从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法
专利名称：从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法
技术领域：
本发明涉及生命医学中的提取技术，具体地说，涉及一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法。
背景技术：
对抗微生物肽的研究、开发利用已引起了国际生物医学界的极大兴趣。由于当今微生物对传统抗生素广泛耐药这一事实，而内源性抗微生物肽经过了几百万年的进化历程仍保留了强大的抗菌效力，所以，在发展抗感染新战略上，内源性抗菌肽格外引人关注，诱导内源性抗菌肽在机体抗感染的关键部位高浓度表达，可能是发展新抗微生物战略的最有前途的选择。研究上皮细胞抗微生物肽基因的诱导表达及其机制，不仅具有重要的理论意义，而且可为发展新抗感染药理学概念或措施，作出重要贡献。
圆小囊淋巴组织中的DNES细胞可产生P物质、血管活性肠肽、促胰液素等10多种生物活性物质。研究发现，在圆小囊淋巴组织中不仅存在着大量的产溶菌酶细胞，还存在有大量的产抗菌肽细胞，并已初步证明产溶菌酶细胞及产抗菌肽细胞的形态特点及分布部位与圆小囊中的DNES细胞一致。通过对圆小囊组织浸出液的初步分离纯化所得的低分子粗提物，对致病性大肠杆菌具有很强的抑菌作用。
兔小囊肽对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等常见的致病菌有明显的抑制作用。同时，还初步进行了兔小囊肽对鸡的免疫功能影响的观察，结果发现，此抗菌肽类物质能显著提高鸡的血清抗体IgG水平和黏膜分泌型抗体IgA水平，黏膜上皮内淋巴细胞也显著高于对照组，这说明小囊肽可提高鸡体的体液免疫和黏膜免疫力。
在《中国免疫学》1993年第9卷第2期上吴琦等发表了一篇名为“人中性粒细胞防御素的分离纯化”的文章，其中提出了一种对人中性粒细胞抗菌肽进行了分离纯化的方法，将获得人中性粒细胞胞浆颗粒，以5％乙酸提取酸溶性组分，然后进行SephadexG100和Bio-gel P10过滤，获得纯化的抗菌肽。由于肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，因而采用该分离纯化的方法需要进行多次才能达到较为满意的纯化效果。
国内外还未见有从兔圆小囊组织中分离提取抗菌肽的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，本发明简化了纯化步骤，又能提高纯化效率。
本发明所述从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，包括如下步骤步骤一，取圆小囊，清洗、破碎；步骤二，将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理将组织匀浆液用乙酸浸提；步骤三，离心，保留上清液；步骤四，将离心后的沉淀再次浸提，再次按照步骤三进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤五，合并两次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液调pH至7.0，离心，弃掉沉淀，收集上清液；步骤六，将上清液过SephadexG100分离柱和分子筛，紫外线监测，收集峰值样品；如上所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，还包括测定所收集到的物质的抗菌活性与分子量，将具有抗菌活性且分子量在7kD以下的物质即兔小囊肽，冻干保存。
本发明所述方法与现有技术比较，可以去除大多杂蛋白，采用分离柱层析，一次即可使兔小囊肽得以纯化，而且节省试剂和时间，适合于较大量的分离纯化。
具体实施例方式
本发明通过改进以往的提纯方法，既简化了纯化步骤，又能提高纯化效率，建立了一套从兔圆小囊组织中分离提取抗菌肽的方法。在吴琦的提取方法中，第一步柱层析不能将溶菌酶和抗菌肽分开，本发明对该方法进行了改进，根据抗菌肽具有耐高温的特性，首先将组织匀浆液进行沸水浴处理，然后将酸溶性组分进行pH值调整，这样处理，既可以除去大分子溶菌酶，又可以避免乙酸带来的对抗菌作用的干扰。从抗菌肽粗提物的电泳结果可以发现，粗提物的蛋白带分子量大都在20000Da以下。
具体做法如下取圆小囊，清洗、破碎；收集屠宰场屠宰兔的圆小囊，灭菌生理盐水冲洗，去浆膜，组织捣碎机捣碎3次，每次1-2min；将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理；将组织充分匀浆，隔水煮沸15min；将组织匀浆液用乙酸浸提；按1∶1(体积比)加入5％乙酸，4℃条件下搅拌、浸提12小时；离心，保留上清液；将混合物于4℃，8000转/min离心30min，取上清液，4℃保存；将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次于4℃搅拌浸提12小时，重复上述离心过程，取上清液，合并两次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液调pH至7.0，离心，弃掉沉淀；将离心后的沉淀再次浸提；调整pH值，于4℃、8000转/min离心15min，收集上清液；将上清液过分离柱SephadexG100柱和截留量为10kD分子筛，紫外检测，收集10kD以下的峰值样品，其中分子量在7kD以下的具有抗菌活性的物质即为兔小囊肽，将其冻干保存。
显然，本发明的上述做法与现有技术中吴琦的方法相比较，可以去除大多杂蛋白，用SephadexG100分离柱层析一次即可使兔小囊肽得以纯化，而且节省试剂和时间，适合于较大量的分离纯化。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，取圆小囊，清洗、破碎；步骤二，将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理，将组织匀浆液用乙酸浸提；步骤三，离心，保留上清液；步骤四，将离心后的沉淀再次浸提，再次按照步骤三进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤五，合并两次上清液，调pH值，离心，弃掉沉淀，收集上清液；步骤六，将上清液过分离柱和分子筛，紫外线监测，收集峰值样品。
2.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括收集屠宰场屠宰兔的圆小囊，灭菌生理盐水冲洗，去浆膜，组织捣碎机捣碎3次，每次1-2min。
3.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤二中将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理，具体包括将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理；将组织充分匀浆，沸水浴15min。
4.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤二中，将组织匀浆液用乙酸浸提具体包括按体积比1∶1加入5％乙酸，4℃条件下搅拌、浸提12小时。
5.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤三中，具体包括将混合物于4℃，8000转/min离心30min，取上清液，在4℃下保存。
6.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤四具体包括将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次于4℃搅拌浸提12小时，重复上述离心过程，取上清液。
7.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤五收集上清液具体包括在4℃、8000转/min离心15min下，收集上清液。
8.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤六采用型号为Sephadex G100分离柱对上清液分离，将上清液过分离柱Sephadex G100柱，用截留量为10kD分子筛收集10kD以下的峰值样品。
9.根据权利要求1或8所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，还包括将分子量在7kD以下的具有抗菌活性的物质冻干保存。
10.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤五中调pH值，是采用0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0。
全文摘要
本发明公开了一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，包括步骤一，取圆小囊，清洗、破碎；步骤二，将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理将组织匀浆液用乙酸浸提；步骤三，离心，保留上清液；步骤四，将离心后的沉淀再次浸提，再次按照步骤三进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤五，合并两次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液调pH至7.0，离心，弃掉沉淀，收集上清液；步骤六，将上清液过SephadexG100分离柱和分子筛，紫外线监测，收集峰值样品。本发明所述方法与现有技术比较，可以去除大多数杂蛋白，采用分离柱层析，一次即可使兔小囊肽得以纯化，而且节省试剂和时间，适合于较大量的分离纯化。
文档编号A61P31/00GK1566153SQ03146358
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者佘锐萍, 王可洲, 马卫明, 李冰玲 申请人:中国农业大学
技术领域：
本发明涉及生命医学中的提取技术，具体地说，涉及一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法。
背景技术：
对抗微生物肽的研究、开发利用已引起了国际生物医学界的极大兴趣。由于当今微生物对传统抗生素广泛耐药这一事实，而内源性抗微生物肽经过了几百万年的进化历程仍保留了强大的抗菌效力，所以，在发展抗感染新战略上，内源性抗菌肽格外引人关注，诱导内源性抗菌肽在机体抗感染的关键部位高浓度表达，可能是发展新抗微生物战略的最有前途的选择。研究上皮细胞抗微生物肽基因的诱导表达及其机制，不仅具有重要的理论意义，而且可为发展新抗感染药理学概念或措施，作出重要贡献。
圆小囊淋巴组织中的DNES细胞可产生P物质、血管活性肠肽、促胰液素等10多种生物活性物质。研究发现，在圆小囊淋巴组织中不仅存在着大量的产溶菌酶细胞，还存在有大量的产抗菌肽细胞，并已初步证明产溶菌酶细胞及产抗菌肽细胞的形态特点及分布部位与圆小囊中的DNES细胞一致。通过对圆小囊组织浸出液的初步分离纯化所得的低分子粗提物，对致病性大肠杆菌具有很强的抑菌作用。
兔小囊肽对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等常见的致病菌有明显的抑制作用。同时，还初步进行了兔小囊肽对鸡的免疫功能影响的观察，结果发现，此抗菌肽类物质能显著提高鸡的血清抗体IgG水平和黏膜分泌型抗体IgA水平，黏膜上皮内淋巴细胞也显著高于对照组，这说明小囊肽可提高鸡体的体液免疫和黏膜免疫力。
在《中国免疫学》1993年第9卷第2期上吴琦等发表了一篇名为“人中性粒细胞防御素的分离纯化”的文章，其中提出了一种对人中性粒细胞抗菌肽进行了分离纯化的方法，将获得人中性粒细胞胞浆颗粒，以5％乙酸提取酸溶性组分，然后进行SephadexG100和Bio-gel P10过滤，获得纯化的抗菌肽。由于肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，因而采用该分离纯化的方法需要进行多次才能达到较为满意的纯化效果。
国内外还未见有从兔圆小囊组织中分离提取抗菌肽的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，本发明简化了纯化步骤，又能提高纯化效率。
本发明所述从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，包括如下步骤步骤一，取圆小囊，清洗、破碎；步骤二，将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理将组织匀浆液用乙酸浸提；步骤三，离心，保留上清液；步骤四，将离心后的沉淀再次浸提，再次按照步骤三进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤五，合并两次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液调pH至7.0，离心，弃掉沉淀，收集上清液；步骤六，将上清液过SephadexG100分离柱和分子筛，紫外线监测，收集峰值样品；如上所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，还包括测定所收集到的物质的抗菌活性与分子量，将具有抗菌活性且分子量在7kD以下的物质即兔小囊肽，冻干保存。
本发明所述方法与现有技术比较，可以去除大多杂蛋白，采用分离柱层析，一次即可使兔小囊肽得以纯化，而且节省试剂和时间，适合于较大量的分离纯化。
具体实施例方式
本发明通过改进以往的提纯方法，既简化了纯化步骤，又能提高纯化效率，建立了一套从兔圆小囊组织中分离提取抗菌肽的方法。在吴琦的提取方法中，第一步柱层析不能将溶菌酶和抗菌肽分开，本发明对该方法进行了改进，根据抗菌肽具有耐高温的特性，首先将组织匀浆液进行沸水浴处理，然后将酸溶性组分进行pH值调整，这样处理，既可以除去大分子溶菌酶，又可以避免乙酸带来的对抗菌作用的干扰。从抗菌肽粗提物的电泳结果可以发现，粗提物的蛋白带分子量大都在20000Da以下。
具体做法如下取圆小囊，清洗、破碎；收集屠宰场屠宰兔的圆小囊，灭菌生理盐水冲洗，去浆膜，组织捣碎机捣碎3次，每次1-2min；将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理；将组织充分匀浆，隔水煮沸15min；将组织匀浆液用乙酸浸提；按1∶1(体积比)加入5％乙酸，4℃条件下搅拌、浸提12小时；离心，保留上清液；将混合物于4℃，8000转/min离心30min，取上清液，4℃保存；将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次于4℃搅拌浸提12小时，重复上述离心过程，取上清液，合并两次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液调pH至7.0，离心，弃掉沉淀；将离心后的沉淀再次浸提；调整pH值，于4℃、8000转/min离心15min，收集上清液；将上清液过分离柱SephadexG100柱和截留量为10kD分子筛，紫外检测，收集10kD以下的峰值样品，其中分子量在7kD以下的具有抗菌活性的物质即为兔小囊肽，将其冻干保存。
显然，本发明的上述做法与现有技术中吴琦的方法相比较，可以去除大多杂蛋白，用SephadexG100分离柱层析一次即可使兔小囊肽得以纯化，而且节省试剂和时间，适合于较大量的分离纯化。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，取圆小囊，清洗、破碎；步骤二，将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理，将组织匀浆液用乙酸浸提；步骤三，离心，保留上清液；步骤四，将离心后的沉淀再次浸提，再次按照步骤三进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤五，合并两次上清液，调pH值，离心，弃掉沉淀，收集上清液；步骤六，将上清液过分离柱和分子筛，紫外线监测，收集峰值样品。
2.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括收集屠宰场屠宰兔的圆小囊，灭菌生理盐水冲洗，去浆膜，组织捣碎机捣碎3次，每次1-2min。
3.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤二中将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理，具体包括将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理；将组织充分匀浆，沸水浴15min。
4.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤二中，将组织匀浆液用乙酸浸提具体包括按体积比1∶1加入5％乙酸，4℃条件下搅拌、浸提12小时。
5.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤三中，具体包括将混合物于4℃，8000转/min离心30min，取上清液，在4℃下保存。
6.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤四具体包括将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次于4℃搅拌浸提12小时，重复上述离心过程，取上清液。
7.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤五收集上清液具体包括在4℃、8000转/min离心15min下，收集上清液。
8.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤六采用型号为Sephadex G100分离柱对上清液分离，将上清液过分离柱Sephadex G100柱，用截留量为10kD分子筛收集10kD以下的峰值样品。
9.根据权利要求1或8所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，还包括将分子量在7kD以下的具有抗菌活性的物质冻干保存。
10.根据权利要求1所述的从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，其特征在于，所述步骤五中调pH值，是采用0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0。
全文摘要
本发明公开了一种从兔圆小囊中分离提取小囊肽的方法，包括步骤一，取圆小囊，清洗、破碎；步骤二，将破碎的圆小囊组织进行沸水浴处理将组织匀浆液用乙酸浸提；步骤三，离心，保留上清液；步骤四，将离心后的沉淀再次浸提，再次按照步骤三进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤五，合并两次上清液，用0.1mol/L NaoH溶液调pH至7.0，离心，弃掉沉淀，收集上清液；步骤六，将上清液过SephadexG100分离柱和分子筛，紫外线监测，收集峰值样品。本发明所述方法与现有技术比较，可以去除大多数杂蛋白，采用分离柱层析，一次即可使兔小囊肽得以纯化，而且节省试剂和时间，适合于较大量的分离纯化。
文档编号A61P31/00GK1566153SQ03146358
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者佘锐萍, 王可洲, 马卫明, 李冰玲 申请人:中国农业大学
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