淫羊藿总黄酮片剂及制备方法
专利名称：淫羊藿总黄酮片剂及制备方法
技术领域：
本发明属于中药制剂技术领域。具体涉及一种淫羊藿总黄酮片及制备方法。
背景技术：
应用激素而引起的并发症和副作用可分为三类第一类是由于激素过多而引起皮质醇增多症的外在表现，如肥胖、满月脸、水牛背、多毛、紫纹、兴奋不寐、易饥多食等；第二类是激素过多引起代谢紊乱，如骨质疏松、高血糖、高血脂、高血压、消化性溃疡甚至出血、抑制免疫功能容易感染；第三类是激素长期应用后导致肾上腺皮质受抑制而呈废用性萎缩，此类患者对激素常呈依赖状态而不易撤除，而且遇到大的应激，如手术或严重感染，随时可发生急性肾上腺皮质功能不足的危象而威胁生命。因此如何减轻激素的副作用和并发症是临床迫切需要解决的难题。国外在改变激素的化学结构上作了不少工作，旨在提高抗炎、抗过敏作用而减少盐类潴留的副作用，但尚未能做到既不影响其抗炎这一主要作用，又能较全面纠正其副作用和并发症，而且使其自身肾上腺不受抑制，并有利于激素撤除，国内也同样如此。
在“肾本质”研究中，60年代初观察到肾阳虚患者垂体-肾上腺皮质轴功能低下，应用温补肾阳药可使之改善。动物实验证明温补肾阳药具有类似激素样作用，且可保护肾上腺免受外源性激素抑制而免于萎缩。
本发明人在10例长期(平均46个月)依赖激素的顽固性哮喘患者，用温补肾阳药可帮助激素顺利递减，使得7例撤激素获得成功，而且垂体-肾上腺皮质功能亦恢复正常。肾本质的研究表明，肾阳虚证患者及老年人都有神经内分泌免疫(Neuroendocrine and immune，NEI)网络功能低下，而温补肾阳复方可以提高已降低的NEI网络功能。在自拟的温肾复方用以延缓或提高NEI网络功能，如温阳片、补肾益寿片、寿而康片及自拟右归饮中均有淫羊藿，这四个温肾复方在肾阳虚证与老龄者的临床与动物实验中，均显示可明显改善其NEI网络功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于开发设计单味淫羊藿的温补肾阳制剂。
本发明提供了一种淫羊藿总黄酮片，该片剂包括淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料组成的，其中淫羊藿总黄酮提取物的含量为60％～65％。
本发明的淫羊藿总黄酮的片剂(仙灵脾)的药效研究如下一、单味淫羊藿(仙灵脾)与温补肾阳复方的比较在地塞米松鼠(模拟肾阳虚)动物模型上，观察补肾复方与单味仙灵脾对肾上腺皮质细胞体外分泌功能的影响。结果补肾复方组与仙灵脾组的肾上腺皮质细胞培养液中皮质酮含量在Cortrosyn(人工合成ACTH)刺激下都介于地塞米松组与对照组之间。见表1表1.补肾药对肾上腺皮质轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞体外Cortrosyn刺激的影响培养液皮质酮浓度(nmol/L，x±SD)组别动物数刺激前刺激后对照12259.91±21.52 381.64±121.84△△地塞米松107.09±6.81* 91.89±105.38激素复方1017.02±10.72* 182.04±134.60△激素仙灵脾 104.44±6.46* 231.63±245.02△注与对照组刺激前比较*P＜0.01；与地塞米松组刺激后比较△P＜0.05；与地塞米松组刺激后比较△△P＜0.01
二、单味淫羊藿临床与动物实验1998年选择需用激素的患者65例，病种有肾病综合征、红斑狼疮、血小板减少性紫癜、重症肌无力。随机分为复方强的松组(强的松加仙灵脾)与强的松组进行比较，结果复方强的松组的垂体-肾上腺皮质及免疫功能都比强的松组明显上升(P＜0.05)。见表2表2.3组观察前后血浆皮质醇、ACTH和淋转测定值比较(x±s)组别例数皮质醇(ug/L) ACTH(pg/ml)淋转(cpm)对照15 观察前 120.4±50.2 32.9±8.2 120335±12231观察后 110.6±50.0 33.0±7.5 124673±10981强的松 25 用药前 110.8±40.9 30.5±7.0 119082±10965用药后 50.2±20.1* 12.9±6.2* 52409±4587*复方40 用药前 110.5±40.6 31.2±7.4 115896±11245强的松 用药后 80.1±20.8△20.2±6.9△98336±5495△注与对照组同期比较*P＜0.05；与强的松组用药后比较△P＜0.05相应的动物实验亦得到相同的结果。见表3、表4表3.3组大鼠垂体-肾上腺、胸腺重量比较(mg，x±s)组别例数 垂体肾上腺 胸腺对照10 8.55±1.10 24.02±3.84 393.61±65.01模型10 6.90±0.98* 11.06±2.04** 204.52±38.49**仙灵脾 10 7.96±1.17△20.81±5.35△△250.32±35.94△△注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与皮质酮组比较△P＜0.05，△△P＜0.01表4.仙灵脾对HPAT轴抑制模型大鼠细胞免疫与细胞因子及抗炎作用的影响(x±s)LPR NKCC IL-2 γ-IFN棉球肉芽肿重量组别 鼠数 (cpm) (％) (u/ml) (mg)对照 10 119716±24856 61.8±8.281.20±8.9085.2±6.1 92.5±6.8
模型10 65187±22802* 15.6±7.8* 37.47±5.34* 40.5±5.2* 68.7±4.5*仙灵脾 10 101290±29580△48.5±9.2△62.92±12.89△63.3±5.8△70.1±5.8△注与对照组比较*P＜0.05；与皮质酮组比较△P＜0.05说明单味仙灵脾即能有效地对抗外源性激素对垂体-肾上腺-胸腺轴的抑制作用。
三、另一项实验采用模拟“肾阳虚”的皮质酮模型大鼠，以淫羊藿及其提取物总黄酮(EF)和多糖(EPS)，分别观察其对神经内分泌和免疫系统有何不同作用。见表5、表6表5.淫羊藿及其提取物对模型大鼠血浆CORT、ACTH的影响(x±s)组别 例数 CORT(μg/ml) ACTH(pg/ml)正常1010.10±4.4799.33±12.92模型104.08±2.15** 59.50±35.91*淫羊藿 105.97±1.88△79.80±24.46△EF 107.59±1.88△△113.0±32.43△△EPS 104.28±1.67 69.42±24.57注与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.005表6淫羊藿及其提取物对模型大鼠淋巴细胞增殖反应、NKC活性及γ-IFN水平的影响(x±s)组别例数淋转(cpm) NKC活性(％) γ-IFN(U/ml)对照 10 119716±24856 61.80±8.20 85.20±6.10模型 10 72854±28485* 15.60±7.80** 41.69±8.69**淫羊藿 10 104307±29695△46.60±8.30△△59.93±11.78△△EF 10 60401±2288415.25±8.40 54.68±15.25△EPS 10 126211±40657△48.62±10.20△△51.83±8.64△注与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.001；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.005结果表明模型组的下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴和细胞免疫功能同时受到明显抑制。淫羊藿水煎剂对HPA轴和细胞免疫均有明显改善，EF对HPA轴有明显改善，对细胞免疫亦有一定程度的改善作用；而EPS仅对细胞免疫有改善作用，由此提示淫羊藿所含不同有效组分具有对NEI系统不同侧重的调节作用。
四、淫羊藿总黄酮与补肾复方对皮质酮大鼠T细胞凋亡相关基因群调控的对比研究本研究采用的淫羊藿为辽宁产朝鲜淫羊藿(Epimedium KereanumNakai)，提取的EF.补肾复方选用右归饮及补肾益寿胶囊，右归饮组成为附子、肉桂、熟地、山茱萸、山药、枸杞子、仙灵脾、炙甘草；补肾益寿胶囊由炙首乌、黄精、人参、枸杞子、仙灵脾、人参、灵芝等组成(由四川太极集团提供)，制成浓度为1.2g/100ml工作液；健脾复方采用四君子汤。4月龄雄性SD大鼠60只，随机分为6组进行实验。造模药物为皮质酮，结果见表7-9表7.各组大鼠T细胞凋亡百分率(x±s)组别 例数 T细胞凋亡百分率％正常组10 34.25±6.47模型组10 45.87±7.22*四君子汤组10 36.92±11.82右归饮组 10 35.90±7.39△△补肾益寿组10 36.20±9.14△EF组 10 36.81±10.33△*与正常组相比，P＜0.01；△与模型组相比P＜0.05；△△与模型组相比P＜0.01表8.各组大鼠T细胞凋亡相关基因表达(x±s)组别 例数 Fas/GAPDHFasL/GAPDH TNFR1/GAPDH TNFR2/GAPD Bcl-2/GAPDHBax/GAPDH正常组 81.572±0.063 1.553±0.0771.725±0.127 1.328±0.0821.294±0.134 1.516±0.193模型组 81.422±0.077**1.413±0.050**1.390±0.163**1.525±0.232*1.573±0.223**1.332±0.120*四君子汤组 81.427±0.062 1.464±0.0601.519±0.055 1.356±0.0871.367±0.028△1.362±0.125右归组 81.486±0.080 1.525±0.067△△1.603±0.046△△1.375±0.1311.350±0.163△1.489±0.177补肾益寿组 81.454±0.048 1.512±0.078△△1.541 ±0.070△1.348±0.0501.376±0.046△1.369±0.138EF组81.430±0.080 1.506±0.089△1.543±0.054△1.384±0.0431.369±0.057△1.374±0.095*与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；**与正常组相比有极显著性差异(P＜0.01)△与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)；△△与模型组相比极有显著性差异(P＜0.01)
表9.各组大鼠caspase8、caspase3活性比较(x±s)组别 例数caspase8 caspase3正常组8 0.125±0.030 0.269±0.094模型组8 0.190±0.066* 0.491±0.157**四君子汤组8 0.158±0.032 0.366±0.079右归组8 0.132±0.031△0.299±0.126△补肾益寿组8 0.134±0.025△0.354±0.027△EF组 8 0.134±0.023△0.326±0.131△*与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；**与正常组相比有极显著性差异(P＜0.01)△与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)。
鉴于两个补肾复方(右归饮和补肾益寿胶囊)仅淫羊藿为共有，故本研究以皮质酮大鼠为模型，设EF与两个补肾复方及健脾复方进行比较。结果表明EF与两个补肾复方对于皮质酮大鼠T细胞过度凋亡均有明显下调作用，而且在下调促凋亡FasL、TNFR1基因的mRNA表达，上调抗凋亡Bcl-2基因的mRNA表达，及降低凋亡启动酶Caspase8、执行酶Caspase3的活性方面都具有完全相同的调节方式。由此看到淫羊藿总黄酮在T细胞凋亡及其基因调控过程中，可以代表补肾复方保护神经内分泌免疫系统拮抗外源性激素对T细胞的抑制，对撤除激素或减轻激素的不良反应有其良好的应用前景。
5、淫羊藿总黄酮对外源性糖皮质激素造成的HPAT轴受抑制模型的保护作用研究材料及方法药物制备淫羊藿总黄酮由上海市医药工业研究院提取，含量为60％。
动物分组、造模雄性SD大鼠55只，月龄4个月，体重230-250g，由复旦大学动物实验部提供。造模药物为皮质酮(Sigma，USA)，使用时溶于灭菌橄榄油中，工作浓度为20mg/ml。大鼠随机分为4组，每组各11只，各组大鼠体重无统计学差异，分别为正常对照组、皮质酮模型组、淫羊藿总黄酮治疗组(EF组)及补肾复方治疗组，模型组及各治疗组均根据10mg/kg皮下注射皮质酮，正常对照组以等体积灭菌橄榄油代替皮质酮，每天1次，连续14天，各治疗组分别根据体重以相应的药物灌胃，正常组及模型组用蒸馏水代替药物灌胃，每天1次，连续14天。第15天，所有大鼠乙醚麻醉后，分别称重、心脏采血、无菌分离脾脏、剥离胸腺、肾上腺。测定血浆皮质醇水平、胸腺指数、肾上腺指数、淋巴细胞转化率。
结果1.各组大鼠体重比较结果见表1。实验表明模型组与正常组相比，体重显著减轻，P＜0.01；淫羊藿总黄酮治疗组体重与模型组比较增加，P＜0.01，补肾复方组体重无明显变化。表明淫羊藿总黄酮可提高大鼠体重，抵消激素对全身皮肤、结缔组织、肌肉等各组织的消耗作用。
表10各组大鼠体重(x±SD)组别 例数 体重正常 11 308.36±11.93**模型 11 266.55±14.94EF组 11 297.09±9.31**复方组11 278.91±15.06**与模型组相比P＜0.012.各组大鼠胸腺指数的比较结果见表2。实验表明模型组与正常组相比，胸腺重量显著减轻，P＜0.01；淫羊藿总黄酮治疗组、补肾复方组与模型组相比均具有极显著性差异，P＜0.01。表明淫羊藿总黄酮与补肾复方均可提高大鼠胸腺重量，抵消激素对中枢淋巴器官的抑制。
表11各组大鼠胸腺指数(x±SD)组别 例数 胸腺指数正常 11 151.01±26.33**模型 11 91.52±28.23EF组 11 146.60±23.49**复方组11 128.40±21.572****与模型组相比P＜0.013.各组大鼠肾上腺指数比较结果见表3。实验表明模型组与正常组相比，肾上腺重量显著减轻，P＜0.01，表明激素对肾上腺具有抑制作用；淫羊藿总黄酮和补肾复方与模型组比较有极显著性差异，P＜0.01，表明淫羊藿总黄酮和补肾复方均可提高大鼠肾上腺重量，对激素抑制肾上腺的作用具有对抗效应。
表12各组大鼠肾上腺指数(x±SD)组别 例数肾上腺指数正常 11 8.22±2.99**模型 11 3.76±0.21EF组 11 7.94±2.15**复方组11 9.16±1.98****与模型组相比P＜0.014.各组大鼠淋巴细胞转化率(LPR)的比较结果见表4。实验表明模型组与正常组相比，淋巴细胞转化率显著降低，P＜0.05，表明激素对外周淋巴细胞具有抑制作用；淫羊藿总黄酮与补肾复方均可提高LPR，与模型组比较淫羊藿总黄酮组P＜0.01，补肾复方组P＜0.05，表明淫羊藿总黄酮具有对抗激素对外周淋巴细胞免疫抑制的作用。
表13各组大鼠LPR(x±SD)组别 例数 LPR正常111.30±0.23*模型110.96±0.12EF组111.31±0.13**复方组 111.21±0.14**与模型组相比P＜0.05；5.各组大鼠血浆皮质醇含量比较结果见表5。实验表明模型组与正常组相比，血浆皮质醇含量显著减少，P＜0.05，表明肾上腺皮质功能已明显减退；补肾复方组血浆皮质醇含量与模型组相比无显著增高，P＞0.05；淫羊藿总黄酮组血浆皮质醇含量与模型组相比增高，具有显著性差异，P＜0.05，表明淫羊藿总黄酮可提高和保护大鼠肾上腺皮质功能，对激素抑制肾上腺皮质功能的作用具有对抗效应。
表14各组大鼠血浆皮质酮含量测定组别 例数血浆皮质酮正常组11 3.68±2.30*模型组11 1.94±1.27EF组 11 4.06±3.06*复方组11 4.58±3.40*与模型组相比P＜0.05；**与模型组相比P＜0.01以上研究提示，淫羊藿总黄酮与补肾复方比较，具有全面的保护外源性糖皮质激素造成大鼠HPAT轴受抑制的作用，结合前期的系列研究结果，充分表明淫羊藿总黄酮对撤除激素或减轻激素的不良反应有其良好的应用前景。
本研究拟对老年大鼠淋巴细胞即刻凋亡(spontaneous apoptosis)进行定量分析，并采用高通量的基因芯片技术分析其基因表达谱。同时进一步观察淫羊藿总黄酮(Epimedium Flavonoids，EF)对淋巴细胞凋亡及其基因表达谱的影响，目的是了解淫羊藿总黄酮重建衰老免疫稳态的基因调控模式，以阐明淫羊藿总黄酮重建衰老免疫稳态的分子机制。
材料与方法1材料1.1动物分组实验用清洁级SD大鼠由复旦大学动植物科学部提供，23月龄大鼠30只，雌雄各半，随机分为2组，即老年对照组(OC组)、淫羊藿总黄酮组(EF组)；EF组给予EF灌胃，OC组同时给予蒸馏水灌胃，灌胃时间为3个月。另设4月龄SD大鼠7只作为年轻对照组(YC组)。所有动物乙醚麻醉，无菌取脾，分离脾脏淋巴细胞。
1.2药物制备本研究采用辽宁产朝鲜淫羊藿(EpimediumKereanum Nakai)，由上海市医药工业研究院中药室提取淫羊藿总黄酮。实验时以蒸馏水配制为3g/100ml的溶液，根据0.06g/kgBW/d灌胃。
1.3试剂淋巴细胞分离液为Lympholyte-Rat(CL5045，CEDARLANE，CANADA)；ANNEXIN V-FITC APOPTOSISDETECTION KIT I(BD Bioscience，U.S.A)；TRIZOLReagent(GIBCOBRL，Life technologies，U.S.A)；Rneasy Mini Kit(Qiagen，Germany)；采用GeneChip T7-oligo(dT)Promoter Primer Kit及SuperScript II RT合成cDNA第一链；采用Enzo BioArray HighYield RNA TranscripLabeling Kit3(Affymetrix，U.S.A)合成生物素标记的cRNA；采用GeneChip Sample Cleanup Module纯化生物素标记的cRNA；采用Test3 Array(Affymetrix)进行预实验，以确定Biotin-labeled cRNA质量。Test Chip检测之后，采用Rat Genome U34A Array(Affymetrix)，对各组cRNA样品进行检测。
2方法2.1流式细胞仪检测细胞凋亡百分率PBS洗涤淋巴细胞2次，以1×binding buffer调整细胞浓度为1×106cells/ml；取100μl样品，加入5μl AnnexinV和5μl PI；轻微混匀细胞，25℃暗室孵育15min；每份样品中加入400μl 1×binding buffer；流式细胞仪检测分析AnnexinV(+)、PI(-)的细胞百分率。
2.2基因芯片检测各组大鼠淋巴细胞基因表达谱并比较分析老年对照组与年轻对照组、淫羊藿总黄酮组与老年对照组差异表达的基因。具体方法如下细胞内总RNA抽提、纯化、鉴定及定量之后，合成cDNA第一链、第二链。双链cDNA产物纯化后，采用EnzoBioArray HighYield RNA Transcrip Labeling Kit合成生物素标记的cRNA.进一步对cRNA产物进行定量和鉴定后，进行cRNA产物的片断化，片断化后的cRNA即可用于杂交。杂交反应在HybridizationOven640(Affymetrix)中进行。进一步进行洗涤及染色，反应在FluidicsStation 400(Affymetrix)中进行，采用Washing Buffer A、WashingBuffer B进行洗涤；采用Streptavidin Phycoerythrin Stain solution进行染色。采用Scanner(Affymetrix)进行扫描，扫描过程在AffymetrixMicroarray Suite5.0的控制下进行。
3数据处理3.1凋亡细胞百分率采用均数±标准差表示，采用SPSS11.0 forwindows软件包进行统计学处理，p＜0.05为有统计学意义。
3.2基因芯片检测数据采用Affymetrix Microarray Suite5.0软件进行分析。数据分析采用Statistical Algorithm.在对单个样本表达分析的前体下，即根据Detection p-value，＜0.04为Present；0.04-0.06为Marginal；＞0.06为Absent，进一步进行两组间比较，根据Signal LogRatio(SLR)进行判断。SLR＞1(即表达倍数＞21)为表达上调，有统计学意义；SLR＜-1(即表达倍数＜2-1)，为表达下调，有统计学意义。
结果1、淫羊藿总黄酮对老年大鼠淋巴细胞细胞凋亡的影响我们采用流式细胞仪结合FITC-Annexin V-PI双染色对各组大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率进行了定量分析。结果表明老年大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率显著高于年轻大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率，提示老年大鼠体内淋巴细胞存在过度凋亡；淫羊藿总黄酮干预后的脾淋巴细胞凋亡百分率与老年大鼠对照组相比显著降低，提示淫羊藿总黄酮可显著干预老年大鼠免疫稳态失衡的重要机制—淋巴细胞过度凋亡，具有老年大鼠重建免疫稳态的作用。见表15表15各组大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率(％)x±SD组别例数细胞凋亡百分率(％)YC 7 10.91±6.70OC 7 25.81±9.11△EF 7 11.95±4.38☆注△OC与YC相比，p＜0.01；☆EF与OC相比，p＜0.012、老年大鼠淋巴细胞基因表达谱与年轻对照比较老年大鼠与年轻大鼠相比较，表达上调的基因有116个，表达下调的基因有215个。结合我们研究的背景进行分析，老年大鼠淋巴细胞特征性的基因表达模式有以下特点(1)具有促进细胞凋亡作用的基因表达显著上调，如参与细胞凋亡发生中心控制及效应环节的Caspasel、Caspase3；Calpain II；Dnase gamma；PKC delta；Bnip31；p47等。具有抗凋亡作用的基因如Cathepsin B、Mtal等表达显著下调。(2)具有抗增殖作用的基因表达显著上调，如Rb、Anti-proliferative factor等。具有促进细胞增殖作用的基因表达显著下调，如c-myc、c-fos、Jun、A-raf；Rgc32、Cyclin B1、Cyclin G-associated kinase等。(3)参与淋巴细胞活化增殖及免疫效应等基本信号通路的组成元件中，多个重要信号分子的表达显著下调，如酶关联受体信号途径重要信号分子Serine/Threonine protein kinase、cAMP dependent protein kinase、Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase 2、Spleen tyrosine kinase、inositol trisphosphate receptor subtype 3(IP3R-3)、RAC protein kinasegamma、、guanylate cyclase、protein-tyrosine-phospatase等。(4)免疫细胞效应及功能的基本调节因子表达异常，如MHC I类抗原表达显著上调，MHC II类抗原表达显著下调；IFN-γ及CD24表达显著下调等。
3、淫羊藿总黄酮对老年大鼠淋巴细胞基因表达的影响淫羊藿总黄酮干预后的老年大鼠淋巴细胞基因谱与老年对照组淋巴细胞基因表达谱相比较，表达的上调基因有447个，表达下调的基因有456个。结合免疫衰老的研究背景进一步分析表明，淫羊藿总黄酮调控老年大鼠淋巴细胞基因表达的作用模式有以下几个特点(1)淫羊藿总黄酮可调节细胞凋亡相关基因的表达—显著下调促凋亡基因的转录的同时显著上调抗凋亡基因的转录。如具有促进细胞凋亡作用的基因Caspase1、Caspase2、Caspase3、Caspase6；Calpains；CathepsinD、CathepsinH、CathepsinS；Dnase gamma；PKC delta等在淫羊藿总黄酮组的表达显著下调。与此同时，Cathepsin B、Mta1、NF-kappa B、Notch的具有抗凋亡作用的基因表达显著上调。(2)淫羊藿总黄酮可调节细胞增殖相关基因的表达，具体表现在显著上调促进细胞生存及增殖的c-Jun、PCNA、A-raf、Rgc32、Cyclin G-associated kinase等基因的转录，同时显著下调抗增殖的Rb等基因的转录。(3)淫羊藿总黄酮显著上调淋巴细胞活化及免疫效应相关的基本信号传导组成元件中多个信号分子的表达，如 Serine/Threonine protein kinase、Serine/Threonine protein kinase(pim3)、Serine/Threonine protein kinase(tpl2)；cAMP dependent protein kinase；PI3K、inositol trisphosphatereceptor subtype 3(IP3R-3)、PI3K Receptor、protein-tyrosine-phospatase、protein kinase C-eta、protein kinase等基因的转录在淫羊藿总黄酮组显著上调。(4)淫羊藿总黄酮显著上调免疫细胞效应及功能的基本调节因子的表达，如淫羊藿总黄酮显著上调CD2、CD3、CD5、TCR；IL-2、IL-2R(CD25)、CD28、CTLA4等基因的表达。
因此，淫羊藿总黄酮在上调抗凋亡基因转录的同时下调促凋亡基因的转录；在上调促增殖基因转录的同时下调抗增殖基因的转录；上调促进淋巴细胞活化信号传导、免疫效应调控等基因的转录。
讨论淫羊藿总黄酮可显著降低老年大鼠淋巴细胞的过度凋亡，提示出其延缓免疫衰老的作用。多个促凋亡基因、抗凋亡基因，促增殖基因、抗增殖基因的功能体现一种协同、拮抗的模式。免疫稳态的维持必须以这些功能相反的基因“对子”的平衡表达为前提。衰老免疫稳态失衡的重要基因背景就是这些基因“对子”的表达稳态被打破。淫羊藿总黄酮上调抗凋亡基因表达的同时，下调促凋亡基因的表达；上调促增殖基因表达的同时，下调抗增殖基因的表达。其作用的总体趋势在于重新调整决定细胞生存与死亡双方力量的对比，从而使衰老状态下淋巴细胞的基因表达趋势呈现一种有利于细胞生存、增殖及正常功能发挥的模式，这正是其重建衰老免疫稳态的分子机制所在。
全基因组分析所提供的大量信息提示出淫羊藿总黄酮调节基因表达失衡的规律，即逆转功能对立的促凋亡基因与抗凋亡基因、促增殖基因与抗增殖基因在衰老淋巴细胞中表达的异常，重塑基因表达的良性平衡，使整合后的基因表达体现出抗凋亡、重建免疫稳态的生物学效应。这一研究结果充分提示出淫羊藿总黄酮具有延缓免疫衰老的作用，并较为全面地阐明了淫羊藿总黄酮延缓免疫衰老的分子作用机制。
本发明的另一目的是提供了上述一种淫羊藿总黄酮片剂的制备方法，该方法包括下列步骤(1)淫羊藿总黄酮提取物的制备淫羊藿叶子加水煎煮二次，每次用水量为药材重量的16倍。第一次煎煮时间为煮沸后保持微沸2小时，第二次煮沸后保持微沸1.5小时，每次煎煮液用4层纱布过滤，合并滤液充分冷却至室温。上大孔吸附树脂，树脂用量为1Kg淫羊藿叶子用1升树脂，流速为1.5L/分钟。上样结束后，以去离子水洗脱，流速同前，去离子水用量为500升，水洗结束后，用15％EtOH200升洗脱，流速同前，再以40％EtOH500升洗脱，流速不变，加50％EtOH300升洗脱，流速同前，以酒精比重计测定洗脱液含醇量达45％时，开始收集洗脱液至所加50％EtOH洗脱结束，减压浓缩至干后，粉碎，即得淫羊藿总黄酮提取物。
(2)将步骤(1)制得的淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料按片剂常规方法制片即得淫羊藿总黄酮片剂。
本发明片剂含量范围淫羊藿总黄酮含量为60％-65％。
剂型及辅料片剂，采用淀粉(制成10％浆)、硬脂酸镁作为辅料。
本发明的另一目的是提供了上述一种淫羊藿总黄酮在制备减轻应用外源性糖皮质激素副作用和延缓免疫衰老药剂的应用。
本发明的淫羊藿总黄酮片剂具有下列作用特点1、减轻应用外源性糖皮质激素副作用主要表现为对抗糖皮质激素对胸腺、肾上腺及淋巴细胞的抑制作用，提高激素应用后大鼠的体重、胸腺指数、肾上腺指数、淋巴细胞转化率及血清皮质酮含量等。从而具有减轻激素应用副作用和不良反应的作用。
2、延缓免疫衰老主要表现为对免疫衰老的重要标志—淋巴细胞的过度凋亡具有显著的下调作用，并可调节衰老淋巴细胞凋亡、增殖、信号传导及免疫效能等多基因的表达。有助于减低免疫衰老相关的疾病如感染、肿瘤、自身免疫性疾病的发生，提高生存质量，延长寿命。
具体实施例方式实例淫羊藿总黄酮片〔处方〕淫羊藿总黄酮1.00kg、淀粉(制成10％浆)0.25g、硬脂酸镁0.01g，共制成10000片〔制法〕取淫羊藿总黄酮粉末状提取物，加入10％淀粉浆，充分搅拌，混合均匀后制成软材，过14目筛制粒，50-70℃干燥至干粒含水量约为6％，整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，压片，每片中含淫羊藿总黄酮0.1g。
〔应用〕减轻应用外源性糖皮质激素副作用；延缓免疫衰老。
〔用法〕口服，一次0.1g，一日0.3g。
权利要求
1.一种淫羊藿总黄酮片剂，其特片在于该片剂包括淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料组成，其中淫羊藿总黄酮提取物含量为60％～65％。
2.一种如权利要求1所述的一种淫羊藿总黄酮片剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)淫羊藿总黄酮提取物的制备淫羊藿叶子加水煎煮二次，每次用水量为药材重量的16倍，第一次煎煮时间为煮沸后保持微沸2小时，第二次煮沸后保持微沸1.5小时，每次煎煮液用4层纱布过滤，合并滤液充分冷却至室温，上大孔吸附树脂，树脂用量为1Kg淫羊藿叶子用1升树脂，流速为1.5L/分钟，上样结束后，以去离子水洗脱，流速同前，去离子水用量为500升，水洗结束后，用15％EtOH200升洗脱，流速同前，再以40％EtOH500升洗脱，流速不变，加50％EtOH300升洗脱，流速同前，以酒精比重计测定洗脱液含醇量达45％时，开始收集洗脱液至所加50％EtOH洗脱结束，减压浓缩至干后，粉碎，即得淫羊藿总黄酮提取物，(2)将步骤(1)制得的淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料按片剂常规方法制片即得淫羊藿总黄酮片剂。
3.一种淫羊藿总黄酮提取物在制备减轻应用外源性糖皮质激素副作用和延缓免疫衰老药剂中的应用。
全文摘要
本发明属于中药制剂技术领域。本发明公开了一种淫羊藿总黄酮片剂。本发明的片剂包括淫羊藿总黄酮与药用辅料组成。它具有减轻激素应用副作用和不良反应的作用和延缓免疫衰老作用。本发明提供了制备方法。
文档编号A61K31/7042GK1569017SQ03141780
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月24日 优先权日2003年7月24日
发明者沈自尹 申请人:复旦大学附属华山医院
技术领域：
本发明属于中药制剂技术领域。具体涉及一种淫羊藿总黄酮片及制备方法。
背景技术：
应用激素而引起的并发症和副作用可分为三类第一类是由于激素过多而引起皮质醇增多症的外在表现，如肥胖、满月脸、水牛背、多毛、紫纹、兴奋不寐、易饥多食等；第二类是激素过多引起代谢紊乱，如骨质疏松、高血糖、高血脂、高血压、消化性溃疡甚至出血、抑制免疫功能容易感染；第三类是激素长期应用后导致肾上腺皮质受抑制而呈废用性萎缩，此类患者对激素常呈依赖状态而不易撤除，而且遇到大的应激，如手术或严重感染，随时可发生急性肾上腺皮质功能不足的危象而威胁生命。因此如何减轻激素的副作用和并发症是临床迫切需要解决的难题。国外在改变激素的化学结构上作了不少工作，旨在提高抗炎、抗过敏作用而减少盐类潴留的副作用，但尚未能做到既不影响其抗炎这一主要作用，又能较全面纠正其副作用和并发症，而且使其自身肾上腺不受抑制，并有利于激素撤除，国内也同样如此。
在“肾本质”研究中，60年代初观察到肾阳虚患者垂体-肾上腺皮质轴功能低下，应用温补肾阳药可使之改善。动物实验证明温补肾阳药具有类似激素样作用，且可保护肾上腺免受外源性激素抑制而免于萎缩。
本发明人在10例长期(平均46个月)依赖激素的顽固性哮喘患者，用温补肾阳药可帮助激素顺利递减，使得7例撤激素获得成功，而且垂体-肾上腺皮质功能亦恢复正常。肾本质的研究表明，肾阳虚证患者及老年人都有神经内分泌免疫(Neuroendocrine and immune，NEI)网络功能低下，而温补肾阳复方可以提高已降低的NEI网络功能。在自拟的温肾复方用以延缓或提高NEI网络功能，如温阳片、补肾益寿片、寿而康片及自拟右归饮中均有淫羊藿，这四个温肾复方在肾阳虚证与老龄者的临床与动物实验中，均显示可明显改善其NEI网络功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于开发设计单味淫羊藿的温补肾阳制剂。
本发明提供了一种淫羊藿总黄酮片，该片剂包括淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料组成的，其中淫羊藿总黄酮提取物的含量为60％～65％。
本发明的淫羊藿总黄酮的片剂(仙灵脾)的药效研究如下一、单味淫羊藿(仙灵脾)与温补肾阳复方的比较在地塞米松鼠(模拟肾阳虚)动物模型上，观察补肾复方与单味仙灵脾对肾上腺皮质细胞体外分泌功能的影响。结果补肾复方组与仙灵脾组的肾上腺皮质细胞培养液中皮质酮含量在Cortrosyn(人工合成ACTH)刺激下都介于地塞米松组与对照组之间。见表1表1.补肾药对肾上腺皮质轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞体外Cortrosyn刺激的影响培养液皮质酮浓度(nmol/L，x±SD)组别动物数刺激前刺激后对照12259.91±21.52 381.64±121.84△△地塞米松107.09±6.81* 91.89±105.38激素复方1017.02±10.72* 182.04±134.60△激素仙灵脾 104.44±6.46* 231.63±245.02△注与对照组刺激前比较*P＜0.01；与地塞米松组刺激后比较△P＜0.05；与地塞米松组刺激后比较△△P＜0.01
二、单味淫羊藿临床与动物实验1998年选择需用激素的患者65例，病种有肾病综合征、红斑狼疮、血小板减少性紫癜、重症肌无力。随机分为复方强的松组(强的松加仙灵脾)与强的松组进行比较，结果复方强的松组的垂体-肾上腺皮质及免疫功能都比强的松组明显上升(P＜0.05)。见表2表2.3组观察前后血浆皮质醇、ACTH和淋转测定值比较(x±s)组别例数皮质醇(ug/L) ACTH(pg/ml)淋转(cpm)对照15 观察前 120.4±50.2 32.9±8.2 120335±12231观察后 110.6±50.0 33.0±7.5 124673±10981强的松 25 用药前 110.8±40.9 30.5±7.0 119082±10965用药后 50.2±20.1* 12.9±6.2* 52409±4587*复方40 用药前 110.5±40.6 31.2±7.4 115896±11245强的松 用药后 80.1±20.8△20.2±6.9△98336±5495△注与对照组同期比较*P＜0.05；与强的松组用药后比较△P＜0.05相应的动物实验亦得到相同的结果。见表3、表4表3.3组大鼠垂体-肾上腺、胸腺重量比较(mg，x±s)组别例数 垂体肾上腺 胸腺对照10 8.55±1.10 24.02±3.84 393.61±65.01模型10 6.90±0.98* 11.06±2.04** 204.52±38.49**仙灵脾 10 7.96±1.17△20.81±5.35△△250.32±35.94△△注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与皮质酮组比较△P＜0.05，△△P＜0.01表4.仙灵脾对HPAT轴抑制模型大鼠细胞免疫与细胞因子及抗炎作用的影响(x±s)LPR NKCC IL-2 γ-IFN棉球肉芽肿重量组别 鼠数 (cpm) (％) (u/ml) (mg)对照 10 119716±24856 61.8±8.281.20±8.9085.2±6.1 92.5±6.8
模型10 65187±22802* 15.6±7.8* 37.47±5.34* 40.5±5.2* 68.7±4.5*仙灵脾 10 101290±29580△48.5±9.2△62.92±12.89△63.3±5.8△70.1±5.8△注与对照组比较*P＜0.05；与皮质酮组比较△P＜0.05说明单味仙灵脾即能有效地对抗外源性激素对垂体-肾上腺-胸腺轴的抑制作用。
三、另一项实验采用模拟“肾阳虚”的皮质酮模型大鼠，以淫羊藿及其提取物总黄酮(EF)和多糖(EPS)，分别观察其对神经内分泌和免疫系统有何不同作用。见表5、表6表5.淫羊藿及其提取物对模型大鼠血浆CORT、ACTH的影响(x±s)组别 例数 CORT(μg/ml) ACTH(pg/ml)正常1010.10±4.4799.33±12.92模型104.08±2.15** 59.50±35.91*淫羊藿 105.97±1.88△79.80±24.46△EF 107.59±1.88△△113.0±32.43△△EPS 104.28±1.67 69.42±24.57注与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.005表6淫羊藿及其提取物对模型大鼠淋巴细胞增殖反应、NKC活性及γ-IFN水平的影响(x±s)组别例数淋转(cpm) NKC活性(％) γ-IFN(U/ml)对照 10 119716±24856 61.80±8.20 85.20±6.10模型 10 72854±28485* 15.60±7.80** 41.69±8.69**淫羊藿 10 104307±29695△46.60±8.30△△59.93±11.78△△EF 10 60401±2288415.25±8.40 54.68±15.25△EPS 10 126211±40657△48.62±10.20△△51.83±8.64△注与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.001；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.005结果表明模型组的下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴和细胞免疫功能同时受到明显抑制。淫羊藿水煎剂对HPA轴和细胞免疫均有明显改善，EF对HPA轴有明显改善，对细胞免疫亦有一定程度的改善作用；而EPS仅对细胞免疫有改善作用，由此提示淫羊藿所含不同有效组分具有对NEI系统不同侧重的调节作用。
四、淫羊藿总黄酮与补肾复方对皮质酮大鼠T细胞凋亡相关基因群调控的对比研究本研究采用的淫羊藿为辽宁产朝鲜淫羊藿(Epimedium KereanumNakai)，提取的EF.补肾复方选用右归饮及补肾益寿胶囊，右归饮组成为附子、肉桂、熟地、山茱萸、山药、枸杞子、仙灵脾、炙甘草；补肾益寿胶囊由炙首乌、黄精、人参、枸杞子、仙灵脾、人参、灵芝等组成(由四川太极集团提供)，制成浓度为1.2g/100ml工作液；健脾复方采用四君子汤。4月龄雄性SD大鼠60只，随机分为6组进行实验。造模药物为皮质酮，结果见表7-9表7.各组大鼠T细胞凋亡百分率(x±s)组别 例数 T细胞凋亡百分率％正常组10 34.25±6.47模型组10 45.87±7.22*四君子汤组10 36.92±11.82右归饮组 10 35.90±7.39△△补肾益寿组10 36.20±9.14△EF组 10 36.81±10.33△*与正常组相比，P＜0.01；△与模型组相比P＜0.05；△△与模型组相比P＜0.01表8.各组大鼠T细胞凋亡相关基因表达(x±s)组别 例数 Fas/GAPDHFasL/GAPDH TNFR1/GAPDH TNFR2/GAPD Bcl-2/GAPDHBax/GAPDH正常组 81.572±0.063 1.553±0.0771.725±0.127 1.328±0.0821.294±0.134 1.516±0.193模型组 81.422±0.077**1.413±0.050**1.390±0.163**1.525±0.232*1.573±0.223**1.332±0.120*四君子汤组 81.427±0.062 1.464±0.0601.519±0.055 1.356±0.0871.367±0.028△1.362±0.125右归组 81.486±0.080 1.525±0.067△△1.603±0.046△△1.375±0.1311.350±0.163△1.489±0.177补肾益寿组 81.454±0.048 1.512±0.078△△1.541 ±0.070△1.348±0.0501.376±0.046△1.369±0.138EF组81.430±0.080 1.506±0.089△1.543±0.054△1.384±0.0431.369±0.057△1.374±0.095*与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；**与正常组相比有极显著性差异(P＜0.01)△与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)；△△与模型组相比极有显著性差异(P＜0.01)
表9.各组大鼠caspase8、caspase3活性比较(x±s)组别 例数caspase8 caspase3正常组8 0.125±0.030 0.269±0.094模型组8 0.190±0.066* 0.491±0.157**四君子汤组8 0.158±0.032 0.366±0.079右归组8 0.132±0.031△0.299±0.126△补肾益寿组8 0.134±0.025△0.354±0.027△EF组 8 0.134±0.023△0.326±0.131△*与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；**与正常组相比有极显著性差异(P＜0.01)△与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)。
鉴于两个补肾复方(右归饮和补肾益寿胶囊)仅淫羊藿为共有，故本研究以皮质酮大鼠为模型，设EF与两个补肾复方及健脾复方进行比较。结果表明EF与两个补肾复方对于皮质酮大鼠T细胞过度凋亡均有明显下调作用，而且在下调促凋亡FasL、TNFR1基因的mRNA表达，上调抗凋亡Bcl-2基因的mRNA表达，及降低凋亡启动酶Caspase8、执行酶Caspase3的活性方面都具有完全相同的调节方式。由此看到淫羊藿总黄酮在T细胞凋亡及其基因调控过程中，可以代表补肾复方保护神经内分泌免疫系统拮抗外源性激素对T细胞的抑制，对撤除激素或减轻激素的不良反应有其良好的应用前景。
5、淫羊藿总黄酮对外源性糖皮质激素造成的HPAT轴受抑制模型的保护作用研究材料及方法药物制备淫羊藿总黄酮由上海市医药工业研究院提取，含量为60％。
动物分组、造模雄性SD大鼠55只，月龄4个月，体重230-250g，由复旦大学动物实验部提供。造模药物为皮质酮(Sigma，USA)，使用时溶于灭菌橄榄油中，工作浓度为20mg/ml。大鼠随机分为4组，每组各11只，各组大鼠体重无统计学差异，分别为正常对照组、皮质酮模型组、淫羊藿总黄酮治疗组(EF组)及补肾复方治疗组，模型组及各治疗组均根据10mg/kg皮下注射皮质酮，正常对照组以等体积灭菌橄榄油代替皮质酮，每天1次，连续14天，各治疗组分别根据体重以相应的药物灌胃，正常组及模型组用蒸馏水代替药物灌胃，每天1次，连续14天。第15天，所有大鼠乙醚麻醉后，分别称重、心脏采血、无菌分离脾脏、剥离胸腺、肾上腺。测定血浆皮质醇水平、胸腺指数、肾上腺指数、淋巴细胞转化率。
结果1.各组大鼠体重比较结果见表1。实验表明模型组与正常组相比，体重显著减轻，P＜0.01；淫羊藿总黄酮治疗组体重与模型组比较增加，P＜0.01，补肾复方组体重无明显变化。表明淫羊藿总黄酮可提高大鼠体重，抵消激素对全身皮肤、结缔组织、肌肉等各组织的消耗作用。
表10各组大鼠体重(x±SD)组别 例数 体重正常 11 308.36±11.93**模型 11 266.55±14.94EF组 11 297.09±9.31**复方组11 278.91±15.06**与模型组相比P＜0.012.各组大鼠胸腺指数的比较结果见表2。实验表明模型组与正常组相比，胸腺重量显著减轻，P＜0.01；淫羊藿总黄酮治疗组、补肾复方组与模型组相比均具有极显著性差异，P＜0.01。表明淫羊藿总黄酮与补肾复方均可提高大鼠胸腺重量，抵消激素对中枢淋巴器官的抑制。
表11各组大鼠胸腺指数(x±SD)组别 例数 胸腺指数正常 11 151.01±26.33**模型 11 91.52±28.23EF组 11 146.60±23.49**复方组11 128.40±21.572****与模型组相比P＜0.013.各组大鼠肾上腺指数比较结果见表3。实验表明模型组与正常组相比，肾上腺重量显著减轻，P＜0.01，表明激素对肾上腺具有抑制作用；淫羊藿总黄酮和补肾复方与模型组比较有极显著性差异，P＜0.01，表明淫羊藿总黄酮和补肾复方均可提高大鼠肾上腺重量，对激素抑制肾上腺的作用具有对抗效应。
表12各组大鼠肾上腺指数(x±SD)组别 例数肾上腺指数正常 11 8.22±2.99**模型 11 3.76±0.21EF组 11 7.94±2.15**复方组11 9.16±1.98****与模型组相比P＜0.014.各组大鼠淋巴细胞转化率(LPR)的比较结果见表4。实验表明模型组与正常组相比，淋巴细胞转化率显著降低，P＜0.05，表明激素对外周淋巴细胞具有抑制作用；淫羊藿总黄酮与补肾复方均可提高LPR，与模型组比较淫羊藿总黄酮组P＜0.01，补肾复方组P＜0.05，表明淫羊藿总黄酮具有对抗激素对外周淋巴细胞免疫抑制的作用。
表13各组大鼠LPR(x±SD)组别 例数 LPR正常111.30±0.23*模型110.96±0.12EF组111.31±0.13**复方组 111.21±0.14**与模型组相比P＜0.05；5.各组大鼠血浆皮质醇含量比较结果见表5。实验表明模型组与正常组相比，血浆皮质醇含量显著减少，P＜0.05，表明肾上腺皮质功能已明显减退；补肾复方组血浆皮质醇含量与模型组相比无显著增高，P＞0.05；淫羊藿总黄酮组血浆皮质醇含量与模型组相比增高，具有显著性差异，P＜0.05，表明淫羊藿总黄酮可提高和保护大鼠肾上腺皮质功能，对激素抑制肾上腺皮质功能的作用具有对抗效应。
表14各组大鼠血浆皮质酮含量测定组别 例数血浆皮质酮正常组11 3.68±2.30*模型组11 1.94±1.27EF组 11 4.06±3.06*复方组11 4.58±3.40*与模型组相比P＜0.05；**与模型组相比P＜0.01以上研究提示，淫羊藿总黄酮与补肾复方比较，具有全面的保护外源性糖皮质激素造成大鼠HPAT轴受抑制的作用，结合前期的系列研究结果，充分表明淫羊藿总黄酮对撤除激素或减轻激素的不良反应有其良好的应用前景。
本研究拟对老年大鼠淋巴细胞即刻凋亡(spontaneous apoptosis)进行定量分析，并采用高通量的基因芯片技术分析其基因表达谱。同时进一步观察淫羊藿总黄酮(Epimedium Flavonoids，EF)对淋巴细胞凋亡及其基因表达谱的影响，目的是了解淫羊藿总黄酮重建衰老免疫稳态的基因调控模式，以阐明淫羊藿总黄酮重建衰老免疫稳态的分子机制。
材料与方法1材料1.1动物分组实验用清洁级SD大鼠由复旦大学动植物科学部提供，23月龄大鼠30只，雌雄各半，随机分为2组，即老年对照组(OC组)、淫羊藿总黄酮组(EF组)；EF组给予EF灌胃，OC组同时给予蒸馏水灌胃，灌胃时间为3个月。另设4月龄SD大鼠7只作为年轻对照组(YC组)。所有动物乙醚麻醉，无菌取脾，分离脾脏淋巴细胞。
1.2药物制备本研究采用辽宁产朝鲜淫羊藿(EpimediumKereanum Nakai)，由上海市医药工业研究院中药室提取淫羊藿总黄酮。实验时以蒸馏水配制为3g/100ml的溶液，根据0.06g/kgBW/d灌胃。
1.3试剂淋巴细胞分离液为Lympholyte-Rat(CL5045，CEDARLANE，CANADA)；ANNEXIN V-FITC APOPTOSISDETECTION KIT I(BD Bioscience，U.S.A)；TRIZOLReagent(GIBCOBRL，Life technologies，U.S.A)；Rneasy Mini Kit(Qiagen，Germany)；采用GeneChip T7-oligo(dT)Promoter Primer Kit及SuperScript II RT合成cDNA第一链；采用Enzo BioArray HighYield RNA TranscripLabeling Kit3(Affymetrix，U.S.A)合成生物素标记的cRNA；采用GeneChip Sample Cleanup Module纯化生物素标记的cRNA；采用Test3 Array(Affymetrix)进行预实验，以确定Biotin-labeled cRNA质量。Test Chip检测之后，采用Rat Genome U34A Array(Affymetrix)，对各组cRNA样品进行检测。
2方法2.1流式细胞仪检测细胞凋亡百分率PBS洗涤淋巴细胞2次，以1×binding buffer调整细胞浓度为1×106cells/ml；取100μl样品，加入5μl AnnexinV和5μl PI；轻微混匀细胞，25℃暗室孵育15min；每份样品中加入400μl 1×binding buffer；流式细胞仪检测分析AnnexinV(+)、PI(-)的细胞百分率。
2.2基因芯片检测各组大鼠淋巴细胞基因表达谱并比较分析老年对照组与年轻对照组、淫羊藿总黄酮组与老年对照组差异表达的基因。具体方法如下细胞内总RNA抽提、纯化、鉴定及定量之后，合成cDNA第一链、第二链。双链cDNA产物纯化后，采用EnzoBioArray HighYield RNA Transcrip Labeling Kit合成生物素标记的cRNA.进一步对cRNA产物进行定量和鉴定后，进行cRNA产物的片断化，片断化后的cRNA即可用于杂交。杂交反应在HybridizationOven640(Affymetrix)中进行。进一步进行洗涤及染色，反应在FluidicsStation 400(Affymetrix)中进行，采用Washing Buffer A、WashingBuffer B进行洗涤；采用Streptavidin Phycoerythrin Stain solution进行染色。采用Scanner(Affymetrix)进行扫描，扫描过程在AffymetrixMicroarray Suite5.0的控制下进行。
3数据处理3.1凋亡细胞百分率采用均数±标准差表示，采用SPSS11.0 forwindows软件包进行统计学处理，p＜0.05为有统计学意义。
3.2基因芯片检测数据采用Affymetrix Microarray Suite5.0软件进行分析。数据分析采用Statistical Algorithm.在对单个样本表达分析的前体下，即根据Detection p-value，＜0.04为Present；0.04-0.06为Marginal；＞0.06为Absent，进一步进行两组间比较，根据Signal LogRatio(SLR)进行判断。SLR＞1(即表达倍数＞21)为表达上调，有统计学意义；SLR＜-1(即表达倍数＜2-1)，为表达下调，有统计学意义。
结果1、淫羊藿总黄酮对老年大鼠淋巴细胞细胞凋亡的影响我们采用流式细胞仪结合FITC-Annexin V-PI双染色对各组大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率进行了定量分析。结果表明老年大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率显著高于年轻大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率，提示老年大鼠体内淋巴细胞存在过度凋亡；淫羊藿总黄酮干预后的脾淋巴细胞凋亡百分率与老年大鼠对照组相比显著降低，提示淫羊藿总黄酮可显著干预老年大鼠免疫稳态失衡的重要机制—淋巴细胞过度凋亡，具有老年大鼠重建免疫稳态的作用。见表15表15各组大鼠脾淋巴细胞凋亡百分率(％)x±SD组别例数细胞凋亡百分率(％)YC 7 10.91±6.70OC 7 25.81±9.11△EF 7 11.95±4.38☆注△OC与YC相比，p＜0.01；☆EF与OC相比，p＜0.012、老年大鼠淋巴细胞基因表达谱与年轻对照比较老年大鼠与年轻大鼠相比较，表达上调的基因有116个，表达下调的基因有215个。结合我们研究的背景进行分析，老年大鼠淋巴细胞特征性的基因表达模式有以下特点(1)具有促进细胞凋亡作用的基因表达显著上调，如参与细胞凋亡发生中心控制及效应环节的Caspasel、Caspase3；Calpain II；Dnase gamma；PKC delta；Bnip31；p47等。具有抗凋亡作用的基因如Cathepsin B、Mtal等表达显著下调。(2)具有抗增殖作用的基因表达显著上调，如Rb、Anti-proliferative factor等。具有促进细胞增殖作用的基因表达显著下调，如c-myc、c-fos、Jun、A-raf；Rgc32、Cyclin B1、Cyclin G-associated kinase等。(3)参与淋巴细胞活化增殖及免疫效应等基本信号通路的组成元件中，多个重要信号分子的表达显著下调，如酶关联受体信号途径重要信号分子Serine/Threonine protein kinase、cAMP dependent protein kinase、Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase 2、Spleen tyrosine kinase、inositol trisphosphate receptor subtype 3(IP3R-3)、RAC protein kinasegamma、、guanylate cyclase、protein-tyrosine-phospatase等。(4)免疫细胞效应及功能的基本调节因子表达异常，如MHC I类抗原表达显著上调，MHC II类抗原表达显著下调；IFN-γ及CD24表达显著下调等。
3、淫羊藿总黄酮对老年大鼠淋巴细胞基因表达的影响淫羊藿总黄酮干预后的老年大鼠淋巴细胞基因谱与老年对照组淋巴细胞基因表达谱相比较，表达的上调基因有447个，表达下调的基因有456个。结合免疫衰老的研究背景进一步分析表明，淫羊藿总黄酮调控老年大鼠淋巴细胞基因表达的作用模式有以下几个特点(1)淫羊藿总黄酮可调节细胞凋亡相关基因的表达—显著下调促凋亡基因的转录的同时显著上调抗凋亡基因的转录。如具有促进细胞凋亡作用的基因Caspase1、Caspase2、Caspase3、Caspase6；Calpains；CathepsinD、CathepsinH、CathepsinS；Dnase gamma；PKC delta等在淫羊藿总黄酮组的表达显著下调。与此同时，Cathepsin B、Mta1、NF-kappa B、Notch的具有抗凋亡作用的基因表达显著上调。(2)淫羊藿总黄酮可调节细胞增殖相关基因的表达，具体表现在显著上调促进细胞生存及增殖的c-Jun、PCNA、A-raf、Rgc32、Cyclin G-associated kinase等基因的转录，同时显著下调抗增殖的Rb等基因的转录。(3)淫羊藿总黄酮显著上调淋巴细胞活化及免疫效应相关的基本信号传导组成元件中多个信号分子的表达，如 Serine/Threonine protein kinase、Serine/Threonine protein kinase(pim3)、Serine/Threonine protein kinase(tpl2)；cAMP dependent protein kinase；PI3K、inositol trisphosphatereceptor subtype 3(IP3R-3)、PI3K Receptor、protein-tyrosine-phospatase、protein kinase C-eta、protein kinase等基因的转录在淫羊藿总黄酮组显著上调。(4)淫羊藿总黄酮显著上调免疫细胞效应及功能的基本调节因子的表达，如淫羊藿总黄酮显著上调CD2、CD3、CD5、TCR；IL-2、IL-2R(CD25)、CD28、CTLA4等基因的表达。
因此，淫羊藿总黄酮在上调抗凋亡基因转录的同时下调促凋亡基因的转录；在上调促增殖基因转录的同时下调抗增殖基因的转录；上调促进淋巴细胞活化信号传导、免疫效应调控等基因的转录。
讨论淫羊藿总黄酮可显著降低老年大鼠淋巴细胞的过度凋亡，提示出其延缓免疫衰老的作用。多个促凋亡基因、抗凋亡基因，促增殖基因、抗增殖基因的功能体现一种协同、拮抗的模式。免疫稳态的维持必须以这些功能相反的基因“对子”的平衡表达为前提。衰老免疫稳态失衡的重要基因背景就是这些基因“对子”的表达稳态被打破。淫羊藿总黄酮上调抗凋亡基因表达的同时，下调促凋亡基因的表达；上调促增殖基因表达的同时，下调抗增殖基因的表达。其作用的总体趋势在于重新调整决定细胞生存与死亡双方力量的对比，从而使衰老状态下淋巴细胞的基因表达趋势呈现一种有利于细胞生存、增殖及正常功能发挥的模式，这正是其重建衰老免疫稳态的分子机制所在。
全基因组分析所提供的大量信息提示出淫羊藿总黄酮调节基因表达失衡的规律，即逆转功能对立的促凋亡基因与抗凋亡基因、促增殖基因与抗增殖基因在衰老淋巴细胞中表达的异常，重塑基因表达的良性平衡，使整合后的基因表达体现出抗凋亡、重建免疫稳态的生物学效应。这一研究结果充分提示出淫羊藿总黄酮具有延缓免疫衰老的作用，并较为全面地阐明了淫羊藿总黄酮延缓免疫衰老的分子作用机制。
本发明的另一目的是提供了上述一种淫羊藿总黄酮片剂的制备方法，该方法包括下列步骤(1)淫羊藿总黄酮提取物的制备淫羊藿叶子加水煎煮二次，每次用水量为药材重量的16倍。第一次煎煮时间为煮沸后保持微沸2小时，第二次煮沸后保持微沸1.5小时，每次煎煮液用4层纱布过滤，合并滤液充分冷却至室温。上大孔吸附树脂，树脂用量为1Kg淫羊藿叶子用1升树脂，流速为1.5L/分钟。上样结束后，以去离子水洗脱，流速同前，去离子水用量为500升，水洗结束后，用15％EtOH200升洗脱，流速同前，再以40％EtOH500升洗脱，流速不变，加50％EtOH300升洗脱，流速同前，以酒精比重计测定洗脱液含醇量达45％时，开始收集洗脱液至所加50％EtOH洗脱结束，减压浓缩至干后，粉碎，即得淫羊藿总黄酮提取物。
(2)将步骤(1)制得的淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料按片剂常规方法制片即得淫羊藿总黄酮片剂。
本发明片剂含量范围淫羊藿总黄酮含量为60％-65％。
剂型及辅料片剂，采用淀粉(制成10％浆)、硬脂酸镁作为辅料。
本发明的另一目的是提供了上述一种淫羊藿总黄酮在制备减轻应用外源性糖皮质激素副作用和延缓免疫衰老药剂的应用。
本发明的淫羊藿总黄酮片剂具有下列作用特点1、减轻应用外源性糖皮质激素副作用主要表现为对抗糖皮质激素对胸腺、肾上腺及淋巴细胞的抑制作用，提高激素应用后大鼠的体重、胸腺指数、肾上腺指数、淋巴细胞转化率及血清皮质酮含量等。从而具有减轻激素应用副作用和不良反应的作用。
2、延缓免疫衰老主要表现为对免疫衰老的重要标志—淋巴细胞的过度凋亡具有显著的下调作用，并可调节衰老淋巴细胞凋亡、增殖、信号传导及免疫效能等多基因的表达。有助于减低免疫衰老相关的疾病如感染、肿瘤、自身免疫性疾病的发生，提高生存质量，延长寿命。
具体实施例方式实例淫羊藿总黄酮片〔处方〕淫羊藿总黄酮1.00kg、淀粉(制成10％浆)0.25g、硬脂酸镁0.01g，共制成10000片〔制法〕取淫羊藿总黄酮粉末状提取物，加入10％淀粉浆，充分搅拌，混合均匀后制成软材，过14目筛制粒，50-70℃干燥至干粒含水量约为6％，整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，压片，每片中含淫羊藿总黄酮0.1g。
〔应用〕减轻应用外源性糖皮质激素副作用；延缓免疫衰老。
〔用法〕口服，一次0.1g，一日0.3g。
权利要求
1.一种淫羊藿总黄酮片剂，其特片在于该片剂包括淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料组成，其中淫羊藿总黄酮提取物含量为60％～65％。
2.一种如权利要求1所述的一种淫羊藿总黄酮片剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)淫羊藿总黄酮提取物的制备淫羊藿叶子加水煎煮二次，每次用水量为药材重量的16倍，第一次煎煮时间为煮沸后保持微沸2小时，第二次煮沸后保持微沸1.5小时，每次煎煮液用4层纱布过滤，合并滤液充分冷却至室温，上大孔吸附树脂，树脂用量为1Kg淫羊藿叶子用1升树脂，流速为1.5L/分钟，上样结束后，以去离子水洗脱，流速同前，去离子水用量为500升，水洗结束后，用15％EtOH200升洗脱，流速同前，再以40％EtOH500升洗脱，流速不变，加50％EtOH300升洗脱，流速同前，以酒精比重计测定洗脱液含醇量达45％时，开始收集洗脱液至所加50％EtOH洗脱结束，减压浓缩至干后，粉碎，即得淫羊藿总黄酮提取物，(2)将步骤(1)制得的淫羊藿总黄酮提取物与药用辅料按片剂常规方法制片即得淫羊藿总黄酮片剂。
3.一种淫羊藿总黄酮提取物在制备减轻应用外源性糖皮质激素副作用和延缓免疫衰老药剂中的应用。
全文摘要
本发明属于中药制剂技术领域。本发明公开了一种淫羊藿总黄酮片剂。本发明的片剂包括淫羊藿总黄酮与药用辅料组成。它具有减轻激素应用副作用和不良反应的作用和延缓免疫衰老作用。本发明提供了制备方法。
文档编号A61K31/7042GK1569017SQ03141780
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月24日 优先权日2003年7月24日
发明者沈自尹 申请人:复旦大学附属华山医院
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