于第31、98、132位，其中第31、98位Cys在haFGF和hbFGF(人的bFGF)中是一致的，而第132位Cys是haFGF独有的。用定点突变技术将Cys转变为中性氨基酸，如丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)，能增加haFGF对热、酸及某些蛋白酶降解的稳定性和生物学活性。Linemeyer等人用点突变的方法将aFGF的3个Cys逐个换成丝氨酸(Ser)，结果发现得到的3个突变体在肝素存在下都保持较高活性。用碘乙酸对aFGF进行化学修饰，发现具有活性的aFGF的所有3个Cys都可被修饰，这说明Cys以及由Cys形成的二硫键对aFGF活性不是必需的。进一步将Ser132突变体的另外2个Cys催化氧化形成一对二硫键，可使aFGF的活性几乎完全丧失，用DTT还原又可使其活性恢复，表明Cys31和Cys98形成的二硫键对aFGF来说不仅不是必要的而且是有害的。Ortega等人曾报道了aFGF3个Cys双点突变和三点突变的研究结果，他们发现这些突变体的活性与野生型和单点突变体比较，都有不同程度的增加，这些结果进一步说明了Cys的存在对aFGF活性的抑制作用，而这种抑制作用很可能是由于二硫键的形成所致。
2.蛋白质药物化学修饰的研究近况及进展化学修饰作为一种重要的改善蛋白质的生物特性的技术在上世纪中叶已引起部分生物学家的重视，但直到最近十年，随着化学修饰剂专业性的提高，化学修饰过程分析和计算方法的完善以及结构生物学的发展，化学修饰才真正为人熟知，并且以其灵活多样，简便易行的特点深受生物界青睐。
化学修饰剂与蛋白质的反应主要有酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等。代表性的修饰剂有醋酸酐、乙酰咪唑、乙二醛、右旋糖苷、肝素、葡聚糖、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维、聚乙烯吡咯酮，聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯顺丁烯二酰肼共聚物，聚氨基酸、多聚唾液酸、环糊精、聚乙二醇等，其中以聚乙二醇(PEG)类修饰剂应用最多。
PEG是一种由重复的乙烯氧亚单元聚合而成的大分子化合物，活性低，无毒，并且具有良好的生物相容性，当它与蛋白质的非必须基团共价结合时，分子量明显增加，肾小球滤过减少，同时PEG衍生物的屏蔽作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，从而增加了被修饰药物的体内稳定性，延长了其生物半衰期。PEG可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生，或者阻止抗原与抗体的结合从而抑制免疫反应的产生。
具有重要作用和功能的化学修饰已经在全球的生物制药领域引起越来越多的关注著名生物制药企业Enzon公司在对不同的蛋白质药物进行化学修饰的研究已有数十年历史，其研制的PEG-门冬酰氨酶、PEG-腺苷脱胺酶和PEG-干扰素已通过美国FDA认证并成功上市，其中注射用聚乙二醇结合α-2b干扰素(PEG-IFN)用于无法接受α干扰素(IFN-α)治疗的18岁以上慢性乙肝病人。慢乙肝是美国流行最广的疾病之一，PEG-IFN每周一次皮下注射极为方便，提高了病人的顺应性。斯克利泼斯医院消化科Mchutchison医师认为IFN-α和利巴韦林联用是慢乙肝的标准疗法，PEG-IFN单剂疗法可作为联合疗法禁忌或不耐受患者的代替疗法。另外，象Roche Holding公司利用PEG修饰粒细胞集落刺激因子(Pegylated G-CSF)用于治疗多种癌症和粒细胞减少症已进入II期临床；Amgen公司研制的肿瘤坏死因子修饰产物(PEG-STNF-R1)也已进入治疗风湿性关节炎的II期临床等等。至于国内，最近十年，利用化学修饰改善蛋白质性质和功能也开展了研究，先后报道了对干扰素α-2b，白介素-2，天冬酰胺酶和天花粉等蛋白类药物的修饰。
本发明利用聚乙二醇对aFGF进行化学修饰，活性回收率为30％-70％，与未修饰的aFGF相比，其热稳定性、抗各种蛋白酶水解能力、体内半衰期都有很大程度的提高，在开发适用于各种适应症的aFGF药物上具有重要应用价值。
二.本发明的实现实施例一聚乙二醇-haFGF97Ser，131Ser的制备1.mPEG5000-maleimide的合成等物质量6-氨基己酸与马来酸酐在足量冰乙酸中加热回流24小时后减压除去冰乙酸，所得产物过硅胶柱分离，分步收集做薄层检测，将含有相同组分的样品合并后减压浓缩，室温条件下，将浓缩样以1∶5到1∶20(mol比)的比例与mPEG5000二氯甲烷溶液混合，向其中加入1‰-2％的DCCI和DMAP作催化剂，反应4-24小时，加入1/3至1/2体积的乙醚作沉淀剂，静置4-8小时，8000rmp离心，收集沉淀，得灰白色固体，即为所要活化酯mPEG5000-maleimide。
2.修饰反应将溶解于PB缓冲液(10-50mM，PH＝6.0-7.5)中的人酸性成纤维细胞生长因子突变体(haFGF97Ser，131Ser，第98、132位Cys突变为Ser)与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化取步骤2中反应液，过Sephedax G-25柱除盐后，上CL-6B肝素亲和层析柱分离，分离条件为CL-6B制备型亲和层析柱(20cm×1.5cm)，采用10-50mM/LPB缓冲液平衡柱，1mL/min流速上样，用10-50mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，10-50mM PB+0.1-1.2M NaCl缓冲液洗脱，洗脱液流速为1mL/min，收集第一个洗脱峰，过Sephedax G-25柱除盐后，即得聚乙二醇-aFGF97Ser，131Ser纯品。实施例二聚乙二醇-haFGFSer31，Ser132的制备1.mPEG5000-maleimide的合成与实施例一相同。
2.修饰反应将溶解于10-50mM的PB缓冲液(PH＝6.5-7.5)中的人酸性成纤维细胞生长因子突变体(haFGFSer31，Ser132，第31、132位Cys突变为Ser)与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化与实施例一相同实施例三 聚乙二醇-aFGFSer31，Ser98的制备1.mPEG5000-maleimide的合成与实施例一相同。
2.修饰反应将溶解于10-50mM的PB缓冲液(PH＝6.5-7.5)中的人酸性成纤维细胞生长因子突变体(aFGFSer31，Ser98，第31、98位Cys突变为Ser)与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化与实施例一相同。
实施例四聚乙二醇-aFGF的制备1.mPEG5000-maleimide的合成与实施例一相同。
2.修饰反应将溶解于10-50mM的PB缓冲液(PH＝6.5-7.5)中的aFGF与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化取步骤2中反应液，过Sephedax G-25柱除盐后，上CL-6B肝素亲和层析柱分离，分离条件为CL-6B制备型亲和层析柱(6cm*1.5cm)，采用10-50mM/LPB缓冲液平衡柱，上样，10-50mM/LPB缓冲液洗柱至基线平稳后，10-50mM PB+0.1-1.2M NaCL缓冲液洗脱，洗脱液流速为1-10mL/min，收集洗脱峰，SDS-PAGE检验，分别过Sephedax G-25柱除盐后，即得不同修饰度的聚乙二醇-haFGF纯品。
权利要求
1.酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)及其各种突变体的聚乙二醇化学修饰物；
2.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物包括用聚乙二醇对全长154个氨基酸残基的aFGF进行修饰所得的聚乙二醇修饰产物；
3.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物还包括用聚乙二醇对N端截短1-30个氨基酸残基的aFGF突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰物；
4.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物还包括用聚乙二醇对aFGF序列中一个或两个半胱氨酸(Cys)残基突变为丝氨酸(Ser)的aFGF突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰物；
5.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物还包括用聚乙二醇对N端截短1-30个氨基酸残基的aFGF序列中的一个或两个Cys残基突变为Ser的aFGF突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰物。
全文摘要
酸性成纤维细胞生长因子具有广泛的生物学功能，在治疗多种疾病上具有重要潜在价值，但是存在稳定性差、体内半衰期短、可能存在免疫原性等缺点。本发明采用聚乙二醇对酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)及其突变体进行化学修饰，获得aFGF及其突变体的聚乙二醇修饰产物，修饰产物均一性好、分离纯化工艺简单、活性回收率高，同时，提高了稳定性、延长了体内半衰期、降低了免疫原性。该酸性成纤维细胞生长因子及其突变体修饰产物可用于心脑血管、神经系统、内脏缺血性等疾病的预防和治疗，以及体表创伤、烧烫伤、溃疡和骨损伤等的治疗。
文档编号A61P17/00GK1502628SQ03140390
公开日2004年6月9日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者郑青, 黄亚东, 李校坤, 苏志坚, 许华, 吴晓萍, 赵文, 杨晓明, 黄志锋, 郑 青 申请人:广州暨南大学医学生物技术研究开发中心, 广州暨南大学医学生物技术研究开发中
技术领域：
本发明涉及一类用聚乙二醇修饰的酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)及其突变体的修饰产物。
一、发明背景1.酸性成纤维细胞生长因子酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是一种对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子，研究表明，aFGF的生物学效应包括(1)参与新生血管的形成。aFGF对血管内皮细胞有较强的趋化作用和促增殖作用，并刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白溶解酶原激活物(t-PA)，进一步降解基底膜，同时诱导毛细血管内皮细胞形成管腔样结构；(2)促进表皮细胞的增殖。体内体外实验表明，在烧伤创面应用aFGF后，免疫组化染色及显微镜观察显示，aFGF组的表皮细胞和全厚层皮肤组织的DNA含量高于生理盐水对照组，S期细胞数也明显高于对照组，表明aFGF可促进表皮细胞的有丝分裂，，从而促进表皮细胞的增殖，加速创面的愈合；(3)aFGF对中胚层及神经外胚层细胞的分化有明显的刺激作用。神经细胞的分裂受aFGF的调节，分裂过程中出现轴突突起生长出生长锥、神经递质合成、递质小泡的转运等神经元特征。
(4)参与血管张力与血压调节给动物注射FGF，可显示出扩张血管和降压效应。FGF的降压效应有3个特点a.有或无肝素作为载体时均表现出降压作用，但血中一定浓度的肝素盐能增加其降压效果；b.FGF诱导的降压反应包括快相与慢相两个阶段，ATP敏感的K+通道可能在早期(快相)血压下降中起一定作用；c.从中枢(脑室内)给予FGF无降压作用，亦不影响从外周静脉血给予FGF的降压效应。FGF诱导的降压效应可能是它能诱导内皮细胞释放松驰因子(EDRF)，进而产生血管扩张效应有关。因此有人认为FGF的这一药理作用有可能给高血压的治疗带来突破。
(5)aFGF对缺血性损伤保护作用FGF能显著减少脑缺血导致的海马神经元死亡率；可防止再灌注损伤中心肌细胞外和线粒体内钙的沉积，减轻组织水肿，降低毛细血管损伤率以及肌酸磷酸激酶(CK)的释放；对急性肢体缺血性损伤，FGF除能显著减轻组织水肿外，还能部分恢复组织活力，减少细胞内钙依赖性ATP酶以及脱氢酶类的损失。其抗缺血损伤效应机制可能包括A.FGF降低血管阻力，有助于开放小动脉与毛细血管而减少组织缺血后的“无再灌流(no reflow)”现象；B.FGF有助于开放K+-ATP通道，促进内皮细胞分泌释放血浆纤维蛋白溶酶原激活物(PA)，进而有助于清除心血管系统的栓塞；C.FGF能调节细胞Ca2+浓度，有助于维持Ca2+依赖性ATP酶的活性，减少自由基的产生。
(6)对神经系统的作用实验表明，许多神经元受慢性神经退化变性疾病的影响，如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)，影响运动神经元；帕金森疾病，影响黑质中的神经元；早老性痴呆，影响基底前脑副交感神经元。这些神经元中都有大量的aFGF分布，aFGF可作为自分泌神经营养因子，感受细胞质膜哪怕是瞬间的渗漏，并立即启动修复，促进神经细胞的迁移和纤溶酶激活剂的释放，增加髓磷脂相关蛋白和类脂的含量，改变神经细胞的典型的细胞进程和细胞膜结构，使神经元免受神经退化变性疾病的影响。
aFGF能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活，使神经元成活时间增加和其轴突延长。Koshinaga等研究了脊髓损伤后aFGF的表达情况后，发现前角运动神经元的aFGF含量增加，表明机体自身产生大量aFGF，在脊髓损伤的自我修复和再生中起作用，这是机体的一种自我保护机制。
此外，aFGF还具有调节摄食过程，调节激素分泌、诱导促甲状腺激素的释放，同时也增加靶细胞对这种激素的敏感性等非促分裂效应。
aFGF广泛的生物学活性表明其在医疗上具有良好的应用前景。但是，作为一类蛋白质药物，它也存在稳定性差、体内半衰期短、可能产生免疫反应等缺点。尽管在发现FGF后国内外对其进行了大量研究，但迄今为止只有我国批准碱性成纤维细胞生长因子作为外用药物用于外伤、溃疡治疗。
对aFGF结构与功能的研究表明，人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)的氨基酸序列中有三个半胱氨酸残基(Cys)，分别位于第31、98、132位，其中第31、98位Cys在haFGF和hbFGF(人的bFGF)中是一致的，而第132位Cys是haFGF独有的。用定点突变技术将Cys转变为中性氨基酸，如丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)，能增加haFGF对热、酸及某些蛋白酶降解的稳定性和生物学活性。Linemeyer等人用点突变的方法将aFGF的3个Cys逐个换成丝氨酸(Ser)，结果发现得到的3个突变体在肝素存在下都保持较高活性。用碘乙酸对aFGF进行化学修饰，发现具有活性的aFGF的所有3个Cys都可被修饰，这说明Cys以及由Cys形成的二硫键对aFGF活性不是必需的。进一步将Ser132突变体的另外2个Cys催化氧化形成一对二硫键，可使aFGF的活性几乎完全丧失，用DTT还原又可使其活性恢复，表明Cys31和Cys98形成的二硫键对aFGF来说不仅不是必要的而且是有害的。Ortega等人曾报道了aFGF3个Cys双点突变和三点突变的研究结果，他们发现这些突变体的活性与野生型和单点突变体比较，都有不同程度的增加，这些结果进一步说明了Cys的存在对aFGF活性的抑制作用，而这种抑制作用很可能是由于二硫键的形成所致。
2.蛋白质药物化学修饰的研究近况及进展化学修饰作为一种重要的改善蛋白质的生物特性的技术在上世纪中叶已引起部分生物学家的重视，但直到最近十年，随着化学修饰剂专业性的提高，化学修饰过程分析和计算方法的完善以及结构生物学的发展，化学修饰才真正为人熟知，并且以其灵活多样，简便易行的特点深受生物界青睐。
化学修饰剂与蛋白质的反应主要有酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等。代表性的修饰剂有醋酸酐、乙酰咪唑、乙二醛、右旋糖苷、肝素、葡聚糖、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维、聚乙烯吡咯酮，聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯顺丁烯二酰肼共聚物，聚氨基酸、多聚唾液酸、环糊精、聚乙二醇等，其中以聚乙二醇(PEG)类修饰剂应用最多。
PEG是一种由重复的乙烯氧亚单元聚合而成的大分子化合物，活性低，无毒，并且具有良好的生物相容性，当它与蛋白质的非必须基团共价结合时，分子量明显增加，肾小球滤过减少，同时PEG衍生物的屏蔽作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，从而增加了被修饰药物的体内稳定性，延长了其生物半衰期。PEG可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生，或者阻止抗原与抗体的结合从而抑制免疫反应的产生。
具有重要作用和功能的化学修饰已经在全球的生物制药领域引起越来越多的关注著名生物制药企业Enzon公司在对不同的蛋白质药物进行化学修饰的研究已有数十年历史，其研制的PEG-门冬酰氨酶、PEG-腺苷脱胺酶和PEG-干扰素已通过美国FDA认证并成功上市，其中注射用聚乙二醇结合α-2b干扰素(PEG-IFN)用于无法接受α干扰素(IFN-α)治疗的18岁以上慢性乙肝病人。慢乙肝是美国流行最广的疾病之一，PEG-IFN每周一次皮下注射极为方便，提高了病人的顺应性。斯克利泼斯医院消化科Mchutchison医师认为IFN-α和利巴韦林联用是慢乙肝的标准疗法，PEG-IFN单剂疗法可作为联合疗法禁忌或不耐受患者的代替疗法。另外，象Roche Holding公司利用PEG修饰粒细胞集落刺激因子(Pegylated G-CSF)用于治疗多种癌症和粒细胞减少症已进入II期临床；Amgen公司研制的肿瘤坏死因子修饰产物(PEG-STNF-R1)也已进入治疗风湿性关节炎的II期临床等等。至于国内，最近十年，利用化学修饰改善蛋白质性质和功能也开展了研究，先后报道了对干扰素α-2b，白介素-2，天冬酰胺酶和天花粉等蛋白类药物的修饰。
本发明利用聚乙二醇对aFGF进行化学修饰，活性回收率为30％-70％，与未修饰的aFGF相比，其热稳定性、抗各种蛋白酶水解能力、体内半衰期都有很大程度的提高，在开发适用于各种适应症的aFGF药物上具有重要应用价值。
二.本发明的实现实施例一聚乙二醇-haFGF97Ser，131Ser的制备1.mPEG5000-maleimide的合成等物质量6-氨基己酸与马来酸酐在足量冰乙酸中加热回流24小时后减压除去冰乙酸，所得产物过硅胶柱分离，分步收集做薄层检测，将含有相同组分的样品合并后减压浓缩，室温条件下，将浓缩样以1∶5到1∶20(mol比)的比例与mPEG5000二氯甲烷溶液混合，向其中加入1‰-2％的DCCI和DMAP作催化剂，反应4-24小时，加入1/3至1/2体积的乙醚作沉淀剂，静置4-8小时，8000rmp离心，收集沉淀，得灰白色固体，即为所要活化酯mPEG5000-maleimide。
2.修饰反应将溶解于PB缓冲液(10-50mM，PH＝6.0-7.5)中的人酸性成纤维细胞生长因子突变体(haFGF97Ser，131Ser，第98、132位Cys突变为Ser)与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化取步骤2中反应液，过Sephedax G-25柱除盐后，上CL-6B肝素亲和层析柱分离，分离条件为CL-6B制备型亲和层析柱(20cm×1.5cm)，采用10-50mM/LPB缓冲液平衡柱，1mL/min流速上样，用10-50mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，10-50mM PB+0.1-1.2M NaCl缓冲液洗脱，洗脱液流速为1mL/min，收集第一个洗脱峰，过Sephedax G-25柱除盐后，即得聚乙二醇-aFGF97Ser，131Ser纯品。实施例二聚乙二醇-haFGFSer31，Ser132的制备1.mPEG5000-maleimide的合成与实施例一相同。
2.修饰反应将溶解于10-50mM的PB缓冲液(PH＝6.5-7.5)中的人酸性成纤维细胞生长因子突变体(haFGFSer31，Ser132，第31、132位Cys突变为Ser)与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化与实施例一相同实施例三 聚乙二醇-aFGFSer31，Ser98的制备1.mPEG5000-maleimide的合成与实施例一相同。
2.修饰反应将溶解于10-50mM的PB缓冲液(PH＝6.5-7.5)中的人酸性成纤维细胞生长因子突变体(aFGFSer31，Ser98，第31、98位Cys突变为Ser)与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化与实施例一相同。
实施例四聚乙二醇-aFGF的制备1.mPEG5000-maleimide的合成与实施例一相同。
2.修饰反应将溶解于10-50mM的PB缓冲液(PH＝6.5-7.5)中的aFGF与mPEG5000-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合，放置于4℃-37℃，反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化取步骤2中反应液，过Sephedax G-25柱除盐后，上CL-6B肝素亲和层析柱分离，分离条件为CL-6B制备型亲和层析柱(6cm*1.5cm)，采用10-50mM/LPB缓冲液平衡柱，上样，10-50mM/LPB缓冲液洗柱至基线平稳后，10-50mM PB+0.1-1.2M NaCL缓冲液洗脱，洗脱液流速为1-10mL/min，收集洗脱峰，SDS-PAGE检验，分别过Sephedax G-25柱除盐后，即得不同修饰度的聚乙二醇-haFGF纯品。
权利要求
1.酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)及其各种突变体的聚乙二醇化学修饰物；
2.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物包括用聚乙二醇对全长154个氨基酸残基的aFGF进行修饰所得的聚乙二醇修饰产物；
3.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物还包括用聚乙二醇对N端截短1-30个氨基酸残基的aFGF突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰物；
4.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物还包括用聚乙二醇对aFGF序列中一个或两个半胱氨酸(Cys)残基突变为丝氨酸(Ser)的aFGF突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰物；
5.权利要求1中所说的aFGF聚乙二醇化学修饰物还包括用聚乙二醇对N端截短1-30个氨基酸残基的aFGF序列中的一个或两个Cys残基突变为Ser的aFGF突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰物。
全文摘要
酸性成纤维细胞生长因子具有广泛的生物学功能，在治疗多种疾病上具有重要潜在价值，但是存在稳定性差、体内半衰期短、可能存在免疫原性等缺点。本发明采用聚乙二醇对酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)及其突变体进行化学修饰，获得aFGF及其突变体的聚乙二醇修饰产物，修饰产物均一性好、分离纯化工艺简单、活性回收率高，同时，提高了稳定性、延长了体内半衰期、降低了免疫原性。该酸性成纤维细胞生长因子及其突变体修饰产物可用于心脑血管、神经系统、内脏缺血性等疾病的预防和治疗，以及体表创伤、烧烫伤、溃疡和骨损伤等的治疗。
文档编号A61P17/00GK1502628SQ03140390
公开日2004年6月9日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者郑青, 黄亚东, 李校坤, 苏志坚, 许华, 吴晓萍, 赵文, 杨晓明, 黄志锋, 郑 青 申请人:广州暨南大学医学生物技术研究开发中心, 广州暨南大学医学生物技术研究开发中
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