具有抗衰老、防治骨质疏松和脑损害的中药制剂的制作方法
专利名称：具有抗衰老、防治骨质疏松和脑损害的中药制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组由中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术提取物所组成的一种具有抗衰老、防治骨质疏松和脑损害的中药制剂复方制剂及其制法，该复方制剂对糖皮质激素长期超生理剂量应用后所致的骨质疏松和脑损害有良好的预防作用。
糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是由肾上腺皮质分泌的一类具有神经活性的甾体激素，它的产生直接受到下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis，HPAA)的影响，也可以对HPAA进行负反馈抑制。糖皮质激素是维持机体正常生命活动的一类重要物质，其药理作用广泛而复杂，过多或过少均会给机体带来严重的影响。在正常状态下由肾上腺皮质所分泌的生理剂量的糖皮质激素主要影响基本生命物质的代谢过程，超生理剂量的糖皮质激素则还有抗炎、抗免疫、抗休克等作用。因此，糖皮质激素在临床上应用极为广泛，如用作内分泌不足的长期替代疗法，治疗严重感染或炎症，治疗自身免疫性或过敏性疾病以及血液病等，疗效显著，但长期大剂量使用可造成一系列严重的不良反应，如类肾上腺皮质功能亢进综合征、继发性感染、溃疡性疾病、心血管疾病、营养不良、智力衰退精神异常甚至脑萎缩性痴呆、骨质疏松症等。尤其是脑萎缩、精神病和骨质疏松症的发生往往不易被觉察，一旦出现危害性大，因此已成为糖皮质激素治疗的停药指征之一。现代研究表明，超生理剂量的的糖皮质激素会对中枢神经系统，尤其是海马神经元产生毒害作用。海马是中枢神经系统中与学习记忆功能密切相关的重要脑区，也是易受糖皮质激素攻击的靶器官，长期接受超生理剂量糖皮质激素，都会使大鼠海马脑区的神经元发生萎缩甚至死亡，同时还伴有动物学习记忆能力的下降。临床上也发现，一些精神性疾病如Cushing症、老年性痴呆、抑郁症和焦虑症等与糖皮质激素的过度分泌也存在一定的因果关系。在中枢神经系统中，GC主要是通过和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptors，GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptors，MR)结合来发挥作用。海马是与认知行为功能密切相关的部位，由于富含肾上腺皮质激素受体，而且是中枢神经系统中含量最高的脑区，因此，当体内糖皮质激素浓度增高时，海马就会受到选择性的攻击，因而造成中枢的损害。糖皮质激素在急性、严重性疾病的抢救过程中发挥着重要的作用，是挽救患者生命的前提，但长期大剂量使用糖皮质激素治疗对脑损害的作用尤其突出。在最近非典疫情中，有报道在接受类固醇鸡尾酒疗法的非典痊愈患者中，半数已经出现了大脑和神经损伤的早期迹象。另一方面，有报道显示，在接受糖皮质激素慢性治疗的患者中，不论任何年龄，均有30％～50％的可能性并发骨质疏松症。此类骨质疏松症的发生可能与糖皮质激素长期应用造成钙排泄增多而吸收减少以及糖皮质激素显著抑制成骨细胞功能有关，其主要表现为骨量显著减少，骨组织微细结构退化，以致骨的脆性增加，患者常发生自发性骨折或无菌性坏死，给患者家庭和社会带来极大的负担。因此，探讨糖皮质激素长期应用所产生中枢毒性和骨质疏松症的可能原因以及研制对抗药物已成为当今迫切需要解决的问题。
对于糖皮质激素性骨质疏松症，有报道用抑制骨吸收药如雌激素来治疗，但是由于雌激素有明显的副作用，长期使用会增加子宫内膜癌和乳腺癌的发病率，故限制了其在临床上的使用；现在临床上也出现不少新药如二磷酸盐类、降钙素类、以及雌激素受体调节剂等也对防止骨丢失有一定作用，但长期使用反而抑制骨形成，导致骨老化、骨质量下降；目前，根据糖皮质激素性骨质疏松症的特点，临床上多主张应用钙剂、Vit D3和同化类激素对其进行治疗，因此类药物属于促进骨形成、促骨矿化药，主要作用是可以使1，25(OH)2D3的浓度维持在正常水平，能更好地调节骨环境中的影响因子，促进骨形成而抑制骨吸收，达到增加骨量的目的。但临床研究也报道了长期使用同化类激素会产生明显的肝脏毒性和水钠潴留，且其吸收不规则，故限制了其在临床上的使用，因此，对糖皮质激素性骨质疏松症的治疗，无论是用促进骨形成、骨矿化药还是用抑制骨吸收药来效果都不理想。另一方面，对于糖皮质激素性骨质疏松长期应用造成的大脑损害，现仍未见有效药物出现，故对临床上出现糖皮质激素性脑损伤症状的患者，一般只能采用对症治疗，但疗效并不理想。因此，本发明的任务是研制一种适合需要长期大剂量使用糖皮质激素的患者预防和治疗脑损害的复方制剂，该复方制剂是由丹参、淫羊霍、黄芪和白术提取物所组成。研究表明该复方制剂能有效提高泼尼松大鼠的智力，有效防治泼尼松所造成的海马神经元的损伤以及降低与衰老相关酶的含量以及有效提高大鼠的骨量。因此，可用于提高机体记忆能力和延缓衰老的发生，尤其可有效预防长期超生理剂量应用糖皮质激素后的脑损伤和骨质疏松症。故可用于需长期应用糖皮质激素治疗的患者作预防性用药，以减少或减缓糖皮质激素性不良反应的发生。
解决这一任务的途径是这样实现的，取中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术，通过下述工艺制作成片剂、冲剂或胶囊剂，供临床应用，研究表明，本制剂对泼尼松大鼠的实验性脑损害和骨质疏松，有良好的防治作用。本制剂能够提高实验动物的智力以及有效保护海马神经元，减少脑匀浆中致衰老酶的含量以及减轻其他糖皮质激素性的不良反应的发生。用本复方制剂治疗糖皮质激素性脑损害国内外文献均未见报道。
本复方制剂可通过下述几个方法制备1、丹参、淫羊霍、黄芪和白术粉碎成粉末，加75～95％乙醇浸泡24小时，过滤，回收乙醇，得醇提物备用，药渣再加水煎煮3次，合并三次滤液，滤过，滤液浓缩至适量，加入前述的醇提物，低温干燥，粉碎，加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
2、丹参、淫羊霍、黄芪和白术生药材以数倍水浸泡后煎煮，重复3次，合并滤液浓缩，加3倍乙醇沉淀，回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到中药总提取物。中药总提取物加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
采用以上1或2方法制得的制品，经药理学、毒理学研究证明，本品对糖皮质激素长期超生理剂量应用后所致的骨质疏松和脑损害有明显的预防和治疗作用，急性毒性试验及长期毒性试验(包括3个月至6个月)均证实本品毒性低，长期服用对心、肝、肾、肺、胃、肠、脾、胸腺、淋巴结等各重要器官均无损害作用。
为观察由丹参、淫羊霍、黄芪和白术组成复方制剂的药效学作用，进行了下述实验1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药品与试剂醋酸泼尼松原料，仙居制药股份有限公司生产。丹参(河北)、黄芪(内蒙古)、淫羊藿(江苏)、白术(浙江)四药均购于广州药材公司，经执业中药师辨认确定。单胺氧化酶测试盒、丙二醛测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶测定试剂盒、超氧化物歧化酶测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程公司生产。
1.1.2 实验中药提取物取中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术按本专利介绍的工艺提取制备。
1.1.3 仪器低速锯(Buehler LTD.USA)；硬组织切片机(德国Leica 2155)；碳化钨刚刀(德国Leica公司产品)；骨组织形态计量学测量软件(KSSScientific Consultants，UT USA)；自动化图像数字化分析仪包括光镜和荧光显微镜(Nikon，日本)；UV-3010紫外分光光度计(日本岛津)；AE240电子天平(Mettler-Toledo instr.shanghai Ltd)；ZS83-I型内切式组织匀浆机(浙新机械厂制造)；MG-2型迷宫刺激器(张家港市生物医学仪器厂)；ASD-3D爱华电子计重秤(深圳市爱华衡器有限公司产品)。
2.4 实验方法1.2 材料1.2.1 动物模型与分组选用4月龄未交配的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，SPF级，平均体重228±10g，由广东医学院实验动物中心提供。
饲养条件饲养室内温度保持在24℃～26℃，湿度维持在50％～60％(由本院实验动物中心提供)，温湿条件适宜，隔日换垫料，专室分笼饲养，专人负责；使用经严格消毒后的标准饲料和纯净过滤水进行喂养(含钙1.33％，磷0.95％，由本院实验动物中心提供)，所有实验动物分笼饲养，确保有足够的活动空间，可自由摄食、摄水。
将48只SD雄性大鼠按体重应用microsoft Excel带的宏程序Analys32.x11产生随机数列，并利用产生的随机数列进行随机分组，一共分为5组，每组8只，具体为(1)NS组正常对照组，每天予0.9％氯化钠溶液(NS)按5ml/kg灌喂给药，1h后重复按5ml/kg灌予NS。
(2)GC组泼尼松模型组，每天先予醋酸泼尼松2.7mg/kg灌胃(3～6组先同法给泼尼松灌胃，后予相应药物治疗)，1h后灌予NS 5ml/kg。
(3)CDH组高剂量复方丹参治疗组，予醋酸泼尼松1h后灌复方丹参制剂10g/kg/d(淫羊藿+黄芪+白术+丹参各2.5g/kg/d)，5ml/kg。
(4)CDM组中剂量复方丹参治疗组，予醋酸泼尼松1h后灌复方丹参制剂5g/kg/d(淫羊藿+黄芪+白术+丹参各1.25g/kg/d)，5ml/kg。
(5)CDL组低剂量复方丹参治疗组，予醋酸泼尼松1h后灌复方丹参制剂2.5g/kg/d(淫羊藿+黄芪+白术+丹参各0.625g/kg/d)，5ml/kg。所有动物分组后观察一天，第二天开始灌胃给药，qd，连续12周。
1.2.2 记忆能力测定方法学习记忆力是智力里的一个重要基本因素，基础研究中常把对学习记忆力的高低作为药物促智或致痴的重要指标之一。药理药效学测试中常常用动物被动逃避反射及主动逃避能力的获得和再现能力来判断药物对记忆的影响。迷宫法是常用的检测动物记忆力高低的方法，本实验中通过采用电迷宫刺激法来检测大鼠对迷宫的记忆能力高低来判断长期使用糖皮质激素对大鼠智力的影响。实验结束前1周，先让大鼠在MG-2型三臂电迷宫刺激器中自动逃避，观察其逃避的习惯方向，并详细记录之，若经检测后无差异，则不用规定安全方向；若大鼠对逃避的方向选择有显著差异，如以逃向左侧常见，则以左侧定为电击区(如II区)，右侧为安全区(如III区)；实验正式开始时，I区为起步区，其中I区和II区带电，而III区不带电，第1天先训练动物建立记忆痕迹，每只大鼠先跑20次(分为5个循环，以免电激时间过长对动物造成伤害，一旦出现电晕现象马上停止且将大鼠取出，单笼平放，密切观察)记录其正确率，24h后重复，但此次电击前先延时5秒，同时给红灯提示，观察大鼠受激反应情况，72h后再重复，记录实验中大鼠的正确次数(ET，times of the exactitude)和错误次数(MT，timesof the mistake)，用ET除以总的测试次数，计算出迷宫正确率ER[ER＝ET/(ET+MT)]。
1.2.3 脑组织切片标本制备方法冰冻状态下取下大鼠头部，在脑的最前端即眼前方眶间最狭窄处取出嗅球，在人字缝交界处取出松果体，然后在额骨的内侧横嵴和顶间骨的前缘骨缝之间打开颅骨取出完整大脑，首先称量大脑重量，并观察外观有无特征性改变，然后将右侧大脑用波氏液固定进行常规石蜡包埋切片。根据包新民等大鼠脑立体定位图谱在距离前囟向尾侧3mm至4mm处修理组织块，行冠状切片，在距离前囟向尾侧约3.5mm处连续切片5-8张，厚4μm，经HE染色后，分别于高倍光镜下观察组织结构变化并用半自动图像分析仪测算海马CA2和CA3区交界处362.5μm范围内单位面积神经元数目(大锥体细胞计数)和测量大鼠大脑纹状皮质17区和18区间分子层厚度和皮层总厚度。其具体测定方法如下(1)海马单位面积大锥体细胞数(HN)测算方法海马是边缘系统的重要结构，结构比较规整，且在记忆中起到极关键的作用，目前已成为神经科学研究的一个热门，其中海马在老化过程中的形态学改变已引起学术界广泛重视。在本实验中，先通过半自动图像分析仪在10×40倍镜下观察海马细胞形态结构，并测算海马CA2和CA3区交界处362.5μm范围内神经元数目(主要是大锥体细胞计数)和该区面积，并计算出该区单位面积内神经细胞数目，以评价糖皮质激素长期应用对大鼠海马结构影响程度的指标。
(2)大鼠大脑分子层厚度和皮层总厚度的比值(M/C)测定方法哺乳动物新皮层由表面向白质一般分成六层，分别是I分子层(molecular layer)，II外颗粒层(internal granular layer)，III外锥体细胞层(pyramidal layer)，IV内颗粒层(internal granular layer)，V内锥体细胞层(internal pyramidal layer)和VI多型细胞层(polymorphic layer)，纹状皮质17区和18区属新皮质，结构较清晰，且在半脑切片中与海马结构距离较近，容易辨认，因此选择测量该区皮层总厚度和分子层厚度作为参数指标。先用半自动图像分析仪在10×40倍镜下初步确认和观察皮层结构，再于10×20倍镜下分别测定在同一平面中分子层的厚度(wall of molecular layer，MW)和皮质总厚度(wall of cortex，CW)，并以其比值M/C作为评价糖皮质激素对大鼠脑皮层结构影响程度的指标。
1.2.4 脑匀浆生化指标测定方法大鼠右心室取血后，迅速断头，立即在冰台上取出完整大脑，称重后左侧大脑先于-20℃预存，48h内在冰浴上用4℃的0.86％盐水研磨制成10％脑匀浆，再经ZS83-I型内切式组织匀浆机充分粉碎，离心取上清测定MAO、SOD、AchE、MDA和脑匀浆蛋白含量。
1.2.5骨标本的制作大鼠用戊巴比妥钠麻醉后心脏抽血处死，取出左侧胫骨，用慢速锯在近端作矢状打开髓腔，于胫骨上段1/3处横行锯断，取胫骨上段进行固定、脱水、包埋和切片，用硬组织切片机分别切下5μm和8μm切片，5μm骨薄片采用Masson-Goldner Trichrome染色方法，染色后用以观察骨小梁表面破骨细胞数目。8μm骨厚片直接封片采用半自动图象数字化分析仪测量骨组织形态计量学静态参数和动态参数。
1.2.6 胫骨近端松质骨组织形态计量学测定用KSS Image图象分析系统，按国际骨形态计量学参数测量的定义和计算标准，测量胫骨近端的静态参数和动态参数。静态参数包括骨组织总面积(T.Ar，mm2)、骨小梁面积(Tb.Ar，mm2)、骨小梁周长(Tb.Pm，mm)及其计算参数[骨小梁面积百分数(％Tb.Ar，％)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)和骨小梁分离度(Tb.Sp，μm)]、总破骨细胞数目(Oc.No)及其指数(Oc.N/mm，#/mm)。动态参数包括单标记周长(sL.Pm，mm)、双标记周长(dL.Pm，mm)和双标记间距(Ir.L.Wi，μm)及其计算参数[标记周长百分数(％L.Pm，％)、骨矿化沉积率(MAR，μm/d)、骨形成率BER/BS(表示骨表面形成率，％yr)、骨形成率BER/BV(表示骨转换程度，％yr)、骨形成率BER/TV(表示骨组织形成率，％yr)]。
1.2.7 统计学方法所有测定指标均采用均数加减标准差的形式表示(Mean±SD)，数据统计使用SPSS软件中的方差分析(ANOVA)进行检验，先用Levene’s test对数据进行方差齐性检验，如方差齐用Bonferroni检验，如方差不齐则用Tamhane’s T2检验，以p＜0.05，p＜0.01表示具有统计学意义。
2 实验结果2.1 泼尼松长期应用对大鼠中枢神经系统生化指标的影响泼尼松长期应用对大鼠大脑重量(CW)及脑匀浆中MAO(单胺氧化酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、AchE(乙酰胆碱酯酶)、MDA(丙二醛)含量影响见表2.1表2.1泼尼松长期应用对大鼠脑匀浆生化指标的影响(x±s，n＝8)Tab 2.1 Changes of chemistry parameters of cerebrum plasm in prednisone rats(x±s，n＝8)CW MAO SOD AChEMDAGroup(g)(U/h/mgprot) (U/h/mgprot) (umol/ml) (nmol/mgprot)NS1.905±0.08 9.57±3.06 29.29±1.87 0.53±0.02 2.97±0.22GC1.874±0.05 22.12±1.11**18.53±2.95**0.36±0.05**2.49±0.51CDH 1.959±0.133 19.06±3.06*25.28±3.97△0.67±0.12△△*2.17±0.28△CDM 1.953±0.104 17.20±2.13△*26.77±4.11△0.61±0.07△△*2.40±0.26CDL 1.924±0.133 12.39±2.45△△24.64±2.63△0.85±0.08△△*2.77±0.31Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
与NS组比较(表2.1)，GC组大鼠大脑重量有下降趋势，脑匀浆中与衰老有关的酶SOD明显下降，而MAO的含量显著升高(P＜0.01)，提示长期使用泼尼松可使大鼠神经系统功能活动受到限制，出现衰老的迹象。GC组AchE含量下降而MDA含量变化不大(P＞0.05)，提示GC组大鼠可能发生胆碱能神经功能率退而引起AchE含量的降低；与GC组比较，CDL可显著升高SOD和AchE的含量而降低MAO的含量(P＜0.01)，提示CD可在一定程度上可对抗泼尼松的中枢性不良反应。
2.2 泼尼松长期应用对大鼠三臂迷宫检测正确率的影响与NS组比较(表2.2)，GC组大鼠活动明显减少，其对外界刺激的反应能力显著下降，在60次跑迷宫测试实验中仅有32次正确(ET)，正确率(ER，ET/60*100％)仅有53.8％，而NS组的正确率达71.5％，提示GC组的ER明显比NS组下降(P＜0.01)，提示长期使用泼尼松可使大鼠发生记忆力衰退。CDH组大鼠迷宫正确率虽比NS组下降(P＜0.05)，但比GC组提高(P＜0.05)，提示CD可有效改善大鼠脑部记忆能力。泼尼松长期应用对大鼠三臂迷宫正确次数(ET)和正确率(ER)的影响见表2.2。
表2.2泼尼松长期应用对大鼠迷宫正确率的影响(x±s，n＝8)Tab2.2 Changes of memory ability in prednisone rats(x±s，n＝8)Group ETER(％)NS42.9±4.5 71.5±7.6GC32.3±5.1**53.8±8.5**CDH 37.1±2.3*△61.9±3.8*△CDM 36±2.7**60±4.6**CDL 36.2±3.5**60.3±5.9**Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △p＜0.05，△△P＜0.01。
2.3 泼尼松长期应用对大鼠脑组织结构影响长期应用泼尼松对大鼠海马单位面积大锥体细胞数(HN)、大脑皮层厚度(CW)及分子层厚度和皮层的总厚度的比值(M/C)的影响见表2.3。
表2.3 长期应用泼尼松对大鼠脑组织结构影响(x±s，n＝8)Tab2.3 Changes of structure of cerebrum in prednisone rats(x±s，n＝8)HN CW M/CGroup(N/mm2)(mm)(mm/mm)NS 1901±3781.244±0.110.111±0.03GC 1737±5331.198±0.190.124±0.01CDH 1927±5581.290±0.100.105±0.02CDM 1996±2701.265±0.170.099±0.02△CDL 1874±3691.372±0.210.098±0.01△Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
各组大鼠大脑外观无显著差异，均为一尖端向前的楔型体，表面光滑缺少沟回，属于平脑型(lissencephalic brain)，未见明显的肿胀、萎缩或颜色变化。光镜下可见长期应用泼尼松后大鼠纹状皮质17区和18区间分子层厚度有增加趋势而皮层总厚度(CW)有减少趋势；虽皮层细胞分层尚清晰，但细胞排列紊乱，部分细胞发生明显水肿，可见有细胞发生明显变性坏死。另一方面，光镜下可见NS组海马神经元分布规则，大小一致，而长期使用泼尼松后大鼠海马区神经元排列分散，胞体肿胀或皱缩，其中CA2和CA3交界处有较多的神经细胞发生核固缩甚至溶解死亡。与NS组比(表2.3)，长期应用泼尼松后大鼠分子层厚度和皮层的总厚度比值(M/C)上升，海马CA2和CA3区交界处362.5um长度范围内单位面积大锥体细胞数(HN)有下降趋势，提示长期超生理剂量使用泼尼松可造成大鼠海马神经元的损伤。而CDM和CDL两组的M/C比GC组显著下降(P＜0.05)，CD三组HN均有上升趋势，其中以CDM明显，提示CD对泼尼松造成的神经细胞损伤有一定的预防作用。
2.4 泼尼松长期应用对大鼠胫骨上段松质骨形态计量学影响泼尼松长期应用对大鼠骨形态计量学中静态参数％Tb.Ar(骨小梁面积百分数)、Tb.N(骨小梁数量)、Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.SP(骨小梁分离度)和骨吸收指标Oc.N/BV(单位骨小梁周长破骨细胞数量)、％Oc.Pm(骨吸收周长百分数)的影响见表2.4表2.4泼尼松对大鼠骨形态计量学静态参数的影响(x±s，n＝8)Tab 2.4 Changes of the static histomorphometry parmeters in prednisone rats(x±s，n＝8)Tb.Ar TbN TbThTbSp Oc.N/BV ％Oc.PmGroup(％) (mm-1)(um)(um) (mm-2) (％)NS15.07±1.702.92±0.2351.86±6.48 292.88±25.52 11.42±1.46 0.873±0.09GC8.83±0.98**1.98±0.20**44.47±2.43*463.53±54.54**38.38±8.65**254±0.34**N-％ -41.3 -31.9 -14.2 58.3 236.1 191.4CS13.93±2.48△△2.83±0.50△△49.02±1.92△△311.03±56.31△△16.14±3.33*△△1.15±0.26*△△G-％ 57.7 42.6 10.3-32.9 -57.9 -54.7CDH 14.14±2.80△△2.82±0.50△△50.08±4.52△△312.55±55.14△△15.35±5.37*△△1.27±0.46*△△G-％ 60.1 42.1 12.6-32.6 -60 -50.3CDM 14.00±2.93△△2.75±0.56△50.96±5.33△326.14±76.62△△18.49±4.42*△△1.46±0.32*△△G-％ 58.1 35.5 14.6-29.6 -51.8 -42.7CDL 13.65±2.43△△2.88±0.51△47.57±4.53 309.87±67.98△△16.21±4.23*△△1.28±0.26*△△G-％ 54.4 44.9 7 -33.2 -57.8 -49.7Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
与NS组比较(表2.4)，GC组大鼠骨静态参数中％Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th均下降(P＜0.01)，提示GC组大鼠松质骨有明显丢失；而GC组Tb.SP、Oc.N、％Or.Pm明显增加(P＜0.01)，提示该组破骨细胞增多，骨吸收增加。与GC组比较，CD三组也能显著提高泼尼松大鼠的％Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th，而降低Tb.SP、Oc.N、％Oc.Pm，以CDH的效果突出。
2.5 泼尼松长期应用对大鼠松质骨形态计量学动态参数的影响泼尼松长期应用对大鼠松质骨形态计量学动态参数％L.Pm(荧光周长百分数)、MAR(骨矿化沉积率)及三种骨形成率指标BFR/BS、BFR/BV和BFR/TV的影响见表2.5表2.5泼尼松对大鼠松质骨形态计量学动态参数的影响(x±s，n＝8)Tab 2.5 Changes of dynamic histomorphometry parameters in prednisone rats(x±s，n＝8)Group ％L.Pm(％)MAR(um/d) BFR/BS(％/year) BFR/BV(％/year) BFR/TV(％/year)NS31.88±8.19 0.85±0.1610.28±3.98336.6±140.8 49.3±17.7GC29.81±9.02 0.81±0.258.91±3.97 332.8±142.5 29.6±13.2*CS31.67±5.41 0.92±0.1110.81±2.85366.1±89.0 51.3±15.6△CDH 31.34±0.76 0.90±0.1910.68±5.17351.4±146.7 49.5±24.5△CDM 30.78±11.3 0.85±0.2910.00±4.67322.3±146.6 43.3±19.7△CDL 28.82±8.78 0.85±0.169.31±4.81 326.3±162.5 41.7±12.0△Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
与NS组比较(表2.5)，GC组大鼠骨动态参数中％L.Pm及MAR、BFR/BS、BFR/BV的变化不大(P＞0.05)，但BFR/TV明显减少(P＜0.05)，提示长期超生理剂量使用泼尼松可使大鼠松质骨骨形成总量减少；与GC组比，CD三组大鼠松质骨的骨矿化沉积率和骨形成率均有上升趋势，其中以BFR/TV升高最为明显，CDH、CDM和CDL三组分别比GC组上升了67％、46％和41％(P＜0.05)，与CS比较无差异(P＞0.05)，提示CD可显著促进大鼠骨形成。
3 讨论3.1 糖皮质激素长期超生理剂量应用可对大鼠造成中枢毒性 临床资料显示，老年人血中糖皮质激素水平远高于成年人和青年人，长期使用糖皮质激素的患者往往伴有记忆功能障碍，因此可认为糖皮质激素与脑老化及中枢神经系统的退行性变关系密切。本实验中予大鼠超生理剂量的泼尼松灌喂3个月后观察到大鼠记忆力下降，大脑皮质和海马结构发生改变以及与衰老有关的酶含量发生改变，与临床上观察到的现象一致，提示糖皮质激素对神经系统的作用在人和大鼠身上表现相近。泼尼松长期超生理剂量应用后对大鼠造成中枢神经系统的毒性具体表现如下
3.1.1 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠三臂电迷宫正确率(ER)明显下降 GC组大鼠三臂电迷宫正确率比NS组明显下降(P＜0.01)(见表2.2)。一般来说，智力测试应该包括学习记忆力、思维力、判断力、理解力和创造力等几方面的测试，它们互相间都有牵及和影响，不易绝然分开，学习记忆力是其中一个重要基本因素，因此对其研究较多，方法也较多。三臂电迷宫法是常用的测试动物学习记忆力高低的方法，此法主要是通过观察动物面对危险时所产生的被动和主动逃避反射获得能力和再现能力来判断药物对学习记忆力的影响，在给提示和不给提示的测试中，如果用药动物正确率比非用药动物明显提高，则提示药物具有显著的益智作用，反之亦然。本实验中发现长期使用泼尼松后大鼠三臂迷宫正确率显著下降，提示泼尼松可能会抑制中枢神经系统发育，影响动物的智力发展，引起智力衰退甚至衰老的提早出现。
3.1.2 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠脑组织中MAO的含量显著上升，SOD和TchE的含量明显下降GC组大鼠脑匀浆中MAO的含量显著上升而SOD和TCHE的含量明显下降(P＜0.01)(见表2.1)。这是三种在脑神经活动中必不可少的生物酶，其在体内平衡与否可直接影响机体活动功能的衰退与否，因此这三种酶与生物体衰老之间关系很密切。关于衰老的机制有很多种说法，其中自由基学说是在1956年由D.Harman首先提出的，其认为在新陈代谢过程中产生的自由基过量会造成DNA和其他大分子损伤。自由基主要是通过引起各种生物膜中不饱和脂质发生过氧化而导致机体发生退行性变，甚至引起生物体衰老死亡，此种反应主要存在功能活跃的组织器官中，如脑、心、肝、肾等。机体对抗自由基损伤的机制主要有两种，一是对损伤大分子的修复机制，二是消除自由基机制。在体内，最有效的自由基消除剂就是SOD，它的含量降低提示体内过氧化反应明显，机体出现老化现象。在GC组中，大鼠脑匀浆中的SOD含量显著下降，提示长期超生理剂量使用泼尼松可明显加重脑内脂质过氧化进程，造成自由基大量堆积，损害了脑的活动和功能。另一方面，MAO可降解脑内的儿茶酚胺含量，使脑活动降低，因此MAO和衰老关系密切。人脑中的MAO-B含量在45岁后随年龄的增加而剧增，故MAO又称为老化相关酶，被认为是老化的标志。GC组大鼠脑匀浆中的MAO含量显著上升，提示长期使用糖皮质激素可加速脑内儿茶酚胺的降解，导致5-羟色胺及其代谢产物5-羟吲哚乙酸含量相对增加，使脑的生理活动失调，导致衰老的发生。乙酰胆碱(Ach)是最古老的递质，其主要功能是作为神经传导的化学递质，在体内的主要灭活方式是靠乙酰胆碱酯酶(AchE)的作用。GC组大鼠脑匀浆中AchE的含量下降，活力降低，同时可观察到GC组大鼠脑组织结构紊乱，神经细胞严重受损，因此可以推测泼尼松长期应用引起脑匀浆中AchE活力下降可能与胆碱能神经退行性变，导致Ach生成减少而引起对AchE的需求下降(即Ach缺乏的继发反应)所致，这与最近研究一致。另也有文献报道在Alzheimer病患者中，发现主要与识别和记忆功能有关的基底前脑中胆碱能神经元发生选择性退行性变，皮层和脑脊液中AchE活性降低；另观察到老年期痴呆病患者额叶皮层中AchE活性也明显低于正常人，与Alzheimer病患者相似，因此可以推断，长期应用糖皮质激素可损伤神经元，引起脑内神经递质合成和释放功能紊乱从而导致生物体衰老的提前出现。
3.1.3 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠海马结构发生形态学改变，特定区域单位面积神经锥体细胞数目下降，大锥体细胞发生明显核固缩性坏死脑组织切片检查发现，NS组大鼠海马CA2和CA3区交界处神经元大小分布规则，细胞结构和层次清晰，呈C状排列。与NS组相比(见表2.3)，GC组大鼠海马大锥体细胞数量下降，其中CA2和CA3区交界处362.5um长度范围内单位面积神经锥体细胞数下降9％；海马细胞结构紊乱、排列分散，胞体肿胀或皱缩，部分可见核固缩深染，甚至可见神经元坏死，大锥体细胞层中可见出现较多胶质细胞。一般情况下，神经元细胞核固缩现象极少见，而神经元细胞核发生固缩是细胞死亡前的表现，GC组大鼠海马细胞发生明显的变化提示泼尼松长期应用可造成海马神经细胞死亡或加速神经元退化，提示糖皮质激素长期应用导致的机体衰老、记忆力衰退可能与海马细胞的凋亡有关。海马结构在进化上由旧皮层(archipallium)演化而来，主要神经元是大锥体细胞，是边缘系统的重要部位，与情感行为、学习记忆等高级神经活动有关，同时又是调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)的高位中枢和应激损伤的主要靶区。研究表明，应激性海马损伤与HPA轴功能亢进互为因果关系，两者造成了慢性应激性海马损伤的恶性循环，其机制尚未明了，可能与糖皮质激素长期应用引起的细胞器退行性变和能量的大量消耗有关。在本实验中观察到长期使用泼尼松后大鼠海马CA2和CA3区交界处的神经元数量下降，胶质细胞增多，提示泼尼松长期超生理剂量应用可造成大鼠海马神经细胞组成和结构发生改变，造成与智力有关的神经活动能力下降。海马是脑内参与记忆的重要部分，其结构发生改变提示记忆功能可能下降，记忆衰退是生物体出现衰老的一个早期症状，因此海马在衰老过程中的形态学变化已经引起了学术界的高度重视。文献报道糖皮质激素损伤海马的机制可能与加速神经元内ATP消耗，干扰神经细胞代谢所致；也有学者认为海马锥体细胞损害是Alzheimer病患者记忆功能障碍的重要病理学基础，主要原因是引起了胆碱能神经元退化所致；本实验结果也显示了长期使用泼尼松可显著影响动物的反应能力，造成大鼠智力减退和衰老甚至是痴呆的提早出现。
3.1.4 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠皮层细胞排列紊乱，部分细胞发生水肿变性，分子层厚度和皮层厚度比值上升 光镜下可见NS组大鼠皮层结构清晰，细胞排列整齐，而GC组大鼠皮层结构分层尚清晰，但细胞排列紊乱，锥体细胞减少。与NS组比较，GC组大鼠大脑皮层厚度减少4％，而纹状皮质17区和18区间分子层厚度和皮层的总厚度的比值上升12％(见表2.3)，提示糖皮质激素长期超生理剂量应用可破坏和改变大鼠大脑皮层结构。一般情况下，分子层神经元较少，主要是水平细胞、星型细胞及与皮质表面平行的神经纤维，此层在皮层总厚度中的比例增加提示其它细胞层的厚度可能发生萎缩，尤其是厚度较大的外锥体细胞层和内锥体细胞层，这两层是高尔基I型神经元主要聚集部位，厚度变薄提示皮层锥体细胞可能发生萎缩，预示皮质区域所形成的信息量外传减弱，是智力受损的主要原因。
3.2 糖皮质激素长期超生理剂量应用可致大鼠骨质疏松3.2.1 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠骨小梁面积百分率减少、骨密度明显降低，分离度显著增加 本实验中GC组大鼠骨形态计量学静态参数显示GC组大鼠胫骨上段松质骨明显丢失(P＜0.01)(见表2.4)，与NS组比较，骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)减少了41.3％(P＜0.01)，骨小梁数目(Tb.N)减少31.9％(P＜0.01)，骨小梁厚度(Tb.Th)减少了14.2％(P＜0.05)，骨小梁分离度(Tb.SP)增加了58.3％(P＜0.01)，说明GC组大鼠骨小梁明显丢失、密度明显降低，分离度显著增加；％Tb.Ar是反映骨量变化的重要指标，Tb.N、Tb.Th和Tb.SP是反映骨小梁显微结构的综合指标，以上变化显示了GC组大鼠松质骨结构发生明显变化，呈现典型骨质疏松状态。
3.2.2 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠破骨细胞活性增加，骨吸收活跃在本实验骨吸收参数中，GC组大鼠单位骨小梁面积破骨细胞数(Oc.N/BV)增加236.1％(P＜0.01)，骨吸收周长百分率(％Oc.Pm)增加191.4％(P＜0.01)，提示长期超生理剂量应用泼尼松后大鼠破骨细胞活性增加，骨吸收活跃，加速了骨质溶解，此作用可能与糖皮质激素抑制肠钙吸收，增加尿钙排出量导致血钙下降而反射性引起PTH(甲状旁腺素)分泌增高，刺激破骨细胞分化活跃有关。
3.2.3 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠单位骨组织面积的骨形成率减少从骨形态计量学动态参数结果观察(见表2.5)，反映骨转换的动态指标包括L.Pm％(荧光标记周长百分数)，MAR(骨矿化沉积率)，BFR/BS(单位长度骨小梁表面上骨形成率)，BFR/BV(单位骨小梁面积骨形成率)，BFR/TV(单位骨组织面积骨形成率)，这些指标均能反映骨形成的活力[48]BFR/BV则反映骨转换程度的高低。本实验中GC组大鼠BFA/TV降低了40％(P＜0.05)，提示单位骨组织面积的骨形成减少，％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV也有不同程度的减少，但无统计学意义(P＞0.05)。文献报道使用泼尼松4.5mg/Kg，3天一次，连续2个月可显著抑制大鼠胫骨骨形成指标中％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV和BFA/TV，本实验中泼尼松长期应用对大鼠胫骨的％L.Pm、MAR、BFR/BS和BFR/BV无明显抑制，可能与实验中泼尼松的用量和给药方法不同有关，此现象值得进一步探讨。在本实验中，采用的是泼尼松每天连续给药的方法，共12周，这种用法可使GC组大鼠的BFA/TV升高而破骨细胞数量增多，可能提示连续用药可能会引起PTH分泌增加而导致破骨细胞活性增高，反馈性刺激成骨细胞活性，造成成骨细胞成骨功能增强，促进骨的形成，这可能是造成本实验中其他动态参数变化不明显的原因，对其仍需进一步探讨。
3.3复方丹参制剂组方原理与依据淫羊藿、黄芪、白术和丹参均是具有抗衰老作用的中药，而骨质疏松是衰老的一种重要表现，因此四味中药可能具有抗骨质疏松的作用。本课题组曾对由淫羊藿、黄芪、白术三味中药制成的制剂进行抗骨质疏松症的动物实验研究，结果发现其每个单味或复方均有抗药物性骨质疏松或去势性骨质疏松的作用，其机制可能是通过增强骨重建而增加骨量。文献报道淫羊藿可通过保护性腺、抑制骨吸收和促进骨形成等途径使机体的骨代谢处在正平衡状态，体外实验也证明了淫羊藿具有促进成骨细胞增殖和分化作用，可通过调节内分泌来协调体内新陈代谢的平衡；研究认为黄芪抗衰老、增强免疫力和改善血循环保护肝肾功能的作用突出，可通过抑制骨吸收而不抑制骨形成作用来对抗去势大鼠的骨丢失；中医认为白术具有补脾益胃和中的功效，研究表明白术有促进骨髓细胞增殖作用和IL-1样作用，有较强的促进骨生长作用。糖皮质激素长期应用除可造成骨质疏松、免疫抑制、心血管疾病和消化系统损伤等不良反应外，对中枢神经系统的毒性作用突出，在临床上也见报道长期使用糖皮质激素后可导致某些患者精神失常。考虑到糖皮质激素对中枢的毒性作用明显，同时也为了能改善糖皮质激素的抗炎作用，故在原有的基础上加进丹参组成复方丹参(CD)中药制剂。丹参具有促进成骨细胞生长、改善中枢神经功能、促进免疫和抗炎作用，期望在所组成的制剂中，丹参的镇静宁神和促进记忆可对抗糖皮质激素的中枢神经系统毒性作用，而淫羊藿的性激素样作用可对抗糖皮质激素引起的性腺抑制作用；黄芪改善循环系统功能可对抗糖皮质激素的心血管系统损害；白术可对抗糖皮质激素长期应用所造成的消化系统反应。故CD的组方原则是为了最大限度减少糖皮质激素长期应用造成的不良反应。
3.3.1 复方丹参制剂可有效预防大鼠骨质疏松症实验结果提示复方丹参制剂能有效防止大鼠的骨丢失，其中以高剂量的效果较为明显，其作用机制可能与CD制剂能明显抑制泼尼松长期应用导致的大鼠骨吸收的增加，同时对骨形成有一定的促进作用有关。复方丹参制剂这种显著增加骨量的作用可能与丹参、黄芪、淫羊藿和白术四种中药的共同作用有关，文献报道①丹参可改善骨环境内部和全身的血液循环，有助于骨的营养供应，丹参还可增加血清中锌的含量而降低铜的含量，可进一步增加松质骨的形成而减少了铜对骨形成的抑制作用；②黄芪能促进胶原蛋白合成，促进成骨细胞分泌类骨质，可有效对抗糖皮质激素长期应用造成的成骨细胞功能抑制作用。③淫羊藿是传统的补肾壮阳药，也具有强壮作用，临床报道，给已经确诊的骨质疏松症患者用淫羊藿复方治疗3个月后症状明显改善，也可明显加快骨折病人骨痂的愈合和改善骨痂的排列和密度，体外实验也提示了淫羊藿水提液可抑制破骨细胞的产生而降低骨吸收以及通过刺激成骨细胞的分化而促进了骨的形成。④白术是常用的补气药，实验研究显示，白术可促进骨髓细胞增殖及具有IL-1的作用，可进一步促进成骨细胞的转化；也有报道给小鼠每天灌服白术水煎液6g/kg，连续1个月，可显著促进小鼠的体重增长和肌肉增强，白术的强壮作用明显。因此，CD制剂对泼尼松大鼠胫骨上段松质骨的作用可能是四种中药的相互协调、相互促进而有各自发挥作用所致。
3.3.2 复方丹参制剂能有效预防大鼠中枢毒性作用本研究观察到CD制剂对泼尼松长期应用所造成的大鼠其他不良反应也有部分对抗作用，具有以下几种表现(1)复方丹参制剂能有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠三臂电迷宫正确率(ER)下降的现象实验结果显示，复方丹参制剂可有效防治长期使用泼尼松所造成的大脑功能下降，与GC组相比，CDH、CDM和CDL三组大鼠的ER分别升高15％、12％和12％，比GC组明显增高(P＞0.05)，提示复方丹参制剂可有效对抗糖皮质激素长期超生理剂量应用所造成的智力衰退，提高泼尼松大鼠的学习记忆能力。
(2)复方丹参制剂可有效对抗糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠脑组织中MAO含量升高和SOD含量下降，但亦显著升高TchE的含量与GC组比较(见表3.6)，CDH、CDM和CDL三组大鼠的MAO分别下降14％、22％和44％，(P＜0.05)，SOD含量分别升高36％、44％和33％(见表3.6)，匀浆中酶含量发生明显改变(P＜0.05)，提示复方丹参制剂可有效防止泼尼松所致的脑组织酶学改变。CDH、CDM和CDL三组大鼠的TchE含量均比NS组显著升高(P＜0.05)，尤其以CDL明显，其作用需进一步探讨。
(3)复方丹参制剂可有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠海马细胞损伤复方丹参制剂三组大鼠的单位面积海马神经元计数均有上升趋势，CDH、CDM和CDL三组大鼠海马特定区域单位面积神经锥体细胞数目分别比GC组上升11％、15％和9％，镜下可见大锥体细胞排列规则，变性少，比GC组明显改善，提示复方丹参制剂可有效保护由糖皮质激素长期应用所导致的海马神经元损伤，这可能与其能有效改善糖皮质激素长期应用引起的神经细胞退行性变和降低泼尼松大鼠脑能量消耗有关。
(4)复方丹参制剂可有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠脑皮层神经细胞损害和结构改变镜下可见CDH、CDM和CDL三组大鼠大脑皮层细胞结构清晰，分子层厚度/总皮层厚度的比值下降，其中CDM和CDL两组的分子层厚度/总皮层厚度的比值比GC组显著下降(P＜0.05)，提示复方丹参制剂对糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠大脑皮质的损害有一定预防作用，但量效关系不明显。
(5)复方丹参制剂能有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠中枢毒性作用的可能原因实验结果显示，复方丹参制剂对泼尼松长期应用造成的大鼠神经系统损伤有显著的预防作用，与GC组比较，复方丹参制剂三组大鼠的神经系统功能明显改善。复方丹参制剂产生该种作用的可能原因是①丹参可明显改善脑部血液供应以及脑缺血后大脑中单胺类物质的代谢紊乱，对神经递质和血管活性物质也有很好的调节作用，可显著改善神经肽和兴奋性氨基酸的含量以及消除脑中氧自由基的含量。②黄芪具有延年益寿、直接抗衰老作用，可以增加血中和脑中SOD的含量，而明显减少体内自由基的生成。本实验中泼尼松大鼠呈现衰老的征象，而黄芪的直接抗衰老作用应该可以对其有一定的预防作用。③淫羊藿和白术[93]均是具有抗衰老作用的药物，在体内可提高SOD的含量，有效清除代谢产生的自由基，对机体有一定的保护作用；另一方面，淫羊藿可增加脑血流量、降低脑血管阻力而白术[98]对植物神经功能有双向调节作用，两者均对神经系统有一定的保护功能。长期超生理剂量使用糖皮质激素可引起脑中神经递质含量改变，引起海马神经元变性坏死和大脑皮层结构紊乱，导致大鼠迷宫正确率明显下降，而复方丹参制剂对此有显著的预防作用，故适用于长期应用糖皮质激素所致的神经系统功能紊乱的预防。
结论4月龄SD大鼠灌喂泼尼松12周后，其不良反应主要表现为体重减轻、骨质疏松、中枢神经系统功能减退以及免疫系统和肝功能受损，睾丸、胸腺及肾上腺萎缩，血脂血糖升高而HDL含量降低等。
复方丹参制剂能有效对抗泼尼松长期超生理剂量应用所致的大鼠体重减轻；可有效对抗泼尼松所致的大鼠骨生长抑制和骨质疏松症，作用随药物浓度的增加而增强，其作用可能与其协调成骨细胞和破骨细胞活性有关；对抗泼尼松长期超生理剂量应用造成的大鼠中枢神经系统不良反应及高CH、高Glu和低HDL血症以及肾上腺、胸腺和睾丸萎缩有一定的对抗作用，因其可从多方面对抗泼尼松长期超生理剂量应用所致的不良反应，且毒性较低。
研究表明本制剂能提高泼尼松大鼠的智力，有效防治泼尼松所造成的海马神经元的损伤以及降低与衰老相关酶的含量，对骨质疏松症也有良好的预防作用。因此，本制剂可用于提高机体记忆能力，预防智力衰退和延缓衰老的发生，尤其可有效预防长期超生理剂量应用糖皮质激素后的脑损伤和骨质疏松。
权利要求
1.一种具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，其特征是该复方制剂是由中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术提取物所组成。
2.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，该复方制剂中的中药提取物是指按下述工艺制备的提取物丹参、淫羊霍、黄芪和白术粉碎成粉末，加75～95％乙醇浸泡24小时，过滤，回收乙醇，得醇提物备用，药渣再加水煎煮3次，合并三次滤液，滤过，滤液浓缩至适量，加入前述的醇提物，低温干燥，粉碎，加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
3.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，该复方制剂中的中药提取物是指按下述工艺制备的提取物丹参、淫羊霍、黄芪和白术生药材以数倍水浸泡后煎煮，重复3次，合并滤液浓缩，加3倍乙醇沉淀，回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到中药总提取物。中药总提取物加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
4.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，其特征是该复方制剂含有丹参素和丹参酮。
5.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，其特征是该复方制剂含有淫羊藿总黄酮。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗衰老，防治糖皮质激素长期超生理剂量应用后所致的骨质疏松和脑损害的复方制剂，该制剂由丹参、淫羊藿、黄芪和白术组成，该复方制剂中丹参、淫羊藿、黄芪和白术均具有抗衰老作用，可共同改善中枢神经功能以及减少骨丢失，有效预防大剂量糖皮质激素长期超生理剂量应用时所产生的不良反应。长期超生理剂量应用糖皮质激素泼尼松可造成智力衰退精神异常甚至脑萎缩性痴呆、骨质疏松症等，研究表明本制剂能提高泼尼松大鼠的智力，有效防治泼尼松所造成的海马神经元的损伤以及降低与衰老相关酶的含量，对骨质疏松症也有良好的预防作用。因此，本制剂可用于提高机体记忆能力，预防智力衰退和延缓衰老的发生，尤其可有效预防长期超生理剂量应用糖皮质激素后的脑损伤和骨质疏松。
文档编号A61P19/10GK1565582SQ03145180
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月2日 优先权日2003年7月2日
发明者邹丽宜, 吴铁, 崔燎, 刘钰瑜, 陈方 申请人:广东医学院
技术领域：
本发明涉及一组由中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术提取物所组成的一种具有抗衰老、防治骨质疏松和脑损害的中药制剂复方制剂及其制法，该复方制剂对糖皮质激素长期超生理剂量应用后所致的骨质疏松和脑损害有良好的预防作用。
糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是由肾上腺皮质分泌的一类具有神经活性的甾体激素，它的产生直接受到下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis，HPAA)的影响，也可以对HPAA进行负反馈抑制。糖皮质激素是维持机体正常生命活动的一类重要物质，其药理作用广泛而复杂，过多或过少均会给机体带来严重的影响。在正常状态下由肾上腺皮质所分泌的生理剂量的糖皮质激素主要影响基本生命物质的代谢过程，超生理剂量的糖皮质激素则还有抗炎、抗免疫、抗休克等作用。因此，糖皮质激素在临床上应用极为广泛，如用作内分泌不足的长期替代疗法，治疗严重感染或炎症，治疗自身免疫性或过敏性疾病以及血液病等，疗效显著，但长期大剂量使用可造成一系列严重的不良反应，如类肾上腺皮质功能亢进综合征、继发性感染、溃疡性疾病、心血管疾病、营养不良、智力衰退精神异常甚至脑萎缩性痴呆、骨质疏松症等。尤其是脑萎缩、精神病和骨质疏松症的发生往往不易被觉察，一旦出现危害性大，因此已成为糖皮质激素治疗的停药指征之一。现代研究表明，超生理剂量的的糖皮质激素会对中枢神经系统，尤其是海马神经元产生毒害作用。海马是中枢神经系统中与学习记忆功能密切相关的重要脑区，也是易受糖皮质激素攻击的靶器官，长期接受超生理剂量糖皮质激素，都会使大鼠海马脑区的神经元发生萎缩甚至死亡，同时还伴有动物学习记忆能力的下降。临床上也发现，一些精神性疾病如Cushing症、老年性痴呆、抑郁症和焦虑症等与糖皮质激素的过度分泌也存在一定的因果关系。在中枢神经系统中，GC主要是通过和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptors，GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptors，MR)结合来发挥作用。海马是与认知行为功能密切相关的部位，由于富含肾上腺皮质激素受体，而且是中枢神经系统中含量最高的脑区，因此，当体内糖皮质激素浓度增高时，海马就会受到选择性的攻击，因而造成中枢的损害。糖皮质激素在急性、严重性疾病的抢救过程中发挥着重要的作用，是挽救患者生命的前提，但长期大剂量使用糖皮质激素治疗对脑损害的作用尤其突出。在最近非典疫情中，有报道在接受类固醇鸡尾酒疗法的非典痊愈患者中，半数已经出现了大脑和神经损伤的早期迹象。另一方面，有报道显示，在接受糖皮质激素慢性治疗的患者中，不论任何年龄，均有30％～50％的可能性并发骨质疏松症。此类骨质疏松症的发生可能与糖皮质激素长期应用造成钙排泄增多而吸收减少以及糖皮质激素显著抑制成骨细胞功能有关，其主要表现为骨量显著减少，骨组织微细结构退化，以致骨的脆性增加，患者常发生自发性骨折或无菌性坏死，给患者家庭和社会带来极大的负担。因此，探讨糖皮质激素长期应用所产生中枢毒性和骨质疏松症的可能原因以及研制对抗药物已成为当今迫切需要解决的问题。
对于糖皮质激素性骨质疏松症，有报道用抑制骨吸收药如雌激素来治疗，但是由于雌激素有明显的副作用，长期使用会增加子宫内膜癌和乳腺癌的发病率，故限制了其在临床上的使用；现在临床上也出现不少新药如二磷酸盐类、降钙素类、以及雌激素受体调节剂等也对防止骨丢失有一定作用，但长期使用反而抑制骨形成，导致骨老化、骨质量下降；目前，根据糖皮质激素性骨质疏松症的特点，临床上多主张应用钙剂、Vit D3和同化类激素对其进行治疗，因此类药物属于促进骨形成、促骨矿化药，主要作用是可以使1，25(OH)2D3的浓度维持在正常水平，能更好地调节骨环境中的影响因子，促进骨形成而抑制骨吸收，达到增加骨量的目的。但临床研究也报道了长期使用同化类激素会产生明显的肝脏毒性和水钠潴留，且其吸收不规则，故限制了其在临床上的使用，因此，对糖皮质激素性骨质疏松症的治疗，无论是用促进骨形成、骨矿化药还是用抑制骨吸收药来效果都不理想。另一方面，对于糖皮质激素性骨质疏松长期应用造成的大脑损害，现仍未见有效药物出现，故对临床上出现糖皮质激素性脑损伤症状的患者，一般只能采用对症治疗，但疗效并不理想。因此，本发明的任务是研制一种适合需要长期大剂量使用糖皮质激素的患者预防和治疗脑损害的复方制剂，该复方制剂是由丹参、淫羊霍、黄芪和白术提取物所组成。研究表明该复方制剂能有效提高泼尼松大鼠的智力，有效防治泼尼松所造成的海马神经元的损伤以及降低与衰老相关酶的含量以及有效提高大鼠的骨量。因此，可用于提高机体记忆能力和延缓衰老的发生，尤其可有效预防长期超生理剂量应用糖皮质激素后的脑损伤和骨质疏松症。故可用于需长期应用糖皮质激素治疗的患者作预防性用药，以减少或减缓糖皮质激素性不良反应的发生。
解决这一任务的途径是这样实现的，取中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术，通过下述工艺制作成片剂、冲剂或胶囊剂，供临床应用，研究表明，本制剂对泼尼松大鼠的实验性脑损害和骨质疏松，有良好的防治作用。本制剂能够提高实验动物的智力以及有效保护海马神经元，减少脑匀浆中致衰老酶的含量以及减轻其他糖皮质激素性的不良反应的发生。用本复方制剂治疗糖皮质激素性脑损害国内外文献均未见报道。
本复方制剂可通过下述几个方法制备1、丹参、淫羊霍、黄芪和白术粉碎成粉末，加75～95％乙醇浸泡24小时，过滤，回收乙醇，得醇提物备用，药渣再加水煎煮3次，合并三次滤液，滤过，滤液浓缩至适量，加入前述的醇提物，低温干燥，粉碎，加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
2、丹参、淫羊霍、黄芪和白术生药材以数倍水浸泡后煎煮，重复3次，合并滤液浓缩，加3倍乙醇沉淀，回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到中药总提取物。中药总提取物加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
采用以上1或2方法制得的制品，经药理学、毒理学研究证明，本品对糖皮质激素长期超生理剂量应用后所致的骨质疏松和脑损害有明显的预防和治疗作用，急性毒性试验及长期毒性试验(包括3个月至6个月)均证实本品毒性低，长期服用对心、肝、肾、肺、胃、肠、脾、胸腺、淋巴结等各重要器官均无损害作用。
为观察由丹参、淫羊霍、黄芪和白术组成复方制剂的药效学作用，进行了下述实验1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药品与试剂醋酸泼尼松原料，仙居制药股份有限公司生产。丹参(河北)、黄芪(内蒙古)、淫羊藿(江苏)、白术(浙江)四药均购于广州药材公司，经执业中药师辨认确定。单胺氧化酶测试盒、丙二醛测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶测定试剂盒、超氧化物歧化酶测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程公司生产。
1.1.2 实验中药提取物取中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术按本专利介绍的工艺提取制备。
1.1.3 仪器低速锯(Buehler LTD.USA)；硬组织切片机(德国Leica 2155)；碳化钨刚刀(德国Leica公司产品)；骨组织形态计量学测量软件(KSSScientific Consultants，UT USA)；自动化图像数字化分析仪包括光镜和荧光显微镜(Nikon，日本)；UV-3010紫外分光光度计(日本岛津)；AE240电子天平(Mettler-Toledo instr.shanghai Ltd)；ZS83-I型内切式组织匀浆机(浙新机械厂制造)；MG-2型迷宫刺激器(张家港市生物医学仪器厂)；ASD-3D爱华电子计重秤(深圳市爱华衡器有限公司产品)。
2.4 实验方法1.2 材料1.2.1 动物模型与分组选用4月龄未交配的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，SPF级，平均体重228±10g，由广东医学院实验动物中心提供。
饲养条件饲养室内温度保持在24℃～26℃，湿度维持在50％～60％(由本院实验动物中心提供)，温湿条件适宜，隔日换垫料，专室分笼饲养，专人负责；使用经严格消毒后的标准饲料和纯净过滤水进行喂养(含钙1.33％，磷0.95％，由本院实验动物中心提供)，所有实验动物分笼饲养，确保有足够的活动空间，可自由摄食、摄水。
将48只SD雄性大鼠按体重应用microsoft Excel带的宏程序Analys32.x11产生随机数列，并利用产生的随机数列进行随机分组，一共分为5组，每组8只，具体为(1)NS组正常对照组，每天予0.9％氯化钠溶液(NS)按5ml/kg灌喂给药，1h后重复按5ml/kg灌予NS。
(2)GC组泼尼松模型组，每天先予醋酸泼尼松2.7mg/kg灌胃(3～6组先同法给泼尼松灌胃，后予相应药物治疗)，1h后灌予NS 5ml/kg。
(3)CDH组高剂量复方丹参治疗组，予醋酸泼尼松1h后灌复方丹参制剂10g/kg/d(淫羊藿+黄芪+白术+丹参各2.5g/kg/d)，5ml/kg。
(4)CDM组中剂量复方丹参治疗组，予醋酸泼尼松1h后灌复方丹参制剂5g/kg/d(淫羊藿+黄芪+白术+丹参各1.25g/kg/d)，5ml/kg。
(5)CDL组低剂量复方丹参治疗组，予醋酸泼尼松1h后灌复方丹参制剂2.5g/kg/d(淫羊藿+黄芪+白术+丹参各0.625g/kg/d)，5ml/kg。所有动物分组后观察一天，第二天开始灌胃给药，qd，连续12周。
1.2.2 记忆能力测定方法学习记忆力是智力里的一个重要基本因素，基础研究中常把对学习记忆力的高低作为药物促智或致痴的重要指标之一。药理药效学测试中常常用动物被动逃避反射及主动逃避能力的获得和再现能力来判断药物对记忆的影响。迷宫法是常用的检测动物记忆力高低的方法，本实验中通过采用电迷宫刺激法来检测大鼠对迷宫的记忆能力高低来判断长期使用糖皮质激素对大鼠智力的影响。实验结束前1周，先让大鼠在MG-2型三臂电迷宫刺激器中自动逃避，观察其逃避的习惯方向，并详细记录之，若经检测后无差异，则不用规定安全方向；若大鼠对逃避的方向选择有显著差异，如以逃向左侧常见，则以左侧定为电击区(如II区)，右侧为安全区(如III区)；实验正式开始时，I区为起步区，其中I区和II区带电，而III区不带电，第1天先训练动物建立记忆痕迹，每只大鼠先跑20次(分为5个循环，以免电激时间过长对动物造成伤害，一旦出现电晕现象马上停止且将大鼠取出，单笼平放，密切观察)记录其正确率，24h后重复，但此次电击前先延时5秒，同时给红灯提示，观察大鼠受激反应情况，72h后再重复，记录实验中大鼠的正确次数(ET，times of the exactitude)和错误次数(MT，timesof the mistake)，用ET除以总的测试次数，计算出迷宫正确率ER[ER＝ET/(ET+MT)]。
1.2.3 脑组织切片标本制备方法冰冻状态下取下大鼠头部，在脑的最前端即眼前方眶间最狭窄处取出嗅球，在人字缝交界处取出松果体，然后在额骨的内侧横嵴和顶间骨的前缘骨缝之间打开颅骨取出完整大脑，首先称量大脑重量，并观察外观有无特征性改变，然后将右侧大脑用波氏液固定进行常规石蜡包埋切片。根据包新民等大鼠脑立体定位图谱在距离前囟向尾侧3mm至4mm处修理组织块，行冠状切片，在距离前囟向尾侧约3.5mm处连续切片5-8张，厚4μm，经HE染色后，分别于高倍光镜下观察组织结构变化并用半自动图像分析仪测算海马CA2和CA3区交界处362.5μm范围内单位面积神经元数目(大锥体细胞计数)和测量大鼠大脑纹状皮质17区和18区间分子层厚度和皮层总厚度。其具体测定方法如下(1)海马单位面积大锥体细胞数(HN)测算方法海马是边缘系统的重要结构，结构比较规整，且在记忆中起到极关键的作用，目前已成为神经科学研究的一个热门，其中海马在老化过程中的形态学改变已引起学术界广泛重视。在本实验中，先通过半自动图像分析仪在10×40倍镜下观察海马细胞形态结构，并测算海马CA2和CA3区交界处362.5μm范围内神经元数目(主要是大锥体细胞计数)和该区面积，并计算出该区单位面积内神经细胞数目，以评价糖皮质激素长期应用对大鼠海马结构影响程度的指标。
(2)大鼠大脑分子层厚度和皮层总厚度的比值(M/C)测定方法哺乳动物新皮层由表面向白质一般分成六层，分别是I分子层(molecular layer)，II外颗粒层(internal granular layer)，III外锥体细胞层(pyramidal layer)，IV内颗粒层(internal granular layer)，V内锥体细胞层(internal pyramidal layer)和VI多型细胞层(polymorphic layer)，纹状皮质17区和18区属新皮质，结构较清晰，且在半脑切片中与海马结构距离较近，容易辨认，因此选择测量该区皮层总厚度和分子层厚度作为参数指标。先用半自动图像分析仪在10×40倍镜下初步确认和观察皮层结构，再于10×20倍镜下分别测定在同一平面中分子层的厚度(wall of molecular layer，MW)和皮质总厚度(wall of cortex，CW)，并以其比值M/C作为评价糖皮质激素对大鼠脑皮层结构影响程度的指标。
1.2.4 脑匀浆生化指标测定方法大鼠右心室取血后，迅速断头，立即在冰台上取出完整大脑，称重后左侧大脑先于-20℃预存，48h内在冰浴上用4℃的0.86％盐水研磨制成10％脑匀浆，再经ZS83-I型内切式组织匀浆机充分粉碎，离心取上清测定MAO、SOD、AchE、MDA和脑匀浆蛋白含量。
1.2.5骨标本的制作大鼠用戊巴比妥钠麻醉后心脏抽血处死，取出左侧胫骨，用慢速锯在近端作矢状打开髓腔，于胫骨上段1/3处横行锯断，取胫骨上段进行固定、脱水、包埋和切片，用硬组织切片机分别切下5μm和8μm切片，5μm骨薄片采用Masson-Goldner Trichrome染色方法，染色后用以观察骨小梁表面破骨细胞数目。8μm骨厚片直接封片采用半自动图象数字化分析仪测量骨组织形态计量学静态参数和动态参数。
1.2.6 胫骨近端松质骨组织形态计量学测定用KSS Image图象分析系统，按国际骨形态计量学参数测量的定义和计算标准，测量胫骨近端的静态参数和动态参数。静态参数包括骨组织总面积(T.Ar，mm2)、骨小梁面积(Tb.Ar，mm2)、骨小梁周长(Tb.Pm，mm)及其计算参数[骨小梁面积百分数(％Tb.Ar，％)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)和骨小梁分离度(Tb.Sp，μm)]、总破骨细胞数目(Oc.No)及其指数(Oc.N/mm，#/mm)。动态参数包括单标记周长(sL.Pm，mm)、双标记周长(dL.Pm，mm)和双标记间距(Ir.L.Wi，μm)及其计算参数[标记周长百分数(％L.Pm，％)、骨矿化沉积率(MAR，μm/d)、骨形成率BER/BS(表示骨表面形成率，％yr)、骨形成率BER/BV(表示骨转换程度，％yr)、骨形成率BER/TV(表示骨组织形成率，％yr)]。
1.2.7 统计学方法所有测定指标均采用均数加减标准差的形式表示(Mean±SD)，数据统计使用SPSS软件中的方差分析(ANOVA)进行检验，先用Levene’s test对数据进行方差齐性检验，如方差齐用Bonferroni检验，如方差不齐则用Tamhane’s T2检验，以p＜0.05，p＜0.01表示具有统计学意义。
2 实验结果2.1 泼尼松长期应用对大鼠中枢神经系统生化指标的影响泼尼松长期应用对大鼠大脑重量(CW)及脑匀浆中MAO(单胺氧化酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、AchE(乙酰胆碱酯酶)、MDA(丙二醛)含量影响见表2.1表2.1泼尼松长期应用对大鼠脑匀浆生化指标的影响(x±s，n＝8)Tab 2.1 Changes of chemistry parameters of cerebrum plasm in prednisone rats(x±s，n＝8)CW MAO SOD AChEMDAGroup(g)(U/h/mgprot) (U/h/mgprot) (umol/ml) (nmol/mgprot)NS1.905±0.08 9.57±3.06 29.29±1.87 0.53±0.02 2.97±0.22GC1.874±0.05 22.12±1.11**18.53±2.95**0.36±0.05**2.49±0.51CDH 1.959±0.133 19.06±3.06*25.28±3.97△0.67±0.12△△*2.17±0.28△CDM 1.953±0.104 17.20±2.13△*26.77±4.11△0.61±0.07△△*2.40±0.26CDL 1.924±0.133 12.39±2.45△△24.64±2.63△0.85±0.08△△*2.77±0.31Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
与NS组比较(表2.1)，GC组大鼠大脑重量有下降趋势，脑匀浆中与衰老有关的酶SOD明显下降，而MAO的含量显著升高(P＜0.01)，提示长期使用泼尼松可使大鼠神经系统功能活动受到限制，出现衰老的迹象。GC组AchE含量下降而MDA含量变化不大(P＞0.05)，提示GC组大鼠可能发生胆碱能神经功能率退而引起AchE含量的降低；与GC组比较，CDL可显著升高SOD和AchE的含量而降低MAO的含量(P＜0.01)，提示CD可在一定程度上可对抗泼尼松的中枢性不良反应。
2.2 泼尼松长期应用对大鼠三臂迷宫检测正确率的影响与NS组比较(表2.2)，GC组大鼠活动明显减少，其对外界刺激的反应能力显著下降，在60次跑迷宫测试实验中仅有32次正确(ET)，正确率(ER，ET/60*100％)仅有53.8％，而NS组的正确率达71.5％，提示GC组的ER明显比NS组下降(P＜0.01)，提示长期使用泼尼松可使大鼠发生记忆力衰退。CDH组大鼠迷宫正确率虽比NS组下降(P＜0.05)，但比GC组提高(P＜0.05)，提示CD可有效改善大鼠脑部记忆能力。泼尼松长期应用对大鼠三臂迷宫正确次数(ET)和正确率(ER)的影响见表2.2。
表2.2泼尼松长期应用对大鼠迷宫正确率的影响(x±s，n＝8)Tab2.2 Changes of memory ability in prednisone rats(x±s，n＝8)Group ETER(％)NS42.9±4.5 71.5±7.6GC32.3±5.1**53.8±8.5**CDH 37.1±2.3*△61.9±3.8*△CDM 36±2.7**60±4.6**CDL 36.2±3.5**60.3±5.9**Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △p＜0.05，△△P＜0.01。
2.3 泼尼松长期应用对大鼠脑组织结构影响长期应用泼尼松对大鼠海马单位面积大锥体细胞数(HN)、大脑皮层厚度(CW)及分子层厚度和皮层的总厚度的比值(M/C)的影响见表2.3。
表2.3 长期应用泼尼松对大鼠脑组织结构影响(x±s，n＝8)Tab2.3 Changes of structure of cerebrum in prednisone rats(x±s，n＝8)HN CW M/CGroup(N/mm2)(mm)(mm/mm)NS 1901±3781.244±0.110.111±0.03GC 1737±5331.198±0.190.124±0.01CDH 1927±5581.290±0.100.105±0.02CDM 1996±2701.265±0.170.099±0.02△CDL 1874±3691.372±0.210.098±0.01△Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
各组大鼠大脑外观无显著差异，均为一尖端向前的楔型体，表面光滑缺少沟回，属于平脑型(lissencephalic brain)，未见明显的肿胀、萎缩或颜色变化。光镜下可见长期应用泼尼松后大鼠纹状皮质17区和18区间分子层厚度有增加趋势而皮层总厚度(CW)有减少趋势；虽皮层细胞分层尚清晰，但细胞排列紊乱，部分细胞发生明显水肿，可见有细胞发生明显变性坏死。另一方面，光镜下可见NS组海马神经元分布规则，大小一致，而长期使用泼尼松后大鼠海马区神经元排列分散，胞体肿胀或皱缩，其中CA2和CA3交界处有较多的神经细胞发生核固缩甚至溶解死亡。与NS组比(表2.3)，长期应用泼尼松后大鼠分子层厚度和皮层的总厚度比值(M/C)上升，海马CA2和CA3区交界处362.5um长度范围内单位面积大锥体细胞数(HN)有下降趋势，提示长期超生理剂量使用泼尼松可造成大鼠海马神经元的损伤。而CDM和CDL两组的M/C比GC组显著下降(P＜0.05)，CD三组HN均有上升趋势，其中以CDM明显，提示CD对泼尼松造成的神经细胞损伤有一定的预防作用。
2.4 泼尼松长期应用对大鼠胫骨上段松质骨形态计量学影响泼尼松长期应用对大鼠骨形态计量学中静态参数％Tb.Ar(骨小梁面积百分数)、Tb.N(骨小梁数量)、Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.SP(骨小梁分离度)和骨吸收指标Oc.N/BV(单位骨小梁周长破骨细胞数量)、％Oc.Pm(骨吸收周长百分数)的影响见表2.4表2.4泼尼松对大鼠骨形态计量学静态参数的影响(x±s，n＝8)Tab 2.4 Changes of the static histomorphometry parmeters in prednisone rats(x±s，n＝8)Tb.Ar TbN TbThTbSp Oc.N/BV ％Oc.PmGroup(％) (mm-1)(um)(um) (mm-2) (％)NS15.07±1.702.92±0.2351.86±6.48 292.88±25.52 11.42±1.46 0.873±0.09GC8.83±0.98**1.98±0.20**44.47±2.43*463.53±54.54**38.38±8.65**254±0.34**N-％ -41.3 -31.9 -14.2 58.3 236.1 191.4CS13.93±2.48△△2.83±0.50△△49.02±1.92△△311.03±56.31△△16.14±3.33*△△1.15±0.26*△△G-％ 57.7 42.6 10.3-32.9 -57.9 -54.7CDH 14.14±2.80△△2.82±0.50△△50.08±4.52△△312.55±55.14△△15.35±5.37*△△1.27±0.46*△△G-％ 60.1 42.1 12.6-32.6 -60 -50.3CDM 14.00±2.93△△2.75±0.56△50.96±5.33△326.14±76.62△△18.49±4.42*△△1.46±0.32*△△G-％ 58.1 35.5 14.6-29.6 -51.8 -42.7CDL 13.65±2.43△△2.88±0.51△47.57±4.53 309.87±67.98△△16.21±4.23*△△1.28±0.26*△△G-％ 54.4 44.9 7 -33.2 -57.8 -49.7Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
与NS组比较(表2.4)，GC组大鼠骨静态参数中％Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th均下降(P＜0.01)，提示GC组大鼠松质骨有明显丢失；而GC组Tb.SP、Oc.N、％Or.Pm明显增加(P＜0.01)，提示该组破骨细胞增多，骨吸收增加。与GC组比较，CD三组也能显著提高泼尼松大鼠的％Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th，而降低Tb.SP、Oc.N、％Oc.Pm，以CDH的效果突出。
2.5 泼尼松长期应用对大鼠松质骨形态计量学动态参数的影响泼尼松长期应用对大鼠松质骨形态计量学动态参数％L.Pm(荧光周长百分数)、MAR(骨矿化沉积率)及三种骨形成率指标BFR/BS、BFR/BV和BFR/TV的影响见表2.5表2.5泼尼松对大鼠松质骨形态计量学动态参数的影响(x±s，n＝8)Tab 2.5 Changes of dynamic histomorphometry parameters in prednisone rats(x±s，n＝8)Group ％L.Pm(％)MAR(um/d) BFR/BS(％/year) BFR/BV(％/year) BFR/TV(％/year)NS31.88±8.19 0.85±0.1610.28±3.98336.6±140.8 49.3±17.7GC29.81±9.02 0.81±0.258.91±3.97 332.8±142.5 29.6±13.2*CS31.67±5.41 0.92±0.1110.81±2.85366.1±89.0 51.3±15.6△CDH 31.34±0.76 0.90±0.1910.68±5.17351.4±146.7 49.5±24.5△CDM 30.78±11.3 0.85±0.2910.00±4.67322.3±146.6 43.3±19.7△CDL 28.82±8.78 0.85±0.169.31±4.81 326.3±162.5 41.7±12.0△Compared with NS*P＜0.05，**P＜0.01；Compared with GC △P＜0.05，△△P＜0.01。
与NS组比较(表2.5)，GC组大鼠骨动态参数中％L.Pm及MAR、BFR/BS、BFR/BV的变化不大(P＞0.05)，但BFR/TV明显减少(P＜0.05)，提示长期超生理剂量使用泼尼松可使大鼠松质骨骨形成总量减少；与GC组比，CD三组大鼠松质骨的骨矿化沉积率和骨形成率均有上升趋势，其中以BFR/TV升高最为明显，CDH、CDM和CDL三组分别比GC组上升了67％、46％和41％(P＜0.05)，与CS比较无差异(P＞0.05)，提示CD可显著促进大鼠骨形成。
3 讨论3.1 糖皮质激素长期超生理剂量应用可对大鼠造成中枢毒性 临床资料显示，老年人血中糖皮质激素水平远高于成年人和青年人，长期使用糖皮质激素的患者往往伴有记忆功能障碍，因此可认为糖皮质激素与脑老化及中枢神经系统的退行性变关系密切。本实验中予大鼠超生理剂量的泼尼松灌喂3个月后观察到大鼠记忆力下降，大脑皮质和海马结构发生改变以及与衰老有关的酶含量发生改变，与临床上观察到的现象一致，提示糖皮质激素对神经系统的作用在人和大鼠身上表现相近。泼尼松长期超生理剂量应用后对大鼠造成中枢神经系统的毒性具体表现如下
3.1.1 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠三臂电迷宫正确率(ER)明显下降 GC组大鼠三臂电迷宫正确率比NS组明显下降(P＜0.01)(见表2.2)。一般来说，智力测试应该包括学习记忆力、思维力、判断力、理解力和创造力等几方面的测试，它们互相间都有牵及和影响，不易绝然分开，学习记忆力是其中一个重要基本因素，因此对其研究较多，方法也较多。三臂电迷宫法是常用的测试动物学习记忆力高低的方法，此法主要是通过观察动物面对危险时所产生的被动和主动逃避反射获得能力和再现能力来判断药物对学习记忆力的影响，在给提示和不给提示的测试中，如果用药动物正确率比非用药动物明显提高，则提示药物具有显著的益智作用，反之亦然。本实验中发现长期使用泼尼松后大鼠三臂迷宫正确率显著下降，提示泼尼松可能会抑制中枢神经系统发育，影响动物的智力发展，引起智力衰退甚至衰老的提早出现。
3.1.2 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠脑组织中MAO的含量显著上升，SOD和TchE的含量明显下降GC组大鼠脑匀浆中MAO的含量显著上升而SOD和TCHE的含量明显下降(P＜0.01)(见表2.1)。这是三种在脑神经活动中必不可少的生物酶，其在体内平衡与否可直接影响机体活动功能的衰退与否，因此这三种酶与生物体衰老之间关系很密切。关于衰老的机制有很多种说法，其中自由基学说是在1956年由D.Harman首先提出的，其认为在新陈代谢过程中产生的自由基过量会造成DNA和其他大分子损伤。自由基主要是通过引起各种生物膜中不饱和脂质发生过氧化而导致机体发生退行性变，甚至引起生物体衰老死亡，此种反应主要存在功能活跃的组织器官中，如脑、心、肝、肾等。机体对抗自由基损伤的机制主要有两种，一是对损伤大分子的修复机制，二是消除自由基机制。在体内，最有效的自由基消除剂就是SOD，它的含量降低提示体内过氧化反应明显，机体出现老化现象。在GC组中，大鼠脑匀浆中的SOD含量显著下降，提示长期超生理剂量使用泼尼松可明显加重脑内脂质过氧化进程，造成自由基大量堆积，损害了脑的活动和功能。另一方面，MAO可降解脑内的儿茶酚胺含量，使脑活动降低，因此MAO和衰老关系密切。人脑中的MAO-B含量在45岁后随年龄的增加而剧增，故MAO又称为老化相关酶，被认为是老化的标志。GC组大鼠脑匀浆中的MAO含量显著上升，提示长期使用糖皮质激素可加速脑内儿茶酚胺的降解，导致5-羟色胺及其代谢产物5-羟吲哚乙酸含量相对增加，使脑的生理活动失调，导致衰老的发生。乙酰胆碱(Ach)是最古老的递质，其主要功能是作为神经传导的化学递质，在体内的主要灭活方式是靠乙酰胆碱酯酶(AchE)的作用。GC组大鼠脑匀浆中AchE的含量下降，活力降低，同时可观察到GC组大鼠脑组织结构紊乱，神经细胞严重受损，因此可以推测泼尼松长期应用引起脑匀浆中AchE活力下降可能与胆碱能神经退行性变，导致Ach生成减少而引起对AchE的需求下降(即Ach缺乏的继发反应)所致，这与最近研究一致。另也有文献报道在Alzheimer病患者中，发现主要与识别和记忆功能有关的基底前脑中胆碱能神经元发生选择性退行性变，皮层和脑脊液中AchE活性降低；另观察到老年期痴呆病患者额叶皮层中AchE活性也明显低于正常人，与Alzheimer病患者相似，因此可以推断，长期应用糖皮质激素可损伤神经元，引起脑内神经递质合成和释放功能紊乱从而导致生物体衰老的提前出现。
3.1.3 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠海马结构发生形态学改变，特定区域单位面积神经锥体细胞数目下降，大锥体细胞发生明显核固缩性坏死脑组织切片检查发现，NS组大鼠海马CA2和CA3区交界处神经元大小分布规则，细胞结构和层次清晰，呈C状排列。与NS组相比(见表2.3)，GC组大鼠海马大锥体细胞数量下降，其中CA2和CA3区交界处362.5um长度范围内单位面积神经锥体细胞数下降9％；海马细胞结构紊乱、排列分散，胞体肿胀或皱缩，部分可见核固缩深染，甚至可见神经元坏死，大锥体细胞层中可见出现较多胶质细胞。一般情况下，神经元细胞核固缩现象极少见，而神经元细胞核发生固缩是细胞死亡前的表现，GC组大鼠海马细胞发生明显的变化提示泼尼松长期应用可造成海马神经细胞死亡或加速神经元退化，提示糖皮质激素长期应用导致的机体衰老、记忆力衰退可能与海马细胞的凋亡有关。海马结构在进化上由旧皮层(archipallium)演化而来，主要神经元是大锥体细胞，是边缘系统的重要部位，与情感行为、学习记忆等高级神经活动有关，同时又是调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)的高位中枢和应激损伤的主要靶区。研究表明，应激性海马损伤与HPA轴功能亢进互为因果关系，两者造成了慢性应激性海马损伤的恶性循环，其机制尚未明了，可能与糖皮质激素长期应用引起的细胞器退行性变和能量的大量消耗有关。在本实验中观察到长期使用泼尼松后大鼠海马CA2和CA3区交界处的神经元数量下降，胶质细胞增多，提示泼尼松长期超生理剂量应用可造成大鼠海马神经细胞组成和结构发生改变，造成与智力有关的神经活动能力下降。海马是脑内参与记忆的重要部分，其结构发生改变提示记忆功能可能下降，记忆衰退是生物体出现衰老的一个早期症状，因此海马在衰老过程中的形态学变化已经引起了学术界的高度重视。文献报道糖皮质激素损伤海马的机制可能与加速神经元内ATP消耗，干扰神经细胞代谢所致；也有学者认为海马锥体细胞损害是Alzheimer病患者记忆功能障碍的重要病理学基础，主要原因是引起了胆碱能神经元退化所致；本实验结果也显示了长期使用泼尼松可显著影响动物的反应能力，造成大鼠智力减退和衰老甚至是痴呆的提早出现。
3.1.4 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠皮层细胞排列紊乱，部分细胞发生水肿变性，分子层厚度和皮层厚度比值上升 光镜下可见NS组大鼠皮层结构清晰，细胞排列整齐，而GC组大鼠皮层结构分层尚清晰，但细胞排列紊乱，锥体细胞减少。与NS组比较，GC组大鼠大脑皮层厚度减少4％，而纹状皮质17区和18区间分子层厚度和皮层的总厚度的比值上升12％(见表2.3)，提示糖皮质激素长期超生理剂量应用可破坏和改变大鼠大脑皮层结构。一般情况下，分子层神经元较少，主要是水平细胞、星型细胞及与皮质表面平行的神经纤维，此层在皮层总厚度中的比例增加提示其它细胞层的厚度可能发生萎缩，尤其是厚度较大的外锥体细胞层和内锥体细胞层，这两层是高尔基I型神经元主要聚集部位，厚度变薄提示皮层锥体细胞可能发生萎缩，预示皮质区域所形成的信息量外传减弱，是智力受损的主要原因。
3.2 糖皮质激素长期超生理剂量应用可致大鼠骨质疏松3.2.1 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠骨小梁面积百分率减少、骨密度明显降低，分离度显著增加 本实验中GC组大鼠骨形态计量学静态参数显示GC组大鼠胫骨上段松质骨明显丢失(P＜0.01)(见表2.4)，与NS组比较，骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)减少了41.3％(P＜0.01)，骨小梁数目(Tb.N)减少31.9％(P＜0.01)，骨小梁厚度(Tb.Th)减少了14.2％(P＜0.05)，骨小梁分离度(Tb.SP)增加了58.3％(P＜0.01)，说明GC组大鼠骨小梁明显丢失、密度明显降低，分离度显著增加；％Tb.Ar是反映骨量变化的重要指标，Tb.N、Tb.Th和Tb.SP是反映骨小梁显微结构的综合指标，以上变化显示了GC组大鼠松质骨结构发生明显变化，呈现典型骨质疏松状态。
3.2.2 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠破骨细胞活性增加，骨吸收活跃在本实验骨吸收参数中，GC组大鼠单位骨小梁面积破骨细胞数(Oc.N/BV)增加236.1％(P＜0.01)，骨吸收周长百分率(％Oc.Pm)增加191.4％(P＜0.01)，提示长期超生理剂量应用泼尼松后大鼠破骨细胞活性增加，骨吸收活跃，加速了骨质溶解，此作用可能与糖皮质激素抑制肠钙吸收，增加尿钙排出量导致血钙下降而反射性引起PTH(甲状旁腺素)分泌增高，刺激破骨细胞分化活跃有关。
3.2.3 糖皮质激素长期超生理剂量应用可使大鼠单位骨组织面积的骨形成率减少从骨形态计量学动态参数结果观察(见表2.5)，反映骨转换的动态指标包括L.Pm％(荧光标记周长百分数)，MAR(骨矿化沉积率)，BFR/BS(单位长度骨小梁表面上骨形成率)，BFR/BV(单位骨小梁面积骨形成率)，BFR/TV(单位骨组织面积骨形成率)，这些指标均能反映骨形成的活力[48]BFR/BV则反映骨转换程度的高低。本实验中GC组大鼠BFA/TV降低了40％(P＜0.05)，提示单位骨组织面积的骨形成减少，％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV也有不同程度的减少，但无统计学意义(P＞0.05)。文献报道使用泼尼松4.5mg/Kg，3天一次，连续2个月可显著抑制大鼠胫骨骨形成指标中％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV和BFA/TV，本实验中泼尼松长期应用对大鼠胫骨的％L.Pm、MAR、BFR/BS和BFR/BV无明显抑制，可能与实验中泼尼松的用量和给药方法不同有关，此现象值得进一步探讨。在本实验中，采用的是泼尼松每天连续给药的方法，共12周，这种用法可使GC组大鼠的BFA/TV升高而破骨细胞数量增多，可能提示连续用药可能会引起PTH分泌增加而导致破骨细胞活性增高，反馈性刺激成骨细胞活性，造成成骨细胞成骨功能增强，促进骨的形成，这可能是造成本实验中其他动态参数变化不明显的原因，对其仍需进一步探讨。
3.3复方丹参制剂组方原理与依据淫羊藿、黄芪、白术和丹参均是具有抗衰老作用的中药，而骨质疏松是衰老的一种重要表现，因此四味中药可能具有抗骨质疏松的作用。本课题组曾对由淫羊藿、黄芪、白术三味中药制成的制剂进行抗骨质疏松症的动物实验研究，结果发现其每个单味或复方均有抗药物性骨质疏松或去势性骨质疏松的作用，其机制可能是通过增强骨重建而增加骨量。文献报道淫羊藿可通过保护性腺、抑制骨吸收和促进骨形成等途径使机体的骨代谢处在正平衡状态，体外实验也证明了淫羊藿具有促进成骨细胞增殖和分化作用，可通过调节内分泌来协调体内新陈代谢的平衡；研究认为黄芪抗衰老、增强免疫力和改善血循环保护肝肾功能的作用突出，可通过抑制骨吸收而不抑制骨形成作用来对抗去势大鼠的骨丢失；中医认为白术具有补脾益胃和中的功效，研究表明白术有促进骨髓细胞增殖作用和IL-1样作用，有较强的促进骨生长作用。糖皮质激素长期应用除可造成骨质疏松、免疫抑制、心血管疾病和消化系统损伤等不良反应外，对中枢神经系统的毒性作用突出，在临床上也见报道长期使用糖皮质激素后可导致某些患者精神失常。考虑到糖皮质激素对中枢的毒性作用明显，同时也为了能改善糖皮质激素的抗炎作用，故在原有的基础上加进丹参组成复方丹参(CD)中药制剂。丹参具有促进成骨细胞生长、改善中枢神经功能、促进免疫和抗炎作用，期望在所组成的制剂中，丹参的镇静宁神和促进记忆可对抗糖皮质激素的中枢神经系统毒性作用，而淫羊藿的性激素样作用可对抗糖皮质激素引起的性腺抑制作用；黄芪改善循环系统功能可对抗糖皮质激素的心血管系统损害；白术可对抗糖皮质激素长期应用所造成的消化系统反应。故CD的组方原则是为了最大限度减少糖皮质激素长期应用造成的不良反应。
3.3.1 复方丹参制剂可有效预防大鼠骨质疏松症实验结果提示复方丹参制剂能有效防止大鼠的骨丢失，其中以高剂量的效果较为明显，其作用机制可能与CD制剂能明显抑制泼尼松长期应用导致的大鼠骨吸收的增加，同时对骨形成有一定的促进作用有关。复方丹参制剂这种显著增加骨量的作用可能与丹参、黄芪、淫羊藿和白术四种中药的共同作用有关，文献报道①丹参可改善骨环境内部和全身的血液循环，有助于骨的营养供应，丹参还可增加血清中锌的含量而降低铜的含量，可进一步增加松质骨的形成而减少了铜对骨形成的抑制作用；②黄芪能促进胶原蛋白合成，促进成骨细胞分泌类骨质，可有效对抗糖皮质激素长期应用造成的成骨细胞功能抑制作用。③淫羊藿是传统的补肾壮阳药，也具有强壮作用，临床报道，给已经确诊的骨质疏松症患者用淫羊藿复方治疗3个月后症状明显改善，也可明显加快骨折病人骨痂的愈合和改善骨痂的排列和密度，体外实验也提示了淫羊藿水提液可抑制破骨细胞的产生而降低骨吸收以及通过刺激成骨细胞的分化而促进了骨的形成。④白术是常用的补气药，实验研究显示，白术可促进骨髓细胞增殖及具有IL-1的作用，可进一步促进成骨细胞的转化；也有报道给小鼠每天灌服白术水煎液6g/kg，连续1个月，可显著促进小鼠的体重增长和肌肉增强，白术的强壮作用明显。因此，CD制剂对泼尼松大鼠胫骨上段松质骨的作用可能是四种中药的相互协调、相互促进而有各自发挥作用所致。
3.3.2 复方丹参制剂能有效预防大鼠中枢毒性作用本研究观察到CD制剂对泼尼松长期应用所造成的大鼠其他不良反应也有部分对抗作用，具有以下几种表现(1)复方丹参制剂能有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠三臂电迷宫正确率(ER)下降的现象实验结果显示，复方丹参制剂可有效防治长期使用泼尼松所造成的大脑功能下降，与GC组相比，CDH、CDM和CDL三组大鼠的ER分别升高15％、12％和12％，比GC组明显增高(P＞0.05)，提示复方丹参制剂可有效对抗糖皮质激素长期超生理剂量应用所造成的智力衰退，提高泼尼松大鼠的学习记忆能力。
(2)复方丹参制剂可有效对抗糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠脑组织中MAO含量升高和SOD含量下降，但亦显著升高TchE的含量与GC组比较(见表3.6)，CDH、CDM和CDL三组大鼠的MAO分别下降14％、22％和44％，(P＜0.05)，SOD含量分别升高36％、44％和33％(见表3.6)，匀浆中酶含量发生明显改变(P＜0.05)，提示复方丹参制剂可有效防止泼尼松所致的脑组织酶学改变。CDH、CDM和CDL三组大鼠的TchE含量均比NS组显著升高(P＜0.05)，尤其以CDL明显，其作用需进一步探讨。
(3)复方丹参制剂可有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠海马细胞损伤复方丹参制剂三组大鼠的单位面积海马神经元计数均有上升趋势，CDH、CDM和CDL三组大鼠海马特定区域单位面积神经锥体细胞数目分别比GC组上升11％、15％和9％，镜下可见大锥体细胞排列规则，变性少，比GC组明显改善，提示复方丹参制剂可有效保护由糖皮质激素长期应用所导致的海马神经元损伤，这可能与其能有效改善糖皮质激素长期应用引起的神经细胞退行性变和降低泼尼松大鼠脑能量消耗有关。
(4)复方丹参制剂可有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠脑皮层神经细胞损害和结构改变镜下可见CDH、CDM和CDL三组大鼠大脑皮层细胞结构清晰，分子层厚度/总皮层厚度的比值下降，其中CDM和CDL两组的分子层厚度/总皮层厚度的比值比GC组显著下降(P＜0.05)，提示复方丹参制剂对糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠大脑皮质的损害有一定预防作用，但量效关系不明显。
(5)复方丹参制剂能有效预防糖皮质激素长期超生理剂量应用所致的大鼠中枢毒性作用的可能原因实验结果显示，复方丹参制剂对泼尼松长期应用造成的大鼠神经系统损伤有显著的预防作用，与GC组比较，复方丹参制剂三组大鼠的神经系统功能明显改善。复方丹参制剂产生该种作用的可能原因是①丹参可明显改善脑部血液供应以及脑缺血后大脑中单胺类物质的代谢紊乱，对神经递质和血管活性物质也有很好的调节作用，可显著改善神经肽和兴奋性氨基酸的含量以及消除脑中氧自由基的含量。②黄芪具有延年益寿、直接抗衰老作用，可以增加血中和脑中SOD的含量，而明显减少体内自由基的生成。本实验中泼尼松大鼠呈现衰老的征象，而黄芪的直接抗衰老作用应该可以对其有一定的预防作用。③淫羊藿和白术[93]均是具有抗衰老作用的药物，在体内可提高SOD的含量，有效清除代谢产生的自由基，对机体有一定的保护作用；另一方面，淫羊藿可增加脑血流量、降低脑血管阻力而白术[98]对植物神经功能有双向调节作用，两者均对神经系统有一定的保护功能。长期超生理剂量使用糖皮质激素可引起脑中神经递质含量改变，引起海马神经元变性坏死和大脑皮层结构紊乱，导致大鼠迷宫正确率明显下降，而复方丹参制剂对此有显著的预防作用，故适用于长期应用糖皮质激素所致的神经系统功能紊乱的预防。
结论4月龄SD大鼠灌喂泼尼松12周后，其不良反应主要表现为体重减轻、骨质疏松、中枢神经系统功能减退以及免疫系统和肝功能受损，睾丸、胸腺及肾上腺萎缩，血脂血糖升高而HDL含量降低等。
复方丹参制剂能有效对抗泼尼松长期超生理剂量应用所致的大鼠体重减轻；可有效对抗泼尼松所致的大鼠骨生长抑制和骨质疏松症，作用随药物浓度的增加而增强，其作用可能与其协调成骨细胞和破骨细胞活性有关；对抗泼尼松长期超生理剂量应用造成的大鼠中枢神经系统不良反应及高CH、高Glu和低HDL血症以及肾上腺、胸腺和睾丸萎缩有一定的对抗作用，因其可从多方面对抗泼尼松长期超生理剂量应用所致的不良反应，且毒性较低。
研究表明本制剂能提高泼尼松大鼠的智力，有效防治泼尼松所造成的海马神经元的损伤以及降低与衰老相关酶的含量，对骨质疏松症也有良好的预防作用。因此，本制剂可用于提高机体记忆能力，预防智力衰退和延缓衰老的发生，尤其可有效预防长期超生理剂量应用糖皮质激素后的脑损伤和骨质疏松。
权利要求
1.一种具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，其特征是该复方制剂是由中药丹参、淫羊霍、黄芪和白术提取物所组成。
2.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，该复方制剂中的中药提取物是指按下述工艺制备的提取物丹参、淫羊霍、黄芪和白术粉碎成粉末，加75～95％乙醇浸泡24小时，过滤，回收乙醇，得醇提物备用，药渣再加水煎煮3次，合并三次滤液，滤过，滤液浓缩至适量，加入前述的醇提物，低温干燥，粉碎，加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
3.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，该复方制剂中的中药提取物是指按下述工艺制备的提取物丹参、淫羊霍、黄芪和白术生药材以数倍水浸泡后煎煮，重复3次，合并滤液浓缩，加3倍乙醇沉淀，回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到中药总提取物。中药总提取物加适量辅料，制成颗粒，压片，包糖衣或装胶囊，即得。
4.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，其特征是该复方制剂含有丹参素和丹参酮。
5.如权利要求1所述的具有抗衰老，防治骨质疏松和脑损害的复方制剂，其特征是该复方制剂含有淫羊藿总黄酮。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗衰老，防治糖皮质激素长期超生理剂量应用后所致的骨质疏松和脑损害的复方制剂，该制剂由丹参、淫羊藿、黄芪和白术组成，该复方制剂中丹参、淫羊藿、黄芪和白术均具有抗衰老作用，可共同改善中枢神经功能以及减少骨丢失，有效预防大剂量糖皮质激素长期超生理剂量应用时所产生的不良反应。长期超生理剂量应用糖皮质激素泼尼松可造成智力衰退精神异常甚至脑萎缩性痴呆、骨质疏松症等，研究表明本制剂能提高泼尼松大鼠的智力，有效防治泼尼松所造成的海马神经元的损伤以及降低与衰老相关酶的含量，对骨质疏松症也有良好的预防作用。因此，本制剂可用于提高机体记忆能力，预防智力衰退和延缓衰老的发生，尤其可有效预防长期超生理剂量应用糖皮质激素后的脑损伤和骨质疏松。
文档编号A61P19/10GK1565582SQ03145180
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月2日 优先权日2003年7月2日
发明者邹丽宜, 吴铁, 崔燎, 刘钰瑜, 陈方 申请人:广东医学院
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