优化的sars冠状病毒n蛋白基因的制作方法
专利名称：优化的sars冠状病毒n蛋白基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学、基因工程学及疫苗学，更具体地涉及优化的SARS冠状病毒N蛋白基因。此基因可运用于在哺乳类动物尤其是人类细胞环境中高效表达产生N蛋白。本发明还涉及含有该基因的载体及疫苗。
背景技术：
非典型肺炎，简称非典，又称严重急性呼吸综合症(SARS)已蔓延到全球三十多个国家和地区，尤为严重的包括中国、中国香港、新加坡、加拿大、越南、中国台湾和美国，短期内已导致严重的生命财产损失。最近的流行病学研究估计在60岁以上患者，死亡率可高达近半数。
一种新的SARS冠状病毒(SARS Coronavirus)已经被确认为是非典的致病诱因，该病毒的基因组已被测序并公布。SARS冠状病毒为ssRNA(+)病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。在电镜下，病毒颗粒呈不规则形，直径约为60-220nm，其表面有梅花形的膜粒，状如皇冠。颗粒中心在负染电镜下呈不定形态，核壳体呈疏松状态。包膜上有两种糖蛋白S蛋白和M蛋白。S蛋白为刺突糖蛋白，是主要的抗原，与受体结合，使细胞融合。M蛋白为跨膜蛋白，参与包膜形成。此外，N蛋白也具有免疫原性。
发展疫苗为预防病毒感染的最有效的方法，并被证实已成功地运用于多种致命的病毒感染，如天花、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、甲型肝炎、乙型肝炎。为了有效地控制和预防SARS，人们正在开发各种SARS疫苗，其中主要有五种类型灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒病毒载体疫苗。
然而，迄今为止尚没有真正有效的SARS疫苗问世。因此，本领域迫切需要开发有效的SARS疫苗，尤其是能够在宿主体内大量引入或产生免疫原性SARS多肽的疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够在宿主体内大量产生免疫原性SARS多肽的优化的SARS冠状病毒N蛋白基因，含有该基因的载体及疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码SARS冠状病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其与天然的SARS冠状病毒的N蛋白编码序列的相同性为76±3％。
在另一优选例中，所述的核酸分子编码SEQ ID NO2所示的SARS冠状病毒N蛋白。
在另一优选例中，所述的核酸分子含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的核酸分子选自下组(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列相同性大于95％，且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一优选例中，与天然的SARS病毒的N蛋白编码序列相比，在哺乳动物细胞中，所述核酸分子编码的N蛋白的表达量提高至少100％。
在本发明的第二方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体是质粒或病毒载体，更佳地所述的病毒载体是腺病毒。
在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体，或者被本发明上述的核酸分子所转化。
在本发明的第四方面，提供了了一种组合物，它含有本发明上述的载体或核酸分子以及药学上可接受的赋型剂或稀释剂。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对SARS冠状病毒的N蛋白的编码序列进行了一系列优化。优化后的编码序列更适合于在哺乳动物例如人类以及其他哺乳类动物的细胞或组织环境中表达，从而不仅更适合在哺乳动物细胞系统大规模高效表达生产N蛋白，而且也更适合作为DNA疫苗。
本发明一种优化的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，含1269bp，编码与原始冠状病毒N蛋白相同的氨基酸序列以保持其免疫抗原性质。然而，此优化合成的基因只与原始冠状病毒N蛋白基因有76.3％相同性。其423个密码子中的265个密码子(或63％密码子)已被改变，但保留了与原N蛋白相相同的氨基酸序列以优化在哺乳类细胞中的表达，以及用于疫苗的用途。
SEQ ID NO1所示的核苷酸序列被称为“CONO”，意为优化的冠状病毒N蛋白基因(CoronavirusNproteinoptimized gene)。
应理解，由于SARS病毒也会象其他病毒一样发生变异，因此，对于氨基酸序列不同于SEQ ID NO2的变异的N蛋白，可以在SEQ ID NO1的基础上，在相应位置用相应的哺乳动物细胞优选的密码子替换相应的SARS病毒的密码子，从而获得优化的、编码突变N蛋白的核苷酸序列。
如本文所用，术语“优化的N蛋白编码序列”是指SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO1相同性大于95％，较佳地大于96％，更佳地大于98％的核苷酸序列。与原SARS病毒的N蛋白核苷酸序列相比，在哺乳动物细胞(如CHO细胞等)中，优化的N蛋白编码序列的表达量提高至少100％，更佳地提高至少200％或更高。
此外，本发明除了包括全长的优化的N蛋白编码序列之外，还包括其片段，例如基于SEQ ID NO1所示序列且编码免疫原性N蛋白片段的核苷酸序列。
本发明优化的N蛋白编码序列，可通过DNA重组技术导入脊椎类动物，尤其是哺乳动物例如人类以及其他哺乳类动物的细胞或组织环境中，从而高效地表达N蛋白、免疫原性片段或其衍生产物。
本发明还提供了含有全部或部分优化的N蛋白编码序列的质粒或病毒载体，以及因被所述质粒转入或病毒载体转染入从而含有本发明优选的N蛋白编码序列的哺乳动物宿主细胞。
一种优选的病毒载体是腺病毒载体，例如目前已用于临床疫苗试验的复制缺陷腺病毒载体，包括E1区域缺失型、E3区域或缺失或保留的5型或2型或其他亚型腺病毒。在某些情况下，腺病毒载体也可包括E1区域，但在其他区域被缺失。其他腺病毒载体可包括多区域缺失的载体，例如助手依赖型或全缺失型腺病毒载体。
在腺病毒基因组的E1区域或者E3区域或其他合适区域，可插入一个SARS病毒的N蛋白表达盒。该表达盒从5′→3′依次含有1)表达启动子(promoter)；2)与所述启动子操作性相连的优化的冠状病毒N蛋白编码序列(包括其变异体或衍生片段)；3)与该优化的编码序列相连的多腺苷酸化信号序列。
除了腺病毒载体之外，其他的其他病毒载体包括但不局限于腺病毒相关病毒(AAV，adem-assocated virus)、痘病毒(vaccinia virus)等。
另一种优选的载体是质粒载体。在该质粒载体中同样插入SARS病毒的N蛋白表达盒。
通过培养导入本发明优化的N蛋白编码序列的哺乳动物细胞，可以大规模高效率地生产N蛋白，然后用常规的分离和纯化方法获得纯化的N蛋白。纯化的N蛋白可用于生产抗体、SARS诊断试剂盒、和其他用途。
疫苗组合物本发明还提供了一种疫苗组合物，它包括携带全部或部分优化的N蛋白编码序列的质粒或病毒载体，以及药学上可接受的载体。当本发明的疫苗组合物被施用于哺乳动物(如人)时，这些质粒或病毒载体会在体内高效表达N蛋白、免疫原性片段或其衍生产物，从而诱导机体产生体液免疫及细胞免疫以防治SARS冠状病毒的感染。
可将药用组合物制备成各种剂型，如粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。
给药途径和剂量当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组病毒载体施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。给药的常规和药学上可接受的途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。
疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“免疫有效量”给予本发明的疫苗，即重组病毒载体的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效地促使保护宿主抵抗SARS病毒感染或SARS症状。
在各疫苗剂份中所选用的病毒载体的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1-1000μg，较佳地为1-200μg，更佳地10-100μg蛋白质。以病毒载体核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1ug-100mg核酸。另外，病毒载体疫苗的有效剂量的一般范围为约102-107，103-106或104-105空斑形成单位(PFU)。对于以腺病毒载体为例的非致病病毒疫苗载体，通常引入106-1012个腺病毒颗粒/每人，较佳地107-1011个腺病毒颗粒/每人。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂可提高对SARS病毒的免疫应答。
通过引介106至1012基因拷贝的非致病病毒疫苗载体腺病毒颗粒以携带此多核苷酸进入脊椎类动物尤以哺乳动物例如人类以及其他哺乳类动物的体内以诱导抗SARS冠状病毒的免疫反应。
本发明的主要优点在于(1)优化的N蛋白编码序列在哺乳动物中的表达效率更高，因此生产N蛋白的效率高。
(2)优化的N蛋白编码序列在哺乳动物中的表达效率更高，因此在接种的哺乳动物体内可产生更多的免疫原性N蛋白，从而有效地激发机体的免疫应答。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1优化的N蛋白编码序列的合成在本实施例中，根据公布的SARS冠状病毒N蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO2，以及哺乳动物的优选密码子，并根据以下原则对编码序列进行优化，(a)在不同物种之间密码子的选用有偏好性；(b)密码子选用的差异与翻译速度相关；(c)密码子的上下文(context)及某一特定密码子在某一特定位置的存在可严重影响翻译速度；尤其是对某些特别影响翻译速度的密码子进行了替换，设计出SEQ ID NO1所示序列。
然后用DNA合成仪(Mclab公司)，通过常规方法，即先获得寡核苷酸片段，然后将各片段退火，并PCR延伸，从而合成得到SEQ ID NO1的DNA序列。
SEQ ID NO1所示的优化合成的N蛋白基因只与原始冠状病毒N蛋白基因有76.3％相同性。其423个密码子中的265个密码子(或63％密码子)已被改变，但编码与原N蛋白相相同的氨基酸序列，以优化在哺乳动物细胞中的表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>陈，凌陈，克勤<120>优化的SARS冠状病毒N蛋白基因<130>033980<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1269<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1269)<223>优化的SARS冠状病毒N蛋白编码序列<400>1atgtctgaca atggccccca gtccaaccag aggtctgccc ccaggatcac ctttggcggc60cccacagact ccacagacaa caaccagaat ggcggcagga atggcgccag gcccaagcag120aggaggcccc agggcctgcc caacaacaca gcctcctggt tcacagccct gacccagcat180ggcaaggagg agctgaggtt ccccaggggc cagggcgtgc ccatcaacac caactctggc240cctgatgacc agattggcta ctacaggagg gccaccagga gggtgagggg cggcgatggc300aagatgaagg agctgtcccc caggtggtac ttctactacc tgggcacagg ccctgaggcc360tccctgccat atggcgccaa caaggagggc attgtctggg tggccacaga gggcgccctg420aacaccccca aggaccacat tggcaccagg aaccccaaca acaatgctgc cacagtgctg480cagctgcccc agggcaccac cctgcccaag ggcttctatg ctgagggctc caggggcggc540tcccaggcct cctccaggtc ctcctccagg tccaggggca actccaggaa ctccacccct600ggctcctcca ggggcaactc ccctgccagg atggcctctg gcggcggcga gacagccctg660gccctgctgc tgctggacag gctgaaccag ctggagtcca aggtctctgg caagggccag720
cagcagcagg gccagacagt gaccaagaag tctgctgctg aggcctccaa gaagcccagg780cagaagagga cagccaccaa gcagtacaat gtgacccagg cctttggcag gaggggccct840gagcagaccc agggcaactt tggcgaccag gacctgatca ggcagggcac agactacaag900cactggcccc agattgccca gtttgcccca tctgcctctg ccttctttgg catgtccagg960attggcatgg aggtgacccc atctggcacc tggctgacct accatggcgc catcaagctg1020gatgacaagg acccccagtt caaggacaat gtgatcctgc tgaacaagca cattgatgcc1080tacaagacct tcccccccac agagcccaag aaggacaaga agaagaagac agatgaggcc1140cagcccctgc cccagaggca gaagaagcag cccacagtga ccctgctgcc tgctgctgac1200atggatgact tctccaggca gctgcagaac tccatgtctg gcgcctctgc tgactccacc1260caggcctaa1269<210>2<211>422<212>PRT<213>SARS冠状病毒(SARA Coronavirus)<400>2Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110
Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro
370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala420
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码SARS冠状病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其与天然的SARS冠状病毒的N蛋白编码序列的相同性为76±3％。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它编码SEQ ID NO2所示的SARS冠状病毒N蛋白。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它选自下组(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列相同性大于95％，且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，与天然的SARS病毒的N蛋白编码序列相比，在哺乳动物细胞中，所述核酸分子编码的N蛋白的表达量提高至少100％。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，它是质粒。
8.如权利要求6所述的载体，其特征在于，它是病毒载体。
9.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
10.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体和药学上可接受的赋型剂或稀释剂。
全文摘要
本发明公开了优化的SARS冠状病毒N蛋白基因，它编码SARS冠状病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其与天然的SARS冠状病毒的N蛋白编码序列的相同性为76±3％(如SEQ ID NO1)。还提供了含有优化的N蛋白编码序列的载体、宿主细胞和疫苗组合物。经优化的N蛋白编码序列在哺乳动物细胞中的表达效率更高，因此生产N蛋白的效率更高，也能更有效地激发哺乳动物产生抗SARS的免疫应答。
文档编号A61P31/14GK1570101SQ03141620
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月16日 优先权日2003年7月16日
发明者陈凌, 陈克勤 申请人:陈克勤, 陈凌
技术领域：
本发明涉及病毒学、基因工程学及疫苗学，更具体地涉及优化的SARS冠状病毒N蛋白基因。此基因可运用于在哺乳类动物尤其是人类细胞环境中高效表达产生N蛋白。本发明还涉及含有该基因的载体及疫苗。
背景技术：
非典型肺炎，简称非典，又称严重急性呼吸综合症(SARS)已蔓延到全球三十多个国家和地区，尤为严重的包括中国、中国香港、新加坡、加拿大、越南、中国台湾和美国，短期内已导致严重的生命财产损失。最近的流行病学研究估计在60岁以上患者，死亡率可高达近半数。
一种新的SARS冠状病毒(SARS Coronavirus)已经被确认为是非典的致病诱因，该病毒的基因组已被测序并公布。SARS冠状病毒为ssRNA(+)病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。在电镜下，病毒颗粒呈不规则形，直径约为60-220nm，其表面有梅花形的膜粒，状如皇冠。颗粒中心在负染电镜下呈不定形态，核壳体呈疏松状态。包膜上有两种糖蛋白S蛋白和M蛋白。S蛋白为刺突糖蛋白，是主要的抗原，与受体结合，使细胞融合。M蛋白为跨膜蛋白，参与包膜形成。此外，N蛋白也具有免疫原性。
发展疫苗为预防病毒感染的最有效的方法，并被证实已成功地运用于多种致命的病毒感染，如天花、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、甲型肝炎、乙型肝炎。为了有效地控制和预防SARS，人们正在开发各种SARS疫苗，其中主要有五种类型灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒病毒载体疫苗。
然而，迄今为止尚没有真正有效的SARS疫苗问世。因此，本领域迫切需要开发有效的SARS疫苗，尤其是能够在宿主体内大量引入或产生免疫原性SARS多肽的疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够在宿主体内大量产生免疫原性SARS多肽的优化的SARS冠状病毒N蛋白基因，含有该基因的载体及疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码SARS冠状病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其与天然的SARS冠状病毒的N蛋白编码序列的相同性为76±3％。
在另一优选例中，所述的核酸分子编码SEQ ID NO2所示的SARS冠状病毒N蛋白。
在另一优选例中，所述的核酸分子含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的核酸分子选自下组(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列相同性大于95％，且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一优选例中，与天然的SARS病毒的N蛋白编码序列相比，在哺乳动物细胞中，所述核酸分子编码的N蛋白的表达量提高至少100％。
在本发明的第二方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体是质粒或病毒载体，更佳地所述的病毒载体是腺病毒。
在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体，或者被本发明上述的核酸分子所转化。
在本发明的第四方面，提供了了一种组合物，它含有本发明上述的载体或核酸分子以及药学上可接受的赋型剂或稀释剂。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对SARS冠状病毒的N蛋白的编码序列进行了一系列优化。优化后的编码序列更适合于在哺乳动物例如人类以及其他哺乳类动物的细胞或组织环境中表达，从而不仅更适合在哺乳动物细胞系统大规模高效表达生产N蛋白，而且也更适合作为DNA疫苗。
本发明一种优化的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，含1269bp，编码与原始冠状病毒N蛋白相同的氨基酸序列以保持其免疫抗原性质。然而，此优化合成的基因只与原始冠状病毒N蛋白基因有76.3％相同性。其423个密码子中的265个密码子(或63％密码子)已被改变，但保留了与原N蛋白相相同的氨基酸序列以优化在哺乳类细胞中的表达，以及用于疫苗的用途。
SEQ ID NO1所示的核苷酸序列被称为“CONO”，意为优化的冠状病毒N蛋白基因(CoronavirusNproteinoptimized gene)。
应理解，由于SARS病毒也会象其他病毒一样发生变异，因此，对于氨基酸序列不同于SEQ ID NO2的变异的N蛋白，可以在SEQ ID NO1的基础上，在相应位置用相应的哺乳动物细胞优选的密码子替换相应的SARS病毒的密码子，从而获得优化的、编码突变N蛋白的核苷酸序列。
如本文所用，术语“优化的N蛋白编码序列”是指SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO1相同性大于95％，较佳地大于96％，更佳地大于98％的核苷酸序列。与原SARS病毒的N蛋白核苷酸序列相比，在哺乳动物细胞(如CHO细胞等)中，优化的N蛋白编码序列的表达量提高至少100％，更佳地提高至少200％或更高。
此外，本发明除了包括全长的优化的N蛋白编码序列之外，还包括其片段，例如基于SEQ ID NO1所示序列且编码免疫原性N蛋白片段的核苷酸序列。
本发明优化的N蛋白编码序列，可通过DNA重组技术导入脊椎类动物，尤其是哺乳动物例如人类以及其他哺乳类动物的细胞或组织环境中，从而高效地表达N蛋白、免疫原性片段或其衍生产物。
本发明还提供了含有全部或部分优化的N蛋白编码序列的质粒或病毒载体，以及因被所述质粒转入或病毒载体转染入从而含有本发明优选的N蛋白编码序列的哺乳动物宿主细胞。
一种优选的病毒载体是腺病毒载体，例如目前已用于临床疫苗试验的复制缺陷腺病毒载体，包括E1区域缺失型、E3区域或缺失或保留的5型或2型或其他亚型腺病毒。在某些情况下，腺病毒载体也可包括E1区域，但在其他区域被缺失。其他腺病毒载体可包括多区域缺失的载体，例如助手依赖型或全缺失型腺病毒载体。
在腺病毒基因组的E1区域或者E3区域或其他合适区域，可插入一个SARS病毒的N蛋白表达盒。该表达盒从5′→3′依次含有1)表达启动子(promoter)；2)与所述启动子操作性相连的优化的冠状病毒N蛋白编码序列(包括其变异体或衍生片段)；3)与该优化的编码序列相连的多腺苷酸化信号序列。
除了腺病毒载体之外，其他的其他病毒载体包括但不局限于腺病毒相关病毒(AAV，adem-assocated virus)、痘病毒(vaccinia virus)等。
另一种优选的载体是质粒载体。在该质粒载体中同样插入SARS病毒的N蛋白表达盒。
通过培养导入本发明优化的N蛋白编码序列的哺乳动物细胞，可以大规模高效率地生产N蛋白，然后用常规的分离和纯化方法获得纯化的N蛋白。纯化的N蛋白可用于生产抗体、SARS诊断试剂盒、和其他用途。
疫苗组合物本发明还提供了一种疫苗组合物，它包括携带全部或部分优化的N蛋白编码序列的质粒或病毒载体，以及药学上可接受的载体。当本发明的疫苗组合物被施用于哺乳动物(如人)时，这些质粒或病毒载体会在体内高效表达N蛋白、免疫原性片段或其衍生产物，从而诱导机体产生体液免疫及细胞免疫以防治SARS冠状病毒的感染。
可将药用组合物制备成各种剂型，如粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。
给药途径和剂量当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组病毒载体施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。给药的常规和药学上可接受的途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。
疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“免疫有效量”给予本发明的疫苗，即重组病毒载体的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效地促使保护宿主抵抗SARS病毒感染或SARS症状。
在各疫苗剂份中所选用的病毒载体的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1-1000μg，较佳地为1-200μg，更佳地10-100μg蛋白质。以病毒载体核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1ug-100mg核酸。另外，病毒载体疫苗的有效剂量的一般范围为约102-107，103-106或104-105空斑形成单位(PFU)。对于以腺病毒载体为例的非致病病毒疫苗载体，通常引入106-1012个腺病毒颗粒/每人，较佳地107-1011个腺病毒颗粒/每人。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂可提高对SARS病毒的免疫应答。
通过引介106至1012基因拷贝的非致病病毒疫苗载体腺病毒颗粒以携带此多核苷酸进入脊椎类动物尤以哺乳动物例如人类以及其他哺乳类动物的体内以诱导抗SARS冠状病毒的免疫反应。
本发明的主要优点在于(1)优化的N蛋白编码序列在哺乳动物中的表达效率更高，因此生产N蛋白的效率高。
(2)优化的N蛋白编码序列在哺乳动物中的表达效率更高，因此在接种的哺乳动物体内可产生更多的免疫原性N蛋白，从而有效地激发机体的免疫应答。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1优化的N蛋白编码序列的合成在本实施例中，根据公布的SARS冠状病毒N蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO2，以及哺乳动物的优选密码子，并根据以下原则对编码序列进行优化，(a)在不同物种之间密码子的选用有偏好性；(b)密码子选用的差异与翻译速度相关；(c)密码子的上下文(context)及某一特定密码子在某一特定位置的存在可严重影响翻译速度；尤其是对某些特别影响翻译速度的密码子进行了替换，设计出SEQ ID NO1所示序列。
然后用DNA合成仪(Mclab公司)，通过常规方法，即先获得寡核苷酸片段，然后将各片段退火，并PCR延伸，从而合成得到SEQ ID NO1的DNA序列。
SEQ ID NO1所示的优化合成的N蛋白基因只与原始冠状病毒N蛋白基因有76.3％相同性。其423个密码子中的265个密码子(或63％密码子)已被改变，但编码与原N蛋白相相同的氨基酸序列，以优化在哺乳动物细胞中的表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>陈，凌陈，克勤<120>优化的SARS冠状病毒N蛋白基因<130>033980<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1269<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1269)<223>优化的SARS冠状病毒N蛋白编码序列<400>1atgtctgaca atggccccca gtccaaccag aggtctgccc ccaggatcac ctttggcggc60cccacagact ccacagacaa caaccagaat ggcggcagga atggcgccag gcccaagcag120aggaggcccc agggcctgcc caacaacaca gcctcctggt tcacagccct gacccagcat180ggcaaggagg agctgaggtt ccccaggggc cagggcgtgc ccatcaacac caactctggc240cctgatgacc agattggcta ctacaggagg gccaccagga gggtgagggg cggcgatggc300aagatgaagg agctgtcccc caggtggtac ttctactacc tgggcacagg ccctgaggcc360tccctgccat atggcgccaa caaggagggc attgtctggg tggccacaga gggcgccctg420aacaccccca aggaccacat tggcaccagg aaccccaaca acaatgctgc cacagtgctg480cagctgcccc agggcaccac cctgcccaag ggcttctatg ctgagggctc caggggcggc540tcccaggcct cctccaggtc ctcctccagg tccaggggca actccaggaa ctccacccct600ggctcctcca ggggcaactc ccctgccagg atggcctctg gcggcggcga gacagccctg660gccctgctgc tgctggacag gctgaaccag ctggagtcca aggtctctgg caagggccag720
cagcagcagg gccagacagt gaccaagaag tctgctgctg aggcctccaa gaagcccagg780cagaagagga cagccaccaa gcagtacaat gtgacccagg cctttggcag gaggggccct840gagcagaccc agggcaactt tggcgaccag gacctgatca ggcagggcac agactacaag900cactggcccc agattgccca gtttgcccca tctgcctctg ccttctttgg catgtccagg960attggcatgg aggtgacccc atctggcacc tggctgacct accatggcgc catcaagctg1020gatgacaagg acccccagtt caaggacaat gtgatcctgc tgaacaagca cattgatgcc1080tacaagacct tcccccccac agagcccaag aaggacaaga agaagaagac agatgaggcc1140cagcccctgc cccagaggca gaagaagcag cccacagtga ccctgctgcc tgctgctgac1200atggatgact tctccaggca gctgcagaac tccatgtctg gcgcctctgc tgactccacc1260caggcctaa1269<210>2<211>422<212>PRT<213>SARS冠状病毒(SARA Coronavirus)<400>2Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110
Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro
370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala420
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码SARS冠状病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其与天然的SARS冠状病毒的N蛋白编码序列的相同性为76±3％。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它编码SEQ ID NO2所示的SARS冠状病毒N蛋白。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它选自下组(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列相同性大于95％，且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，与天然的SARS病毒的N蛋白编码序列相比，在哺乳动物细胞中，所述核酸分子编码的N蛋白的表达量提高至少100％。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，它是质粒。
8.如权利要求6所述的载体，其特征在于，它是病毒载体。
9.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
10.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体和药学上可接受的赋型剂或稀释剂。
全文摘要
本发明公开了优化的SARS冠状病毒N蛋白基因，它编码SARS冠状病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其与天然的SARS冠状病毒的N蛋白编码序列的相同性为76±3％(如SEQ ID NO1)。还提供了含有优化的N蛋白编码序列的载体、宿主细胞和疫苗组合物。经优化的N蛋白编码序列在哺乳动物细胞中的表达效率更高，因此生产N蛋白的效率更高，也能更有效地激发哺乳动物产生抗SARS的免疫应答。
文档编号A61P31/14GK1570101SQ03141620
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月16日 优先权日2003年7月16日
发明者陈凌, 陈克勤 申请人:陈克勤, 陈凌
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