一种男性不育、弱精症的治疗药物的制作方法
专利名称：一种男性不育、弱精症的治疗药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种治疗男性不育、弱精症药物——尿激酶，具体地讲，本发明涉及的是尿激酶药物、制备这种药物的方法及其在治疗男性弱精症、男性不育障碍方面的用途。
50年代初，Williams最先在人尿液中发现尿激酶，70年代末期Propping和Asted等人从精液中分离出两种溶酶原激活因子(uPA)，并用生化的方法证实人精子中存在尿激酶型纤溶酶原激活因子，其在免疫学和生物活性上类似尿激酶。后来研究者们用尿激酶免疫动物生产出uPA多抗和单抗，用来进一步研究uPA，进一步的研究发现，早期发现的人体内尿激酶实际上就是现在的uPA。自早期在人尿液中发现尿激酶和从精液中分离出两种溶酶原激活因子(uPA)至今，在现有技术中，尿激酶(Urokinase)主要用于治疗血栓，给药途径为注射，见国家药典，从没有人将尿激酶同改善精子的质量联系在一起。
发明人在新药研究过程中发现，尿激酶(Urokinase)有治疗男性不育障碍、弱精症的新用途，目前国内外尚无报道和使用。
本发明的目的在于提供一种能够有效治疗男性不育障碍、弱精症的药物——尿激酶。
本发明的另一个目的是提供多种制备尿激酶制剂的配方及制备工艺，包括口服含片、口服胶囊、注射液和栓剂。
本发明的另一个目的是研究精子和精浆中尿激酶的活性同男性不育障碍和弱精症的关系，从而提供一种通过检验精子和精浆中尿激酶的活性而确定男性不育障碍和弱精症的方法。
本发明的再一个目的是将尿激酶应用于治疗男性不育障碍和弱精症。
为了完成上述任务，本发明采用的技术方案为首先研究人精子和精浆中尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子uPA和尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子受体uPAR，以及弱精症患者精子和精浆中uPA酶活性与含量的变化。尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子(uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶，它将纤溶酶原转变为纤溶酶；尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子受体(uPAR)是一种分子量为55-66,000的单链糖蛋白，它通过糖磷酯酰肌醇附着于质膜上，人精浆和精子中uPA的生理作用尚未完全明了。
另外，本发明主要从以下几个方面进行了研究①观察正常男子精浆中尿激酶的含量及酶的生物学活性和精子中尿激酶的含量、活性及分布。
②观察精子活力不足，精液常规其它各项基本正常的不育症男子精浆和精子中尿激酶含量及生物学活性变化。
③对精子活力不足，其它条件同上的不育男子体内应用尿激酶后，观察精液中精子活力变化。
④对上述条件患者离体精液中加入尿激酶后，观察精子活力变化。
具体地讲，本发明主要采用了免疫组织化学方法，对人精子中uPA及uPA受体进行定位观察。用琼脂糖-纤维蛋白-平板法+免疫阻抗对人精子和精浆中uPA的活性进行测定，用ELISA-双抗夹心法对人精子和精浆中uPA的含量进行了测定。此外对弱精症不育男子和精液参数正常的男子，体外加uPA后，30、60、90和120分钟时，光镜下观察精子活力的改变1.免疫组化方法包括免疫胶体金染色光镜观察和免疫胶体金染色(单抗隆抗体+多克隆抗体双标记法)，不复染，进行电镜观察，同时设立对照染色进行比较观察，该方法特异性强，灵敏度高，实验结果满意。
2.琼脂糖-纤维蛋白-平板法+免疫阻抗通过测量溶解圈的大小，了解uPA的酶活性，出现的透明圈的直径与uPA的对数呈线性关系，通过uPA的含量了解酶的活性，该方法准确，能直接反应出酶的活性。
3.ELISA-双抗夹心法采用双抗夹心方法进行uPA定量测定，方法灵敏度高，特异性强，与放射免疫所测结果相似，用该法所测的标准曲线其相关系数为0.999，批间和批内变异系数小，分别为10.46％和2.26％。
实验观察结果表明①正常男子精子中uPA主要分布在精子顶体内外膜和头部浆膜上，意外发现精子尾部中段线粒体集中的部位也存在uPA。在uPA出现的部位均可发现uPAR。
②弱精症患者精子中uPA活性及含量显著低于正常男子组，uPA活性与含量分别与精子活力和活率呈明显正相关。
③体外尿激酶兴奋试验表明，加入尿激酶后，30、60、90、120分钟时精子的活率均有提高，前向运动精子的数目亦有增加。体内给药前后比较，尿激酶明显提高精子平均活率和前向运动能力。
④弱精症和精液液化不良者，精浆中uPA活性和含量显著低于正常男子组，统计学上有显著差异。
根据上述实验结果，归纳为以下几点①uPA可能与uPAR发生结合才发挥生理作用。由于精子中存在uPA受体，不排除uPA是精子在生殖道运行过程中结合上去的。
②精子尾部中段uPA和uPAR的存在可能有特殊的生理意义，它与精子头部uPA的功能可能不同。该部位为线粒体集中的地方，推测可能与能量利用和精子的运动有关。
③uPA与精子的活力和活率呈正相关。
④uPA可能参与精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向运动。
⑤uPA有可能发展成为一种治疗弱精症患者的药物。
⑥进一步研究uPA，有可能通过抑制uPA活性，达到男性抗生育的作用。
综上所述，我们总结出本发明的显著特征在于1、采用胶体金双标免疫电镜法，在国内外首次从形态上直观、准确证实了uPA和uPAR在人精子中的分布。
2、国内外首次提出精子尾部中段存在uPA和uPAR，并从形态学上得以证实，同时推测可能的生理意义。
3、国内外首次提出弱精症患者与精子中uPA含量和活性降低有关，提出uPA可作为一种治疗弱精症的药物。
4、提出精浆中uPA可能参与精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向运动。
由于uPA有提高精子的活力和活率的作用，而且能参与精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向运动。因此，uPA可以成为一种治疗男性不育障碍和弱精症的新药。
一种治疗男性不育障碍和弱精症的药物，该药物中主要成分为尿激酶，其特征在于该药物中含有10000-100000单位的尿激酶，配方如下组分 用量尿激酶10000-100000单位β-环糊精 0-60mg甘露醇0-100mg酸性介质 0-20mg聚乙二醇 0-20mg黏合剂0-25mg淀粉 0-150蔗糖粉0-250mg硬脂酸镁 0-6mg羧甲基淀粉钠 0-22吐温 0-2mg半合成脂肪酸酶0-40mg总计 10000-100000单位至300mg本发明的治疗男性不育障碍和弱精症的药物，其特征在于所述的尿激酶的用量优选在12000-80000单位之间。
本发明的治疗男性不育障碍和弱精症的药物，当包合剂、黏合剂和其它辅料的含量为零时，尿激酶中加入生理盐水，可以制成注射液。
使用尿激酶治疗男性不育障碍和弱精症，可以以传统的注射方式给药，但以注射方式给药，一方面对于使用者很不方便，另一方面难以克服尿激酶本身的副作用；口服给药时，由于胃中酶对尿激酶的作用，可能使尿激酶失活而影响尿激酶应有的作用。为了既方便使用，又同时保证尿激酶的活性，本发明利用β-环糊精分子微囊的特性，采用β-环糊精包合尿激酶。由于β-环糊精分子呈环状排列，葡萄糖甙基上的羟基均位于环状结构的外围，故外围为亲水性，内部为疏水性，形成圆筒状，尿激酶可以进入环糊精内部被保护，也可以氢键连接形式增强其稳定性，可以保证尿激酶的稳定性。
本发明的尿激酶口含片的配方如下组分 用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精6-60mg甘露醇 30-100mg硬脂酸 2-20mg聚乙二醇 2-20mg纤维素 1.5-15mg蔗糖粉 5-250mg硬脂酸镁 1-6mg辅料若干 适量合计 300mg本发明的尿激酶口含片，其特征在于所述的尿激酶的用量优选在12000-80000单位之间。
口服片或胶囊的配方为配方 用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精0-60mg淀粉 30-150纤维素 5-25mg羧甲基淀粉钠 0-60mg硬脂酸镁 0-6mg二氧化硅 0-10mg本发明配方中的环糊精可以从β-环糊精及其多种衍生物中选择，例如羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、乙基-β-环糊精(E-β-CD)、二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、三甲基-β-环糊精(TM-β-CD)、单糖基-β-环糊精(G1·β-CD)、双糖基-β-环糊精(G2·β-CD)、麦芽三糖基-β-环糊精(G3·β-CD)、二单糖基-β-环糊精(2G1·β-CD)、二双糖基-β-环糊精(2G2·β-CD)等。如欲要求进一步缓释，亦可选择二乙基-β-环糊精(DE-β-CD)、三乙基-β-环糊精(TE-β-CD)等，也可以是两种或两种以上的混合物；优选二甲基-β-环糊精、乙基-β-环糊精(E-β-CD)和三乙基-β-环糊精。
在上述配方中的酸性介质可选择使用硬脂酸、软脂酸、棕桐酸、抗坏血酸等等。优选硬脂酸，抗坏血酸和棕榈酸。
在上述配方中的粘合剂可选自如下的一种或组合羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚a-羟乙甲基丙烯酸酯、聚维酮、聚醋酸乙烯酯、醋酸纤维素、糊精、白糊精、微晶纤维素、甲基纤维素、丙烯酸甲酯、丙烯酸树脂I-IV号、羟乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、卡泊姆、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、淀粉等等，这样进一步增强尿激酶的稳定性。优选的粘合剂选自羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素和乙基纤维素。
上述配方中的聚乙二醇，也可以用其它各种型号的聚乙二醇，如聚乙二醇4000，聚乙二醇8000，也可以是聚乙二醇的衍生物或适合本发明的其它聚合物。
本发明的上述配方，可以选择不同的粘合剂、不同的酸性介质、不同的环糊精及其衍生物以及不同的聚合物。
上述配方可以制成口服片剂、口服胶囊、颗粒剂、栓剂以及适合本发明的其他制剂。
此外，只要达到相同的血药浓度，用于本发明的尿激酶也可以用传统的方法制成注射剂、口服胶囊、口服片剂、颗粒剂、栓剂以及适合本发明的其它制剂。
上述辅料、用量及剂型可以有多种变化，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的，在此不一一列出。但应理解，所有在上述配方范围内及剂型的变化，都应包括在本发明范围内。
本发明所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇6000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约2--6hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的羟丙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以40--70℃鼓风干燥4--8hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可；用专用模具压片，片重约为300mg/片。
本发明所述的口服片剂、胶囊、颗粒的制备工艺如下1.将HPMC加适量EtOH分散后，加60-80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过70-80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将所有辅料加入，搅拌均匀为糊状，加尿激酶制药软材。
3.将软材以18目制粒，40-60℃通风干燥，18目整粒。
4.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀压片或加二氧化硅制胶囊。
当用β-环糊精包合制备口服片剂或胶囊时，制备工艺同口含片的制备过程，所不同的是最后成型的工艺。
本发明在男性生殖领域，对uPA和uPAR与精子活力的研究以及由此提出的治疗男性不育障碍和弱精症的药物------尿激酶，填补了国内外空白；本发明在进行制剂学研究的基础上，采用β-环糊精对尿激酶进行包合，加其他原辅料，并配合独特的制备工艺，研制成一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物，药物的特征为有生理活性的片剂，口含型，使尿激酶本身存在的缺陷得以克服，使尿激酶的疗效显著提高，并减轻了该物质的副作用，增强了稳定性；可有效地发挥其治疗男性不育障碍、弱精症的新用途。
由于uPA与精子活力密切相关，检验精子和精浆中尿激酶的活性对部分弱精症(精子活力低下)或精液液化不良有明确病因和诊断作用，该方法简单，准确，可靠，不要特殊仪器设备，能在基层医院检验科开展。
实验结果表明，该药物保持了尿激酶的活性，可有效地发挥其治疗男性不育障碍、弱精症的新用途。引起精子活力低下的病因较多，尿激酶活性降低可能是病因之一，因此分析精子和精浆中尿激酶的活性对指导弱精症的治疗有一定意义。对部分精子活力低下或精液液化异常，尿激酶有很好的治疗效果，有良好的推广前景。
实施例一本发明的配方及制备工艺的关键，在于β-环糊精对主药成份的包合。在本实施例中，包合物选择二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)，其配方如下组分 用量尿激酶 20000单位二甲基-β-环糊精 10mg甘露醇 46mg硬脂酸 6mg羟丙基甲基纤维素 30mg聚乙二醇6000 3mg硬脂酸镁 10mg蔗糖粉(不含硫) 220mg合计 每片重300mg本实施例所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇6000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约2hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的羟丙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以40℃鼓风干燥8hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可。用专用模具压片，片重为300mg/片。实施例二在本实施例中，包合物选择乙基-β-环糊精，其配方如下组分 用量尿激酶10000单位乙基-β-环糊精60mg甘露醇100mg软脂酸17.5mg聚乙二醇6000 20mg乙基甲基纤维素1.5mg蔗糖粉(不含硫)100mg硬脂酸镁 1mg合计 每片重300mg
本实施例所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇6000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约6hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、软脂酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的乙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以75℃鼓风干燥2hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可。用专用模具压片，片重为300mg/片。实施例三配方组分 用量尿激酶 100000单位三甲基-β-环糊精 6mg甘露醇 30mg抗坏血酸 10mg聚乙二醇4000 15mg乙基纤维素 1.5mg蔗糖粉(不含硫) 210mg硬脂酸镁 6mg合计 每片重300mg本实施例所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇4000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约4hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、抗坏血酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的乙基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以55℃鼓风干燥4hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可。用专用模具压片，片重为300mg/片。实施例四口服片剂配方及制备工艺组分 用量尿激酶 20000单位三甲基-β-环糊精 11mg淀粉 150mg低取代羟丙基纤维素(L-HPC)20mg
羧甲基淀粉钠(CMS-Na)11mg硬脂酸镁(M，S) 3mg其中，乙醇和蒸馏水可以以任意比例混合。
本实施例所述的尿激酶口服片剂的制备工艺如下1.将HPMC加适量乙醇分散，然后加80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜，过80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将β-环糊精加乙醇和水，HPMC三者的混合液，搅拌均匀为糊状，加尿激酶，研磨包合40分钟备用。
3.将淀粉、L-HPC混合均匀，加已包合好的主药，搅拌均匀，加适量的粘合剂制成软材。
4.将软材以16目制粒，50℃通风干燥，16目整粒。
5.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀方可压片。实施例五口服片剂配方及制备工艺组分用量尿激酶 70000单位单糖基-β-环糊精60mg淀粉100mg低取代羟丙基纤维素(L-HPC) 2.5mg羟丙基甲基纤维素(HPMC) 2.5mg-乙醇(EtOH) HPMC 3％浓度蒸馏水 -羧甲基淀粉钠(CMS-Na)26mg硬脂酸镁(M，S) 2mg其中，乙醇和蒸馏水可以以任意比例混合。
1.将HPMC加适量EtOH分散后，加80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将所有辅料加入，搅拌均匀为糊状，加尿激酶制药软材。
3.将软材以18目制粒，50℃通风干燥，18目整粒。
4.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀压片。实施例六胶囊剂配方及制备工艺组分 用量尿激酶 20000单位
β-CD 10mg淀粉 100mgL-HPC 10mg
SiO25mg本实施例所述的尿激酶口服胶囊剂的制备工艺如下1.将HPMC加适量EtOH分散后，加60℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过70目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将-CD加1(HPMC液)搅拌均匀为糊状，加尿激酶，研磨包合460分钟备用。
3.将淀粉、L-HPC混合均匀，加包合好的主药搅拌均匀，加适量粘合剂1制药软材。
4.将软材以18目制粒，50℃通风干燥，18目整粒。
5.干燥整粒后加二氧化硅，混匀灌装2#胶囊。实施例七胶囊剂配方及制备工艺组分 用量尿激酶20000单位淀粉 110mgL-HPC 10mg
SiO25mg本实施例所述的尿激酶口服胶囊剂的制备工艺如下步骤1-3同实施例五，步骤4为4.上述物料干燥整粒后加二氧化硅，混匀灌装2#胶囊。实施例八栓剂处方及制备工艺组分 用量尿激酶20000单位β-CD 10mg吐温802mg
36型半合成脂肪酸酶 40mg本实施例所述的尿激酶栓剂的制备工艺如下1.将β-CD加适量EtOH搅拌均匀为糊状，加尿激酶研磨包合40分钟备用。
2.将36型半合成脂肪酸酶加热溶解后保温38℃，加主药的包合物，充分混合均匀保温。
3.将混合均匀、保温物灌膜冷却成形。实施例九尿激酶注射液配方中的其它组份为0，取尿激酶干粉40000单位，使用时，按比例加入生理盐水，即成为尿激酶注射液。实施例十 人精子中尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)和尿激酶型纤溶酶元激活因子受体(uPAR)的定位研究。
70年代末期Propping和Asted等人用生化的方法证实人精子中存在尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)。尔后，较多学者对它存在的生理意义进行了追踪研究，然而对uPA在精子中存在的部位缺乏了解。早期对uPA的生化研究多采用纤维蛋白平板法，因该方法受到精液中其它丝氨酸蛋白水解酶的干扰，缺乏特异性。尽管八十年代和九十年代采用酶标法和放射免疫方法进行测定，并证实了uPA的存在，但对uPA在精子中存在的部位一直只是一种推测，缺少形态学方面的证据。此外对精子中uPA的来源也一直存在争论，有学者推测uPA是在精子通过生殖道的过程中结合上去的。如果是结合上去的，首先必须证明精子膜上存在uPA的受体，对精子中是否存在uPA受体的文献，国内外均无报道。还有一种认为uPA发挥生理作用是通过与uPA受体结合后才表现出生理效应的，表明了uPAR存在的重要性。因此要进一步了解uPA，开展uPA和uPAR的定位研究有重要意义。
我们先后采用免疫组织化学的方法，包括免疫胶体金光镜法和胶体金双标记电镜法、SABC荧光法等对正常男子射出体外的精子进行了研究。作用的第一抗体分别来自国内军事医学科学院生物工程研究所和丹麦Finsen实验室。实验结果表明，uPA和uPAR主要分布在精子顶体内外膜和头部浆膜上。有趣的是我们还发现在精子尾部中段有uPA和uPAR的分布，该部位是精子线粒体集中的地方，线粒体主要为精子提供运动所需能量，以上发现均为国内外首次报道。根据uPA和uPAR分布的部位，推测他们的生理作用可能不同。位于精子顶体部位的uPA和uPAR可能参与顶体反应，有助于精子对卵子的识别及精子穿过透明带和宫颈粘液；位于精子尾部的uPA和uPAR可能与精子运动有关，以确保精子在附睾中不与管壁以及精子彼此间发生粘附，同时对精液的液化有促进作用。实施例十一正常男子和弱精症男子精子中uPA的含量和活性与精子运动的关系。
人精液射出体外后，约5-30分钟液化，液化后的精子具有运动能力，包括原地微动，缓慢前向运动，中速运动和快速运动，还有一部分精子不活动。普通光镜下观察这部分不动的精子可能是死精子也可以是活精子，因某种原因而不能运动。通过对可动和不动精子的百分率来表示精子的活率。把所有运动的精子根据它们作前向运动的速度和百分数来判断精子活力的好坏。本研究就是了解uPA与精子活率和前向运动能力的关系。人精子中存在uPA和uPAR在前面已被证实，但有关正常男子和弱精症男子精子中的uPA含量和活性报道较少，通过对弱精症男子精子中uPA的分析，可以了解到uPA对精子运动的影响。
本研究通过对正常男子uPA含量和活性的测定，同时对弱精症(精子活率低下和前向运动能力差)的不育症男子精子中uPA含量与活性进行对照并进行相关分析。uPA活性测定采用琼脂糖-纤维蛋白平板法结合免疫阻断法。含量测定采用ELISA双抗夹心法。实验结果发现弱精症男子精子中uPA含量与活性显著低于正常生育男子精子中uPA的含量，两组间有极显著性意义，经相关分析发现uPA的含量与精子活率和活力有明显相关性。我们还发现，正常男子精子中uPA活性也高于弱精症不育男子组，统计学处理有极显著性差异。精子uPA活性值与精子活率，活力亦呈直线相关，并有统计学意义。根据上述实验结果，我们认为精子中uPA与精子的活率和前向运动有一定关系。由于uPA可能参与生殖过程的许多方面，如精子的成熟、运动、精液的液化、宫颈粘液的穿透、与卵子的结合、顶体反应、穿透透明带、胚胎的发育及着床等。弱精症男子引起的不育，可能是uPA含量与活性低下而引起精子运动能力差，不能运行到女性输卵管壶腹部受孕所致，但也不能完全排除因uPA低下而不能参与其它生殖过程而致不育。总之表明uPA与精子的运动有相关关系。实施例十二 uPA对弱精症患者精子活力影响的实验研究50年代初Williams最先在人尿液中发现尿激酶，70年代末期Propping等人从精液中分离出两种溶酶原激活因子，在免疫学和生物活性上类似尿激酶。后来研究者们用尿激酶免疫动物生产出uPA多抗和单抗，用来进一步研究uPA，早期发现人体内尿激酶实际上就是现在的uPA。通过对正常健康志愿者精液中加入尿激酶后进行观察，发现尿激酶有提高精子运动的作用，证实uPA的确有提高精子活率和前向运动能力的作用。我们观察了28例弱精症男子。实验方法为离体精液体外试管法，将两次精液分析精液参数除活率和或活力低下其它均正常的标本作为研究对象，待精液液化后分别加入不同浓度的尿激酶，观察加入尿激酶后30，60，90和120分钟时精子活率的变化。另外一种实验是对弱精症男子体内给予尿激酶，连续用10天，观察用尿激酶前后精子活率和前向运动能力的变化。经统计学处理，实验结果发现加入尿激酶后30，60，90和120分钟时对精子活率均有所提高，前向运动精子的数目亦有增加。体内给予尿激酶后，精子平均活率由44.64％上升到64.71％，有极显著性差异。体内外实验证明尿激酶有提高精子活率和前向运动能力的作用。这一作用可能与降低精液粘稠度有关，但不排除有可能通过其它机制提高精子运动能力的可能。实施例十三 精浆中uPA活性和含量与精子活力的关系MacGregor等人发现精浆中纤溶酶原激活因子的浓度比血液中高出60-100倍。精浆中uPA存在的生理作用不是十分明了，推测可能与精液的液化有关。液化良好的精液有利于精子作前向运动。液化不良的精液，精浆中可见到细长的纤维蛋白并相互网织使精子运动空间减少，精子的运动受到限制。我们测定了20例精液液化不良男子精浆中uPA活性，并同时与15例正常男了精浆中uPA活性进行比较，结果发现液化不良组精浆中尿激酶活性明显低于正常男子组，有极显著性差异。此外我们也对22例精子活率低下组并无精液液化不良现象的不育症男子进行尿激酶测定，结果发现精浆中尿激酶的含量低于精液参数正常组男子精浆尿激酶的含量，有极显著性差异。根据前述的研究，精子活率低下(弱精症)患者，精子中uPA活性与含量明显降低，本研究发现弱精症患者精浆中uPA含量也同时表现出低值。关于精浆中uPA或称尿激酶的生理意义除降低精液粘稠度，有利精子运动外，是否还有其它方面的作用，还有待更进一步的研究。
权利要求
1.一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物——主要成分为尿激酶，其特征在于该药物中含有10000-100000单位的尿激酶，配方如下组分用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精 0-60mg甘露醇 0-100mg酸性介质0-20mg聚乙二醇0-20mg黏合剂 0-25mg淀粉0-150蔗糖粉 0-250mg硬脂酸镁0-6mg羧甲基淀粉钠0-60吐温0-2mg半合成脂肪酸酶 0-40mg总计10000-100000单位至300mg。
2.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于尿激酶的用量优选在15000-80000单位之间。
3.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于药物中其它组份为0，尿激酶用量为10000-100000单位时，加入适量生理盐水，制成注射液。
4.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于口含片的配方为配方 用量尿激酶10000-100000单位β-环糊精 6-60mg甘露醇30-100mg硬脂酸2-20mg聚乙二醇6000 2-20mg羟丙基甲基纤维素 1.5-15mg蔗糖粉5-250mg硬脂酸镁 1-6mg合计 每片重300mg
5.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于口服片或胶囊的配方为配方 用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精0-60mg淀粉 30-150纤维素 5-50mg羧甲基淀粉钠 0-100mg硬脂酸镁 0-6mg二氧化硅 0-10mg
6.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于所述β-环糊精为羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、乙基-β-环糊精(E-β-CD)、二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、三甲基-β-环糊精(TM-β-CD)、单糖基-β-环糊精(G1·β-CD)、双糖基-β-环糊精(G2·-CD)、麦芽三糖基-β-环糊精(G3·β-CD)、二单糖基-β-环糊精(2G1·β-CD)、二双糖基-β-环糊精(2G2·β-CD)等，如欲要求进一步缓释，亦可选择二乙基-β-环糊精(DE-β-CD)、三乙基-β-环糊精(TE-β-CD)等，也可以是两种或两种以上的混合物。
7.根据权利要求6所述β-环糊精，其特征在于优选二甲基-β-环糊精、乙基-β-环糊精(E-β-CD)和三乙基-β-环糊精。
8.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于其中粘合剂选自如下的一种或组合羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚a-羟乙甲基丙烯酸酯、聚维酮、聚醋酸乙烯酯、醋酸纤维素、糊精、白糊精、微晶纤维素、甲基纤维素、丙烯酸甲酯、丙烯酸树脂I-IV号、羟乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、卡泊姆、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙等等，这样进一步增强尿激酶的稳定性。优选的粘合剂选自羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素、乙基纤维素。
9.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于所述配方中的聚乙二醇，可以是聚乙二醇4000，聚乙二醇6000，聚乙二醇7000或其它各种型号的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物。
10.一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物——尿激酶口含片的制备工艺，其特征在于①先将聚乙二醇用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约2-6hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物；②将甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉等辅料混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的羟丙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以40--70℃鼓风干燥4-8hr，以16目筛整理；③将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可；用专用模具压片，片重约为300mg/片。
11.根据权利要求10所述的制备工艺，其特征在于该工艺中的①和②步得到的颗粒，可以用于制备口服片剂和胶囊。
12.一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物——尿激酶口服片或胶囊的制备工艺，其特征在于1.将HPMC加适量EtOH分散后，加60-80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过70-80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。2.将所有辅料加入，搅拌均匀为糊状，加尿激酶制药软材。3.将软材以18目制粒，40-60℃通风干燥，18目整粒。4.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀压片或加二氧化硅制胶囊。
13.根据权利要求1所述的尿激酶口服固体制剂、栓剂，在治疗男性不育障碍、弱精症的应用。
全文摘要
本发明涉及一种男性不育障碍、弱精症的治疗药物—尿激酶,尿激酶制剂以及尿激酶制剂对男性不育障碍、弱精症治疗的新用途,注射和口服制剂可以用传统的剂型配方,本发明还采用β－环糊精对尿激酶进行包含,配合独特的制备工艺,研制成有生理活性的口含型药物片剂,使尿激酶的疗效显著提高,并减轻了该物质的副作用,增强了稳定性,实验结果表明,该药物保持了尿激酶的活性,可有效地发挥其治疗男性不育障碍、弱精症的新用途。
文档编号A61K38/49GK1260997SQ9912193
公开日2000年7月26日 申请日期1999年10月15日 优先权日1998年10月16日
发明者丁钉生, 熊承良 申请人:珠海经济特区生物化学制药厂
技术领域：
本发明涉及的是一种治疗男性不育、弱精症药物——尿激酶，具体地讲，本发明涉及的是尿激酶药物、制备这种药物的方法及其在治疗男性弱精症、男性不育障碍方面的用途。
50年代初，Williams最先在人尿液中发现尿激酶，70年代末期Propping和Asted等人从精液中分离出两种溶酶原激活因子(uPA)，并用生化的方法证实人精子中存在尿激酶型纤溶酶原激活因子，其在免疫学和生物活性上类似尿激酶。后来研究者们用尿激酶免疫动物生产出uPA多抗和单抗，用来进一步研究uPA，进一步的研究发现，早期发现的人体内尿激酶实际上就是现在的uPA。自早期在人尿液中发现尿激酶和从精液中分离出两种溶酶原激活因子(uPA)至今，在现有技术中，尿激酶(Urokinase)主要用于治疗血栓，给药途径为注射，见国家药典，从没有人将尿激酶同改善精子的质量联系在一起。
发明人在新药研究过程中发现，尿激酶(Urokinase)有治疗男性不育障碍、弱精症的新用途，目前国内外尚无报道和使用。
本发明的目的在于提供一种能够有效治疗男性不育障碍、弱精症的药物——尿激酶。
本发明的另一个目的是提供多种制备尿激酶制剂的配方及制备工艺，包括口服含片、口服胶囊、注射液和栓剂。
本发明的另一个目的是研究精子和精浆中尿激酶的活性同男性不育障碍和弱精症的关系，从而提供一种通过检验精子和精浆中尿激酶的活性而确定男性不育障碍和弱精症的方法。
本发明的再一个目的是将尿激酶应用于治疗男性不育障碍和弱精症。
为了完成上述任务，本发明采用的技术方案为首先研究人精子和精浆中尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子uPA和尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子受体uPAR，以及弱精症患者精子和精浆中uPA酶活性与含量的变化。尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子(uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶，它将纤溶酶原转变为纤溶酶；尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子受体(uPAR)是一种分子量为55-66,000的单链糖蛋白，它通过糖磷酯酰肌醇附着于质膜上，人精浆和精子中uPA的生理作用尚未完全明了。
另外，本发明主要从以下几个方面进行了研究①观察正常男子精浆中尿激酶的含量及酶的生物学活性和精子中尿激酶的含量、活性及分布。
②观察精子活力不足，精液常规其它各项基本正常的不育症男子精浆和精子中尿激酶含量及生物学活性变化。
③对精子活力不足，其它条件同上的不育男子体内应用尿激酶后，观察精液中精子活力变化。
④对上述条件患者离体精液中加入尿激酶后，观察精子活力变化。
具体地讲，本发明主要采用了免疫组织化学方法，对人精子中uPA及uPA受体进行定位观察。用琼脂糖-纤维蛋白-平板法+免疫阻抗对人精子和精浆中uPA的活性进行测定，用ELISA-双抗夹心法对人精子和精浆中uPA的含量进行了测定。此外对弱精症不育男子和精液参数正常的男子，体外加uPA后，30、60、90和120分钟时，光镜下观察精子活力的改变1.免疫组化方法包括免疫胶体金染色光镜观察和免疫胶体金染色(单抗隆抗体+多克隆抗体双标记法)，不复染，进行电镜观察，同时设立对照染色进行比较观察，该方法特异性强，灵敏度高，实验结果满意。
2.琼脂糖-纤维蛋白-平板法+免疫阻抗通过测量溶解圈的大小，了解uPA的酶活性，出现的透明圈的直径与uPA的对数呈线性关系，通过uPA的含量了解酶的活性，该方法准确，能直接反应出酶的活性。
3.ELISA-双抗夹心法采用双抗夹心方法进行uPA定量测定，方法灵敏度高，特异性强，与放射免疫所测结果相似，用该法所测的标准曲线其相关系数为0.999，批间和批内变异系数小，分别为10.46％和2.26％。
实验观察结果表明①正常男子精子中uPA主要分布在精子顶体内外膜和头部浆膜上，意外发现精子尾部中段线粒体集中的部位也存在uPA。在uPA出现的部位均可发现uPAR。
②弱精症患者精子中uPA活性及含量显著低于正常男子组，uPA活性与含量分别与精子活力和活率呈明显正相关。
③体外尿激酶兴奋试验表明，加入尿激酶后，30、60、90、120分钟时精子的活率均有提高，前向运动精子的数目亦有增加。体内给药前后比较，尿激酶明显提高精子平均活率和前向运动能力。
④弱精症和精液液化不良者，精浆中uPA活性和含量显著低于正常男子组，统计学上有显著差异。
根据上述实验结果，归纳为以下几点①uPA可能与uPAR发生结合才发挥生理作用。由于精子中存在uPA受体，不排除uPA是精子在生殖道运行过程中结合上去的。
②精子尾部中段uPA和uPAR的存在可能有特殊的生理意义，它与精子头部uPA的功能可能不同。该部位为线粒体集中的地方，推测可能与能量利用和精子的运动有关。
③uPA与精子的活力和活率呈正相关。
④uPA可能参与精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向运动。
⑤uPA有可能发展成为一种治疗弱精症患者的药物。
⑥进一步研究uPA，有可能通过抑制uPA活性，达到男性抗生育的作用。
综上所述，我们总结出本发明的显著特征在于1、采用胶体金双标免疫电镜法，在国内外首次从形态上直观、准确证实了uPA和uPAR在人精子中的分布。
2、国内外首次提出精子尾部中段存在uPA和uPAR，并从形态学上得以证实，同时推测可能的生理意义。
3、国内外首次提出弱精症患者与精子中uPA含量和活性降低有关，提出uPA可作为一种治疗弱精症的药物。
4、提出精浆中uPA可能参与精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向运动。
由于uPA有提高精子的活力和活率的作用，而且能参与精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向运动。因此，uPA可以成为一种治疗男性不育障碍和弱精症的新药。
一种治疗男性不育障碍和弱精症的药物，该药物中主要成分为尿激酶，其特征在于该药物中含有10000-100000单位的尿激酶，配方如下组分 用量尿激酶10000-100000单位β-环糊精 0-60mg甘露醇0-100mg酸性介质 0-20mg聚乙二醇 0-20mg黏合剂0-25mg淀粉 0-150蔗糖粉0-250mg硬脂酸镁 0-6mg羧甲基淀粉钠 0-22吐温 0-2mg半合成脂肪酸酶0-40mg总计 10000-100000单位至300mg本发明的治疗男性不育障碍和弱精症的药物，其特征在于所述的尿激酶的用量优选在12000-80000单位之间。
本发明的治疗男性不育障碍和弱精症的药物，当包合剂、黏合剂和其它辅料的含量为零时，尿激酶中加入生理盐水，可以制成注射液。
使用尿激酶治疗男性不育障碍和弱精症，可以以传统的注射方式给药，但以注射方式给药，一方面对于使用者很不方便，另一方面难以克服尿激酶本身的副作用；口服给药时，由于胃中酶对尿激酶的作用，可能使尿激酶失活而影响尿激酶应有的作用。为了既方便使用，又同时保证尿激酶的活性，本发明利用β-环糊精分子微囊的特性，采用β-环糊精包合尿激酶。由于β-环糊精分子呈环状排列，葡萄糖甙基上的羟基均位于环状结构的外围，故外围为亲水性，内部为疏水性，形成圆筒状，尿激酶可以进入环糊精内部被保护，也可以氢键连接形式增强其稳定性，可以保证尿激酶的稳定性。
本发明的尿激酶口含片的配方如下组分 用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精6-60mg甘露醇 30-100mg硬脂酸 2-20mg聚乙二醇 2-20mg纤维素 1.5-15mg蔗糖粉 5-250mg硬脂酸镁 1-6mg辅料若干 适量合计 300mg本发明的尿激酶口含片，其特征在于所述的尿激酶的用量优选在12000-80000单位之间。
口服片或胶囊的配方为配方 用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精0-60mg淀粉 30-150纤维素 5-25mg羧甲基淀粉钠 0-60mg硬脂酸镁 0-6mg二氧化硅 0-10mg本发明配方中的环糊精可以从β-环糊精及其多种衍生物中选择，例如羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、乙基-β-环糊精(E-β-CD)、二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、三甲基-β-环糊精(TM-β-CD)、单糖基-β-环糊精(G1·β-CD)、双糖基-β-环糊精(G2·β-CD)、麦芽三糖基-β-环糊精(G3·β-CD)、二单糖基-β-环糊精(2G1·β-CD)、二双糖基-β-环糊精(2G2·β-CD)等。如欲要求进一步缓释，亦可选择二乙基-β-环糊精(DE-β-CD)、三乙基-β-环糊精(TE-β-CD)等，也可以是两种或两种以上的混合物；优选二甲基-β-环糊精、乙基-β-环糊精(E-β-CD)和三乙基-β-环糊精。
在上述配方中的酸性介质可选择使用硬脂酸、软脂酸、棕桐酸、抗坏血酸等等。优选硬脂酸，抗坏血酸和棕榈酸。
在上述配方中的粘合剂可选自如下的一种或组合羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚a-羟乙甲基丙烯酸酯、聚维酮、聚醋酸乙烯酯、醋酸纤维素、糊精、白糊精、微晶纤维素、甲基纤维素、丙烯酸甲酯、丙烯酸树脂I-IV号、羟乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、卡泊姆、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、淀粉等等，这样进一步增强尿激酶的稳定性。优选的粘合剂选自羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素和乙基纤维素。
上述配方中的聚乙二醇，也可以用其它各种型号的聚乙二醇，如聚乙二醇4000，聚乙二醇8000，也可以是聚乙二醇的衍生物或适合本发明的其它聚合物。
本发明的上述配方，可以选择不同的粘合剂、不同的酸性介质、不同的环糊精及其衍生物以及不同的聚合物。
上述配方可以制成口服片剂、口服胶囊、颗粒剂、栓剂以及适合本发明的其他制剂。
此外，只要达到相同的血药浓度，用于本发明的尿激酶也可以用传统的方法制成注射剂、口服胶囊、口服片剂、颗粒剂、栓剂以及适合本发明的其它制剂。
上述辅料、用量及剂型可以有多种变化，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的，在此不一一列出。但应理解，所有在上述配方范围内及剂型的变化，都应包括在本发明范围内。
本发明所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇6000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约2--6hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的羟丙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以40--70℃鼓风干燥4--8hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可；用专用模具压片，片重约为300mg/片。
本发明所述的口服片剂、胶囊、颗粒的制备工艺如下1.将HPMC加适量EtOH分散后，加60-80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过70-80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将所有辅料加入，搅拌均匀为糊状，加尿激酶制药软材。
3.将软材以18目制粒，40-60℃通风干燥，18目整粒。
4.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀压片或加二氧化硅制胶囊。
当用β-环糊精包合制备口服片剂或胶囊时，制备工艺同口含片的制备过程，所不同的是最后成型的工艺。
本发明在男性生殖领域，对uPA和uPAR与精子活力的研究以及由此提出的治疗男性不育障碍和弱精症的药物------尿激酶，填补了国内外空白；本发明在进行制剂学研究的基础上，采用β-环糊精对尿激酶进行包合，加其他原辅料，并配合独特的制备工艺，研制成一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物，药物的特征为有生理活性的片剂，口含型，使尿激酶本身存在的缺陷得以克服，使尿激酶的疗效显著提高，并减轻了该物质的副作用，增强了稳定性；可有效地发挥其治疗男性不育障碍、弱精症的新用途。
由于uPA与精子活力密切相关，检验精子和精浆中尿激酶的活性对部分弱精症(精子活力低下)或精液液化不良有明确病因和诊断作用，该方法简单，准确，可靠，不要特殊仪器设备，能在基层医院检验科开展。
实验结果表明，该药物保持了尿激酶的活性，可有效地发挥其治疗男性不育障碍、弱精症的新用途。引起精子活力低下的病因较多，尿激酶活性降低可能是病因之一，因此分析精子和精浆中尿激酶的活性对指导弱精症的治疗有一定意义。对部分精子活力低下或精液液化异常，尿激酶有很好的治疗效果，有良好的推广前景。
实施例一本发明的配方及制备工艺的关键，在于β-环糊精对主药成份的包合。在本实施例中，包合物选择二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)，其配方如下组分 用量尿激酶 20000单位二甲基-β-环糊精 10mg甘露醇 46mg硬脂酸 6mg羟丙基甲基纤维素 30mg聚乙二醇6000 3mg硬脂酸镁 10mg蔗糖粉(不含硫) 220mg合计 每片重300mg本实施例所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇6000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约2hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的羟丙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以40℃鼓风干燥8hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可。用专用模具压片，片重为300mg/片。实施例二在本实施例中，包合物选择乙基-β-环糊精，其配方如下组分 用量尿激酶10000单位乙基-β-环糊精60mg甘露醇100mg软脂酸17.5mg聚乙二醇6000 20mg乙基甲基纤维素1.5mg蔗糖粉(不含硫)100mg硬脂酸镁 1mg合计 每片重300mg
本实施例所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇6000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约6hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、软脂酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的乙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以75℃鼓风干燥2hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可。用专用模具压片，片重为300mg/片。实施例三配方组分 用量尿激酶 100000单位三甲基-β-环糊精 6mg甘露醇 30mg抗坏血酸 10mg聚乙二醇4000 15mg乙基纤维素 1.5mg蔗糖粉(不含硫) 210mg硬脂酸镁 6mg合计 每片重300mg本实施例所述的尿激酶口含片的制备工艺如下1.先将聚乙二醇4000用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约4hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物。
2.将甘露醇、抗坏血酸、蔗糖粉混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的乙基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以55℃鼓风干燥4hr，以16目筛整理颗粒。
3.将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可。用专用模具压片，片重为300mg/片。实施例四口服片剂配方及制备工艺组分 用量尿激酶 20000单位三甲基-β-环糊精 11mg淀粉 150mg低取代羟丙基纤维素(L-HPC)20mg
羧甲基淀粉钠(CMS-Na)11mg硬脂酸镁(M，S) 3mg其中，乙醇和蒸馏水可以以任意比例混合。
本实施例所述的尿激酶口服片剂的制备工艺如下1.将HPMC加适量乙醇分散，然后加80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜，过80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将β-环糊精加乙醇和水，HPMC三者的混合液，搅拌均匀为糊状，加尿激酶，研磨包合40分钟备用。
3.将淀粉、L-HPC混合均匀，加已包合好的主药，搅拌均匀，加适量的粘合剂制成软材。
4.将软材以16目制粒，50℃通风干燥，16目整粒。
5.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀方可压片。实施例五口服片剂配方及制备工艺组分用量尿激酶 70000单位单糖基-β-环糊精60mg淀粉100mg低取代羟丙基纤维素(L-HPC) 2.5mg羟丙基甲基纤维素(HPMC) 2.5mg-乙醇(EtOH) HPMC 3％浓度蒸馏水 -羧甲基淀粉钠(CMS-Na)26mg硬脂酸镁(M，S) 2mg其中，乙醇和蒸馏水可以以任意比例混合。
1.将HPMC加适量EtOH分散后，加80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将所有辅料加入，搅拌均匀为糊状，加尿激酶制药软材。
3.将软材以18目制粒，50℃通风干燥，18目整粒。
4.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀压片。实施例六胶囊剂配方及制备工艺组分 用量尿激酶 20000单位
β-CD 10mg淀粉 100mgL-HPC 10mg
SiO25mg本实施例所述的尿激酶口服胶囊剂的制备工艺如下1.将HPMC加适量EtOH分散后，加60℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过70目筛备用(研磨剂、粘合剂)。
2.将-CD加1(HPMC液)搅拌均匀为糊状，加尿激酶，研磨包合460分钟备用。
3.将淀粉、L-HPC混合均匀，加包合好的主药搅拌均匀，加适量粘合剂1制药软材。
4.将软材以18目制粒，50℃通风干燥，18目整粒。
5.干燥整粒后加二氧化硅，混匀灌装2#胶囊。实施例七胶囊剂配方及制备工艺组分 用量尿激酶20000单位淀粉 110mgL-HPC 10mg
SiO25mg本实施例所述的尿激酶口服胶囊剂的制备工艺如下步骤1-3同实施例五，步骤4为4.上述物料干燥整粒后加二氧化硅，混匀灌装2#胶囊。实施例八栓剂处方及制备工艺组分 用量尿激酶20000单位β-CD 10mg吐温802mg
36型半合成脂肪酸酶 40mg本实施例所述的尿激酶栓剂的制备工艺如下1.将β-CD加适量EtOH搅拌均匀为糊状，加尿激酶研磨包合40分钟备用。
2.将36型半合成脂肪酸酶加热溶解后保温38℃，加主药的包合物，充分混合均匀保温。
3.将混合均匀、保温物灌膜冷却成形。实施例九尿激酶注射液配方中的其它组份为0，取尿激酶干粉40000单位，使用时，按比例加入生理盐水，即成为尿激酶注射液。实施例十 人精子中尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)和尿激酶型纤溶酶元激活因子受体(uPAR)的定位研究。
70年代末期Propping和Asted等人用生化的方法证实人精子中存在尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)。尔后，较多学者对它存在的生理意义进行了追踪研究，然而对uPA在精子中存在的部位缺乏了解。早期对uPA的生化研究多采用纤维蛋白平板法，因该方法受到精液中其它丝氨酸蛋白水解酶的干扰，缺乏特异性。尽管八十年代和九十年代采用酶标法和放射免疫方法进行测定，并证实了uPA的存在，但对uPA在精子中存在的部位一直只是一种推测，缺少形态学方面的证据。此外对精子中uPA的来源也一直存在争论，有学者推测uPA是在精子通过生殖道的过程中结合上去的。如果是结合上去的，首先必须证明精子膜上存在uPA的受体，对精子中是否存在uPA受体的文献，国内外均无报道。还有一种认为uPA发挥生理作用是通过与uPA受体结合后才表现出生理效应的，表明了uPAR存在的重要性。因此要进一步了解uPA，开展uPA和uPAR的定位研究有重要意义。
我们先后采用免疫组织化学的方法，包括免疫胶体金光镜法和胶体金双标记电镜法、SABC荧光法等对正常男子射出体外的精子进行了研究。作用的第一抗体分别来自国内军事医学科学院生物工程研究所和丹麦Finsen实验室。实验结果表明，uPA和uPAR主要分布在精子顶体内外膜和头部浆膜上。有趣的是我们还发现在精子尾部中段有uPA和uPAR的分布，该部位是精子线粒体集中的地方，线粒体主要为精子提供运动所需能量，以上发现均为国内外首次报道。根据uPA和uPAR分布的部位，推测他们的生理作用可能不同。位于精子顶体部位的uPA和uPAR可能参与顶体反应，有助于精子对卵子的识别及精子穿过透明带和宫颈粘液；位于精子尾部的uPA和uPAR可能与精子运动有关，以确保精子在附睾中不与管壁以及精子彼此间发生粘附，同时对精液的液化有促进作用。实施例十一正常男子和弱精症男子精子中uPA的含量和活性与精子运动的关系。
人精液射出体外后，约5-30分钟液化，液化后的精子具有运动能力，包括原地微动，缓慢前向运动，中速运动和快速运动，还有一部分精子不活动。普通光镜下观察这部分不动的精子可能是死精子也可以是活精子，因某种原因而不能运动。通过对可动和不动精子的百分率来表示精子的活率。把所有运动的精子根据它们作前向运动的速度和百分数来判断精子活力的好坏。本研究就是了解uPA与精子活率和前向运动能力的关系。人精子中存在uPA和uPAR在前面已被证实，但有关正常男子和弱精症男子精子中的uPA含量和活性报道较少，通过对弱精症男子精子中uPA的分析，可以了解到uPA对精子运动的影响。
本研究通过对正常男子uPA含量和活性的测定，同时对弱精症(精子活率低下和前向运动能力差)的不育症男子精子中uPA含量与活性进行对照并进行相关分析。uPA活性测定采用琼脂糖-纤维蛋白平板法结合免疫阻断法。含量测定采用ELISA双抗夹心法。实验结果发现弱精症男子精子中uPA含量与活性显著低于正常生育男子精子中uPA的含量，两组间有极显著性意义，经相关分析发现uPA的含量与精子活率和活力有明显相关性。我们还发现，正常男子精子中uPA活性也高于弱精症不育男子组，统计学处理有极显著性差异。精子uPA活性值与精子活率，活力亦呈直线相关，并有统计学意义。根据上述实验结果，我们认为精子中uPA与精子的活率和前向运动有一定关系。由于uPA可能参与生殖过程的许多方面，如精子的成熟、运动、精液的液化、宫颈粘液的穿透、与卵子的结合、顶体反应、穿透透明带、胚胎的发育及着床等。弱精症男子引起的不育，可能是uPA含量与活性低下而引起精子运动能力差，不能运行到女性输卵管壶腹部受孕所致，但也不能完全排除因uPA低下而不能参与其它生殖过程而致不育。总之表明uPA与精子的运动有相关关系。实施例十二 uPA对弱精症患者精子活力影响的实验研究50年代初Williams最先在人尿液中发现尿激酶，70年代末期Propping等人从精液中分离出两种溶酶原激活因子，在免疫学和生物活性上类似尿激酶。后来研究者们用尿激酶免疫动物生产出uPA多抗和单抗，用来进一步研究uPA，早期发现人体内尿激酶实际上就是现在的uPA。通过对正常健康志愿者精液中加入尿激酶后进行观察，发现尿激酶有提高精子运动的作用，证实uPA的确有提高精子活率和前向运动能力的作用。我们观察了28例弱精症男子。实验方法为离体精液体外试管法，将两次精液分析精液参数除活率和或活力低下其它均正常的标本作为研究对象，待精液液化后分别加入不同浓度的尿激酶，观察加入尿激酶后30，60，90和120分钟时精子活率的变化。另外一种实验是对弱精症男子体内给予尿激酶，连续用10天，观察用尿激酶前后精子活率和前向运动能力的变化。经统计学处理，实验结果发现加入尿激酶后30，60，90和120分钟时对精子活率均有所提高，前向运动精子的数目亦有增加。体内给予尿激酶后，精子平均活率由44.64％上升到64.71％，有极显著性差异。体内外实验证明尿激酶有提高精子活率和前向运动能力的作用。这一作用可能与降低精液粘稠度有关，但不排除有可能通过其它机制提高精子运动能力的可能。实施例十三 精浆中uPA活性和含量与精子活力的关系MacGregor等人发现精浆中纤溶酶原激活因子的浓度比血液中高出60-100倍。精浆中uPA存在的生理作用不是十分明了，推测可能与精液的液化有关。液化良好的精液有利于精子作前向运动。液化不良的精液，精浆中可见到细长的纤维蛋白并相互网织使精子运动空间减少，精子的运动受到限制。我们测定了20例精液液化不良男子精浆中uPA活性，并同时与15例正常男了精浆中uPA活性进行比较，结果发现液化不良组精浆中尿激酶活性明显低于正常男子组，有极显著性差异。此外我们也对22例精子活率低下组并无精液液化不良现象的不育症男子进行尿激酶测定，结果发现精浆中尿激酶的含量低于精液参数正常组男子精浆尿激酶的含量，有极显著性差异。根据前述的研究，精子活率低下(弱精症)患者，精子中uPA活性与含量明显降低，本研究发现弱精症患者精浆中uPA含量也同时表现出低值。关于精浆中uPA或称尿激酶的生理意义除降低精液粘稠度，有利精子运动外，是否还有其它方面的作用，还有待更进一步的研究。
权利要求
1.一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物——主要成分为尿激酶，其特征在于该药物中含有10000-100000单位的尿激酶，配方如下组分用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精 0-60mg甘露醇 0-100mg酸性介质0-20mg聚乙二醇0-20mg黏合剂 0-25mg淀粉0-150蔗糖粉 0-250mg硬脂酸镁0-6mg羧甲基淀粉钠0-60吐温0-2mg半合成脂肪酸酶 0-40mg总计10000-100000单位至300mg。
2.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于尿激酶的用量优选在15000-80000单位之间。
3.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于药物中其它组份为0，尿激酶用量为10000-100000单位时，加入适量生理盐水，制成注射液。
4.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于口含片的配方为配方 用量尿激酶10000-100000单位β-环糊精 6-60mg甘露醇30-100mg硬脂酸2-20mg聚乙二醇6000 2-20mg羟丙基甲基纤维素 1.5-15mg蔗糖粉5-250mg硬脂酸镁 1-6mg合计 每片重300mg
5.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于口服片或胶囊的配方为配方 用量尿激酶 10000-100000单位β-环糊精0-60mg淀粉 30-150纤维素 5-50mg羧甲基淀粉钠 0-100mg硬脂酸镁 0-6mg二氧化硅 0-10mg
6.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于所述β-环糊精为羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、乙基-β-环糊精(E-β-CD)、二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、三甲基-β-环糊精(TM-β-CD)、单糖基-β-环糊精(G1·β-CD)、双糖基-β-环糊精(G2·-CD)、麦芽三糖基-β-环糊精(G3·β-CD)、二单糖基-β-环糊精(2G1·β-CD)、二双糖基-β-环糊精(2G2·β-CD)等，如欲要求进一步缓释，亦可选择二乙基-β-环糊精(DE-β-CD)、三乙基-β-环糊精(TE-β-CD)等，也可以是两种或两种以上的混合物。
7.根据权利要求6所述β-环糊精，其特征在于优选二甲基-β-环糊精、乙基-β-环糊精(E-β-CD)和三乙基-β-环糊精。
8.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于其中粘合剂选自如下的一种或组合羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚a-羟乙甲基丙烯酸酯、聚维酮、聚醋酸乙烯酯、醋酸纤维素、糊精、白糊精、微晶纤维素、甲基纤维素、丙烯酸甲酯、丙烯酸树脂I-IV号、羟乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、卡泊姆、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙等等，这样进一步增强尿激酶的稳定性。优选的粘合剂选自羟丙甲纤维素、乙基甲基纤维素、乙基纤维素。
9.根据权利要求1所述的治疗男性不育障碍、弱精症的药物，其特征在于所述配方中的聚乙二醇，可以是聚乙二醇4000，聚乙二醇6000，聚乙二醇7000或其它各种型号的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物。
10.一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物——尿激酶口含片的制备工艺，其特征在于①先将聚乙二醇用温水溶解，冷却，加尿激酶搅拌均匀，加β-环糊精不断搅拌，约2-6hr使之包合完全，过滤后，用清水洗净即得包合物；②将甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉等辅料混合均匀，加包合物，再充分混合均匀后加3％的羟丙基甲基纤维素，制成软材，然后用16目筛制颗粒，以40--70℃鼓风干燥4-8hr，以16目筛整理；③将整理好的颗粒加硬脂酸镁，混合均匀即可；用专用模具压片，片重约为300mg/片。
11.根据权利要求10所述的制备工艺，其特征在于该工艺中的①和②步得到的颗粒，可以用于制备口服片剂和胶囊。
12.一种治疗男性不育障碍、弱精症的药物——尿激酶口服片或胶囊的制备工艺，其特征在于1.将HPMC加适量EtOH分散后，加60-80℃蒸馏水稀释至需要浓度，密闭放置过夜后，过70-80目筛备用(研磨剂、粘合剂)。2.将所有辅料加入，搅拌均匀为糊状，加尿激酶制药软材。3.将软材以18目制粒，40-60℃通风干燥，18目整粒。4.干燥整粒后加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀压片或加二氧化硅制胶囊。
13.根据权利要求1所述的尿激酶口服固体制剂、栓剂，在治疗男性不育障碍、弱精症的应用。
全文摘要
本发明涉及一种男性不育障碍、弱精症的治疗药物—尿激酶,尿激酶制剂以及尿激酶制剂对男性不育障碍、弱精症治疗的新用途,注射和口服制剂可以用传统的剂型配方,本发明还采用β－环糊精对尿激酶进行包含,配合独特的制备工艺,研制成有生理活性的口含型药物片剂,使尿激酶的疗效显著提高,并减轻了该物质的副作用,增强了稳定性,实验结果表明,该药物保持了尿激酶的活性,可有效地发挥其治疗男性不育障碍、弱精症的新用途。
文档编号A61K38/49GK1260997SQ9912193
公开日2000年7月26日 申请日期1999年10月15日 优先权日1998年10月16日
发明者丁钉生, 熊承良 申请人:珠海经济特区生物化学制药厂
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