消旋去甲胡桐素a制备抗艾滋病毒类药物的应用的制作方法
专利名称：消旋去甲胡桐素a制备抗艾滋病毒类药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及消旋去甲胡桐素A在制备抗爱滋病毒类药物中的应用，尤其是在制备抗HIV-1耐药株的药物中的应用。本发明还涉及消旋去甲胡桐素A与不同靶位的HIV-1抑制剂的联合用药及所组成的组合物。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，自从1981年美国报道首例爱滋病人以来，该病迅速在全球传播，已成为严重危害人民健康的恶性传染病，被称为“二十世纪瘟疫”，全球已死亡2800万人，还有4000余万艾滋病感染者。通过对HIV的病毒分子生物学及艾滋病致病机制研究发现艾滋病毒逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)，蛋白酶(Protease，PI)和整合酶(Integrase，IN)是HIV-1基因组在复制中的三个关键酶，均为开展抗艾滋病毒药物的重要靶点，因此近十几年来艾滋病药物的研制主要寻找抑制上述三个关键酶的抑制剂。
自从1987年第一个逆转录酶抑制剂核苷类药物齐多夫定(zidorudire)被美国食品药物管理局(FDA)批准用于临床治疗艾滋病药物以来，迄今为止共批准18种，其中逆转录酶抑制剂12种，(包括核苷类9种，非核苷类3种)与蛋白酶抑制剂6种，有关整合酶抑制剂研发较慢，目前只有S-1360作为第一个整合酶抑制剂用于临床I期试验。此外最近3月13日美国FDA批准了一种新作用类型药物T-20治疗艾滋病。它是通过阻止艾滋病毒进入细胞起作用，有别于上述二种酶抑制剂，他们作用靶点是针对已进入人体细胞内的艾滋病毒逆转录酶及蛋白酶。但是上述这些逆转录酶抑制剂药物单独用于治疗艾滋病人均产生不同程度的耐药性，不仅使所起的药效消失，而且很快产生耐药毒株的再传播，将使他人的治疗更困难，治疗效果并不理想，毒副作用也较大。自从1995年艾滋病毒蛋白酶抑制剂问世后，二种不同酶抑制剂联合用法可显著提高艾滋病疗效。1996年提出了鸡尾酒疗法，即二种逆转录酶抑制剂与一种蛋白酶抑制剂的联合用药，现称为高效抗逆转录病毒治疗(High activeanti-retroviral therapy)疗法。如Indinavir/AZT/3TC；Retonavir/AZT/3TC；Indinavir/d4T/3TC。临床实践证明两药或多药同时或交替使用比单一用药有明显优点，由于增加了针对病毒作用靶点，产生相加或协同抗病毒作用，因而减少单一药物用量，从而降低了毒副反应，延缓了耐药毒株的出现。联合用药能使病人血液中的HIV-1载量大大减少，甚至减少到测不出水平，因此能显著延长艾滋病人的生命。美国自从开展了联合用药，其国内艾滋病人的死亡率下降。
联合用药虽然比单药前进了一大步，但是爱滋病人仍然潜伏在病人的静止CD4T记忆细胞内(resting memory CD4T)和病人的淋巴结内，并不能根除病毒，长期使用出现一定副作用，随之耐药株出现，疗效下降，一旦停药后病毒又可繁殖，而且药物价格昂贵，极大多数病人难以负担，为克服上述问题，必须继续寻找高效低毒价廉药物，作用于病毒的不同环节与途径，研制不同类型的新型抗艾滋病毒药物成为十分必要。
目前，HIV的临床治疗最棘手的问题是耐药变株，是治疗失败的主要原因。我国患者绝大部分无药治疗，随着联合国对HIV药价格协调政策之实施，国外药物进入国内市场，耐药是必然趋势。
目前被美国FDA批准的临床用于治疗艾滋病的有蛋白酶抑制剂有沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。逆转录酶抑制剂有核苷类和非核苷类；其中核苷类逆转录酶抑制剂有齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir +lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine +zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)；非核苷类逆转录酶抑制剂有奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。进入细胞抑制剂有T-20。
本发明涉及四环香豆素化合物消旋去甲胡桐素A为选择性逆转录酶抑制剂，对人外周血单核细胞(PBMC)培养中有很强的抑制HIV-1P24抗原活性，已于2001年6月21日向中华人民共和国国家知识产权局申请了用途专利，申请号为01129601.1。
发明内容
本发明人现已出人意料地发现消旋去甲胡酮素A在对HIV-1病毒抑制的同时可有效地抑制或耐受HIV-1病毒对药物产生的耐药株，从而可有效地抑制爱滋病毒并可与其它抗爱滋病药物联用更好地治疗爱滋病。本发明基于上述发现现已完成。
因此，本发明第一方面涉及通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A在制备治疗存在HIV-i耐药株的爱滋病的药物中的用途。
本发明还涉及药物组合物，其包括通式(I)的消旋去甲胡桐素A，和制药领域中常用的载体。
本发明还涉及药物组合物，其包括通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A和至少一种其它的HIV抑制剂。
本发明还涉及式I消旋去甲胡桐素A与至少一种其它HIV-1抑制剂联合用于制备用于治疗爱滋病的药物中用途。
本发明还涉及一种药盒，其包括上述组合物。
本发明还涉及治疗爱滋病的方法，其包括给爱滋病患者治疗有效量式I去甲胡桐素A或去甲胡桐素A与至少一种其它HIV-1抑制剂。
本发明所述的化合物包括其立体异构体和药效学上可接受的盐。
根据本发明，本发明中所述其它HIV-1抑制剂选自至少一种蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂或进入细胞抑制剂。
根据本发明，其中蛋白酶抑制剂举例讲是沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。
根据本发明，其中逆转录酶抑制剂举例讲是核苷类和非核苷类；优选的核苷类逆转录酶抑制剂是齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir+lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine+zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)，；优选的非核苷类逆转录酶抑制剂是奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。
根据本发明，其中进入细胞抑制剂为T-20。
本发明应用不同细胞如人外周血单核细胞(PBMC)、MT-4细胞，不同的病毒毒株，如3’-叠氮-3’-脱氧胸苷敏感的临床毒株HIV-1018aAZT、AZT-耐药株HIV-1018c、HTLV-IIIB毒株、HIV-1 302143、非核苷类L697661耐药株HIV090，进行药理实验。
实验结果显示去甲胡桐素A在不同细胞培养内对不同HIV-1毒株都有抑制活性，尤其是对非核苷类药物L697661耐药株(HIV090)有很强的抑制活性。众所周知，此耐药株含临床常见的Y181c突变。
实验结果还表明去甲胡桐素A和其他抗HIV药物联用有协同作用。消旋去甲胡桐素A使茚地那韦IC50由80.65ng/ml降为0.66ng/ml，降低了122倍，CI＝0.12，说明消旋去甲胡桐素A和茚地那韦具有协同作用。消旋去甲胡桐素A使T-20 IC50由0.011μg/ml降为0.0014μg/ml，降低了7.9倍，CI＝0.003，说明消旋去甲胡桐素A和T-20具有协同作用。消旋去甲胡桐素A使叠氮胸苷(AZT)IC50由0.70nm降为0.41nm，降低了1.7倍，CI＝0.35，说明消旋去甲胡桐素A和叠氮胸苷具有协同作用。
根据本发明消旋去甲胡桐素A的抗HIV作用可通过抑制人免疫缺陷病毒逆转录酶起作用。其不仅对人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)(野生株)有抑制活性，IC50＝3.17(礛)；对HIV-1 RT(耐药株Y181c)抑制活性更高，IC50＝0.114(礛)。
本发明进一步涉及含有治疗有效剂量的消旋去甲胡桐素A及其药物学上可以接受的盐的药物组合物。本发明还涉及消旋去甲胡桐素A与其它的抗爱滋病毒类药物组成的药物组合物。其它的抗爱滋病毒类药物包括蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂。优选的蛋白酶抑制剂包括茚地那韦；优选的逆转录酶抑制剂包括叠氮胸苷；优选的进入细胞抑制剂包括T-20。本发明的药物组合物，还包括至少由消旋去甲胡桐素A和选自逆转录酶、蛋白酶、进入细胞抑制剂中的至少两种抑制剂的组成的药物组合物。
本发明因此还涉及含有作为活性成份的化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的活性成分。
本发明的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围本发明的化合物的用量为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
根据本发明还包括消旋去甲胡桐素A的药物组合物与其它的抗爱滋病毒类药物的药物组合物，组合包装用于同时出售的药品。例如，至少由消旋去甲胡桐素A与蛋白酶抑制剂组成。优选的蛋白酶抑制剂是沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。例如至少由消旋去甲胡桐素A与逆转录酶抑制剂组成。优选的逆转录酶抑制剂是核苷类和非核苷类；优选的核苷类逆转录酶抑制剂是齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir +lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine+zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)，；优选的非核苷类逆转录酶抑制剂是奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。例如至少由消旋去甲胡桐素A与进入细胞抑制剂的组成。优选的是T-20。组合包装药品可以至少由消旋去甲胡桐素A和选自逆转录酶、蛋白酶、进入细胞抑制剂中的至少2种抑制剂的组成，其中蛋白酶抑制剂是茚地那韦、逆转录酶抑制剂是叠氮胸苷、进入细胞抑制剂是T-20。例如，消旋去甲胡桐素A注射剂和叠氮胸苷注射剂同时组合包装，以利于同时出售、同时使用。
术语AZT，3’-叠氮-3’-脱氧胸苷HIV-1 RT抑制剂，即抑制HIV-1繁殖是由于干扰了HIV-1逆转录酶(RT)的活性的化合物HIV-1 PR抑制剂，即抑制HIV-1繁殖是由于干扰了HIV-1蛋白酶(PR)的活性的化合物HIV-1进入细胞抑制剂，即抑制HIV-1繁殖是由于干扰了HIV-1的进入宿主细胞的化合物HIV-1突变株，是指能抗拒特别的HIV-1 RT抑制剂的变异株T-20为36个氨基酸合成多肽，其结构式为Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQLLELDKWASLWNWF-NH2，此药已于2003年3月13日被美国FDA批准为第一个新类型(进入细胞阻断剂)药物，又名enfuvirtide。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面将结合实施例采用消旋去甲胡桐素A(±-11-去甲Calanolide A)的药理实验及结果，来说明其在制药领域中的新用途。
消旋去甲胡桐素A体外的抗HIV-1活性一、材料和方法1.细胞人外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll-Hypaque密度梯度离心方法从HIV-1阴性的志愿者的外周血分离出来；MT-4细胞由R.C.Gallo教授(美国，巴尔的摩，人类病毒学研究所)提供。
2.培养基RPMI 1640加上20％胎牛血清，5％白细胞介素2，又称R-3培养基；新鲜的PBMC在R-3(加上5微克/毫升的PHA)中培养48小时，然后，PBMC用RP1640洗一次。RPMI 1640加上20％胎牛血清，又称R-20培养基，H9细胞在R-20中培养。
3.病毒毒株HIV-1018aAZT(3’-叠氮-3’-脱氧胸苷)-敏感临床株；HIV-1018c；AZT-耐受株。这两个毒株均由美国加州大学圣地亚哥分校的Douglas Richmen教授提供，HTLV-IIIB毒株由R.C.Gallo教授(美国，巴尔的摩，人类病毒学研究所)提供，HIV-1 302143(儿童HIV-1毒株)，与HIV090(非核苷类L697661耐药株)美国国立卫生研究院(NIH)提供。
4.样品消旋去甲胡桐素A，中国医学科学院药物研究所抗病毒科研小组提供。T-20(传入抑制剂)美国Trimeris公司提供。齐多夫定(AZT)，茚地那韦(indinavir)美国科州医学中心Robert Schooley教授ACTG实验室提供。
5.HIV-1 p24抗原产量的测定HIV-1 p24抗原定量测定是用全病毒抗原俘获ELISA(美国，佛罗里达，Coulter公司产品)方法完成，具体程序按其提供说明书操作。
6.样品毒性测定用台玢蓝(Trypan blue staining)染色方法判定细胞死活数目，蓝染细胞为死细胞，无色细胞为存活细胞。
7.数据统计分析使用“Chou Dose Effect”的软件处理数据。
二、实验设计1.消旋去甲胡桐素A在细胞培养中对HIV-1复制的抑制作用在96孔细胞培养板内，2×105细胞(H9细胞)，100TCID50的HIV-1毒株及按一定倍数稀释的消旋去甲胡桐素A共同培养，或是细胞预先被病毒感染2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞一次，然后加入不同浓度的消旋去甲胡桐素A共同培养。病毒感染4天后收获上清测定P24产量，用“ChouDose Effect”软件计算50％抑制浓度(IC50)。
2.消旋去甲胡桐素A产生的细胞毒性在96孔细胞培养细胞板内，2×105细胞与一定倍数稀释的消旋去甲胡桐素A共同培养，4天后镜下计数细胞死活(用台玢蓝染色，Trypan blue staining)数目，并用“ChouDose Effect”软件计算50％毒性浓度(TC50)。
治疗指数TI＝TC50/IC503.消旋去甲胡桐素A与AZT，Indinavir，T-20治疗艾滋病药物的协同抗HIV-1的作用细胞预先被100TCID50的HIV-1感染2小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次。消旋去甲胡桐素A，AZT或Indinavir，T-20被相同固定的比率稀释(如1∶5)。各种浓度的消旋去甲胡桐素A和各种浓度的AZT或Indinavir，T-20单独和两两相同稀释度的药品加到每个对应孔中，最后每孔加入2×105细胞共同培养4天，收集上清做P24产量检测。用“Chou Dose Effect”软件计算单独及联合用药的IC50和联合治疗指数(CI)值。CI＜0.9指示协同作用；0.9＜CI＜1.1指示相加作用；CI＞1.1指示拮抗作用。
三、实验结果表1去甲胡桐素A在不同细胞培养内，对不同HIV-1 P24的抑制作用细胞 病毒株 IC50(μM) TC50(μM) TIPBMC HIV-1018a 3.51 594.131169.3(外周血单核细胞) (成人，AZT敏感株)HIV-1018c 7.5678.4(成人，AZT耐药株)HIV-1 302143 14.42 34.1(儿童)HTLV-111B 27.92 21.3(实验株)MT-4细胞 HIV-111B 4.65 23 4.9HIV-0900.185 124.3(对非核苷类L697661耐药株)由表1可知，去甲胡桐素A在PBMC及MT-4细胞内对不同HIV-1毒株包括核苷类药物AZT成人敏感株及AZT耐药株、儿童株等病毒株都有抑制活性，尤其是对非核苷类药物L697661耐药株(HIV090)有很强的抑制活性。众所周知，此耐药株含临床常见的Y181c突变。
实验结果表明消旋去甲胡桐素A使茚地那韦IC50由80.65ng/ml降为0.66ng/ml，降低了122倍，CI＝0.12，说明消旋去甲胡桐素A和茚地那韦具有协同作用。
消旋去甲胡桐素A使T-20 IC50由0.011μg/ml降为0.0014μg/ml，降低了7.9倍，CI＝0.003，说明消旋去甲胡桐素A和T-20具有协同作用。
消旋去甲胡桐素A使叠氮胸苷(AZT)IC50由0.70nm降为0.41nm，降低了1.7倍，CI＝0.35，说明消旋去甲胡桐素A和叠氮胸苷具有协同作用。
实施例2消旋去甲胡桐素A对HIV-1逆转酶的抑制实验1.人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)(野株)HIV-1逆转录酶P66/P51重组质粒转染大肠杆菌PKRT2，自美国国立卫生研究所(NIH)引进，自行培养表达提纯，制备试验用HIV-1逆转录酶，-80℃保存待用。
HIV-1逆转录酶(突变株)包括L100I、Y181C、Y188H及G138A 4个突变株的逆转录酶，此4个突变酶均为重组基因工程酶，均由瑞典Astra药厂引进。
2.HIV-1 RT实验方法HIV-1 RT(野株及突变株)活性测定反应总体积60μl，含50mmol/LTris-HCl，pH7.8；6mmol/L MgCl2；100mmol/L KCl；5mmol/L DTT；0.133mg/ml BSA；2μg/ml rA.(dT)12；0.2μmol/L3HdTTP及适量酶，37℃反应，30分钟，取50μl反应液均匀点在滤纸园片上，立即投入冷5％三氯醋酸(TCA)溶液(含0.02mol/L焦磷酸钠)。经3次5％TCA及3次95％乙醇洗涤脱水后，烤干，在液闪记数仪内测cpm。
3.计算结果按下列公式计算不同浓度药液抑制％ 按Reed-Muench法计算50％抑制浓度(IC50)4.实验结果见下表消旋去甲胡桐素A抗HIV-1 RT IC50病毒株 IC50μmol/L 平均IC50μmol/L野株3.09，3.18，2.38 2.88L100I 9.7Y181C 0.625，0.60.61(比野株小4.7倍)Y188H 34.2G138A 6.3，5.63 5.97
野株IC50三次测定的具体数据列表如下
L100I IC50测定的具体数据如下
Y181C IC50测定的具体数据如下
Y188H IC50测定的具体数据如下
G138A IC50测定的具体数据如下
本发明主要涉及消旋去甲胡桐素A其抗病毒机制，不仅对人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)(野生株)有活性，对HIV-1 RT(耐药株Y181c)抑制活性更高。
权利要求
1.如通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A在制备治疗含HIV-1耐药株的爱滋病药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其特征在于所述的HIV-1耐药株选自3’-叠氮-3’-脱氧胸苷耐受株、非核苷类L697661耐药株。
3.一种治疗HIV-1耐药株的药物组合物，其特征在于含有有效剂量消旋去甲胡桐素A。
4.一种药物组合物，其特征在于含有有效剂量消旋去甲胡桐素A与至少一种其它HIV-1抑制剂。
5.权利要求4的组合物，其中所述其它HIV-1抑制剂选自至少一种蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂或进入细胞抑制剂。
6.权利要求5的组合物，蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。
7.权利要求5的组合物，逆转录酶抑制剂是选自核苷类逆转录酶抑制剂和其它非核苷类逆转录酶抑制剂。
8.权利要求7的组合物，核苷类逆转录酶抑制剂选自齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir +lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine +zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)。
9.权利要求7的组合物，其它非核苷类逆转录酶抑制剂选自奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。
10.权利要求5的组合物，其中进入细胞抑制剂是T-20。
全文摘要
本发明公开了如通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A在制备抗爱滋病毒类药物中的应用，尤其是在制备抗HIV－1耐药株的药物中的应用。本发明还涉及消旋去甲胡桐素A与其它HIV－1抑制剂的组合而成的药物组合物。
文档编号A61P31/00GK1565442SQ0314251
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者王琳, 刘刚, 陶佩珍, 张兴权, 章天, 黄飚, 赵知中 申请人:中国医学科学院药物研究所
技术领域：
本发明涉及消旋去甲胡桐素A在制备抗爱滋病毒类药物中的应用，尤其是在制备抗HIV-1耐药株的药物中的应用。本发明还涉及消旋去甲胡桐素A与不同靶位的HIV-1抑制剂的联合用药及所组成的组合物。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，自从1981年美国报道首例爱滋病人以来，该病迅速在全球传播，已成为严重危害人民健康的恶性传染病，被称为“二十世纪瘟疫”，全球已死亡2800万人，还有4000余万艾滋病感染者。通过对HIV的病毒分子生物学及艾滋病致病机制研究发现艾滋病毒逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)，蛋白酶(Protease，PI)和整合酶(Integrase，IN)是HIV-1基因组在复制中的三个关键酶，均为开展抗艾滋病毒药物的重要靶点，因此近十几年来艾滋病药物的研制主要寻找抑制上述三个关键酶的抑制剂。
自从1987年第一个逆转录酶抑制剂核苷类药物齐多夫定(zidorudire)被美国食品药物管理局(FDA)批准用于临床治疗艾滋病药物以来，迄今为止共批准18种，其中逆转录酶抑制剂12种，(包括核苷类9种，非核苷类3种)与蛋白酶抑制剂6种，有关整合酶抑制剂研发较慢，目前只有S-1360作为第一个整合酶抑制剂用于临床I期试验。此外最近3月13日美国FDA批准了一种新作用类型药物T-20治疗艾滋病。它是通过阻止艾滋病毒进入细胞起作用，有别于上述二种酶抑制剂，他们作用靶点是针对已进入人体细胞内的艾滋病毒逆转录酶及蛋白酶。但是上述这些逆转录酶抑制剂药物单独用于治疗艾滋病人均产生不同程度的耐药性，不仅使所起的药效消失，而且很快产生耐药毒株的再传播，将使他人的治疗更困难，治疗效果并不理想，毒副作用也较大。自从1995年艾滋病毒蛋白酶抑制剂问世后，二种不同酶抑制剂联合用法可显著提高艾滋病疗效。1996年提出了鸡尾酒疗法，即二种逆转录酶抑制剂与一种蛋白酶抑制剂的联合用药，现称为高效抗逆转录病毒治疗(High activeanti-retroviral therapy)疗法。如Indinavir/AZT/3TC；Retonavir/AZT/3TC；Indinavir/d4T/3TC。临床实践证明两药或多药同时或交替使用比单一用药有明显优点，由于增加了针对病毒作用靶点，产生相加或协同抗病毒作用，因而减少单一药物用量，从而降低了毒副反应，延缓了耐药毒株的出现。联合用药能使病人血液中的HIV-1载量大大减少，甚至减少到测不出水平，因此能显著延长艾滋病人的生命。美国自从开展了联合用药，其国内艾滋病人的死亡率下降。
联合用药虽然比单药前进了一大步，但是爱滋病人仍然潜伏在病人的静止CD4T记忆细胞内(resting memory CD4T)和病人的淋巴结内，并不能根除病毒，长期使用出现一定副作用，随之耐药株出现，疗效下降，一旦停药后病毒又可繁殖，而且药物价格昂贵，极大多数病人难以负担，为克服上述问题，必须继续寻找高效低毒价廉药物，作用于病毒的不同环节与途径，研制不同类型的新型抗艾滋病毒药物成为十分必要。
目前，HIV的临床治疗最棘手的问题是耐药变株，是治疗失败的主要原因。我国患者绝大部分无药治疗，随着联合国对HIV药价格协调政策之实施，国外药物进入国内市场，耐药是必然趋势。
目前被美国FDA批准的临床用于治疗艾滋病的有蛋白酶抑制剂有沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。逆转录酶抑制剂有核苷类和非核苷类；其中核苷类逆转录酶抑制剂有齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir +lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine +zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)；非核苷类逆转录酶抑制剂有奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。进入细胞抑制剂有T-20。
本发明涉及四环香豆素化合物消旋去甲胡桐素A为选择性逆转录酶抑制剂，对人外周血单核细胞(PBMC)培养中有很强的抑制HIV-1P24抗原活性，已于2001年6月21日向中华人民共和国国家知识产权局申请了用途专利，申请号为01129601.1。
发明内容
本发明人现已出人意料地发现消旋去甲胡酮素A在对HIV-1病毒抑制的同时可有效地抑制或耐受HIV-1病毒对药物产生的耐药株，从而可有效地抑制爱滋病毒并可与其它抗爱滋病药物联用更好地治疗爱滋病。本发明基于上述发现现已完成。
因此，本发明第一方面涉及通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A在制备治疗存在HIV-i耐药株的爱滋病的药物中的用途。
本发明还涉及药物组合物，其包括通式(I)的消旋去甲胡桐素A，和制药领域中常用的载体。
本发明还涉及药物组合物，其包括通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A和至少一种其它的HIV抑制剂。
本发明还涉及式I消旋去甲胡桐素A与至少一种其它HIV-1抑制剂联合用于制备用于治疗爱滋病的药物中用途。
本发明还涉及一种药盒，其包括上述组合物。
本发明还涉及治疗爱滋病的方法，其包括给爱滋病患者治疗有效量式I去甲胡桐素A或去甲胡桐素A与至少一种其它HIV-1抑制剂。
本发明所述的化合物包括其立体异构体和药效学上可接受的盐。
根据本发明，本发明中所述其它HIV-1抑制剂选自至少一种蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂或进入细胞抑制剂。
根据本发明，其中蛋白酶抑制剂举例讲是沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。
根据本发明，其中逆转录酶抑制剂举例讲是核苷类和非核苷类；优选的核苷类逆转录酶抑制剂是齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir+lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine+zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)，；优选的非核苷类逆转录酶抑制剂是奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。
根据本发明，其中进入细胞抑制剂为T-20。
本发明应用不同细胞如人外周血单核细胞(PBMC)、MT-4细胞，不同的病毒毒株，如3’-叠氮-3’-脱氧胸苷敏感的临床毒株HIV-1018aAZT、AZT-耐药株HIV-1018c、HTLV-IIIB毒株、HIV-1 302143、非核苷类L697661耐药株HIV090，进行药理实验。
实验结果显示去甲胡桐素A在不同细胞培养内对不同HIV-1毒株都有抑制活性，尤其是对非核苷类药物L697661耐药株(HIV090)有很强的抑制活性。众所周知，此耐药株含临床常见的Y181c突变。
实验结果还表明去甲胡桐素A和其他抗HIV药物联用有协同作用。消旋去甲胡桐素A使茚地那韦IC50由80.65ng/ml降为0.66ng/ml，降低了122倍，CI＝0.12，说明消旋去甲胡桐素A和茚地那韦具有协同作用。消旋去甲胡桐素A使T-20 IC50由0.011μg/ml降为0.0014μg/ml，降低了7.9倍，CI＝0.003，说明消旋去甲胡桐素A和T-20具有协同作用。消旋去甲胡桐素A使叠氮胸苷(AZT)IC50由0.70nm降为0.41nm，降低了1.7倍，CI＝0.35，说明消旋去甲胡桐素A和叠氮胸苷具有协同作用。
根据本发明消旋去甲胡桐素A的抗HIV作用可通过抑制人免疫缺陷病毒逆转录酶起作用。其不仅对人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)(野生株)有抑制活性，IC50＝3.17(礛)；对HIV-1 RT(耐药株Y181c)抑制活性更高，IC50＝0.114(礛)。
本发明进一步涉及含有治疗有效剂量的消旋去甲胡桐素A及其药物学上可以接受的盐的药物组合物。本发明还涉及消旋去甲胡桐素A与其它的抗爱滋病毒类药物组成的药物组合物。其它的抗爱滋病毒类药物包括蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂。优选的蛋白酶抑制剂包括茚地那韦；优选的逆转录酶抑制剂包括叠氮胸苷；优选的进入细胞抑制剂包括T-20。本发明的药物组合物，还包括至少由消旋去甲胡桐素A和选自逆转录酶、蛋白酶、进入细胞抑制剂中的至少两种抑制剂的组成的药物组合物。
本发明因此还涉及含有作为活性成份的化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的活性成分。
本发明的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围本发明的化合物的用量为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
根据本发明还包括消旋去甲胡桐素A的药物组合物与其它的抗爱滋病毒类药物的药物组合物，组合包装用于同时出售的药品。例如，至少由消旋去甲胡桐素A与蛋白酶抑制剂组成。优选的蛋白酶抑制剂是沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。例如至少由消旋去甲胡桐素A与逆转录酶抑制剂组成。优选的逆转录酶抑制剂是核苷类和非核苷类；优选的核苷类逆转录酶抑制剂是齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir +lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine+zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)，；优选的非核苷类逆转录酶抑制剂是奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。例如至少由消旋去甲胡桐素A与进入细胞抑制剂的组成。优选的是T-20。组合包装药品可以至少由消旋去甲胡桐素A和选自逆转录酶、蛋白酶、进入细胞抑制剂中的至少2种抑制剂的组成，其中蛋白酶抑制剂是茚地那韦、逆转录酶抑制剂是叠氮胸苷、进入细胞抑制剂是T-20。例如，消旋去甲胡桐素A注射剂和叠氮胸苷注射剂同时组合包装，以利于同时出售、同时使用。
术语AZT，3’-叠氮-3’-脱氧胸苷HIV-1 RT抑制剂，即抑制HIV-1繁殖是由于干扰了HIV-1逆转录酶(RT)的活性的化合物HIV-1 PR抑制剂，即抑制HIV-1繁殖是由于干扰了HIV-1蛋白酶(PR)的活性的化合物HIV-1进入细胞抑制剂，即抑制HIV-1繁殖是由于干扰了HIV-1的进入宿主细胞的化合物HIV-1突变株，是指能抗拒特别的HIV-1 RT抑制剂的变异株T-20为36个氨基酸合成多肽，其结构式为Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQLLELDKWASLWNWF-NH2，此药已于2003年3月13日被美国FDA批准为第一个新类型(进入细胞阻断剂)药物，又名enfuvirtide。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面将结合实施例采用消旋去甲胡桐素A(±-11-去甲Calanolide A)的药理实验及结果，来说明其在制药领域中的新用途。
消旋去甲胡桐素A体外的抗HIV-1活性一、材料和方法1.细胞人外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll-Hypaque密度梯度离心方法从HIV-1阴性的志愿者的外周血分离出来；MT-4细胞由R.C.Gallo教授(美国，巴尔的摩，人类病毒学研究所)提供。
2.培养基RPMI 1640加上20％胎牛血清，5％白细胞介素2，又称R-3培养基；新鲜的PBMC在R-3(加上5微克/毫升的PHA)中培养48小时，然后，PBMC用RP1640洗一次。RPMI 1640加上20％胎牛血清，又称R-20培养基，H9细胞在R-20中培养。
3.病毒毒株HIV-1018aAZT(3’-叠氮-3’-脱氧胸苷)-敏感临床株；HIV-1018c；AZT-耐受株。这两个毒株均由美国加州大学圣地亚哥分校的Douglas Richmen教授提供，HTLV-IIIB毒株由R.C.Gallo教授(美国，巴尔的摩，人类病毒学研究所)提供，HIV-1 302143(儿童HIV-1毒株)，与HIV090(非核苷类L697661耐药株)美国国立卫生研究院(NIH)提供。
4.样品消旋去甲胡桐素A，中国医学科学院药物研究所抗病毒科研小组提供。T-20(传入抑制剂)美国Trimeris公司提供。齐多夫定(AZT)，茚地那韦(indinavir)美国科州医学中心Robert Schooley教授ACTG实验室提供。
5.HIV-1 p24抗原产量的测定HIV-1 p24抗原定量测定是用全病毒抗原俘获ELISA(美国，佛罗里达，Coulter公司产品)方法完成，具体程序按其提供说明书操作。
6.样品毒性测定用台玢蓝(Trypan blue staining)染色方法判定细胞死活数目，蓝染细胞为死细胞，无色细胞为存活细胞。
7.数据统计分析使用“Chou Dose Effect”的软件处理数据。
二、实验设计1.消旋去甲胡桐素A在细胞培养中对HIV-1复制的抑制作用在96孔细胞培养板内，2×105细胞(H9细胞)，100TCID50的HIV-1毒株及按一定倍数稀释的消旋去甲胡桐素A共同培养，或是细胞预先被病毒感染2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞一次，然后加入不同浓度的消旋去甲胡桐素A共同培养。病毒感染4天后收获上清测定P24产量，用“ChouDose Effect”软件计算50％抑制浓度(IC50)。
2.消旋去甲胡桐素A产生的细胞毒性在96孔细胞培养细胞板内，2×105细胞与一定倍数稀释的消旋去甲胡桐素A共同培养，4天后镜下计数细胞死活(用台玢蓝染色，Trypan blue staining)数目，并用“ChouDose Effect”软件计算50％毒性浓度(TC50)。
治疗指数TI＝TC50/IC503.消旋去甲胡桐素A与AZT，Indinavir，T-20治疗艾滋病药物的协同抗HIV-1的作用细胞预先被100TCID50的HIV-1感染2小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次。消旋去甲胡桐素A，AZT或Indinavir，T-20被相同固定的比率稀释(如1∶5)。各种浓度的消旋去甲胡桐素A和各种浓度的AZT或Indinavir，T-20单独和两两相同稀释度的药品加到每个对应孔中，最后每孔加入2×105细胞共同培养4天，收集上清做P24产量检测。用“Chou Dose Effect”软件计算单独及联合用药的IC50和联合治疗指数(CI)值。CI＜0.9指示协同作用；0.9＜CI＜1.1指示相加作用；CI＞1.1指示拮抗作用。
三、实验结果表1去甲胡桐素A在不同细胞培养内，对不同HIV-1 P24的抑制作用细胞 病毒株 IC50(μM) TC50(μM) TIPBMC HIV-1018a 3.51 594.131169.3(外周血单核细胞) (成人，AZT敏感株)HIV-1018c 7.5678.4(成人，AZT耐药株)HIV-1 302143 14.42 34.1(儿童)HTLV-111B 27.92 21.3(实验株)MT-4细胞 HIV-111B 4.65 23 4.9HIV-0900.185 124.3(对非核苷类L697661耐药株)由表1可知，去甲胡桐素A在PBMC及MT-4细胞内对不同HIV-1毒株包括核苷类药物AZT成人敏感株及AZT耐药株、儿童株等病毒株都有抑制活性，尤其是对非核苷类药物L697661耐药株(HIV090)有很强的抑制活性。众所周知，此耐药株含临床常见的Y181c突变。
实验结果表明消旋去甲胡桐素A使茚地那韦IC50由80.65ng/ml降为0.66ng/ml，降低了122倍，CI＝0.12，说明消旋去甲胡桐素A和茚地那韦具有协同作用。
消旋去甲胡桐素A使T-20 IC50由0.011μg/ml降为0.0014μg/ml，降低了7.9倍，CI＝0.003，说明消旋去甲胡桐素A和T-20具有协同作用。
消旋去甲胡桐素A使叠氮胸苷(AZT)IC50由0.70nm降为0.41nm，降低了1.7倍，CI＝0.35，说明消旋去甲胡桐素A和叠氮胸苷具有协同作用。
实施例2消旋去甲胡桐素A对HIV-1逆转酶的抑制实验1.人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)(野株)HIV-1逆转录酶P66/P51重组质粒转染大肠杆菌PKRT2，自美国国立卫生研究所(NIH)引进，自行培养表达提纯，制备试验用HIV-1逆转录酶，-80℃保存待用。
HIV-1逆转录酶(突变株)包括L100I、Y181C、Y188H及G138A 4个突变株的逆转录酶，此4个突变酶均为重组基因工程酶，均由瑞典Astra药厂引进。
2.HIV-1 RT实验方法HIV-1 RT(野株及突变株)活性测定反应总体积60μl，含50mmol/LTris-HCl，pH7.8；6mmol/L MgCl2；100mmol/L KCl；5mmol/L DTT；0.133mg/ml BSA；2μg/ml rA.(dT)12；0.2μmol/L3HdTTP及适量酶，37℃反应，30分钟，取50μl反应液均匀点在滤纸园片上，立即投入冷5％三氯醋酸(TCA)溶液(含0.02mol/L焦磷酸钠)。经3次5％TCA及3次95％乙醇洗涤脱水后，烤干，在液闪记数仪内测cpm。
3.计算结果按下列公式计算不同浓度药液抑制％ 按Reed-Muench法计算50％抑制浓度(IC50)4.实验结果见下表消旋去甲胡桐素A抗HIV-1 RT IC50病毒株 IC50μmol/L 平均IC50μmol/L野株3.09，3.18，2.38 2.88L100I 9.7Y181C 0.625，0.60.61(比野株小4.7倍)Y188H 34.2G138A 6.3，5.63 5.97
野株IC50三次测定的具体数据列表如下
L100I IC50测定的具体数据如下
Y181C IC50测定的具体数据如下
Y188H IC50测定的具体数据如下
G138A IC50测定的具体数据如下
本发明主要涉及消旋去甲胡桐素A其抗病毒机制，不仅对人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)(野生株)有活性，对HIV-1 RT(耐药株Y181c)抑制活性更高。
权利要求
1.如通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A在制备治疗含HIV-1耐药株的爱滋病药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其特征在于所述的HIV-1耐药株选自3’-叠氮-3’-脱氧胸苷耐受株、非核苷类L697661耐药株。
3.一种治疗HIV-1耐药株的药物组合物，其特征在于含有有效剂量消旋去甲胡桐素A。
4.一种药物组合物，其特征在于含有有效剂量消旋去甲胡桐素A与至少一种其它HIV-1抑制剂。
5.权利要求4的组合物，其中所述其它HIV-1抑制剂选自至少一种蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂或进入细胞抑制剂。
6.权利要求5的组合物，蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)。
7.权利要求5的组合物，逆转录酶抑制剂是选自核苷类逆转录酶抑制剂和其它非核苷类逆转录酶抑制剂。
8.权利要求7的组合物，核苷类逆转录酶抑制剂选自齐多夫丁(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫丁(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、三齐韦(trizivir、abacavir +lamivudine+ zidovudine)、双汰芝(combivir，lamivudine +zidovudine)、坦诺福韦(Tenofovir)。
9.权利要求7的组合物，其它非核苷类逆转录酶抑制剂选自奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、施多宁(Efavrienz)。
10.权利要求5的组合物，其中进入细胞抑制剂是T-20。
全文摘要
本发明公开了如通式(I)所示的消旋去甲胡桐素A在制备抗爱滋病毒类药物中的应用，尤其是在制备抗HIV－1耐药株的药物中的应用。本发明还涉及消旋去甲胡桐素A与其它HIV－1抑制剂的组合而成的药物组合物。
文档编号A61P31/00GK1565442SQ0314251
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者王琳, 刘刚, 陶佩珍, 张兴权, 章天, 黄飚, 赵知中 申请人:中国医学科学院药物研究所
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