Sars冠状病毒3cl蛋白酶抑制剂及其用途的制作方法
专利名称：Sars冠状病毒3cl蛋白酶抑制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类抗SARS冠状病毒的化合物，具体涉及一类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂及其用途。
背景技术：
肆虐全球的非典型肺炎(SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome)，给人类的身心健康带来了极大的伤害。对SARS的药物研发成为我国和世界许多国家科学家研究的焦点。
自从发现变种的冠状病毒是导致SARS的主要元凶以来，已测定了几十个不同来源SARS病毒的全基因组序列。对这些基因组序列的比较分析发现SARS病毒基因组有一定变异，但变异速度不快。冠状病毒的主要蛋白酶或称3CL蛋白酶是病毒复制中的关键蛋白，其主要功能是水解病毒所表达的两个多聚蛋白质。序列分析表明3CL蛋白酶在已测定的SARS基因组中是保守的，有可能成为药物设计的关键靶标之一。
发明内容
本发明的目的是找到SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂。
本发明的技术方案是对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的空间结构进行同源模建，分析其底物结合部位多种可能的构象，对可能的二聚体界面进行分析，以得到不同3CL蛋白酶构象，并根据此进行药物设计，利用反相高压液相色谱方法对所设计的化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测试，筛选出对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的化合物。
经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示通式为式I的一类化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶具有抑制作用
式I式I中，R1～R2独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，卤素、羟基，C1～C4烷氧基，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，苯基，取代苯基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，也可以被1-3个选自下面的取代基取代卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，三氟甲氧基。
R3和R4独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C6环烷基，C5～C7环烯基，羟基，C1～C4烷氧基，C1～C4烷氨基，羟基，卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，醛基，胺甲酰基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基。
R5和R6独立选自氢，C1～C8直链或支链烷基，C2～C8直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，C1～C4烷胺甲酰基，氨基，胺甲酰基，脲基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，羧基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，磺酰胺基，甲基磺酰胺基，二甲基磺酰胺基等，R1～R6优选是卤素。
式I化合物中存在有手性中心，因此本发明还包括其各种旋光异构体。
式I化合物还包括其水合物。
式I化合物可以与酸形成各种可药用的盐，如盐酸盐。
将式I化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备治疗和预防SARS病毒感染的药物。
当R1～R6均为氯时，其盐酸盐是pkumdl_cvs_1001(Calmidazolium chloride)，本发明经测试发现，该化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶具有较好的抑制作用。
本发明利用反相高压液相色谱方法对受试化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测定的方法是国际通用的天然底物测定微小RNA病毒方法，该方法可定量、准确度高、重现性好、不易受其他物质干扰。
高压液相色谱利用不同物质在色谱柱上保留时间不同，来进行样品的分离纯化或定性鉴定，配合适当的检测装置(如紫外可见光检测器)还可以获得定量的信息。当使用紫外检测器时，被鉴定样品的紫外吸收符合朗伯-比尔定律，因此色谱峰面积与被鉴定样品的含量成正比。从其峰面积可以确定产物生成的量，进而计算出酶促反应的速度，酶促反应的速度是表征酶活力的重要指标。加入抑制剂之后，酶活力下降，酶促反应的速度也随之降低，可以观察到色谱峰面积减小，而色谱峰面积减小的比例反映了抑制剂对酶活力抑制的强度。
具体实施例方式在以下实施例中，我们所用候选化合物购自SIGMA等试剂公司；所用3CL蛋白酶为经基因克隆、表达、纯化制备的，最后经过凝胶过滤柱达到95％以上纯度；所用的底物是根据3CL蛋白酶在SARS病毒多聚蛋白质上的切点所合成的11肽。
进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤以及底物反应条件等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
实施例1 SARS冠状病毒3CL蛋白酶的制备一、实验缓冲液体系1.破壁缓冲液 40mM Tris-HCl100mM NaCl10mM咪唑7.5mM β-巯基乙醇2.Ni-NTA柱(1)洗柱缓冲液40mM Tris-HCl100mM NaCl
10mM咪唑7.5mM β-巯基乙醇(2)洗脱缓冲液40mM Tris-HCl100mM NaCl250mM 咪唑7.5mM β-巯基乙醇(3)凝胶过滤柱40mM Tris-HCl100mM NaCl7.5mM β-巯基乙醇二、操作步骤及方法1.载体构建从3CL蛋白酶的克隆载体中用引物扩增，通过Nhe I和Xho I的DNA限制性内切酶切口连接入表达载体pET21a(Novagen公司)，得到3CL蛋白酶的表达载体pET21a-3CLP-21x。该载体表达的3CL蛋白酶的氨基酸链碳端带有6个组氨酸。
2.表达纯化表达载体pET21a-3CLP-21x转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。在转化平板上挑取一个转化子单菌落，50毫升LB培养基37℃，220转/分钟培养12小时后，按1％的接种量转接入1升LB培养基中37℃，220转/分钟继续培养至OD600＝0.8，加入终浓度为0.5mM/L的IPTG，30℃，240转/分钟诱导表达3小时。5000g离心收集菌体，超声破壁，24000g离心收集上清液。上清液过Ni-NTA柱(Qiagen公司)纯化，过完Ni柱后得到的产品经过超滤浓缩，再经过Sephacryl S-200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia公司)纯化，最终得到95％以上纯度的3CL蛋白酶产品，产量约每升培养液15毫克纯蛋白。
实施例2底物合成根据3CL蛋白酶在病毒多聚蛋白质上的切点，设计了一个11肽NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH2，作为3CL蛋白酶酶促反应的分解底物，酶促反应的分解产物分别为NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-COOH和NH2-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH2。利用标准的芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基(tBu)保护策略多肽固相合成方法合成此底物11肽。多肽固相合成在Rink树脂(Advanced ChemTech公司，美国)上进行。
实验方法1.称量0.667g Rink树脂(取代值0.6mmol/g)，在反应器中以5mL二氯甲烷溶胀3小时；2.抽干二氯甲烷，再加入40％六氢吡啶DMF溶液5mL，脱除Fmoc保护基，反应40分钟；3.抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂；4.称量1.6mmol保护氨基酸，加入等摩尔量的1-羟基苯并三氮唑及2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-四甲基脲六氟磷酸盐的N-甲基吡咯烷酮溶液2mL溶解，反应成活泼酯，再加入等摩尔量二异丙基乙基胺。
5.将此溶液加入反应器，于摇床震荡反应3-5小时。；6.反应完成后，抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂；7.取少量树脂，加入干净小试管，分别加入(1)水合茚三酮/无水乙醇溶液(2)苯酚/无水乙醇溶液(3)KCN/吡啶溶液各两滴，于沸水浴中加热2~3分，观察树脂颜色。若树脂无色，则反应完全，可继续进行后续反应步骤(8)；若树脂变蓝色，则反应不完全，应自步骤(4)重新进行这一步偶联反应；8.加入40％六氢吡啶DMF溶液5mL，脱除Fmoc保护基，反应40分钟；9.抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂。按步骤(4)偶联下一氨基酸；10.待所有氨基酸残基偶联完成并脱Fmoc保护后，将树脂仔细洗涤干净，真空干燥至恒重；11.每25mg肽树脂加入1mL K试剂(5％水，5％苯酚，5％苯甲硫醚，2.5％二巯基乙烷，82.5％三氟乙酸)于室温反应不超过3小时；12.反应完成后，加入大量冰乙醚中，冰冻过夜。过滤并用冰乙醚洗净；13.用适当浓度的乙腈/水溶液溶解，过滤除去树脂，洗净。滤液真空冻干，即得产物。
14.产物经高压液相色谱分离纯化，以基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱鉴定分子量。
所用保护氨基酸分别为Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(But)-OH，，Fmoc-Thr(But)-OH，Fmoc-Val-OH。
实施例3 反相高压液相色谱测试抑制剂pkumdl_cvs_1001一、实验试剂储备液Tris-HCl缓冲溶液储备液200mM，pH＝8.0；二硫代苏糖醇储备液100mg/mL溶于水；3CL蛋白酶储备液6mg/mL溶于Tris-HCl缓冲溶液，分子量为35kDa；底物11肽冻干粉，分子量为1192Da。
实验溶液Tris-HCl缓冲溶液40mM，pH＝8.0。
3CL蛋白酶溶液取10 L3CL蛋白酶储备液，加二硫代苏糖醇储备液10L，Tris-HCl缓冲溶液360L。
底物11肽称量一定质量冻干粉，用Tris-HCl缓冲溶液溶解至浓度为4mM。
终止液0.1％三氟乙酸水溶液抑制剂pkumdl_cvs_1001(Calmidazolium chloride)为SIGMA公司产品，CAS Number57265-65-3。将其溶于DMSO，制备成浓度为1mM的溶液。
二、操作步骤及方法取5L Tris-HCl缓冲溶液，加5L抑制剂DMSO溶液，20L底物11肽溶液。加入20L 3CL蛋白酶溶液后开始计时，20分钟后加入50L终止液。
反应时底物11肽浓度为1.6mM，3CL蛋白酶浓度为1.8M，二硫代苏糖醇浓度为6.8mM，抑制剂浓度为0.1mM。
高压液相色谱分析Zorbax C18分析型反相色谱柱(Agilent公司，美国)，Lab-Prep高压液相色谱系统(Gilson公司，法国)，Unipoint高压液相色谱控制软件(Gilson公司，法国)，紫外检测波长为220纳米。流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，洗脱梯度为0至50％流动相B，洗脱时间为15min，流速1mL/min，进样量80L。利用Unipoint高压液相色谱控制软件包含的峰面积积分方法计算底物11肽被3CL蛋白酶分解所得到的两产物的峰面积。将此峰面积与空白样品(为用不含抑制剂的DMSO配制的分析样品)相应峰面积对比，则可以确定生成产物减少的比例，可以据此计算抑制率。
三、实验结果经对抑制剂pkumdl_cvs_1001进行三次测试，结果见下表
权利要求
1.用式I化合物制备SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的用途， 式I其中，R1～R2独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，卤素、羟基，C1～C4烷氧基，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，苯基，取代苯基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，也可以被1-3个选自下面的取代基取代卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，三氟甲氧基；R3和R4独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C6环烷基，C5～C7环烯基，羟基，C1～C4烷氧基，C1～C4烷氨基，羟基，卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，醛基，胺甲酰基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基；R5和R6独立选自氢，C1～C8直链或支链烷基，C2～C8直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，C1～C4烷胺甲酰基，氨基，胺甲酰基，脲基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，羧基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，磺酰胺基，甲基磺酰胺基，二甲基磺酰胺基。
2.权利要求1所述的用途，其中式I化合物的R1～R6分别是卤素。
3.权利要求2所述的用途，其中式I化合物的R1～R6分别是氯。
4.权利要求1所述的用途，其中式I化合物包括其旋光异构体。
5.权利要求4所述的用途，其中式I化合物包括其水合物。
6.权利要求4或5所述的用途，其中式I化合物包括其可药用的盐。
7.权利要求4或5所述的用途，所述可药用的盐是盐酸盐。
8.用权利要求6所述的式I化合物与药学上可接受的辅剂制备治疗和预防SARS病毒感染药物的用途。
全文摘要
本发明涉及SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂及其用途。本发明利用反相高压液相色谱方法对通式为式I的一类化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测试，证实其对SARS冠状病毒3CL蛋白酶具有抑制作用，可用于治疗和预防SARS病毒感染。
文档编号A61P31/14GK1569841SQ0314604
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者来鲁华, 刘莹, 范可强, 刘振明, 魏平, 陈浩, 裴剑锋, 刘士勇 申请人:北京大学
技术领域：
本发明涉及一类抗SARS冠状病毒的化合物，具体涉及一类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂及其用途。
背景技术：
肆虐全球的非典型肺炎(SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome)，给人类的身心健康带来了极大的伤害。对SARS的药物研发成为我国和世界许多国家科学家研究的焦点。
自从发现变种的冠状病毒是导致SARS的主要元凶以来，已测定了几十个不同来源SARS病毒的全基因组序列。对这些基因组序列的比较分析发现SARS病毒基因组有一定变异，但变异速度不快。冠状病毒的主要蛋白酶或称3CL蛋白酶是病毒复制中的关键蛋白，其主要功能是水解病毒所表达的两个多聚蛋白质。序列分析表明3CL蛋白酶在已测定的SARS基因组中是保守的，有可能成为药物设计的关键靶标之一。
发明内容
本发明的目的是找到SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂。
本发明的技术方案是对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的空间结构进行同源模建，分析其底物结合部位多种可能的构象，对可能的二聚体界面进行分析，以得到不同3CL蛋白酶构象，并根据此进行药物设计，利用反相高压液相色谱方法对所设计的化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测试，筛选出对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的化合物。
经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示通式为式I的一类化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶具有抑制作用
式I式I中，R1～R2独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，卤素、羟基，C1～C4烷氧基，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，苯基，取代苯基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，也可以被1-3个选自下面的取代基取代卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，三氟甲氧基。
R3和R4独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C6环烷基，C5～C7环烯基，羟基，C1～C4烷氧基，C1～C4烷氨基，羟基，卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，醛基，胺甲酰基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基。
R5和R6独立选自氢，C1～C8直链或支链烷基，C2～C8直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，C1～C4烷胺甲酰基，氨基，胺甲酰基，脲基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，羧基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，磺酰胺基，甲基磺酰胺基，二甲基磺酰胺基等，R1～R6优选是卤素。
式I化合物中存在有手性中心，因此本发明还包括其各种旋光异构体。
式I化合物还包括其水合物。
式I化合物可以与酸形成各种可药用的盐，如盐酸盐。
将式I化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备治疗和预防SARS病毒感染的药物。
当R1～R6均为氯时，其盐酸盐是pkumdl_cvs_1001(Calmidazolium chloride)，本发明经测试发现，该化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶具有较好的抑制作用。
本发明利用反相高压液相色谱方法对受试化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测定的方法是国际通用的天然底物测定微小RNA病毒方法，该方法可定量、准确度高、重现性好、不易受其他物质干扰。
高压液相色谱利用不同物质在色谱柱上保留时间不同，来进行样品的分离纯化或定性鉴定，配合适当的检测装置(如紫外可见光检测器)还可以获得定量的信息。当使用紫外检测器时，被鉴定样品的紫外吸收符合朗伯-比尔定律，因此色谱峰面积与被鉴定样品的含量成正比。从其峰面积可以确定产物生成的量，进而计算出酶促反应的速度，酶促反应的速度是表征酶活力的重要指标。加入抑制剂之后，酶活力下降，酶促反应的速度也随之降低，可以观察到色谱峰面积减小，而色谱峰面积减小的比例反映了抑制剂对酶活力抑制的强度。
具体实施例方式在以下实施例中，我们所用候选化合物购自SIGMA等试剂公司；所用3CL蛋白酶为经基因克隆、表达、纯化制备的，最后经过凝胶过滤柱达到95％以上纯度；所用的底物是根据3CL蛋白酶在SARS病毒多聚蛋白质上的切点所合成的11肽。
进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤以及底物反应条件等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
实施例1 SARS冠状病毒3CL蛋白酶的制备一、实验缓冲液体系1.破壁缓冲液 40mM Tris-HCl100mM NaCl10mM咪唑7.5mM β-巯基乙醇2.Ni-NTA柱(1)洗柱缓冲液40mM Tris-HCl100mM NaCl
10mM咪唑7.5mM β-巯基乙醇(2)洗脱缓冲液40mM Tris-HCl100mM NaCl250mM 咪唑7.5mM β-巯基乙醇(3)凝胶过滤柱40mM Tris-HCl100mM NaCl7.5mM β-巯基乙醇二、操作步骤及方法1.载体构建从3CL蛋白酶的克隆载体中用引物扩增，通过Nhe I和Xho I的DNA限制性内切酶切口连接入表达载体pET21a(Novagen公司)，得到3CL蛋白酶的表达载体pET21a-3CLP-21x。该载体表达的3CL蛋白酶的氨基酸链碳端带有6个组氨酸。
2.表达纯化表达载体pET21a-3CLP-21x转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。在转化平板上挑取一个转化子单菌落，50毫升LB培养基37℃，220转/分钟培养12小时后，按1％的接种量转接入1升LB培养基中37℃，220转/分钟继续培养至OD600＝0.8，加入终浓度为0.5mM/L的IPTG，30℃，240转/分钟诱导表达3小时。5000g离心收集菌体，超声破壁，24000g离心收集上清液。上清液过Ni-NTA柱(Qiagen公司)纯化，过完Ni柱后得到的产品经过超滤浓缩，再经过Sephacryl S-200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia公司)纯化，最终得到95％以上纯度的3CL蛋白酶产品，产量约每升培养液15毫克纯蛋白。
实施例2底物合成根据3CL蛋白酶在病毒多聚蛋白质上的切点，设计了一个11肽NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH2，作为3CL蛋白酶酶促反应的分解底物，酶促反应的分解产物分别为NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-COOH和NH2-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH2。利用标准的芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基(tBu)保护策略多肽固相合成方法合成此底物11肽。多肽固相合成在Rink树脂(Advanced ChemTech公司，美国)上进行。
实验方法1.称量0.667g Rink树脂(取代值0.6mmol/g)，在反应器中以5mL二氯甲烷溶胀3小时；2.抽干二氯甲烷，再加入40％六氢吡啶DMF溶液5mL，脱除Fmoc保护基，反应40分钟；3.抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂；4.称量1.6mmol保护氨基酸，加入等摩尔量的1-羟基苯并三氮唑及2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-四甲基脲六氟磷酸盐的N-甲基吡咯烷酮溶液2mL溶解，反应成活泼酯，再加入等摩尔量二异丙基乙基胺。
5.将此溶液加入反应器，于摇床震荡反应3-5小时。；6.反应完成后，抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂；7.取少量树脂，加入干净小试管，分别加入(1)水合茚三酮/无水乙醇溶液(2)苯酚/无水乙醇溶液(3)KCN/吡啶溶液各两滴，于沸水浴中加热2~3分，观察树脂颜色。若树脂无色，则反应完全，可继续进行后续反应步骤(8)；若树脂变蓝色，则反应不完全，应自步骤(4)重新进行这一步偶联反应；8.加入40％六氢吡啶DMF溶液5mL，脱除Fmoc保护基，反应40分钟；9.抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂。按步骤(4)偶联下一氨基酸；10.待所有氨基酸残基偶联完成并脱Fmoc保护后，将树脂仔细洗涤干净，真空干燥至恒重；11.每25mg肽树脂加入1mL K试剂(5％水，5％苯酚，5％苯甲硫醚，2.5％二巯基乙烷，82.5％三氟乙酸)于室温反应不超过3小时；12.反应完成后，加入大量冰乙醚中，冰冻过夜。过滤并用冰乙醚洗净；13.用适当浓度的乙腈/水溶液溶解，过滤除去树脂，洗净。滤液真空冻干，即得产物。
14.产物经高压液相色谱分离纯化，以基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱鉴定分子量。
所用保护氨基酸分别为Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(But)-OH，，Fmoc-Thr(But)-OH，Fmoc-Val-OH。
实施例3 反相高压液相色谱测试抑制剂pkumdl_cvs_1001一、实验试剂储备液Tris-HCl缓冲溶液储备液200mM，pH＝8.0；二硫代苏糖醇储备液100mg/mL溶于水；3CL蛋白酶储备液6mg/mL溶于Tris-HCl缓冲溶液，分子量为35kDa；底物11肽冻干粉，分子量为1192Da。
实验溶液Tris-HCl缓冲溶液40mM，pH＝8.0。
3CL蛋白酶溶液取10 L3CL蛋白酶储备液，加二硫代苏糖醇储备液10L，Tris-HCl缓冲溶液360L。
底物11肽称量一定质量冻干粉，用Tris-HCl缓冲溶液溶解至浓度为4mM。
终止液0.1％三氟乙酸水溶液抑制剂pkumdl_cvs_1001(Calmidazolium chloride)为SIGMA公司产品，CAS Number57265-65-3。将其溶于DMSO，制备成浓度为1mM的溶液。
二、操作步骤及方法取5L Tris-HCl缓冲溶液，加5L抑制剂DMSO溶液，20L底物11肽溶液。加入20L 3CL蛋白酶溶液后开始计时，20分钟后加入50L终止液。
反应时底物11肽浓度为1.6mM，3CL蛋白酶浓度为1.8M，二硫代苏糖醇浓度为6.8mM，抑制剂浓度为0.1mM。
高压液相色谱分析Zorbax C18分析型反相色谱柱(Agilent公司，美国)，Lab-Prep高压液相色谱系统(Gilson公司，法国)，Unipoint高压液相色谱控制软件(Gilson公司，法国)，紫外检测波长为220纳米。流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，洗脱梯度为0至50％流动相B，洗脱时间为15min，流速1mL/min，进样量80L。利用Unipoint高压液相色谱控制软件包含的峰面积积分方法计算底物11肽被3CL蛋白酶分解所得到的两产物的峰面积。将此峰面积与空白样品(为用不含抑制剂的DMSO配制的分析样品)相应峰面积对比，则可以确定生成产物减少的比例，可以据此计算抑制率。
三、实验结果经对抑制剂pkumdl_cvs_1001进行三次测试，结果见下表
权利要求
1.用式I化合物制备SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的用途， 式I其中，R1～R2独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，卤素、羟基，C1～C4烷氧基，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，苯基，取代苯基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，也可以被1-3个选自下面的取代基取代卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，三氟甲基，三氟甲氧基；R3和R4独立选自氢，C1～C4直链或支链烷基，C2～C5直链或支链烯基，C3～C6环烷基，C5～C7环烯基，羟基，C1～C4烷氧基，C1～C4烷氨基，羟基，卤素，硝基，羟甲基，酰胺基，醛基，胺甲酰基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，苯基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基；R5和R6独立选自氢，C1～C8直链或支链烷基，C2～C8直链或支链烯基，C3～C8环烷基，C5～C8环烯基，C1～C4烷胺甲酰基，氨基，胺甲酰基，脲基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代卤素，羧基，羟基，C3～C8环烷基，C5～C7环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，磺酰胺基，甲基磺酰胺基，二甲基磺酰胺基。
2.权利要求1所述的用途，其中式I化合物的R1～R6分别是卤素。
3.权利要求2所述的用途，其中式I化合物的R1～R6分别是氯。
4.权利要求1所述的用途，其中式I化合物包括其旋光异构体。
5.权利要求4所述的用途，其中式I化合物包括其水合物。
6.权利要求4或5所述的用途，其中式I化合物包括其可药用的盐。
7.权利要求4或5所述的用途，所述可药用的盐是盐酸盐。
8.用权利要求6所述的式I化合物与药学上可接受的辅剂制备治疗和预防SARS病毒感染药物的用途。
全文摘要
本发明涉及SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂及其用途。本发明利用反相高压液相色谱方法对通式为式I的一类化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测试，证实其对SARS冠状病毒3CL蛋白酶具有抑制作用，可用于治疗和预防SARS病毒感染。
文档编号A61P31/14GK1569841SQ0314604
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者来鲁华, 刘莹, 范可强, 刘振明, 魏平, 陈浩, 裴剑锋, 刘士勇 申请人:北京大学
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