杨树皮类脂佐剂及其制备方法和使用方法
专利名称：杨树皮类脂佐剂及其制备方法和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种天然免疫佐剂，尤其涉及一种杨树皮类脂用作免疫佐剂，以及这种佐剂的制备方法和使用方法。
背景技术：
运用现代生物技术对疫苗进行研究，成为解决和预防众多疾病的关键所在。减毒疫苗的出现曾经给医学界带来惊喜，但是，其在免疫力持续期方面却远远满足不了人们的期望值；灭活苗具有不散布活毒，不会变异返强等优点而日益受到重视，因此许多国内外专家力主生产并推广灭活疫苗取代活苗。近二十年来开始研究的基因工程疫苗则是为了使抗原在机体中持续表达而设计的。
由于佐剂能提高疫苗的免疫原性，促进细胞免疫和体液免疫功能，因此选择合适的佐剂和开发新型佐剂也是当前疫苗研究中的一个重要部分。上个世纪30年代佐剂的研究达到了第一个高潮，以白油为佐剂的研究风靡全世界，但是，随之而来的是副作用之强烈、致癌物质的危害。目前广泛应用的灭活疫苗主要是油佐剂疫苗，但油苗存在保护率低、产生免疫力时间晚、难保存、难注射、注射局部易发生肿胀、脓肿、肉芽肿、甚至坏死等一系列缺点。另外，从公共卫生的角度看，用于制苗的白油系苯环类化学物质，有致癌的可能，在动物体内残留，对人体有害。
20世纪80年代后期及90年代，由于在应用生物合成、基因重组及其它现代生物技术制备大量免疫原性较弱的纯化亚单位疫苗或合成疫苗的过程中，必须利用佐剂才能发挥其有效的免疫原性，因而再一次推动了佐剂的研究。这些研究包括用控制释放的投递系统一次免疫、免疫刺激复合体(ISCOM)、细胞因子、天然物质等，尽管这些佐剂由于种种原因没能推广开来，但是，这些努力却推动了生物制品研究领域最重要内容之一的佐剂研究进入了新时代。
以天然免疫增强剂为免疫佐剂的研究方兴未艾，以蜂胶为代表的新型佐剂尽管能全面启动细胞免疫系统，减少应激，但存在着免疫期较短，在常温下保存易发生变色、沉淀、形成结块、副作用大等一系列缺点。
杨树皮类脂是从杨树皮中提取的一种纯天然物质(杨树皮类脂萃取中试报告，林产化学与工业，1992第一期)，具有高度的生物学活性，富含大量的磷脂、不饱和甾醇、固醇、糖脂、维生素E、胡萝卜素以及大量的具有维生素PP功能的不饱和脂肪酸、多种常量、微量元素、18种必需氨基酸等。杨树皮类脂在医学上的应用前景也处于不断的深入研究中，但到目前为止还没有杨树皮类脂用作畜禽用疫苗佐剂的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种杨树皮类脂作为佐剂的新用途，以及杨树皮类脂用作佐剂的制备方法和使用方法。
杨树皮类脂用于佐剂是通过如下方法制备得到的以下操作均为无菌操作(1)粗提类脂液在20-40℃加热，同时按100-1000转/分转速搅拌20-30分钟；(2)将上述搅拌获得的物质过80-120目铜网，得到滤液；(3)将步骤(2)得到的滤液在20-40℃水浴加热均匀，同时按1500-3000转/分转速搅拌10-20分钟；(4)将步骤(3)得到的液体在50-70℃水浴加热均匀，并过100-120目铜网，将此滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂，保存备用。
本发明进一步提供这种杨树皮类脂佐剂的使用方法(1)500-1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4-6％(W/V)；(2)将上述混合物通过乳化压力为10-15MPa，剪切压力为45-60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20-30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。
杨树皮类脂作为免疫佐剂，既可以保持抗原的特性，又能成为良好的免疫增强剂和刺激剂，这是其他常规的佐剂如羊毛脂、弗氏佐剂等无可比拟的。
以杨树皮类脂为免疫佐剂制备的疫苗具有以下优特点(1)产生免疫力时间早注射鸡体后7-10天即可产生坚强免疫力，比油佐剂疫苗提前10天左右。
(2)保存运输方便无需特殊冷藏设备，0-8℃下可保存18个月，常温下可保存12个月，冷冻保存可达到2年之久。
(3)应激性小，吸收良好给7-10日龄的鸡注射，在机体内被很好得吸收，不产生残留，因此不影响肉鸡出口。由于应激性小，因此在产蛋高峰期注射不会影响产蛋率。
(4)提高产蛋率本疫苗由于含有大量的维生素E等提高产蛋率的营养成分，注射后会不同程度地提高产蛋鸡的产蛋率。
以矿物油为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的油苗、以蜂胶为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的蜂胶苗与以杨树皮类脂为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的类脂苗三者的比较
本发明杨树皮类脂用作佐剂的制备方法特点如下由于粗提的类脂液中杂质较多，因此，通过搅拌，可将大的粗颗粒沉淀；并且由于类脂在低温下为半固体，通过热过滤，一方面过滤沉淀物质，另一方面容易过滤；多次过滤，温度逐步提升，可有效保护生物活性物质不至于突然变性失活。
本发明杨树皮类脂用作佐剂的使用方法中，类脂含量的确定(终浓度为4-6％(W/V))，一方面可使本产品规程化，另一方面也是因为用于佐剂时免疫效果的限制，即，使用本含量免疫效果最好；压力的选择，取决于类脂本身的特性和制备疫苗的要求，高速乳化，可使抗原与佐剂更加充分乳化，分散系更为均匀，制备的疫苗形状更为稳定。
具体实施例方式
实施例1制备杨树皮类脂佐剂和疫苗以下操作均为无菌操作。杨树皮粗提类脂(购自山东莒县林产化工厂)500克置于25℃水浴锅中，100转/分缓慢搅拌30分钟。过80目铜网，得到滤液。滤液再经过30℃水浴，1500转/分中速搅拌20分钟。再经过50℃水浴，过120目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备鸡新城疫病毒抗原取8日SPF鸡胚(购自济南SPF鸡场)，用碘酒消毒，无菌操作，按照每枚鸡胚0.2ml剂量将稀释10000倍的新城疫种毒(购自中国兽药监察所)注射到鸡胚的尿囊腔内，而后将针孔用无菌胶布密封，将封好的鸡胚置于37-38℃培养箱内继续孵化至13日龄。孵化结束将鸡胚置于2-10℃冷库内冷却24小时后，取出，碘酒消毒，无菌收集鸡胚尿囊腔内的含毒液体，将含毒液体按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛灭活剂(购自莱阳化工厂)，37℃灭活12小时，其间振摇6次。灭活完毕，进行无菌检验、安全检验。合格者的鸡新城疫病毒抗原即可用于制备疫苗。
制备疫苗时，可将上述制得的灭活的鸡新城疫病毒抗原10000ml以500转/分搅拌，同时缓缓加入上述制得的杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中的终浓度达到5％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为15MPa，剪切压力为45MPa的均质机内乳化，乳化温度要求20℃，乳化时间20秒。乳化完毕，得到鸡新城疫类脂灭活疫苗。将上述疫苗进行无菌检验(检验方法如下)、安全检验(检验方法如下)，合格后分装。
无菌检验取上述方法制备的疫苗1ml，接种于高压灭菌的马丁固体培养基，置入37℃培养箱内培养24-48小时，无菌生长，则无菌检验合格。
安全检验取10日龄和30日龄健康易感鸡各5只，分别颈部皮下注射疫苗0.5ml，1.0ml，连续观察14天，注苗局部无严重反应，鸡全部健活，则安全检验合格。
实施例2制备杨树皮类脂佐剂和疫苗以下操作均为无菌操作。将杨树皮粗提类脂1200g(购自山东莒县林产化工厂)置于40℃水浴锅中，800转/分缓慢搅拌20分钟。过120目铜网，得到滤液。滤液再经过40℃水浴，2500转/分中速搅拌10分钟。再经过70℃水浴，过100目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备鸡产蛋下降综合症病毒抗原取10日SPF鸭胚(购自济南SPF鸡场)，用碘酒消毒，无菌操作，按照每枚鸭胚0.2ml剂量将稀释100倍的产蛋下降综合症种毒(购自中国兽药监察所)注射到鸭胚的尿囊腔内，而后将针孔用无菌胶布密封，将封好的鸭胚置入37-38℃培养箱内继续孵化至15日龄。孵化结束将鸭胚置入2-10℃冷库内冷却24小时后，取出，碘酒消毒，无菌收集鸭胚尿囊腔内的含毒液体，将含毒液体按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛灭活剂(购自莱阳化工厂)，37℃灭活12小时，其间振摇6次。灭活完毕，进行无菌检验、安全检验(方法通上)。合格者即可用于制备疫苗。
制备疫苗时，可将灭活的鸡新城疫病毒抗原(制备方法见实施例1)和灭活的鸡产蛋下降综合症病毒抗原(制备方法如上)混合(各10000ml)后以1000转/分搅拌，同时缓缓加入上述杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中的终浓度达到6％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为15MPa，剪切压力为45MPa的均质机内乳化，乳化温度要求在25℃之间，乳化时间30秒。乳化完毕，将上述的乳化液进行检验(检验方法同实施例1)，合格后分装，得到鸡新城疫与产蛋下降综合症二联类脂灭活疫苗。
实施例3鸡新城疫类脂灭活疫苗的免疫使用实施例1制得的鸡新城疫类脂灭活疫苗，免疫程序如下10日龄雏鸡颈部皮下注射0.3ml/只，40-60日龄第二次免疫，颈部皮下注射0.5ml/只，免疫两次，即可保护整个生长期不受鸡新城疫病毒的侵袭。采集第二次免疫后14天鸡群的血液，分离血清，采用血清学中的微量血凝抑制(HI)方法(参考农业部畜牧兽医局《兽医生物制品规程》)对血清抗体进行评估，本实施例的类脂疫苗免疫效果与蜂胶作为佐剂的同种疫苗的免疫效果相比，同期抗体平均高2-3个滴度，并且应激性小，不影响鸡产蛋率。
测定免疫鸡新城疫(ND)类脂灭活疫苗后鸡血清抗体的方法(1)材料鸡新城疫标准4单位抗原(购自哈尔滨兽医研究所)待检血清(采集免疫类脂疫苗7天以后的鸡群)0.01M PH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或0.85％的生理盐水0.8％的鸡红细胞悬液96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微量振荡器等(2)操作1)0.8％鸡红细胞悬液的制备无菌采取健康鸡血4ml于4ml阿氏液中，2500转/分离心5分钟，弃去析出的血清和白细胞，再加入4ml阿氏液洗涤红细胞，然后2500转/分离心，重复上述操作3-4次，最后吸取红细胞0.8ml加到10ml生理盐水中即得0.8％鸡红细胞悬液。
2)在每孔加入PBS或生理盐水0.05ml，然后在第一孔加入待检血清，混匀，从中吸取0.05ml加入第二孔，混匀从中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀释到第11孔，吸出0.05ml弃去。第12孔作抗原对照(阳性对照)。然后每孔都加入稀释好的4单位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理盐水0.05ml(阴性对照)。放入微量振荡器上振荡1分钟，于20-30℃环境中作用10分钟，然后每孔加上0.8％的鸡红细胞0.05ml。放在37℃温箱中孵育，15分钟后观察。
结果判定在阳性对照孔完全凝集、阴性对照孔完全沉集的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的(抗体滴度)HI滴度。按照上述方法对鸡群进行免疫后的待测新城疫抗体滴度平均为8-9log2，(各种佐剂的新城疫疫苗抗体测定方法及判定标准均相同，按照目前测定标准，当抗体水平维持在4log2以上时就具有保护力。当抗体在5-6log2以上时具有坚强的保护力)。
实施例4使用实施例2中的鸡新城疫与产蛋下降综合症二联类脂灭活疫苗，免疫程序如下120日龄雏鸡颈部皮下注射0.5ml/只，230日龄第二次免疫，颈部皮下注射0.5ml/只，免疫两次，即可保护整个生长期不受新城疫、产蛋下降综合症病毒的侵袭。采集免疫鸡群的血液，分离血清，采用血清学中的微量血凝抑制(HI)方法(参考农业部畜牧兽医局《兽医生物制品规程》)对血清抗体进行评估，本实施例的类脂疫苗的免疫效果与蜂胶作为佐剂的同种疫苗的免疫效果相比，同期抗体平均高2-3个滴度，并且应激性小，不影响鸡产蛋率。
具体试验方法及结果一、测定ND的抗体方法同实施例3，具体的测定结果为采集第二次免疫免14天的鸡群血清测定抗体水平，滴度平均为8-9Log2。
二、测定的减蛋综合症抗体的方法如下材料1、鸡产蛋下降综合症标准4单位抗原(购自哈尔滨兽医研究所)2、待检血清(采集免疫类脂疫苗7天以后的鸡群)
3、0.01M PH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或0.85％的生理盐水4、0.8％的鸡红细胞悬液5、96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微量振荡器等(2)操作1)0.8％鸡红细胞悬液的制备无菌采取健康鸡血4ml于4ml阿氏液中，2500转/分离心5分钟，弃去析出的血清和白细胞，再加入4ml阿氏液洗涤红细胞，然后2500转/分离心，重复上述操作3-4次，最后吸取红细胞0.8ml加到10ml生理盐水中即得0.8％的鸡红细胞悬液。
2)在每孔加入PBS或生理盐水0.05ml，然后在第一孔加入待检血清，混匀，从中吸取0.05ml加入第二孔，混匀从中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀释到第11孔，吸出0.05ml弃去。第12孔作抗原对照(阳性对照)。然后每孔都加入稀释好的4单位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理盐水0.05ml(阴性对照)。于微量振荡器上振荡1分钟，于20-30℃环境中作用10分钟，然后每孔加上0.8％的鸡红细胞0.05ml。放在37℃温箱中孵育，15分钟后观察。
结果判定在阳性对照孔完全凝集、阴性对照孔完全沉集的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的(抗体滴度)HI滴度。按照上述方法对鸡群进行免疫后的待测产蛋下降综合症抗体滴度平均为8-9log2，(各种佐剂的产蛋下降综合症疫苗抗体测定方法及判定标准均相同，按照目前测定标准，当抗体水平维持在4log2以上时就具有保护力。当抗体在5-6log2以上时具有坚强的保护力)。
实施例5对产蛋率的影响试验将鸡新城疫类脂灭活疫苗制品20001批在某种鸡养鸡场进行了试验，共免疫罗曼商品蛋鸡雏鸡1000羽，免疫后进行了产蛋量、产蛋率测定和临床观察，现将试验结果报告如下。
1、材料与方法1.1材料 鸡新城疫类脂灭活疫苗20001批、新城疫灭活油苗00102批(购自农业部定点企业齐鲁动物保健品厂)。试验鸡共计2000羽份，分2组，A组免疫类脂疫苗、B组免疫油苗。
1.2免疫程序与免疫方法A组7日龄雏鸡每只颈部皮下注射鸡新城疫类脂灭活疫苗0.3ml，同时以LaSota疫苗滴鼻点眼，100日龄、195日龄分别胸肌注射类脂疫苗1.0ml/只。
B组7日龄雏鸡每只颈部皮下注射鸡新城疫类脂灭活疫苗0.3ml，同时以LaSota疫苗滴鼻点眼，100日龄、195日龄分别胸肌注射类脂疫苗1.0ml/只。
1.3日粮 按照罗曼公司推荐的日粮配方，统一标准，统一配方，同一饲养标准进行饲喂。
1.4观察产蛋情况，从200日龄收集每天产蛋数量，计算产蛋率。
结果2批疫苗免疫的鸡群均正常开产见蛋，保持了正常的产蛋高峰期，但免疫类脂疫苗的鸡群产蛋高峰期比油苗提前10天左右。第3次免疫在195日龄，到达200日龄时开始统计产蛋量，计算产蛋率，具体产蛋率统计如下结果见表疫苗 鸡数(个) 第一周 第二周 第三周 第四周产蛋数(个) 产蛋数(个) 产蛋数(个) 产蛋数(个)20001类脂疫苗 1000 62796188 6132616700102油苗 1000 59785817 56145719四周的统计结果表明，免疫类脂疫苗的鸡群产蛋量(24766)比免疫油苗的鸡群产蛋量(23128)多1638枚，免疫类脂疫苗的鸡群产蛋率(88.45％)比免疫油苗的鸡群产蛋率(82.6％)高5.85％个百分点。
实施例6制备杨树皮类脂佐剂和疫苗以下操作均为无菌操作。将杨树皮粗提类脂(购自山东莒县林产化工厂)800克置于20℃水浴锅中，1000转/分缓慢搅拌25分钟。过100目铜网，得到滤液。滤液经过20℃水浴，3000转/分中速搅拌15分钟；再经过60℃水浴，过120目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备疫苗时，可将实施例1的方法制备的灭活的鸡新城疫病毒抗原10000ml以800转/分搅拌，同时缓缓加入上述制得的杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中的终浓度达到4％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为10MPa，剪切压力为60MPa的均质机内乳化，乳化温度为30℃，乳化时间20秒。乳化完毕，得到鸡新城疫类脂灭活疫苗。将上述疫苗进行无菌检验(检验方法如下)、安全检验(检验方法如下)，合格后分装。
无菌检验取上述方法制备的疫苗1ml，接种于高压灭菌的马丁固体培养基，置入37℃培养箱内培养24-48小时，无菌生长，则无菌检验合格。
安全检验取10日龄和30日龄健康易感鸡各5只，分别颈部皮下注射疫苗0.5ml，1.0ml，连续观察14天，注苗局部无严重反应，鸡全部健活，则安全检验合格。
权利要求
1.一种杨树皮类脂在制备佐剂中的应用。
2.一种将杨树皮类脂用于佐剂的制备方法，包括如下步骤(1)粗提类脂液在20-40℃加热，同时按100-1000转/分转速搅拌20-30分钟；(2)将上述搅拌获得的物质过80-120目铜网，得到滤液；(3)将步骤(2)得到的滤液在20-40℃水浴加热均匀，同时按1500-3000转/分转速搅拌10-20分钟；(4)将步骤(3)得到的液体在50-70℃水浴加热均匀，并过100-120目铜网，将此滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂，保存备用；以上操作均为无菌操作。
3.一种杨树皮类脂佐剂的使用方法，包括如下步骤(1)500-1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4-6％(W/V)；(2)将上述混合物通过乳化压力为10-15MPa，剪切压力为45-60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20-30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种免疫佐剂，尤其涉及一种杨树皮类脂用作免疫佐剂，以及这种佐剂的制备方法和使用方法。该佐剂是通过将粗提类脂液在无菌环境中，按一定条件搅拌、过滤，冷却制得。该佐剂保存运输方便，无需特殊冷藏设备；该佐剂和抗原以一定比例混合免疫动物，其产生免疫力时间早，且应激性小，易保存运输，免疫鸡后，还可提高产蛋率。
文档编号A61K39/39GK1531970SQ0314255
公开日2004年9月29日 申请日期2003年6月11日 优先权日2002年12月19日
发明者张兴晓 申请人:张兴晓
技术领域：
本发明涉及一种天然免疫佐剂，尤其涉及一种杨树皮类脂用作免疫佐剂，以及这种佐剂的制备方法和使用方法。
背景技术：
运用现代生物技术对疫苗进行研究，成为解决和预防众多疾病的关键所在。减毒疫苗的出现曾经给医学界带来惊喜，但是，其在免疫力持续期方面却远远满足不了人们的期望值；灭活苗具有不散布活毒，不会变异返强等优点而日益受到重视，因此许多国内外专家力主生产并推广灭活疫苗取代活苗。近二十年来开始研究的基因工程疫苗则是为了使抗原在机体中持续表达而设计的。
由于佐剂能提高疫苗的免疫原性，促进细胞免疫和体液免疫功能，因此选择合适的佐剂和开发新型佐剂也是当前疫苗研究中的一个重要部分。上个世纪30年代佐剂的研究达到了第一个高潮，以白油为佐剂的研究风靡全世界，但是，随之而来的是副作用之强烈、致癌物质的危害。目前广泛应用的灭活疫苗主要是油佐剂疫苗，但油苗存在保护率低、产生免疫力时间晚、难保存、难注射、注射局部易发生肿胀、脓肿、肉芽肿、甚至坏死等一系列缺点。另外，从公共卫生的角度看，用于制苗的白油系苯环类化学物质，有致癌的可能，在动物体内残留，对人体有害。
20世纪80年代后期及90年代，由于在应用生物合成、基因重组及其它现代生物技术制备大量免疫原性较弱的纯化亚单位疫苗或合成疫苗的过程中，必须利用佐剂才能发挥其有效的免疫原性，因而再一次推动了佐剂的研究。这些研究包括用控制释放的投递系统一次免疫、免疫刺激复合体(ISCOM)、细胞因子、天然物质等，尽管这些佐剂由于种种原因没能推广开来，但是，这些努力却推动了生物制品研究领域最重要内容之一的佐剂研究进入了新时代。
以天然免疫增强剂为免疫佐剂的研究方兴未艾，以蜂胶为代表的新型佐剂尽管能全面启动细胞免疫系统，减少应激，但存在着免疫期较短，在常温下保存易发生变色、沉淀、形成结块、副作用大等一系列缺点。
杨树皮类脂是从杨树皮中提取的一种纯天然物质(杨树皮类脂萃取中试报告，林产化学与工业，1992第一期)，具有高度的生物学活性，富含大量的磷脂、不饱和甾醇、固醇、糖脂、维生素E、胡萝卜素以及大量的具有维生素PP功能的不饱和脂肪酸、多种常量、微量元素、18种必需氨基酸等。杨树皮类脂在医学上的应用前景也处于不断的深入研究中，但到目前为止还没有杨树皮类脂用作畜禽用疫苗佐剂的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种杨树皮类脂作为佐剂的新用途，以及杨树皮类脂用作佐剂的制备方法和使用方法。
杨树皮类脂用于佐剂是通过如下方法制备得到的以下操作均为无菌操作(1)粗提类脂液在20-40℃加热，同时按100-1000转/分转速搅拌20-30分钟；(2)将上述搅拌获得的物质过80-120目铜网，得到滤液；(3)将步骤(2)得到的滤液在20-40℃水浴加热均匀，同时按1500-3000转/分转速搅拌10-20分钟；(4)将步骤(3)得到的液体在50-70℃水浴加热均匀，并过100-120目铜网，将此滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂，保存备用。
本发明进一步提供这种杨树皮类脂佐剂的使用方法(1)500-1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4-6％(W/V)；(2)将上述混合物通过乳化压力为10-15MPa，剪切压力为45-60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20-30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。
杨树皮类脂作为免疫佐剂，既可以保持抗原的特性，又能成为良好的免疫增强剂和刺激剂，这是其他常规的佐剂如羊毛脂、弗氏佐剂等无可比拟的。
以杨树皮类脂为免疫佐剂制备的疫苗具有以下优特点(1)产生免疫力时间早注射鸡体后7-10天即可产生坚强免疫力，比油佐剂疫苗提前10天左右。
(2)保存运输方便无需特殊冷藏设备，0-8℃下可保存18个月，常温下可保存12个月，冷冻保存可达到2年之久。
(3)应激性小，吸收良好给7-10日龄的鸡注射，在机体内被很好得吸收，不产生残留，因此不影响肉鸡出口。由于应激性小，因此在产蛋高峰期注射不会影响产蛋率。
(4)提高产蛋率本疫苗由于含有大量的维生素E等提高产蛋率的营养成分，注射后会不同程度地提高产蛋鸡的产蛋率。
以矿物油为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的油苗、以蜂胶为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的蜂胶苗与以杨树皮类脂为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的类脂苗三者的比较
本发明杨树皮类脂用作佐剂的制备方法特点如下由于粗提的类脂液中杂质较多，因此，通过搅拌，可将大的粗颗粒沉淀；并且由于类脂在低温下为半固体，通过热过滤，一方面过滤沉淀物质，另一方面容易过滤；多次过滤，温度逐步提升，可有效保护生物活性物质不至于突然变性失活。
本发明杨树皮类脂用作佐剂的使用方法中，类脂含量的确定(终浓度为4-6％(W/V))，一方面可使本产品规程化，另一方面也是因为用于佐剂时免疫效果的限制，即，使用本含量免疫效果最好；压力的选择，取决于类脂本身的特性和制备疫苗的要求，高速乳化，可使抗原与佐剂更加充分乳化，分散系更为均匀，制备的疫苗形状更为稳定。
具体实施例方式
实施例1制备杨树皮类脂佐剂和疫苗以下操作均为无菌操作。杨树皮粗提类脂(购自山东莒县林产化工厂)500克置于25℃水浴锅中，100转/分缓慢搅拌30分钟。过80目铜网，得到滤液。滤液再经过30℃水浴，1500转/分中速搅拌20分钟。再经过50℃水浴，过120目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备鸡新城疫病毒抗原取8日SPF鸡胚(购自济南SPF鸡场)，用碘酒消毒，无菌操作，按照每枚鸡胚0.2ml剂量将稀释10000倍的新城疫种毒(购自中国兽药监察所)注射到鸡胚的尿囊腔内，而后将针孔用无菌胶布密封，将封好的鸡胚置于37-38℃培养箱内继续孵化至13日龄。孵化结束将鸡胚置于2-10℃冷库内冷却24小时后，取出，碘酒消毒，无菌收集鸡胚尿囊腔内的含毒液体，将含毒液体按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛灭活剂(购自莱阳化工厂)，37℃灭活12小时，其间振摇6次。灭活完毕，进行无菌检验、安全检验。合格者的鸡新城疫病毒抗原即可用于制备疫苗。
制备疫苗时，可将上述制得的灭活的鸡新城疫病毒抗原10000ml以500转/分搅拌，同时缓缓加入上述制得的杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中的终浓度达到5％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为15MPa，剪切压力为45MPa的均质机内乳化，乳化温度要求20℃，乳化时间20秒。乳化完毕，得到鸡新城疫类脂灭活疫苗。将上述疫苗进行无菌检验(检验方法如下)、安全检验(检验方法如下)，合格后分装。
无菌检验取上述方法制备的疫苗1ml，接种于高压灭菌的马丁固体培养基，置入37℃培养箱内培养24-48小时，无菌生长，则无菌检验合格。
安全检验取10日龄和30日龄健康易感鸡各5只，分别颈部皮下注射疫苗0.5ml，1.0ml，连续观察14天，注苗局部无严重反应，鸡全部健活，则安全检验合格。
实施例2制备杨树皮类脂佐剂和疫苗以下操作均为无菌操作。将杨树皮粗提类脂1200g(购自山东莒县林产化工厂)置于40℃水浴锅中，800转/分缓慢搅拌20分钟。过120目铜网，得到滤液。滤液再经过40℃水浴，2500转/分中速搅拌10分钟。再经过70℃水浴，过100目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备鸡产蛋下降综合症病毒抗原取10日SPF鸭胚(购自济南SPF鸡场)，用碘酒消毒，无菌操作，按照每枚鸭胚0.2ml剂量将稀释100倍的产蛋下降综合症种毒(购自中国兽药监察所)注射到鸭胚的尿囊腔内，而后将针孔用无菌胶布密封，将封好的鸭胚置入37-38℃培养箱内继续孵化至15日龄。孵化结束将鸭胚置入2-10℃冷库内冷却24小时后，取出，碘酒消毒，无菌收集鸭胚尿囊腔内的含毒液体，将含毒液体按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛灭活剂(购自莱阳化工厂)，37℃灭活12小时，其间振摇6次。灭活完毕，进行无菌检验、安全检验(方法通上)。合格者即可用于制备疫苗。
制备疫苗时，可将灭活的鸡新城疫病毒抗原(制备方法见实施例1)和灭活的鸡产蛋下降综合症病毒抗原(制备方法如上)混合(各10000ml)后以1000转/分搅拌，同时缓缓加入上述杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中的终浓度达到6％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为15MPa，剪切压力为45MPa的均质机内乳化，乳化温度要求在25℃之间，乳化时间30秒。乳化完毕，将上述的乳化液进行检验(检验方法同实施例1)，合格后分装，得到鸡新城疫与产蛋下降综合症二联类脂灭活疫苗。
实施例3鸡新城疫类脂灭活疫苗的免疫使用实施例1制得的鸡新城疫类脂灭活疫苗，免疫程序如下10日龄雏鸡颈部皮下注射0.3ml/只，40-60日龄第二次免疫，颈部皮下注射0.5ml/只，免疫两次，即可保护整个生长期不受鸡新城疫病毒的侵袭。采集第二次免疫后14天鸡群的血液，分离血清，采用血清学中的微量血凝抑制(HI)方法(参考农业部畜牧兽医局《兽医生物制品规程》)对血清抗体进行评估，本实施例的类脂疫苗免疫效果与蜂胶作为佐剂的同种疫苗的免疫效果相比，同期抗体平均高2-3个滴度，并且应激性小，不影响鸡产蛋率。
测定免疫鸡新城疫(ND)类脂灭活疫苗后鸡血清抗体的方法(1)材料鸡新城疫标准4单位抗原(购自哈尔滨兽医研究所)待检血清(采集免疫类脂疫苗7天以后的鸡群)0.01M PH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或0.85％的生理盐水0.8％的鸡红细胞悬液96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微量振荡器等(2)操作1)0.8％鸡红细胞悬液的制备无菌采取健康鸡血4ml于4ml阿氏液中，2500转/分离心5分钟，弃去析出的血清和白细胞，再加入4ml阿氏液洗涤红细胞，然后2500转/分离心，重复上述操作3-4次，最后吸取红细胞0.8ml加到10ml生理盐水中即得0.8％鸡红细胞悬液。
2)在每孔加入PBS或生理盐水0.05ml，然后在第一孔加入待检血清，混匀，从中吸取0.05ml加入第二孔，混匀从中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀释到第11孔，吸出0.05ml弃去。第12孔作抗原对照(阳性对照)。然后每孔都加入稀释好的4单位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理盐水0.05ml(阴性对照)。放入微量振荡器上振荡1分钟，于20-30℃环境中作用10分钟，然后每孔加上0.8％的鸡红细胞0.05ml。放在37℃温箱中孵育，15分钟后观察。
结果判定在阳性对照孔完全凝集、阴性对照孔完全沉集的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的(抗体滴度)HI滴度。按照上述方法对鸡群进行免疫后的待测新城疫抗体滴度平均为8-9log2，(各种佐剂的新城疫疫苗抗体测定方法及判定标准均相同，按照目前测定标准，当抗体水平维持在4log2以上时就具有保护力。当抗体在5-6log2以上时具有坚强的保护力)。
实施例4使用实施例2中的鸡新城疫与产蛋下降综合症二联类脂灭活疫苗，免疫程序如下120日龄雏鸡颈部皮下注射0.5ml/只，230日龄第二次免疫，颈部皮下注射0.5ml/只，免疫两次，即可保护整个生长期不受新城疫、产蛋下降综合症病毒的侵袭。采集免疫鸡群的血液，分离血清，采用血清学中的微量血凝抑制(HI)方法(参考农业部畜牧兽医局《兽医生物制品规程》)对血清抗体进行评估，本实施例的类脂疫苗的免疫效果与蜂胶作为佐剂的同种疫苗的免疫效果相比，同期抗体平均高2-3个滴度，并且应激性小，不影响鸡产蛋率。
具体试验方法及结果一、测定ND的抗体方法同实施例3，具体的测定结果为采集第二次免疫免14天的鸡群血清测定抗体水平，滴度平均为8-9Log2。
二、测定的减蛋综合症抗体的方法如下材料1、鸡产蛋下降综合症标准4单位抗原(购自哈尔滨兽医研究所)2、待检血清(采集免疫类脂疫苗7天以后的鸡群)
3、0.01M PH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或0.85％的生理盐水4、0.8％的鸡红细胞悬液5、96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微量振荡器等(2)操作1)0.8％鸡红细胞悬液的制备无菌采取健康鸡血4ml于4ml阿氏液中，2500转/分离心5分钟，弃去析出的血清和白细胞，再加入4ml阿氏液洗涤红细胞，然后2500转/分离心，重复上述操作3-4次，最后吸取红细胞0.8ml加到10ml生理盐水中即得0.8％的鸡红细胞悬液。
2)在每孔加入PBS或生理盐水0.05ml，然后在第一孔加入待检血清，混匀，从中吸取0.05ml加入第二孔，混匀从中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀释到第11孔，吸出0.05ml弃去。第12孔作抗原对照(阳性对照)。然后每孔都加入稀释好的4单位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理盐水0.05ml(阴性对照)。于微量振荡器上振荡1分钟，于20-30℃环境中作用10分钟，然后每孔加上0.8％的鸡红细胞0.05ml。放在37℃温箱中孵育，15分钟后观察。
结果判定在阳性对照孔完全凝集、阴性对照孔完全沉集的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的(抗体滴度)HI滴度。按照上述方法对鸡群进行免疫后的待测产蛋下降综合症抗体滴度平均为8-9log2，(各种佐剂的产蛋下降综合症疫苗抗体测定方法及判定标准均相同，按照目前测定标准，当抗体水平维持在4log2以上时就具有保护力。当抗体在5-6log2以上时具有坚强的保护力)。
实施例5对产蛋率的影响试验将鸡新城疫类脂灭活疫苗制品20001批在某种鸡养鸡场进行了试验，共免疫罗曼商品蛋鸡雏鸡1000羽，免疫后进行了产蛋量、产蛋率测定和临床观察，现将试验结果报告如下。
1、材料与方法1.1材料 鸡新城疫类脂灭活疫苗20001批、新城疫灭活油苗00102批(购自农业部定点企业齐鲁动物保健品厂)。试验鸡共计2000羽份，分2组，A组免疫类脂疫苗、B组免疫油苗。
1.2免疫程序与免疫方法A组7日龄雏鸡每只颈部皮下注射鸡新城疫类脂灭活疫苗0.3ml，同时以LaSota疫苗滴鼻点眼，100日龄、195日龄分别胸肌注射类脂疫苗1.0ml/只。
B组7日龄雏鸡每只颈部皮下注射鸡新城疫类脂灭活疫苗0.3ml，同时以LaSota疫苗滴鼻点眼，100日龄、195日龄分别胸肌注射类脂疫苗1.0ml/只。
1.3日粮 按照罗曼公司推荐的日粮配方，统一标准，统一配方，同一饲养标准进行饲喂。
1.4观察产蛋情况，从200日龄收集每天产蛋数量，计算产蛋率。
结果2批疫苗免疫的鸡群均正常开产见蛋，保持了正常的产蛋高峰期，但免疫类脂疫苗的鸡群产蛋高峰期比油苗提前10天左右。第3次免疫在195日龄，到达200日龄时开始统计产蛋量，计算产蛋率，具体产蛋率统计如下结果见表疫苗 鸡数(个) 第一周 第二周 第三周 第四周产蛋数(个) 产蛋数(个) 产蛋数(个) 产蛋数(个)20001类脂疫苗 1000 62796188 6132616700102油苗 1000 59785817 56145719四周的统计结果表明，免疫类脂疫苗的鸡群产蛋量(24766)比免疫油苗的鸡群产蛋量(23128)多1638枚，免疫类脂疫苗的鸡群产蛋率(88.45％)比免疫油苗的鸡群产蛋率(82.6％)高5.85％个百分点。
实施例6制备杨树皮类脂佐剂和疫苗以下操作均为无菌操作。将杨树皮粗提类脂(购自山东莒县林产化工厂)800克置于20℃水浴锅中，1000转/分缓慢搅拌25分钟。过100目铜网，得到滤液。滤液经过20℃水浴，3000转/分中速搅拌15分钟；再经过60℃水浴，过120目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备疫苗时，可将实施例1的方法制备的灭活的鸡新城疫病毒抗原10000ml以800转/分搅拌，同时缓缓加入上述制得的杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中的终浓度达到4％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为10MPa，剪切压力为60MPa的均质机内乳化，乳化温度为30℃，乳化时间20秒。乳化完毕，得到鸡新城疫类脂灭活疫苗。将上述疫苗进行无菌检验(检验方法如下)、安全检验(检验方法如下)，合格后分装。
无菌检验取上述方法制备的疫苗1ml，接种于高压灭菌的马丁固体培养基，置入37℃培养箱内培养24-48小时，无菌生长，则无菌检验合格。
安全检验取10日龄和30日龄健康易感鸡各5只，分别颈部皮下注射疫苗0.5ml，1.0ml，连续观察14天，注苗局部无严重反应，鸡全部健活，则安全检验合格。
权利要求
1.一种杨树皮类脂在制备佐剂中的应用。
2.一种将杨树皮类脂用于佐剂的制备方法，包括如下步骤(1)粗提类脂液在20-40℃加热，同时按100-1000转/分转速搅拌20-30分钟；(2)将上述搅拌获得的物质过80-120目铜网，得到滤液；(3)将步骤(2)得到的滤液在20-40℃水浴加热均匀，同时按1500-3000转/分转速搅拌10-20分钟；(4)将步骤(3)得到的液体在50-70℃水浴加热均匀，并过100-120目铜网，将此滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂，保存备用；以上操作均为无菌操作。
3.一种杨树皮类脂佐剂的使用方法，包括如下步骤(1)500-1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4-6％(W/V)；(2)将上述混合物通过乳化压力为10-15MPa，剪切压力为45-60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20-30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种免疫佐剂，尤其涉及一种杨树皮类脂用作免疫佐剂，以及这种佐剂的制备方法和使用方法。该佐剂是通过将粗提类脂液在无菌环境中，按一定条件搅拌、过滤，冷却制得。该佐剂保存运输方便，无需特殊冷藏设备；该佐剂和抗原以一定比例混合免疫动物，其产生免疫力时间早，且应激性小，易保存运输，免疫鸡后，还可提高产蛋率。
文档编号A61K39/39GK1531970SQ0314255
公开日2004年9月29日 申请日期2003年6月11日 优先权日2002年12月19日
发明者张兴晓 申请人:张兴晓
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