一种防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂的制作方法
专利名称：一种防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂，该制剂由人参与维甲酸组成，对由随年龄增长而发生的和由日光照射所致的皮肤衰老有良好的预防和治疗作用，也可用于皮肤美容，保持皮肤处于年轻状态。
健康和长寿是生命科学永恒的主题。随着世界人口的加速老龄化，抗衰老研究已成为迅速崛起的一门应用科学。为开发研究抗衰老药物，提高生命质量，延缓机体衰老，延长健康寿命，目前抗衰老研究已进入机体。组织，细胞，分子，基因等全方位、多层次、多因素研究的新阶段。衰老是生物体在生命周期中随年龄增长而发生的全身各组织、器官减退和稳态功能下降的过程。皮肤是机体衰老过程中最易显露的器官。人的皮肤衰老不仅有损于美容，且与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、角化棘皮瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生也有着病因学的关系，因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。
皮肤衰老是内源性衰老和外源性环境因素共同作用的结果。虽然在某些程度上，环境因素对暴露部位的皮肤衰老起着重要作用，但内源性生理衰老所起的作用不容忽视。环境因素是在内源性生理衰老的基出上起加速或延缓衰老的作用。部位不同，二因素作用的侧重点各不相同，如遮光部位的皮肤主要以内源性生理特衰老因素为主，暴露部位则主要是环境因素损伤的结果，二者的临床和组织病理表现均不相同，但就整体而言，任何部位的皮肤衰老都是二因素共同作用的结果。
近几年来，国内外对维甲酸预防和延缓皮肤衰老的作用进行了广泛的研究，已证实有比较满意的效果。维甲酸是细胞增殖、分化、基因表达强有力的生物调节剂，对表皮和真皮有着显著的影响。Kligman对光老化小鼠模型用全反式维甲酸外用进行实验，发现在第5周和第10周的活检标本中，维甲酸组胶原层的厚度是赋形剂小鼠皮肤的2倍，其厚度与维甲酸应用的时间和剂量成正比，新形成的胶原经组织化学和超微结构检查证明与正常组组胶原相同，电镜下观察可见胶原束与皮面平行，排成正常的“胶合板样”，纤维母细胞众多，具有代谢活跃的形态特征，且皮肤内血管丰富，分枝较多，说明维甲酸提高了纤维母细胞和血管内皮细胞的活性。临床研究也表明，局部应用维甲酸可增加表皮角朊细胞的分化和角质透明颗粒的形成，使角朊细胞内聚性和黑素细胞活力降低，并抑制角质形成，使角质层变薄，还增加粘蛋白的合成，使胞间基质丰富，并可改善紫外线引起的弹力纤维蛋白变性，增加新胶原蛋白的形成，使微血管再生，血流量增加，故长期外用可明显减少光老化皮肤的临床症状，使皮肤表面的细小皱纹得到改善，皮肤光滑亮泽，色斑减淡，预防和缓解老年斑、日光性角化及皮肤癌的发生。
人参是传统的抗衰老中药，已证明人参具有广泛开的药理作用，能提高细胞寿命，维持衰老细胞的生存能力，促进DNA、RNA和蛋白质的合成，可与体内的自由基结合，减少脂褐素在体内的沉积等，具有较强的抗自由基作用。研究表明，灌服人参后，可明显的增加小鼠的皮肤中羟脯氨酸的含量。本实验用2.5％人参液外涂皮肤衰老模型小鼠的皮肤后发现其表皮轻度增厚，胶原合成较基质组外用组有所增厚，但不及正常小鼠皮肤胶原厚度，而弹力纤维含量与基质组比较无明显差异。SOD检测则较基质组显著升高，达正常组水平，MDA含量与基质组无明显减少，皮肤羟脯氨酸含量较基质组无明显增多，说明人参液外用未能呈现明显的抗皮肤衰老作用。
为了解决皮肤抗衰老问题，本发明采用了人参和维甲酸组成复方外用制剂，用于实验研究，取得了明显的疗效，初步解决了皮肤衰老的预防和治疗问题，该产品还具有保健美容的功效。
解决这一任务的途径是这样实现的，取中药人参和维甲酸通过下述工艺制作成霜剂用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配90g基质，取人参液和维甲酸溶解后，在基质冷至50C时加入，搅拌均匀即得。
配制例一取2.5％的人参液溶解于蒸馏水10ml，维甲酸10mg加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参液，混匀即得。
配制例二取人参皂甙2.5g溶于10ml的水中，维甲酸5mg，加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参皂甙液，混匀即得。
研究表明，本发明的人参维甲酸霜，人参可采用吉林红参，生晒参，花旗参，其配制浓度0.5％～10％较好，其最佳浓度为2％～5％。人参皂苷，人参茎叶皂苷也可代替人参液，其配制浓度0.1％～5％较好，其最佳浓度为0.5％～2.5％。
研究表明，本发明的人参维甲酸霜，维甲酸配制浓度1mg％～50mg％较好，其最佳浓度为2mg％～10mg％。
实施例一人参维甲酸霜对D-半乳糖加光照建立小鼠皮肤衰老模型的药效学观察1.材料和方法1.1实验动物及饲养条件选用3月龄雌性昆明种小鼠220只(广东医学院实验动物中心提供)，清洁级，平均体重20±2g，10只一笼饲养，鼠笼规格为55×35×20cm3，保证动物有足够的活动空间，使用标准饲料(实验动物中心提供)，其中钙含量为1.33％，磷含量为0.95％，所有动物自由摄食、摄水，在温度25℃～28℃，湿度60％～80％，通风良好的条件下饲养。1.2.药物与动物分组组号 数量 方法 给药方案正常组 20皮下注射生理盐水基质组 20光照+注射D-半乳糖+外用基质 2mg/cm2.d-1维甲酸组 20光照+注射D-半乳糖+外用维甲酸霜 2mg/cm2.d-1人参皂甙组 20光照+注射D-半乳糖+外用人参霜 2mg/cm2.d-1维生素E组20光照+注射D-半乳糖+外用VitE霜 2mg/cm2.d-1维甲酸+人参组20光照+注射D-半乳糖+外用维甲酸人参霜 2mg/cm2.d-11.3实验仪器设备仪器产地AE-240型电子分析天平 Mettler-Toledo仪器(上海)有限公司752型紫外分光光度计 上海第三分析仪器厂荧光光度计上海精密仪器厂紫外线强度计 上海顾村电光仪器厂JB-2型恒温磁力搅拌器 上海雷磁仪器厂新泾分厂SHH.W21.600三用电热恒温水浴箱子 天津市华北实验仪器有限公司DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱子 上海医用恒温设备厂HITACHT55P-72超速离心机 日本HITACHT公司半自动图象数字化分析仪包括光镜和荧光显微镜Nikon日本计算机 Macintosh IICi，美国苹果公司产品数字化板报 SummaSketchII plusKSS Image Analysis(version2.0) KSS Scientific consultants，UT USALEICA MPS30荧光-光学显微镜及显微照相机 德国LEICA公司制造WFX-ID原子吸收分光光度计 北京第二光学仪器厂生产JI-80-2B台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造华凌电冰箱 BCD-205WE广东1.4实验方法1.4.1 D-半乳糖制造亚急性衰老模型的建立每日颈背皮下注射12.5％D-半乳糖0.24ml/30g，给药标示量为80mgkg-1.d-1，对照组注射等体积的生理盐水连续造模42天。光老化模型制作方法如下光源紫外线灯管二只，上海第三光源厂生产，功率，40W，含UVC(200～290nm)和少量UVB，二只灯管平行排列；浙江华兴灯具厂生产的金属卤素灯一盏，功率500W，最强光谱为360nm，其中UVA占70％。
方法每次照射前用15％的硫化钠糊脱去小鼠背部毛，暴露约定俗成3*5cm2的皮肤，初次正式照射前，先测定最小红斑量及光照射强度，在距皮肤40cm的高度UVC2h，然后卤素灯照射1.5h，每次剂量UVC3.7J/cm2，UVA5.04J/cm2，每二天照射一次，共42天。1.4.2涂药方法在光照+半乳糖造模的同时，给药组外用药涂抹，每次2mg，均匀涂抹于暴光部位，每日一次，共42天。1.4.3标本取材方法各组小鼠在杀死前断尾取血，拟测定血中的CAT、GSH-PX、SOD之用；实验终止时，所有动物称重，用硫化钠糊背部脱毛，摘眼球放血处死，收集血液离心，分离血清，拟测定SOD、MDA用；取背部正中皮肤1*1cm2大小，迅速放入10％中性福尔马林液中固定，作组织切片进行组织形态学定量分析；2实验结果2.1皮肤组织病理学形态观察及计算机图象定量分析1.皮肤组织病理学形态观察表皮结构的变化正常组表皮较薄，角质层仅0.001mm，由3～5层细胞组成，棘细胞呈散在分布，基底细胞排列整齐，基底膜带较平坦。(2)D-半乳糖组表皮变薄，细胞层数变少，基底细胞胞体变小。(3)光照组表皮轻度增厚，基底细胞变得不典型，极性消失，大小不等，部分细胞核变大，深染，提示代谢旺盛。(4)模型组可见表皮变得更加菲薄，细胞排列散乱，基底细胞极性消失，细胞大小不一。(5)维甲酸组表皮较正常组和模型组显著增厚，细胞层数增多，可达7～12层，排列有序，细胞间质丰富，基底细胞胞体增大，呈立方形，排列规整，提示维甲酸有显著的促进基底细胞增殖作用。(6)人参外用组表皮较模型组轻度增厚，但不及正常表皮厚度，提示外用人参皂甙有轻微的促进表皮增殖的作用，但不显著。(7)维生素E外用组表皮较正常组和模型组显著增厚，提示维生素E外用可明显促进表皮细胞增殖。(8)维甲酸人参霜较维甲酸单用更明显地促进表皮增厚，使表皮细胞层数增至10～12层，胞间基质丰富，基底细胞胞体较大，排列更加规整，提示二者联用对表皮细胞的增殖有明显的同作用。
2.小鼠皮肤表皮厚度的计算机图象定量分析计算机图象定量分析小鼠表皮厚度变化变化的结果见表1表1小鼠皮肤表皮厚度计算机图象定量分析变化(n＝20)组别 表皮厚度(μm) 变化率基础组 27.9±3.6D-半乳糖(H) 16.6±4.3*40.5％光照组 29.1±5.9 4％D-半乳糖+光照组 13.7±4.6**▲△△50.8％维甲酸霜组 50.4±5.4**▲80％ 223％人参霜组 23.6±3.4▲ -15％ 51％
维生素E霜组 40.7±4.6**▲ 45％ 160％维甲酸人参霜组62.1±6 9**▲ 122％ 298％*示与基础组比较*P＜0.05**P＜0.01；▲示与D-半乳糖比较；△示与光照组比较表1显示(1)D-半乳糖组表皮厚度较正常组明显变薄，厚度减少了40.5％，差异有显著性(P＜0.01)。(2)光照组与正常组比较，表皮厚度稍有增加，但差别无显著性(P＞0.05)。(3)模型组与D-半乳糖组比较，表皮厚度明显减少，减少了17％，差异有显著性(P＜0.05)。(4)模型组与光照组相比，厚度显著减少，有非常显著性差异(P＜0.001)。提示光照后加速了D-半乳糖造成的小鼠细胞代谢紊乱，使皮肤衰老进一步加深。(5)维甲酸霜组较基础组和D-半乳糖+光照组基质组表皮厚度分别增加了80％、223％，均有显著差别(P＜0.01)(P＜0.01)。(6)人参霜组较D-半乳糖+光照模型组稍有增厚，但不及正常组厚度，无统计学差别。(7)维生素E霜组较正常组和D-半乳糖+光照组基质组表皮厚度分别增加了45％、160％，均有显著性差别(P＜0.01)(P＜0.01)，但不及维甲酸霜组外用的厚度。(8)维甲酸人参霜组较正常组和D-半乳糖+光照组基质组表皮厚度分别增加了122％、298％，差别显著，分别为(P＜0.0001)(P＜0.0001)，比维生素E霜组增厚更明显。2.2小鼠真皮弹力纤维间苯二酚-品红染色形态学观察1、小鼠真皮弹力纤维间苯二酚-品红染色形态学观察小鼠真皮弹力纤维间苯二酚-品红染色形态学观察显示(1)正常弹力纤维较细长，有轻微弯曲度，走向与皮面平行，排列稀疏，在毛囊周围呈环形排列。(2)D-半乳糖组弹力纤维减少，乳头层减少更明显。(3)光照组弹力纤维显著增粗、增多，堆积，部分卷曲，排列蓬乱不规则，附近有纤细的弹力纤维出现。(4)D-半乳糖+光照组模型组真皮乳头层弹力纤维少，网状层纤维数量少，但粗大，卷曲，排列不规则。(5)维甲酸霜组较正常组和模型组弹力纤维显著增多，特别是乳头层有众多纤细的弹力纤维，网状层弹力纤维增多、增粗，提示维甲酸霜促进了成纤维细胞的活性，合成了新的弹力纤维。(6)人参霜组、VitE霜组较模型组稍增多，但无统计学意义，说明人参霜组、VitE霜组外用不引起弹力纤维的太大改变。(7)维甲酸人参霜组弹力纤维较维甲酸组及模型组显著减少，提示维甲酸与人参皂甙可能同抑制了成纤维细胞合成弹力纤维，使之向合成胶原纤维转变。
2、小鼠真皮弹力纤维计算机图象定量分析小鼠真皮弹力纤维面积的计算机图象定量分析结果见表2表2.小鼠真皮弹力纤维面积的计算机图象定量分析x±s(n＝20)组别 真皮弹力纤维面积(μm2) 变化率基础组 899.7±70.6D-半乳糖(H)635.4±65.4**29％光照组 1257.3±78.7*40％D-半乳糖+光照组826.4±65.3△ 33％维甲酸霜组 1024.4±85.3*▲▲ 14％ 24％人参霜组 847.0±76.2 -5％ 2％维生素E霜组836.3±35.46％ -6％ +1％维甲酸人参霜组 570.0±45.4**▲▲ -37％ -31％*示与Basal比较*P＜0.05**P＜0.01；▲示与D-galactose比较；△示与UV比较由表2可见(1)D-半乳糖组弹力纤维总面积较正常组减少，减少了29％，差异有非常显著性(P＜0.01)。(2)光照组弹力纤维的总面积较正常组显著增多，增加了40％，差异有显著性(P＜0.05)，提示光照作为一种刺激因素诱导了成纤维细胞的活性，促进了弹力纤维的合成。(3)模型组与光照组相比，弹力纤维显著减少(p＜0.05)。提示D-半乳糖引起的代谢障碍引起了细胞的活性降低，抵消了光照引起的增殖作用。(4)维甲酸组较正常组和基质组弹力纤维显著增多，分别增多了14％、24％，差异有显著性(P＜0.05)(P＜0.01)。(5)人参组、VitE组较基质组无明显改变(P＞0.05)。维甲酸加人参皂甙联用较正常组、基质组、维甲酸组显著减少了37％、31％、45％，可能联用改变了成纤维细胞合成弹力纤维的功能。2.3真皮胶原纤维染色形态学观察及计算机图象定量分析
1、真皮胶原纤维形态学观察真皮胶原纤维形态学观察可见(1)正常组胶原纤维束细长，胞体丰富，呈束状排列，走向与皮面平行，呈波纹状，在毛囊周围纤维纤细且排列疏松。(2)光照组真皮浅层胶原纤维纤细，着色较淡，网状层纤维束较粗大，着色深染，成纤维细胞增多，有炎细胞浸润，提示成熟胶原纤维减少。(3)D-半乳糖组胶原束细长，走向平直。胞体小。(4)模型组真皮浅层胶原纤维染色稍淡，胶原束较细，网状层纤维束粗大，炎细胞较度浸润。(5)维甲酸霜组较正常组、基质组的胶原层显著增厚，胶原束排列致密，规整，与皮面平行，呈波纹状，中间有丰富的成纤维细胞和小血管。(6)人参霜组较基质组胶原增厚，但不及正常组胶原丰富。(7)VitE霜组较基质组显著增厚，超过了正常组但不及维甲酸霜组，胶原束排列不及维甲酸组整齐。(4)维甲酸人参霜组较维甲酸组胶原层更为丰富，胶原束排列更为致密、规整，中间有丰富的成纤维细胞和小血管。提示维甲酸与人参皂甙有同作用。
2、真皮胶原纤维厚度的计算机图象定量分析真皮胶原纤维厚度的计算机图象定量分析见表3表3真皮胶原纤维厚度的计算机图象定量分析x±s(n＝20)Group dermis depth(μm)Change基础组 842.0±64.3D-半乳糖(H)624.5±48.5**25％光照组 734.1±59.3412％D-半乳糖+光照组603.7±47.52△ 17％维甲酸组 1472.4±75.9**▲▲ +75％ +119％人参皂甙组 810.7±57.4 +3％+18％维生素E霜组1286.5±68.7**▲▲ +52％ +19％维甲酸人参霜组 1687.3±79.6**▲▲ +99％ +150％*示与Basal比较*P＜0.05**P＜0.01；▲示与D-galactose比较；△示与UV比较表3示(1)D-半乳糖组胶原厚度较正常组显著变薄，厚度减少了25％，有非常显著性差异(P＜0.01)，提示代谢紊乱抑制了成纤维细胞合成胶原蛋白。(2)光照组胶原厚度较正常组比较也变薄，减少了12％，差异有显著性(P＜0.05)，提示光照使胶原合成和代谢发生了改变，胶原层变薄。(3)模型组较光照组胶原厚度变薄，降低了17％，结果有显著性差异(P＜0.05)提示光照加D-半乳糖加剧了皮肤细胞的损伤。(4)维甲酸组较基质组、正常组胶原厚度显著增多，分别增加了75％、119％，有显著性差异(P＜0.05)。(5)人参组较基质组胶原增加了18％，但差异无显著性，提示人参外用促进皮肤胶原合成的作用不明显。(6)VitE组较正常组和基质组显著增加52％、91％(P＜0.01)，提示外用VitE有显著的促进胶原合成的作用。(7)维甲酸与人参联用胶原厚度较维甲酸组明显增加，有显著性差异(P＜0.05)，提示维甲酸与人参联用更加促进了胶原合成，二者有明显的协同作用。3.讨论3.1 UVC加金属卤素灯照射能快而深入的造成小鼠皮肤的光损伤目前光老化研究中常用的光源是中波UVB(290～320nm)，长期照射可使无毛小鼠产生类似于人皮肤光老化的改变。Kligman等应用UVB+IR长期照射豚鼠可使真皮弹力纤维增生，胶原发生改变；方家磷用氙灯加金属卤素灯长期照射豚鼠均可导致类似人光老化的皮肤特征表皮轻度增厚，真皮弹力纤维增生，成熟佼原纤维下降，网状纤维增多，新生佼原合成增多，炎症反应增强等表现。
光线为一连续的电磁辐射波，波长越短，能量越大，UVC的能量在紫外线中最强，但穿透力不强，仅0.01mm，一般不能透过大气层到达地面，日光光中能穿透大气层到达地面的是UVB、UVA和可见光，红外线，引去人光老化的主要是UVA、UVB，故人们常用此作人工光源建立光老化模型进行研究。
考虑到UVC能量大，对生命细胞的杀伤力最强，造成组织光损伤快而明显，本实验采用UVC灯作光源，由于UVC穿透力差，只能作用于表皮和真皮浅层，故在用UVC照射后，又用金属卤素灯(UVA占70％)加强光损伤的深度，这样联合照射能快速而深入地造成小鼠皮肤光损伤。又因为小鼠表皮非常薄，仅0.01mm，黑素细胞后少，用硫化钠糊脱去毛及部分角质层后，更有利于光线和药物的透入，使皮肤对光线更敏感，这在本实验中也得到了证实。照射5个红斑量后，皮肤红斑水肿明显，10天后皮肤明显干燥、粗糙、脱屑、生素沉着，照射42天后组织切片观察表皮轻度增厚，真皮弹力纤维增多粗大，成熟胶原纤维明显减少，新生的胶原纤维增多，炎症细胞浸润明显，小鼠耳部外观及组织切片上亦有同样表现，见图。本实验结果证实UVC+UVA可快速而深入地造成小鼠皮肤的光损伤。3.2. D-半乳糖造成小鼠皮肤细胞的衰老本实验结果表明，D-半乳糖组表皮较正常组变薄，细胞层数减少，细胞变小；胶原层厚度变薄，胶原束增粗老化，排列疏松；弹力纤维减少，成纤维细胞减少，无炎细胞浸润，说明基底细胞和成纤维细胞活性降低，合成功能下降，细胞处于一种“萎缩”状态。抗衰老生化指标也显示，模型组皮肤中SOD活力下降％，MDA含量升高％，羟脯氨酸显著下降，表明皮肤细胞出现了衰老。
本实验结果提示，D-半乳糖造成小鼠的亚急性衰老，是由于胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，该物质不能在细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响细胞正常渗透压，导致细胞代谢紊乱所致，同样，也造成了皮肤细胞的代谢障碍，使皮肤细胞呈现衰老表现。Vlassara也报告了一种解释衰老与糖尿病及多种并发症的相关机制，认为糖尿病与衰老有共同的机制即非酶蛋白的高度糖基化，他发现蛋白高度糖基化形成的不可逆终产物(ACT)可在胶原蛋白、基底膜蛋白中不断积累，导致多系统的衰老变化，如皮肤等，此机理在本实验结果中也得到了证实。
3.3光照加D-半乳糖可明显加剧小鼠皮肤老化的进程由于年轻动物组织细胞有强大的修复功能，用之制作光老化模型需时长，照射强度大，用作抗衰老药物研究不能良好的反应药物的效果，若用老年鼠又因个体差异大，所受影响因素多，体质差，不易获得，故本实验采用D-半乳糖造成皮肤细胞的衰老状态，又用光照造成皮肤细胞的光损伤，进一步加剧了皮肤的衰老。
众多研究表明，UVB照射皮肤早期，表皮细胞受到UV的刺激，基底细胞增殖、分化活跃，表皮层增厚，真皮浅层弹力纤维随胶原纤维减少而产生，提示轻度受损的成纤维细胞由生成腋原蛋白转入合成弹力蛋白；中后期，弹力纤维进一步增生，变粗，同时伴有网状纤维增生，示UV造成真皮损伤过程中胶原合成增加，这可能是成纤维细胞受UV照射后改变其因表型的结果；晚期呈萎缩状态。本实验光照组也出现了类似的组织学变化，其作用机理可能是光照作为一种损伤刺激最早损害部位可能是调节SOD和CAT基因，使二者合成减少，致使自由基积聚，诱导DNA的氧化破坏和交联，造成DNA复制错误，核苷酸辅酶破坏，含巯基酶失活，继而引起mRNA转录的改变，照射早期由合成胶原纤维转而合成弹力纤维，中期网状纤维增生，新合成胶原纤维增多，又因UV引起炎症浸润，浸润的Mo、中性粒细胞释放蛋白水解酶，使成熟胶原进一步减少，整体胶原即由I型向III型胶原转变；另外真皮弹力纤维因吸收UV而产生弹力蛋白变性，纤维增粗，聚集成团，呈现光老化的增生表现，晚期则呈现“萎缩”状态。
本实验用D-半乳糖造成小鼠皮肤衰老又用光照造成皮肤的光损伤，可见表皮显著变薄，较D-半乳糖组和光照组表皮更菲薄，表皮细胞层数减少，基底细胞大小不均，排列疏松紊乱，极性消失；真皮厚度变薄，胶原层纤维减少，着色较深，说明新生胶原不多；弹力纤维增粗，堆积，排列不规则，但新生弹力纤维不多；炎症浸润不明显。抗衰老指标显示皮肤SOD活性较D-半乳糖组和光照组均显著降低，MDA显著增加，皮肤羟脯氨酸含量较D-半乳糖组和光照组均显著减少(羟脯氨酸也是检测皮肤衰老程度的一个敏感指标)，这些指标说明D-半乳糖加光照显著地加速了皮肤衰老，比单用光照或单用D-半乳糖更快而明显地加剧了皮肤的衰老。可能的机制是光照损害了调节SOD和CAT基因，使二者合成减少，致使皮肤中的SOD、CAT等抗氧化酶类进一步减少，皮肤中自由基浓度增高，加剧了细胞的老化，又由于皮肤细胞处于代谢紊乱，即“老化”状态，不能对光线的刺激产生过强的反应，故皮肤不表现光老化的“增生”状态而呈现更为衰老的表现。
本实验采用UVC+UVA+D-半乳糖联合应用制造皮肤衰老模型还属国内外首创，该模型组织切片观测可使表皮变薄，真皮老化变薄，胶原减少，排列疏松，弹力纤维增粗、变性、堆积；计算机图象分析系统测定表皮厚度、胶原厚度、弹力纤维含量均较单用D-半乳糖造成的亚急性衰老模型和单纯光照所引起的光损伤均显示更为严重的皮肤衰老表现。皮肤衰老生化指标也充分证明了这个结论。因此，该模型为研究皮肤衰老及相关疾病的发生机制，进行药物筛选，评价药物疗效及作用机制提供了一个快速、简单易行、方法可靠的工具。
3.4.人参皂甙、维甲酸、VitE外用抗皮肤衰老研究为检测该皮肤衰老模型的可靠性，我们选择了人参皂甙、维甲酸、VitE外用进行抗皮肤衰老的研究。本实验设计了人参外用组、维甲酸外用组、VitE外用组、人参维甲酸联用组及单纯基质组，通过皮肤组织切片图象分析和皮肤各生化指标的测定来观察这些药物的抗皮肤衰老效果。3.4.1维甲酸外用有显著的抗皮肤衰老作用近几年来，国内外对维甲酸预防和延缓皮肤衰老的作用进行了广泛的研究，已证实有比较满意的效果。维甲酸是细胞增殖、分化、基因表达强有力的生物调节剂，对表皮和真皮有着显著的影响。Kligman对光老化小鼠模型用全反式维甲酸外用进行实验，发现在第5周和第10周的活检标本中，维甲酸组胶原层的厚度是赋形剂小鼠皮肤的2倍，其厚度与维甲酸应用的时间和剂量成正比，新形成的胶原经组织化学和超微结构检查证明与正常组胶原相同，电镜下观察可见胶原束与皮面平行，排成正常的“胶合板样”，纤维母细胞众多，具有代谢活跃的形态特征，且皮肤内血管丰富，分枝较多，说明维甲酸提高了纤维母细胞和血管内皮细胞的活性。临床研究也表明，局部应用维甲酸可增加表皮角角朊细胞的分化和角质透明颗粒的形成，使角朊细胞内聚性和黑素细胞活力降低，并抑制角质形成，使角质层变薄，还增加粘蛋白的合成，使胞间基质丰富，并可改善紫外线引起的弹力纤维蛋白变性，增加新胶原蛋白的形成，使微血管再生，血流量增加，故长期外用可明显减少光老化皮肤的临床症状，使皮肤表面的细小皱纹得到改善，皮肤光滑亮泽，色斑减淡，预防和缓解老年斑、日光性角化及皮肤癌的发生。
对维甲酸的作用机理，Gilchrest进行了比较深入的研究，结果显示，维甲酸经皮吸收后到达靶器官，通过与特定的膜受体结合或细胞的摄粒作用穿过胞膜，在胞质内与细胞的维甲酸受体结合蛋白(CRABP)结合，CRABP的作用可能有二方面即可将维甲酸运送到胞核，触发维甲酸对细胞活动的系列作用，同时，又控制游离的维甲酸进入胞核的水平，从而限制了维甲酸对细胞活动的影响，维甲酸进入细胞核后，与一种维甲酸受体结合，形成复合物，与DNA上特定的RA应答因子结合，并调节特定基因的转录，表达各种相关产物。
本实验结果表明，维甲酸可明显增加表皮和胶原层的厚度，使细胞层数增多，细胞排列规整，胞间基质丰富，胶原层显著增厚，排列致密有序，与皮面平行，呈波纹状，其间成纤维细胞丰富，血管增多，新生纤细的弹力纤维明显增多。抗衰老生化指标检测，维甲酸外用可明显升高SOD活性，降低MDA含量，显著增加皮肤羟脯氨酸的含量，说明维甲酸外用确能使衰老皮肤呈现年轻化的表现，与前人的报导相同。维甲酸改善D-半乳糖加光照所致的皮肤衰老状态，可能是维甲酸激活了D-半乳糖造成的衰老细胞的活性，促进了基底细胞和成纤维细胞的分裂、增殖，修复了光损伤而呈现出年青化的表现。致于这种刺激细胞的增殖活性是否具有持久的抗衰老作用，还有待进一步研究。3.4.2 人参霜外用抗皮肤衰老作用不明显人参是传统的抗衰老中药，已证明人参具有广泛开的药理作用，能提高细胞寿命，维持衰老细胞的生存能力，促进DNA、RNA和蛋白质的合成，可与体内的自由基结合，减少脂褐素在体内的沉积等，具有较强的抗自由基作用。研究表明，灌服人参后，可明显的增加小鼠的皮肤中羟脯氨酸的含量，但对人参皂甙外用未见报导。本实验用2.5％人参霜外涂皮肤衰老模型小鼠的皮肤后发现其表皮轻度增厚，胶原合成较基质组外用组有所增厚，但不及正常小鼠皮肤胶原厚度，而弹力纤维含量与基质组比较无明显差异。SOD检测则较基质组显著升高，达正常组水平，MDA含量与基质组无明显减少，皮肤羟脯氨酸含量较基质组无明显增多，说明人参皂甙外用未能呈现明显的抗皮肤衰老作用，可能与人参皂甙分子量较大，透皮量较少有关，致于透皮量。透皮机理如何，还有待进一步研究。3.4.3维生素E外用有抗皮肤衰老作用维生素E是公认的抗氧化剂，可抑制生物膜中脂质过氧化过程，有一定的抗衰老作用，大剂量可抑制胶原酶的活性，并能改善结缔组织的代谢，改善微循环等作用。研究表明，活性氧基和氧自由基在皮肤光损伤、光老化及光致癌中起重要作用，紫外线照射后皮肤酶和非酶性抗氧化剂明显降低，采用自由基清除剂的抗氧化剂补充治疗可以防止皮肤氧化性损伤。Bisseett等人证明用抗氧化剂生育酚局部外用可防止紫外线诱导的皮肤急慢性光损伤，其机理可能是抗氧化剂能有效地抑制光损伤的脂质过氧化作用和聚酰胺的产生及表皮鸟氨酸羟羧酶的合成从而改善了皮肤光损伤细胞的功能，减缓了皮肤细胞衰老的发生发展，本实验结果也佐证了这个论点。本实验在皮肤衰老模型的基础上，用2.5％维生素E霜外用与基质组(单纯霜剂)相比，维生素E组表皮厚度明显增厚，细胞层数增多，基底细胞数排列规整，胞体丰满，胶原层较基质组明显增厚，且有较多的成纤维细胞和毛细血管，弹力纤维与基质组相当，说明成纤维细胞以合成胶原蛋白为主，皮肤SOD检测较基质组明显升高，MDA降低明显，羟脯氨酸含量较基质组显著升高，达正常皮肤水平，说明VitE确有抗皮肤衰老作用，但效果不及维甲酸外用组。3.4.4人参维甲酸霜对抗皮肤衰老具有良好的作用上述人参霜外用抗皮肤衰老作用不明显，但与维甲酸联用后则表现为明显的协同作用。本实验结果显示，人参维甲酸霜较维甲酸组表皮厚度及胶原层明显增厚，表皮细胞层数更多，细胞间基质更丰富，胶原束排列更规整，弹力纤维却明显减少，SOD活性在各实验组中最高，而MDA含量则较低，皮肤羟脯氨酸含量最高，说明人参维甲酸霜较单用具有更好的抗皮肤衰老，机理可能是维甲酸是一种角质剥脱剂，可抑制张力原纤维的合成，减少角化细胞间的接触，从而使角质层细胞易溶解，间隙变宽，减少了屏障作用，从而促进了人参的透皮吸收量而发挥人参的抗衰老作用，其协同作用机制还需进一步探讨。
权利要求
1.一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂人参维甲酸霜，其特征是该复方制剂是由中药人参与维甲酸组成。
2.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该复方制剂中的中药人参是指人参的提取物，其配制浓度0.5％～10％较好，其最佳浓度为2％～5％。
3.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该复方制剂中的维甲酸配制浓度为1mg％～50mg％较好，其最佳浓度为2mg％～10mg％。
4.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该复方制剂中的中药人参是指人参皂苷，人参茎叶皂苷，其配制浓度0.1％～5％较好，其最佳浓度为0.5％～2.5％。
5.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该霜剂的制备工艺是取2.5％的人参液溶解于蒸馏水10ml，维甲酸10mg加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参液，混匀即得。
6.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该霜剂的制备工艺是取人参皂甙2.5g溶于10ml的水中，维甲酸5mg，加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参皂甙液，混匀即得。
全文摘要
本发明公开了一种防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂人参维甲酸霜，该制剂由人参与维甲酸组成，对由随年龄增长而发生和由日光照射所致的皮肤衰老有良好的预防和治疗作用，也可用于皮肤美容，保持皮肤处于年轻状态。衰老是生物体在生命周期中随年龄增长而发生的全身各组织、器官减退和稳态功能下降的过程。皮肤是机体衰老过程中最易显露的器官。人的皮肤衰老不仅有损于美容，且与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、角化棘皮瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生也有着病因学的关系，因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。为了解决皮肤抗衰老问题，本发明采用了人参和维甲酸组成复方外用制剂，用于实验研究，取得了明显的疗效，初步解决了皮肤衰老的预防和治疗问题，该产品还具有保健美容的功效，可用于皮肤美容，保持皮肤处于年轻状态。
文档编号A61K31/19GK1480133SQ0314557
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月7日 优先权日2003年7月7日
发明者吴铁, 王红丽, 吴 铁 申请人:广东医学院
技术领域：
本发明涉及一种防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂，该制剂由人参与维甲酸组成，对由随年龄增长而发生的和由日光照射所致的皮肤衰老有良好的预防和治疗作用，也可用于皮肤美容，保持皮肤处于年轻状态。
健康和长寿是生命科学永恒的主题。随着世界人口的加速老龄化，抗衰老研究已成为迅速崛起的一门应用科学。为开发研究抗衰老药物，提高生命质量，延缓机体衰老，延长健康寿命，目前抗衰老研究已进入机体。组织，细胞，分子，基因等全方位、多层次、多因素研究的新阶段。衰老是生物体在生命周期中随年龄增长而发生的全身各组织、器官减退和稳态功能下降的过程。皮肤是机体衰老过程中最易显露的器官。人的皮肤衰老不仅有损于美容，且与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、角化棘皮瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生也有着病因学的关系，因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。
皮肤衰老是内源性衰老和外源性环境因素共同作用的结果。虽然在某些程度上，环境因素对暴露部位的皮肤衰老起着重要作用，但内源性生理衰老所起的作用不容忽视。环境因素是在内源性生理衰老的基出上起加速或延缓衰老的作用。部位不同，二因素作用的侧重点各不相同，如遮光部位的皮肤主要以内源性生理特衰老因素为主，暴露部位则主要是环境因素损伤的结果，二者的临床和组织病理表现均不相同，但就整体而言，任何部位的皮肤衰老都是二因素共同作用的结果。
近几年来，国内外对维甲酸预防和延缓皮肤衰老的作用进行了广泛的研究，已证实有比较满意的效果。维甲酸是细胞增殖、分化、基因表达强有力的生物调节剂，对表皮和真皮有着显著的影响。Kligman对光老化小鼠模型用全反式维甲酸外用进行实验，发现在第5周和第10周的活检标本中，维甲酸组胶原层的厚度是赋形剂小鼠皮肤的2倍，其厚度与维甲酸应用的时间和剂量成正比，新形成的胶原经组织化学和超微结构检查证明与正常组组胶原相同，电镜下观察可见胶原束与皮面平行，排成正常的“胶合板样”，纤维母细胞众多，具有代谢活跃的形态特征，且皮肤内血管丰富，分枝较多，说明维甲酸提高了纤维母细胞和血管内皮细胞的活性。临床研究也表明，局部应用维甲酸可增加表皮角朊细胞的分化和角质透明颗粒的形成，使角朊细胞内聚性和黑素细胞活力降低，并抑制角质形成，使角质层变薄，还增加粘蛋白的合成，使胞间基质丰富，并可改善紫外线引起的弹力纤维蛋白变性，增加新胶原蛋白的形成，使微血管再生，血流量增加，故长期外用可明显减少光老化皮肤的临床症状，使皮肤表面的细小皱纹得到改善，皮肤光滑亮泽，色斑减淡，预防和缓解老年斑、日光性角化及皮肤癌的发生。
人参是传统的抗衰老中药，已证明人参具有广泛开的药理作用，能提高细胞寿命，维持衰老细胞的生存能力，促进DNA、RNA和蛋白质的合成，可与体内的自由基结合，减少脂褐素在体内的沉积等，具有较强的抗自由基作用。研究表明，灌服人参后，可明显的增加小鼠的皮肤中羟脯氨酸的含量。本实验用2.5％人参液外涂皮肤衰老模型小鼠的皮肤后发现其表皮轻度增厚，胶原合成较基质组外用组有所增厚，但不及正常小鼠皮肤胶原厚度，而弹力纤维含量与基质组比较无明显差异。SOD检测则较基质组显著升高，达正常组水平，MDA含量与基质组无明显减少，皮肤羟脯氨酸含量较基质组无明显增多，说明人参液外用未能呈现明显的抗皮肤衰老作用。
为了解决皮肤抗衰老问题，本发明采用了人参和维甲酸组成复方外用制剂，用于实验研究，取得了明显的疗效，初步解决了皮肤衰老的预防和治疗问题，该产品还具有保健美容的功效。
解决这一任务的途径是这样实现的，取中药人参和维甲酸通过下述工艺制作成霜剂用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配90g基质，取人参液和维甲酸溶解后，在基质冷至50C时加入，搅拌均匀即得。
配制例一取2.5％的人参液溶解于蒸馏水10ml，维甲酸10mg加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参液，混匀即得。
配制例二取人参皂甙2.5g溶于10ml的水中，维甲酸5mg，加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参皂甙液，混匀即得。
研究表明，本发明的人参维甲酸霜，人参可采用吉林红参，生晒参，花旗参，其配制浓度0.5％～10％较好，其最佳浓度为2％～5％。人参皂苷，人参茎叶皂苷也可代替人参液，其配制浓度0.1％～5％较好，其最佳浓度为0.5％～2.5％。
研究表明，本发明的人参维甲酸霜，维甲酸配制浓度1mg％～50mg％较好，其最佳浓度为2mg％～10mg％。
实施例一人参维甲酸霜对D-半乳糖加光照建立小鼠皮肤衰老模型的药效学观察1.材料和方法1.1实验动物及饲养条件选用3月龄雌性昆明种小鼠220只(广东医学院实验动物中心提供)，清洁级，平均体重20±2g，10只一笼饲养，鼠笼规格为55×35×20cm3，保证动物有足够的活动空间，使用标准饲料(实验动物中心提供)，其中钙含量为1.33％，磷含量为0.95％，所有动物自由摄食、摄水，在温度25℃～28℃，湿度60％～80％，通风良好的条件下饲养。1.2.药物与动物分组组号 数量 方法 给药方案正常组 20皮下注射生理盐水基质组 20光照+注射D-半乳糖+外用基质 2mg/cm2.d-1维甲酸组 20光照+注射D-半乳糖+外用维甲酸霜 2mg/cm2.d-1人参皂甙组 20光照+注射D-半乳糖+外用人参霜 2mg/cm2.d-1维生素E组20光照+注射D-半乳糖+外用VitE霜 2mg/cm2.d-1维甲酸+人参组20光照+注射D-半乳糖+外用维甲酸人参霜 2mg/cm2.d-11.3实验仪器设备仪器产地AE-240型电子分析天平 Mettler-Toledo仪器(上海)有限公司752型紫外分光光度计 上海第三分析仪器厂荧光光度计上海精密仪器厂紫外线强度计 上海顾村电光仪器厂JB-2型恒温磁力搅拌器 上海雷磁仪器厂新泾分厂SHH.W21.600三用电热恒温水浴箱子 天津市华北实验仪器有限公司DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱子 上海医用恒温设备厂HITACHT55P-72超速离心机 日本HITACHT公司半自动图象数字化分析仪包括光镜和荧光显微镜Nikon日本计算机 Macintosh IICi，美国苹果公司产品数字化板报 SummaSketchII plusKSS Image Analysis(version2.0) KSS Scientific consultants，UT USALEICA MPS30荧光-光学显微镜及显微照相机 德国LEICA公司制造WFX-ID原子吸收分光光度计 北京第二光学仪器厂生产JI-80-2B台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造华凌电冰箱 BCD-205WE广东1.4实验方法1.4.1 D-半乳糖制造亚急性衰老模型的建立每日颈背皮下注射12.5％D-半乳糖0.24ml/30g，给药标示量为80mgkg-1.d-1，对照组注射等体积的生理盐水连续造模42天。光老化模型制作方法如下光源紫外线灯管二只，上海第三光源厂生产，功率，40W，含UVC(200～290nm)和少量UVB，二只灯管平行排列；浙江华兴灯具厂生产的金属卤素灯一盏，功率500W，最强光谱为360nm，其中UVA占70％。
方法每次照射前用15％的硫化钠糊脱去小鼠背部毛，暴露约定俗成3*5cm2的皮肤，初次正式照射前，先测定最小红斑量及光照射强度，在距皮肤40cm的高度UVC2h，然后卤素灯照射1.5h，每次剂量UVC3.7J/cm2，UVA5.04J/cm2，每二天照射一次，共42天。1.4.2涂药方法在光照+半乳糖造模的同时，给药组外用药涂抹，每次2mg，均匀涂抹于暴光部位，每日一次，共42天。1.4.3标本取材方法各组小鼠在杀死前断尾取血，拟测定血中的CAT、GSH-PX、SOD之用；实验终止时，所有动物称重，用硫化钠糊背部脱毛，摘眼球放血处死，收集血液离心，分离血清，拟测定SOD、MDA用；取背部正中皮肤1*1cm2大小，迅速放入10％中性福尔马林液中固定，作组织切片进行组织形态学定量分析；2实验结果2.1皮肤组织病理学形态观察及计算机图象定量分析1.皮肤组织病理学形态观察表皮结构的变化正常组表皮较薄，角质层仅0.001mm，由3～5层细胞组成，棘细胞呈散在分布，基底细胞排列整齐，基底膜带较平坦。(2)D-半乳糖组表皮变薄，细胞层数变少，基底细胞胞体变小。(3)光照组表皮轻度增厚，基底细胞变得不典型，极性消失，大小不等，部分细胞核变大，深染，提示代谢旺盛。(4)模型组可见表皮变得更加菲薄，细胞排列散乱，基底细胞极性消失，细胞大小不一。(5)维甲酸组表皮较正常组和模型组显著增厚，细胞层数增多，可达7～12层，排列有序，细胞间质丰富，基底细胞胞体增大，呈立方形，排列规整，提示维甲酸有显著的促进基底细胞增殖作用。(6)人参外用组表皮较模型组轻度增厚，但不及正常表皮厚度，提示外用人参皂甙有轻微的促进表皮增殖的作用，但不显著。(7)维生素E外用组表皮较正常组和模型组显著增厚，提示维生素E外用可明显促进表皮细胞增殖。(8)维甲酸人参霜较维甲酸单用更明显地促进表皮增厚，使表皮细胞层数增至10～12层，胞间基质丰富，基底细胞胞体较大，排列更加规整，提示二者联用对表皮细胞的增殖有明显的同作用。
2.小鼠皮肤表皮厚度的计算机图象定量分析计算机图象定量分析小鼠表皮厚度变化变化的结果见表1表1小鼠皮肤表皮厚度计算机图象定量分析变化(n＝20)组别 表皮厚度(μm) 变化率基础组 27.9±3.6D-半乳糖(H) 16.6±4.3*40.5％光照组 29.1±5.9 4％D-半乳糖+光照组 13.7±4.6**▲△△50.8％维甲酸霜组 50.4±5.4**▲80％ 223％人参霜组 23.6±3.4▲ -15％ 51％
维生素E霜组 40.7±4.6**▲ 45％ 160％维甲酸人参霜组62.1±6 9**▲ 122％ 298％*示与基础组比较*P＜0.05**P＜0.01；▲示与D-半乳糖比较；△示与光照组比较表1显示(1)D-半乳糖组表皮厚度较正常组明显变薄，厚度减少了40.5％，差异有显著性(P＜0.01)。(2)光照组与正常组比较，表皮厚度稍有增加，但差别无显著性(P＞0.05)。(3)模型组与D-半乳糖组比较，表皮厚度明显减少，减少了17％，差异有显著性(P＜0.05)。(4)模型组与光照组相比，厚度显著减少，有非常显著性差异(P＜0.001)。提示光照后加速了D-半乳糖造成的小鼠细胞代谢紊乱，使皮肤衰老进一步加深。(5)维甲酸霜组较基础组和D-半乳糖+光照组基质组表皮厚度分别增加了80％、223％，均有显著差别(P＜0.01)(P＜0.01)。(6)人参霜组较D-半乳糖+光照模型组稍有增厚，但不及正常组厚度，无统计学差别。(7)维生素E霜组较正常组和D-半乳糖+光照组基质组表皮厚度分别增加了45％、160％，均有显著性差别(P＜0.01)(P＜0.01)，但不及维甲酸霜组外用的厚度。(8)维甲酸人参霜组较正常组和D-半乳糖+光照组基质组表皮厚度分别增加了122％、298％，差别显著，分别为(P＜0.0001)(P＜0.0001)，比维生素E霜组增厚更明显。2.2小鼠真皮弹力纤维间苯二酚-品红染色形态学观察1、小鼠真皮弹力纤维间苯二酚-品红染色形态学观察小鼠真皮弹力纤维间苯二酚-品红染色形态学观察显示(1)正常弹力纤维较细长，有轻微弯曲度，走向与皮面平行，排列稀疏，在毛囊周围呈环形排列。(2)D-半乳糖组弹力纤维减少，乳头层减少更明显。(3)光照组弹力纤维显著增粗、增多，堆积，部分卷曲，排列蓬乱不规则，附近有纤细的弹力纤维出现。(4)D-半乳糖+光照组模型组真皮乳头层弹力纤维少，网状层纤维数量少，但粗大，卷曲，排列不规则。(5)维甲酸霜组较正常组和模型组弹力纤维显著增多，特别是乳头层有众多纤细的弹力纤维，网状层弹力纤维增多、增粗，提示维甲酸霜促进了成纤维细胞的活性，合成了新的弹力纤维。(6)人参霜组、VitE霜组较模型组稍增多，但无统计学意义，说明人参霜组、VitE霜组外用不引起弹力纤维的太大改变。(7)维甲酸人参霜组弹力纤维较维甲酸组及模型组显著减少，提示维甲酸与人参皂甙可能同抑制了成纤维细胞合成弹力纤维，使之向合成胶原纤维转变。
2、小鼠真皮弹力纤维计算机图象定量分析小鼠真皮弹力纤维面积的计算机图象定量分析结果见表2表2.小鼠真皮弹力纤维面积的计算机图象定量分析x±s(n＝20)组别 真皮弹力纤维面积(μm2) 变化率基础组 899.7±70.6D-半乳糖(H)635.4±65.4**29％光照组 1257.3±78.7*40％D-半乳糖+光照组826.4±65.3△ 33％维甲酸霜组 1024.4±85.3*▲▲ 14％ 24％人参霜组 847.0±76.2 -5％ 2％维生素E霜组836.3±35.46％ -6％ +1％维甲酸人参霜组 570.0±45.4**▲▲ -37％ -31％*示与Basal比较*P＜0.05**P＜0.01；▲示与D-galactose比较；△示与UV比较由表2可见(1)D-半乳糖组弹力纤维总面积较正常组减少，减少了29％，差异有非常显著性(P＜0.01)。(2)光照组弹力纤维的总面积较正常组显著增多，增加了40％，差异有显著性(P＜0.05)，提示光照作为一种刺激因素诱导了成纤维细胞的活性，促进了弹力纤维的合成。(3)模型组与光照组相比，弹力纤维显著减少(p＜0.05)。提示D-半乳糖引起的代谢障碍引起了细胞的活性降低，抵消了光照引起的增殖作用。(4)维甲酸组较正常组和基质组弹力纤维显著增多，分别增多了14％、24％，差异有显著性(P＜0.05)(P＜0.01)。(5)人参组、VitE组较基质组无明显改变(P＞0.05)。维甲酸加人参皂甙联用较正常组、基质组、维甲酸组显著减少了37％、31％、45％，可能联用改变了成纤维细胞合成弹力纤维的功能。2.3真皮胶原纤维染色形态学观察及计算机图象定量分析
1、真皮胶原纤维形态学观察真皮胶原纤维形态学观察可见(1)正常组胶原纤维束细长，胞体丰富，呈束状排列，走向与皮面平行，呈波纹状，在毛囊周围纤维纤细且排列疏松。(2)光照组真皮浅层胶原纤维纤细，着色较淡，网状层纤维束较粗大，着色深染，成纤维细胞增多，有炎细胞浸润，提示成熟胶原纤维减少。(3)D-半乳糖组胶原束细长，走向平直。胞体小。(4)模型组真皮浅层胶原纤维染色稍淡，胶原束较细，网状层纤维束粗大，炎细胞较度浸润。(5)维甲酸霜组较正常组、基质组的胶原层显著增厚，胶原束排列致密，规整，与皮面平行，呈波纹状，中间有丰富的成纤维细胞和小血管。(6)人参霜组较基质组胶原增厚，但不及正常组胶原丰富。(7)VitE霜组较基质组显著增厚，超过了正常组但不及维甲酸霜组，胶原束排列不及维甲酸组整齐。(4)维甲酸人参霜组较维甲酸组胶原层更为丰富，胶原束排列更为致密、规整，中间有丰富的成纤维细胞和小血管。提示维甲酸与人参皂甙有同作用。
2、真皮胶原纤维厚度的计算机图象定量分析真皮胶原纤维厚度的计算机图象定量分析见表3表3真皮胶原纤维厚度的计算机图象定量分析x±s(n＝20)Group dermis depth(μm)Change基础组 842.0±64.3D-半乳糖(H)624.5±48.5**25％光照组 734.1±59.3412％D-半乳糖+光照组603.7±47.52△ 17％维甲酸组 1472.4±75.9**▲▲ +75％ +119％人参皂甙组 810.7±57.4 +3％+18％维生素E霜组1286.5±68.7**▲▲ +52％ +19％维甲酸人参霜组 1687.3±79.6**▲▲ +99％ +150％*示与Basal比较*P＜0.05**P＜0.01；▲示与D-galactose比较；△示与UV比较表3示(1)D-半乳糖组胶原厚度较正常组显著变薄，厚度减少了25％，有非常显著性差异(P＜0.01)，提示代谢紊乱抑制了成纤维细胞合成胶原蛋白。(2)光照组胶原厚度较正常组比较也变薄，减少了12％，差异有显著性(P＜0.05)，提示光照使胶原合成和代谢发生了改变，胶原层变薄。(3)模型组较光照组胶原厚度变薄，降低了17％，结果有显著性差异(P＜0.05)提示光照加D-半乳糖加剧了皮肤细胞的损伤。(4)维甲酸组较基质组、正常组胶原厚度显著增多，分别增加了75％、119％，有显著性差异(P＜0.05)。(5)人参组较基质组胶原增加了18％，但差异无显著性，提示人参外用促进皮肤胶原合成的作用不明显。(6)VitE组较正常组和基质组显著增加52％、91％(P＜0.01)，提示外用VitE有显著的促进胶原合成的作用。(7)维甲酸与人参联用胶原厚度较维甲酸组明显增加，有显著性差异(P＜0.05)，提示维甲酸与人参联用更加促进了胶原合成，二者有明显的协同作用。3.讨论3.1 UVC加金属卤素灯照射能快而深入的造成小鼠皮肤的光损伤目前光老化研究中常用的光源是中波UVB(290～320nm)，长期照射可使无毛小鼠产生类似于人皮肤光老化的改变。Kligman等应用UVB+IR长期照射豚鼠可使真皮弹力纤维增生，胶原发生改变；方家磷用氙灯加金属卤素灯长期照射豚鼠均可导致类似人光老化的皮肤特征表皮轻度增厚，真皮弹力纤维增生，成熟佼原纤维下降，网状纤维增多，新生佼原合成增多，炎症反应增强等表现。
光线为一连续的电磁辐射波，波长越短，能量越大，UVC的能量在紫外线中最强，但穿透力不强，仅0.01mm，一般不能透过大气层到达地面，日光光中能穿透大气层到达地面的是UVB、UVA和可见光，红外线，引去人光老化的主要是UVA、UVB，故人们常用此作人工光源建立光老化模型进行研究。
考虑到UVC能量大，对生命细胞的杀伤力最强，造成组织光损伤快而明显，本实验采用UVC灯作光源，由于UVC穿透力差，只能作用于表皮和真皮浅层，故在用UVC照射后，又用金属卤素灯(UVA占70％)加强光损伤的深度，这样联合照射能快速而深入地造成小鼠皮肤光损伤。又因为小鼠表皮非常薄，仅0.01mm，黑素细胞后少，用硫化钠糊脱去毛及部分角质层后，更有利于光线和药物的透入，使皮肤对光线更敏感，这在本实验中也得到了证实。照射5个红斑量后，皮肤红斑水肿明显，10天后皮肤明显干燥、粗糙、脱屑、生素沉着，照射42天后组织切片观察表皮轻度增厚，真皮弹力纤维增多粗大，成熟胶原纤维明显减少，新生的胶原纤维增多，炎症细胞浸润明显，小鼠耳部外观及组织切片上亦有同样表现，见图。本实验结果证实UVC+UVA可快速而深入地造成小鼠皮肤的光损伤。3.2. D-半乳糖造成小鼠皮肤细胞的衰老本实验结果表明，D-半乳糖组表皮较正常组变薄，细胞层数减少，细胞变小；胶原层厚度变薄，胶原束增粗老化，排列疏松；弹力纤维减少，成纤维细胞减少，无炎细胞浸润，说明基底细胞和成纤维细胞活性降低，合成功能下降，细胞处于一种“萎缩”状态。抗衰老生化指标也显示，模型组皮肤中SOD活力下降％，MDA含量升高％，羟脯氨酸显著下降，表明皮肤细胞出现了衰老。
本实验结果提示，D-半乳糖造成小鼠的亚急性衰老，是由于胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，该物质不能在细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响细胞正常渗透压，导致细胞代谢紊乱所致，同样，也造成了皮肤细胞的代谢障碍，使皮肤细胞呈现衰老表现。Vlassara也报告了一种解释衰老与糖尿病及多种并发症的相关机制，认为糖尿病与衰老有共同的机制即非酶蛋白的高度糖基化，他发现蛋白高度糖基化形成的不可逆终产物(ACT)可在胶原蛋白、基底膜蛋白中不断积累，导致多系统的衰老变化，如皮肤等，此机理在本实验结果中也得到了证实。
3.3光照加D-半乳糖可明显加剧小鼠皮肤老化的进程由于年轻动物组织细胞有强大的修复功能，用之制作光老化模型需时长，照射强度大，用作抗衰老药物研究不能良好的反应药物的效果，若用老年鼠又因个体差异大，所受影响因素多，体质差，不易获得，故本实验采用D-半乳糖造成皮肤细胞的衰老状态，又用光照造成皮肤细胞的光损伤，进一步加剧了皮肤的衰老。
众多研究表明，UVB照射皮肤早期，表皮细胞受到UV的刺激，基底细胞增殖、分化活跃，表皮层增厚，真皮浅层弹力纤维随胶原纤维减少而产生，提示轻度受损的成纤维细胞由生成腋原蛋白转入合成弹力蛋白；中后期，弹力纤维进一步增生，变粗，同时伴有网状纤维增生，示UV造成真皮损伤过程中胶原合成增加，这可能是成纤维细胞受UV照射后改变其因表型的结果；晚期呈萎缩状态。本实验光照组也出现了类似的组织学变化，其作用机理可能是光照作为一种损伤刺激最早损害部位可能是调节SOD和CAT基因，使二者合成减少，致使自由基积聚，诱导DNA的氧化破坏和交联，造成DNA复制错误，核苷酸辅酶破坏，含巯基酶失活，继而引起mRNA转录的改变，照射早期由合成胶原纤维转而合成弹力纤维，中期网状纤维增生，新合成胶原纤维增多，又因UV引起炎症浸润，浸润的Mo、中性粒细胞释放蛋白水解酶，使成熟胶原进一步减少，整体胶原即由I型向III型胶原转变；另外真皮弹力纤维因吸收UV而产生弹力蛋白变性，纤维增粗，聚集成团，呈现光老化的增生表现，晚期则呈现“萎缩”状态。
本实验用D-半乳糖造成小鼠皮肤衰老又用光照造成皮肤的光损伤，可见表皮显著变薄，较D-半乳糖组和光照组表皮更菲薄，表皮细胞层数减少，基底细胞大小不均，排列疏松紊乱，极性消失；真皮厚度变薄，胶原层纤维减少，着色较深，说明新生胶原不多；弹力纤维增粗，堆积，排列不规则，但新生弹力纤维不多；炎症浸润不明显。抗衰老指标显示皮肤SOD活性较D-半乳糖组和光照组均显著降低，MDA显著增加，皮肤羟脯氨酸含量较D-半乳糖组和光照组均显著减少(羟脯氨酸也是检测皮肤衰老程度的一个敏感指标)，这些指标说明D-半乳糖加光照显著地加速了皮肤衰老，比单用光照或单用D-半乳糖更快而明显地加剧了皮肤的衰老。可能的机制是光照损害了调节SOD和CAT基因，使二者合成减少，致使皮肤中的SOD、CAT等抗氧化酶类进一步减少，皮肤中自由基浓度增高，加剧了细胞的老化，又由于皮肤细胞处于代谢紊乱，即“老化”状态，不能对光线的刺激产生过强的反应，故皮肤不表现光老化的“增生”状态而呈现更为衰老的表现。
本实验采用UVC+UVA+D-半乳糖联合应用制造皮肤衰老模型还属国内外首创，该模型组织切片观测可使表皮变薄，真皮老化变薄，胶原减少，排列疏松，弹力纤维增粗、变性、堆积；计算机图象分析系统测定表皮厚度、胶原厚度、弹力纤维含量均较单用D-半乳糖造成的亚急性衰老模型和单纯光照所引起的光损伤均显示更为严重的皮肤衰老表现。皮肤衰老生化指标也充分证明了这个结论。因此，该模型为研究皮肤衰老及相关疾病的发生机制，进行药物筛选，评价药物疗效及作用机制提供了一个快速、简单易行、方法可靠的工具。
3.4.人参皂甙、维甲酸、VitE外用抗皮肤衰老研究为检测该皮肤衰老模型的可靠性，我们选择了人参皂甙、维甲酸、VitE外用进行抗皮肤衰老的研究。本实验设计了人参外用组、维甲酸外用组、VitE外用组、人参维甲酸联用组及单纯基质组，通过皮肤组织切片图象分析和皮肤各生化指标的测定来观察这些药物的抗皮肤衰老效果。3.4.1维甲酸外用有显著的抗皮肤衰老作用近几年来，国内外对维甲酸预防和延缓皮肤衰老的作用进行了广泛的研究，已证实有比较满意的效果。维甲酸是细胞增殖、分化、基因表达强有力的生物调节剂，对表皮和真皮有着显著的影响。Kligman对光老化小鼠模型用全反式维甲酸外用进行实验，发现在第5周和第10周的活检标本中，维甲酸组胶原层的厚度是赋形剂小鼠皮肤的2倍，其厚度与维甲酸应用的时间和剂量成正比，新形成的胶原经组织化学和超微结构检查证明与正常组胶原相同，电镜下观察可见胶原束与皮面平行，排成正常的“胶合板样”，纤维母细胞众多，具有代谢活跃的形态特征，且皮肤内血管丰富，分枝较多，说明维甲酸提高了纤维母细胞和血管内皮细胞的活性。临床研究也表明，局部应用维甲酸可增加表皮角角朊细胞的分化和角质透明颗粒的形成，使角朊细胞内聚性和黑素细胞活力降低，并抑制角质形成，使角质层变薄，还增加粘蛋白的合成，使胞间基质丰富，并可改善紫外线引起的弹力纤维蛋白变性，增加新胶原蛋白的形成，使微血管再生，血流量增加，故长期外用可明显减少光老化皮肤的临床症状，使皮肤表面的细小皱纹得到改善，皮肤光滑亮泽，色斑减淡，预防和缓解老年斑、日光性角化及皮肤癌的发生。
对维甲酸的作用机理，Gilchrest进行了比较深入的研究，结果显示，维甲酸经皮吸收后到达靶器官，通过与特定的膜受体结合或细胞的摄粒作用穿过胞膜，在胞质内与细胞的维甲酸受体结合蛋白(CRABP)结合，CRABP的作用可能有二方面即可将维甲酸运送到胞核，触发维甲酸对细胞活动的系列作用，同时，又控制游离的维甲酸进入胞核的水平，从而限制了维甲酸对细胞活动的影响，维甲酸进入细胞核后，与一种维甲酸受体结合，形成复合物，与DNA上特定的RA应答因子结合，并调节特定基因的转录，表达各种相关产物。
本实验结果表明，维甲酸可明显增加表皮和胶原层的厚度，使细胞层数增多，细胞排列规整，胞间基质丰富，胶原层显著增厚，排列致密有序，与皮面平行，呈波纹状，其间成纤维细胞丰富，血管增多，新生纤细的弹力纤维明显增多。抗衰老生化指标检测，维甲酸外用可明显升高SOD活性，降低MDA含量，显著增加皮肤羟脯氨酸的含量，说明维甲酸外用确能使衰老皮肤呈现年轻化的表现，与前人的报导相同。维甲酸改善D-半乳糖加光照所致的皮肤衰老状态，可能是维甲酸激活了D-半乳糖造成的衰老细胞的活性，促进了基底细胞和成纤维细胞的分裂、增殖，修复了光损伤而呈现出年青化的表现。致于这种刺激细胞的增殖活性是否具有持久的抗衰老作用，还有待进一步研究。3.4.2 人参霜外用抗皮肤衰老作用不明显人参是传统的抗衰老中药，已证明人参具有广泛开的药理作用，能提高细胞寿命，维持衰老细胞的生存能力，促进DNA、RNA和蛋白质的合成，可与体内的自由基结合，减少脂褐素在体内的沉积等，具有较强的抗自由基作用。研究表明，灌服人参后，可明显的增加小鼠的皮肤中羟脯氨酸的含量，但对人参皂甙外用未见报导。本实验用2.5％人参霜外涂皮肤衰老模型小鼠的皮肤后发现其表皮轻度增厚，胶原合成较基质组外用组有所增厚，但不及正常小鼠皮肤胶原厚度，而弹力纤维含量与基质组比较无明显差异。SOD检测则较基质组显著升高，达正常组水平，MDA含量与基质组无明显减少，皮肤羟脯氨酸含量较基质组无明显增多，说明人参皂甙外用未能呈现明显的抗皮肤衰老作用，可能与人参皂甙分子量较大，透皮量较少有关，致于透皮量。透皮机理如何，还有待进一步研究。3.4.3维生素E外用有抗皮肤衰老作用维生素E是公认的抗氧化剂，可抑制生物膜中脂质过氧化过程，有一定的抗衰老作用，大剂量可抑制胶原酶的活性，并能改善结缔组织的代谢，改善微循环等作用。研究表明，活性氧基和氧自由基在皮肤光损伤、光老化及光致癌中起重要作用，紫外线照射后皮肤酶和非酶性抗氧化剂明显降低，采用自由基清除剂的抗氧化剂补充治疗可以防止皮肤氧化性损伤。Bisseett等人证明用抗氧化剂生育酚局部外用可防止紫外线诱导的皮肤急慢性光损伤，其机理可能是抗氧化剂能有效地抑制光损伤的脂质过氧化作用和聚酰胺的产生及表皮鸟氨酸羟羧酶的合成从而改善了皮肤光损伤细胞的功能，减缓了皮肤细胞衰老的发生发展，本实验结果也佐证了这个论点。本实验在皮肤衰老模型的基础上，用2.5％维生素E霜外用与基质组(单纯霜剂)相比，维生素E组表皮厚度明显增厚，细胞层数增多，基底细胞数排列规整，胞体丰满，胶原层较基质组明显增厚，且有较多的成纤维细胞和毛细血管，弹力纤维与基质组相当，说明成纤维细胞以合成胶原蛋白为主，皮肤SOD检测较基质组明显升高，MDA降低明显，羟脯氨酸含量较基质组显著升高，达正常皮肤水平，说明VitE确有抗皮肤衰老作用，但效果不及维甲酸外用组。3.4.4人参维甲酸霜对抗皮肤衰老具有良好的作用上述人参霜外用抗皮肤衰老作用不明显，但与维甲酸联用后则表现为明显的协同作用。本实验结果显示，人参维甲酸霜较维甲酸组表皮厚度及胶原层明显增厚，表皮细胞层数更多，细胞间基质更丰富，胶原束排列更规整，弹力纤维却明显减少，SOD活性在各实验组中最高，而MDA含量则较低，皮肤羟脯氨酸含量最高，说明人参维甲酸霜较单用具有更好的抗皮肤衰老，机理可能是维甲酸是一种角质剥脱剂，可抑制张力原纤维的合成，减少角化细胞间的接触，从而使角质层细胞易溶解，间隙变宽，减少了屏障作用，从而促进了人参的透皮吸收量而发挥人参的抗衰老作用，其协同作用机制还需进一步探讨。
权利要求
1.一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂人参维甲酸霜，其特征是该复方制剂是由中药人参与维甲酸组成。
2.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该复方制剂中的中药人参是指人参的提取物，其配制浓度0.5％～10％较好，其最佳浓度为2％～5％。
3.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该复方制剂中的维甲酸配制浓度为1mg％～50mg％较好，其最佳浓度为2mg％～10mg％。
4.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该复方制剂中的中药人参是指人参皂苷，人参茎叶皂苷，其配制浓度0.1％～5％较好，其最佳浓度为0.5％～2.5％。
5.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该霜剂的制备工艺是取2.5％的人参液溶解于蒸馏水10ml，维甲酸10mg加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参液，混匀即得。
6.如权利要求1所述的一种具有防治皮肤衰老、具有保健美容功效的复方制剂人参维甲酸霜，该霜剂的制备工艺是取人参皂甙2.5g溶于10ml的水中，维甲酸5mg，加入少量无水酒精中使其溶解，滴加适量吐温-80，然后加入2ml的蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸单甘油酯等按一定比例配成的基质80g，在50C加入上乳化液和人参皂甙液，混匀即得。
全文摘要
本发明公开了一种防治皮肤衰老、具有保健美容功效的外用制剂人参维甲酸霜，该制剂由人参与维甲酸组成，对由随年龄增长而发生和由日光照射所致的皮肤衰老有良好的预防和治疗作用，也可用于皮肤美容，保持皮肤处于年轻状态。衰老是生物体在生命周期中随年龄增长而发生的全身各组织、器官减退和稳态功能下降的过程。皮肤是机体衰老过程中最易显露的器官。人的皮肤衰老不仅有损于美容，且与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、角化棘皮瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生也有着病因学的关系，因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。为了解决皮肤抗衰老问题，本发明采用了人参和维甲酸组成复方外用制剂，用于实验研究，取得了明显的疗效，初步解决了皮肤衰老的预防和治疗问题，该产品还具有保健美容的功效，可用于皮肤美容，保持皮肤处于年轻状态。
文档编号A61K31/19GK1480133SQ0314557
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月7日 优先权日2003年7月7日
发明者吴铁, 王红丽, 吴 铁 申请人:广东医学院
最新回复(0)