具有抗病毒活性的中草药萃取物及其制造方法
专利名称：具有抗病毒活性的中草药萃取物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，特别是指一种以低极性溶剂萃取女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或其混合物的萃取物。本发明还涉及该中草药萃取物的制备方法及应用。
背景技术：
病毒依其传播特性，可能经空气、口沫或接触传染途径而引发各种疾病。每年夏、秋二季，在台湾造成重大影响的肠病毒感染症，对国人健康确实造成极大的威胁，特别是对于幼童，肠病毒可经由接触病人的口鼻分泌物、粪便、飞沫等途径传染，尤其人群密集处易造成流行。目前对于肠病毒感染，并无特殊的治疗方法，医师大部分均给予对抗症状的支持性疗法；此外，肠病毒种类繁多且具变异性，因此，无法因为曾受感染而对其他类型的病毒产生终身免疫。预防病毒感染之道，即在于常洗手、加强居家环境清洁及室内通风、带口罩以及避免接触感染者。
美国专利第6,214,350号是有关于女贞(Ligustrum lucidum及/或L.japonicum)果实的水溶液萃取物，其制备方法包括将女贞果实与水接触；分离不溶性成分；将水溶液酸化得到酸沉淀物；以及纯化该酸沉淀物的步骤。该专利揭示了将女贞果实的水溶液萃取物用于治疗B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)以及人体免疫缺损病毒(HIV)。
美国专利第5,888,527号是有关于以儿茶素类及红茶多酚类为活性成分的茶萃取物，该萃取物也为水溶液萃取物，用于对抗真菌、细菌及流感病毒。
到目前为止，并无任何公开文献教示以低极性溶剂萃取女贞果实，并可将该萃取物用以对抗病毒，特别是小RNA病毒(小核糖核酸病毒)科中的肠病毒。此外，由于水是高极性的溶剂，并且由于各种病毒的作用机理不同以及对于不同药物具有高度的特异性，因此，并无法由前揭背景技术而推及本发明的构想以及实施。此外，对于以中草药治疗或预防由病毒所引起的疾病或症状，仍有其需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，其是藉由将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。
本发明的另一目的在于提供一种制备具有抗病毒活性的中草药萃取物的方法，是将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取。
本发明的又一目的在于提供一种活体外抗病毒活性的方法，包括将本发明具有抗病毒活性的中草药萃取物与病毒接触，藉此抑制病毒的活性。
在优选具体实例中，本发明是将具有抗病毒活性的中草药萃取物作为活体外抗病毒活性的应用。
在本发明的说明中，女贞子是指木樨科(Oleaceae)植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的果实；黄精是指百合科(Liliaceae)多年生草本植物，包括黄精(Polygonatum sibiricum Red)、滇黄精(P.kingianum Coll.et Hemsl)或多花黄精(P.cvrtonema Hua)的根或茎；仙鹤草是指蔷薇科(Rosaceae)多年生草本植物仙鹤草(Agrlmonlaallosa Ledeb)全草、根或芽。熟地黄是指玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物地黄(Rehmannia glutinosa(Gaertn.)Libosch)经蒸制后的块状根。
在传统中草药的使用中，药材自天然植物摘取后，通常会经过处理，以利后续储存。例如，熟地黄是由生地黄(或简称地黄)炮制而得。所谓炮制，是指药材根据医疗、调制及制剂的需要，经过加工处理的方法，其主要目的包括(1)降低或清除中药的毒性及副作用；(2)增强中药功效；(3)转变药物性能；(4)清洁药材，提高药物的纯度；(5)利于贮藏，保存药效；以及(6)矫味、矫臭及赋色。
相同地，本发明所使的其它药材也可经适当的步骤处理。例如，女贞子及黄精通常会以加潬(亦即，将药物迅速放入沸水中，经短暂加热后，立即取出的方法)或蒸(利用水蒸气或隔水加热药物的方法)的方式处理，之后将其干燥以利储存。此外，仙鹤草通常是以晒干的方式处理。
无须特别教示，上述的药材处理步骤为本领域技术人员所熟知，并且也涵盖于本发明的范畴内。在本发明的说明中，药材可以包括，但并不限于上述步骤而处理特定植物部位所得到的，或是得自传统民间或中草药店的药材。
一般而言，中草药都是以溶剂萃取法提取其中的有效成分，此为最常见及最常用的方法，而其中，水、甲醇、乙醇或丙酮是较常被使用的萃取溶剂。这些溶剂的特征在于它们的高极性。极性是分子的一种物理性质，分子极性的强弱，由分子的结构决定，并可用偶极矩及介电常数来比较。
上述溶剂中，水是高极性溶剂，其介电常数约为80，对于中草药植物细胞的穿透力大，但由于分子极性强且能形成氢键，因而沸点高、不易浓缩；此外，水萃取物具有易发霉的缺点。甲醇、乙醇及丙酮是属于亲水性的溶剂，其特征为极性较大，与水能混溶，其介电常数分别约为31.2、26.0及21.5；此类溶剂对中草药植物细胞的穿透力强，分子极性比水小，沸点也比水低。至于亲脂性的溶剂是指与水不能混溶、或混溶性低的溶剂，例如，石油醚(介电常数约为1.8)、苯(介电常数约为2.3)、乙醚(介电常数约为4.3)、氯仿(介电常数约为5.2)、乙酸乙酯(介电常数约为6.1)等，对中草药植物细胞的穿透力弱，沸点低。
不同于先前技术中所使用的高极性溶剂(例如，水)，本发明是使用低极性的溶剂作为萃取溶剂，来萃取女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或其混合物中抗病毒的有效成分。优选地，在本发明的中草药中，女贞子是指女贞的果实部位；黄精(包括，但并不限于黄精、滇黄精或多花黄精)是使用其根或茎部位；仙鹤草是使用其全草、根或芽部位；熟地黄是生地黄经蒸制后的块状根。上述一种或多种中草药材的混合物，也是在本发明的范畴内。
因此，本发明的主要目的在于提供一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，是藉由将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。
为了达成较佳的萃取效果，在进行本发明的萃取步骤前，可将上述一种或多种中草药材以捣碎、研磨、切碎等物理方式而尽可能使其变为较小颗粒，优选是以研磨的方式进行，更优选是将上述一种或多种中草药材研磨成粉末状，以利后续的萃取。
在本发明的内容中，名词“低极性”溶剂的定义是指介电常数约为10以下的溶剂，适合的例子包括，但并不限于，乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯或其混合物。
在本发明的一个优选具体实例中，低极性的溶剂是二氯甲烷、正己烷或正丁醇。
在上述一种或多种中草药材磨碎后，以及进行本发明的萃取步骤前，可视需要以甲醇或乙醇或其混合物而进行前萃取步骤。如上所述，虽然甲醇及乙醇是属于亲水性、高极性的溶剂(介电常数约为26至31)，但由于除了蛋白质、油脂及蜡之外，中草药植物细胞中的其它成分在甲醇或乙醇中均有一定程度的溶解度，因此，使用甲醇或乙醇或其混合物进行前萃取，可有助于后续本发明以低极性溶剂的萃取。
将上述一种或多种中草药材以低极性的溶剂萃取后，该萃取物即可加以调配作为各种广泛的应用。然而，为了使萃取物中有效成分的纯度提高，可视需要于本发明的萃取步骤后，进行各种的纯化步骤。将萃取物进行纯化的方法无须特别教示，为本领域普通技术人员所熟知，可使用的方法包括，例如层析法、结晶法、过滤法、沉淀法等，应视所欲达成的目的而决定。
在本发明的优选具体实例中，上述一种或多种中草药材在以至少一种低极性溶剂萃取之后，可进行纯化的步骤，例如利用过滤法，以移除不溶性的成分。在另一优选具体实例中，纯化步骤包括利用硅胶，以二氯甲烷/乙酸乙酯作为冲提液/洗脱液而进行。
本发明的另一的另一方面是提供一种制备具有抗病毒活性的中草药萃取物的方法，是将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。视需要，可于萃取前以甲醇或乙醇或其混合物进行前萃取步骤。同样地，在以低极性溶剂萃取之后，可将萃取物进行纯化的步骤，以得到较纯的有效成分。
本发明同时还提供一种活体外抗病毒活性的方法，其包括将本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物与病毒接触，藉此抑制病毒的活性。
在本发明的内容中，名词“病毒”特别是指小RNA病毒科(Picornaviridae)成员的病毒，尤其是肠病毒(Enterviruses)，特别是肠病毒71型。
本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，可以纯化及/或未纯化的形式使用，或优选地，与传统上用于配方技艺中的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂一起使用，可用于制造各种具有抗病毒功效的制品。为达这个目的，可以传统的方式而对该萃取物适当地赋形成为可乳化的浓缩液(例如，作为洗手乳、洗涤剂、洗衣精、洗发乳)、可涂布的糊状物(例如，作为涂料)、可直接喷洒的溶液(例如，作为喷剂)、稀释的溶液(例如，作为饮料、健康食品)、可充填的成分(例如，作为玩具、擦拭布)、可与载剂相混的粉末、可溶解的粉末、粉尘、颗粒，以及也可包覆在适合的包覆剂中(例如，作为空气过滤器、水滤材、口罩内容物或滤膜)。作为组合物的类型，则可根据所要的目的及主要的环境而选择，例如，喷洒、雾化、喷撒、散播、涂布或乳化等的施用方法。组合物也可包含另外的佐剂，例如，稳定剂、消泡剂、粘度调节剂、粘结剂或发粘剂或其它用于获得特殊效果的配方。
本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，通常是以组合物的形式使用，并可同时或连续地配合其它的物质使用，例如，其它对抗病毒的药物或其混合物或营养成分等，以达到增强抗病毒效果的协同活性。
视需要，也可将本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，调配成治疗或预防病毒(优选是肠病毒，更优选是肠病毒71型)的医药组合物，以治疗或预防肠病毒感染症或重症肠病毒感染症。本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，可单独地或与医药上可接受的载体或赋形剂结合，以单一剂量或多剂量的形式而施药。医药上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂及赋形剂，可根据传统的技术而调配，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版，Gennaro编辑，Mack出版公司，Easton，PA(1995)中记载的技术。
医药组合物可特定地调配，以用于任何适合的给药途径，例如，口服、直肠、鼻、肺部、局部(包括颊以及舌下)、经皮、池内、腹膜内、阴道及非肠胃道(包括皮下、肌肉内、椎管内、静脉内以及皮内)途径。应了解的是，优选的给药途径将根据一般的症状及被治疗患者的年龄、要治疗症状的特性以及所选择的活性成分而决定。
用于口服施药的医药组合物可包括各类固体剂型，例如，胶囊、锭剂、糖衣锭、药丸、粉末以及颗粒。适合地，它们可根据在本领域中所熟知的方法，而与膜衣(例如，肠衣)一起制备，或者同时适当调配以提供活性成分的控制释放，例如，持续或延长的释放。
用于口服施药的液体剂型包括溶液、乳液、悬浮液、糖浆以及万能药。
用于非肠胃道施药的医药组合物包括无菌水溶液以及非水溶液的注射溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及使用前要再溶解于无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(粉针剂)。
其它适合的施药形式包括栓剂、喷剂、软膏、乳霜、凝胶、吸入剂、皮肤贴片、植入剂等等。
本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物的实际剂量，应根据施药的频率及模式、被治疗的患者的性别、年龄、体重以及一般状况、要治疗的症状的特性及严重性以及任何伴随的疾病等因素而决定。
具体实施例方式
本发明将藉由以下实施例进一步详细说明，但该等实施例仅用于举例说明，而非用于限定本发明的实施范畴。
实施例1女贞子萃取物的制备将1.5公斤新鲜女贞子(购自一般市场)，于室温中以乙醇进行前萃取(六次，每次2公升乙醇)，然后将萃取物以二氯甲烷(1-2公升)进行萃取。将萃取物通入装有硅胶柱，以二氯甲烷/乙酸乙酯(10∶1-1∶5)作为洗脱液洗脱，得到本发明的女贞子萃取物(80克)。
实施例2黄精萃取物的制备相同于实施例1的步骤，将等量的黄精以正己烷萃取及纯化，得到本发明的黄精萃取物。
实施例3仙鹤草萃取物的制备相同于实施例1的步骤，将等量的仙鹤草以正己烷萃取及纯化，得到本发明的仙鹤草萃取物。
实施例4熟地黄萃取物的制备相同于实施例1的步骤，将等量的熟地黄以二氯甲烷/正丁醇萃取及纯化，得到本发明的熟地黄萃取物。
实施例5细胞培养将横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma；RD)细胞(得自长庚医院病毒室)培养于含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养液中，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养。细胞继代培养时先以1×磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗两次，接着加入适量的0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA；Gibco)处理细胞，待细胞由培养皿表面脱落之后，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，将细胞均匀打散分置于培养皿中，置于含5％CO2的37℃培养箱中继续培养。
实施例6病毒培养将肠病毒71型的病毒株(Enterovirus 71/Tw/2231/98；得自长庚医院病毒室)，以不含胎牛血清的培养液稀释。将RD细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液，待细胞约九分满时，以1×PBS清洗一次，并加入前述稀释的病毒液，置于含5％CO2的35℃培养箱中吸附1小时之后，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，置于含5％CO2的35℃培养箱中培养。当95％以上的细胞出现变圆脱落的细胞病变时，收集上清液，经离心、冷冻、解冻后，置于-80℃冰箱保存。
实施例7毒性试验将实施例5所培养的细胞，培养于96孔的细胞培养盘，并与待测药物混合1小时之后，再加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，置于含5％CO2的35℃培养箱中培养3-4天。判读时加入5％福尔马林固定1-2小时，并以0.1％结晶紫(J.T.Baker)染色2-3分钟，以水冲洗后，测量OD570nm值。
实施例8中和试验将实施例5所培养的细胞，培养于96孔的细胞培养盘，并将定量的病毒液与待测萃取物混合后，加入培养液中吸附1小时，再加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，置于含5％CO2的35℃培养箱中培养3-4天。判读时加入5％福尔马林固定1-2小时，并以0.1％结晶紫染色2-3分钟，以水冲洗后，测量OD570nm值。
比较例相同于实施例1的步骤，将熟地黄、仙鹤草、黄柏、黄芩及黄精，以高极性的水进行萃取。
此外，将女贞子同实施例1的方法，以乙醇进行前萃取之后，将萃取物再以甲醇萃取，然后在乙酸乙酯∶水(1∶1)之间分层，得到有机相及水溶液相的萃取物。
将实施例1-4的本发明中草药萃取物以及比较例的萃取物，如实施例8的方法进行中和试验，以测定抑制病毒活性的能力。
在中和试验中，本发明以二氯甲烷萃取的女贞子萃取物，在0.66毫克/毫升的浓度，对肠病毒71型具有45％的抑制效果，本发明其它以低极性溶剂萃取的萃取物，例如，熟地黄的二氯甲烷/正丁醇萃取物，在0.1-0.25毫克/毫升的浓度，黄精的正己烷萃取物，在0.1-0.5毫克/毫升的浓度，以及仙鹤草的正己烷萃取物，在0.125-0.25毫克/毫升的浓度，对肠病毒71型均具有抑制效果；相较于其它高极性溶剂的萃取物，本发明的中草药萃取物具有明显的抗病毒活性。此外，相较于前述美国专利的背景技术，是以水作为溶剂而萃取，本发明也以水萃取女贞子作为比较例，结果，女贞子水溶性萃取物对于肠病毒71型并无抑制作用。
此外，在毒性试验中，本发明的女贞子萃取物对RD细胞的百分之五十致死剂量(LD50)为0.247毫克/毫升，也较其它萃取物显示更高的耐受性。
由上述实验结果可知，本发明制备的中草药萃取物可有效对抗肠病毒，特别是肠病毒71型，因此，将该等中草药萃取物应用于例如，空气滤清器、滤膜、口罩、洗手乳、水滤材、涂料、擦拭布等，可将病毒吸附于其上，一方面将病毒阻隔于前述材料上，避免病毒与人体接触而感染，另一方面，具有抗病毒活性的材料可令吸附于其上的病毒失活，使病毒失去感染力，藉此可杜绝病毒的传播途径，对于病毒传播的防治工作，将有极大的助益。因此，本发明实已具备产业利用性。
虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此，本发明的保护范围，当以权利要求书为准。
权利要求
1.一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，是藉由将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。
2.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中女贞子是木樨科植物女贞的果实。
3.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中黄精是包括百合科植物黄精、滇黄精或多花黄精的根或茎。
4.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中仙鹤草是蔷薇科多年生草本植物仙鹤草的全草、根或芽。
5.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中熟地黄是玄参科多年生草本植物地黄经蒸制后的块状根。
6.如权利要求1所述的中草药萃取物，在该萃取步骤之前，可视需要用选自由甲醇及乙醇所组成的族群中的溶剂进行前萃取。
7.如权利要求1所述的中草药萃取物，在该萃取步骤之后，还包括纯化步骤。
8.如权利要求7所述的中草药萃取物，其中该纯化步骤包括以硅胶进行纯化。
9.如权利要求8所述的中草药萃取物，其中该纯化步骤是以二氯甲烷/乙酸乙酯冲提而进行。
10.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中该低极性的溶剂包括介电常数约为10以下的溶剂。
11.如权利要求10所述的中草药萃取物，其中该低极性的溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇、乙醚或苯。
12.如权利要求11所述的中草药萃取物，其中该低极性的溶剂为二氯甲烷、正己烷或正丁醇。
13.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中该病毒是小RNA病毒科的病毒。
14.如权利要求13所述的中草药萃取物，其中所述病毒是肠病毒。
15.如权利要求14所述的中草药萃取物，其中该病毒是肠病毒71型。
16.一种制备具有抗病毒活性的中草药萃取物的方法，是将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取。
17.如权利要求16所述的方法，其中女贞子是木樨科植物女贞的果实。
18.如权利要求16所述的方法，其中黄精是包括百合科植物黄精、滇黄精或多花黄精的根或茎。
19.如权利要求16所述的方法，其中仙鹤草是蔷薇科多年生草本植物仙鹤草的全草、根或芽。
20.如权利要求16所述的方法，其中熟地黄是玄参科多年生草本植物地黄经蒸制后的块状根。
21.如权利要求16所述的方法，在该萃取步骤之前，可视需要用选自由甲醇及乙醇所组成的族群中的溶剂进行前萃取。
22.如权利要求16所述的方法，在该萃取步骤之后，还包括纯化步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中该纯化步骤包括以硅胶进行纯化。
24.如权利要求23所述的方法，其中该纯化步骤是以二氯甲烷/乙酸乙酯冲提而进行。
25.如权利要求16所述的方法，其中该低极性的溶剂包括介电常数约为10以下的溶剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中该低极性的溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇、乙醚或苯。
27.如权利要求26所述的方法，其中该低极性的溶剂是二氯甲烷、正己烷或正丁醇。
28.如权利要求16所述的方法，其中该病毒是小RNA病毒科的病毒。
29.如权利要求28所述的方法，其中该病毒是肠病毒。
30.如权利要求29所述的方法，其中该病毒是肠病毒71型。
31.一种活体外抗病毒活性的方法，其包括将权利要求1-12任一项的中草药萃取物与病毒接触，藉此抑制病毒的活性。
32.如权利要求31所述的方法，其中该病毒是小RNA病毒科的病毒。
33.如权利要求32所述的方法，其中该病毒是肠病毒。
34.如权利要求33所述的方法，其中该病毒是肠病毒71型。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，特别是以低极性溶剂萃取女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或其混合物的萃取物。本发明还涉及该中草药萃取物的制备方法及应用。
文档编号A61P31/14GK1565595SQ0314657
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月4日 优先权日2003年7月4日
发明者罗立清, 陈联泰, 刘馨瑜 申请人:财团法人工业技术研究院
技术领域：
本发明涉及一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，特别是指一种以低极性溶剂萃取女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或其混合物的萃取物。本发明还涉及该中草药萃取物的制备方法及应用。
背景技术：
病毒依其传播特性，可能经空气、口沫或接触传染途径而引发各种疾病。每年夏、秋二季，在台湾造成重大影响的肠病毒感染症，对国人健康确实造成极大的威胁，特别是对于幼童，肠病毒可经由接触病人的口鼻分泌物、粪便、飞沫等途径传染，尤其人群密集处易造成流行。目前对于肠病毒感染，并无特殊的治疗方法，医师大部分均给予对抗症状的支持性疗法；此外，肠病毒种类繁多且具变异性，因此，无法因为曾受感染而对其他类型的病毒产生终身免疫。预防病毒感染之道，即在于常洗手、加强居家环境清洁及室内通风、带口罩以及避免接触感染者。
美国专利第6,214,350号是有关于女贞(Ligustrum lucidum及/或L.japonicum)果实的水溶液萃取物，其制备方法包括将女贞果实与水接触；分离不溶性成分；将水溶液酸化得到酸沉淀物；以及纯化该酸沉淀物的步骤。该专利揭示了将女贞果实的水溶液萃取物用于治疗B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)以及人体免疫缺损病毒(HIV)。
美国专利第5,888,527号是有关于以儿茶素类及红茶多酚类为活性成分的茶萃取物，该萃取物也为水溶液萃取物，用于对抗真菌、细菌及流感病毒。
到目前为止，并无任何公开文献教示以低极性溶剂萃取女贞果实，并可将该萃取物用以对抗病毒，特别是小RNA病毒(小核糖核酸病毒)科中的肠病毒。此外，由于水是高极性的溶剂，并且由于各种病毒的作用机理不同以及对于不同药物具有高度的特异性，因此，并无法由前揭背景技术而推及本发明的构想以及实施。此外，对于以中草药治疗或预防由病毒所引起的疾病或症状，仍有其需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，其是藉由将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。
本发明的另一目的在于提供一种制备具有抗病毒活性的中草药萃取物的方法，是将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取。
本发明的又一目的在于提供一种活体外抗病毒活性的方法，包括将本发明具有抗病毒活性的中草药萃取物与病毒接触，藉此抑制病毒的活性。
在优选具体实例中，本发明是将具有抗病毒活性的中草药萃取物作为活体外抗病毒活性的应用。
在本发明的说明中，女贞子是指木樨科(Oleaceae)植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的果实；黄精是指百合科(Liliaceae)多年生草本植物，包括黄精(Polygonatum sibiricum Red)、滇黄精(P.kingianum Coll.et Hemsl)或多花黄精(P.cvrtonema Hua)的根或茎；仙鹤草是指蔷薇科(Rosaceae)多年生草本植物仙鹤草(Agrlmonlaallosa Ledeb)全草、根或芽。熟地黄是指玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物地黄(Rehmannia glutinosa(Gaertn.)Libosch)经蒸制后的块状根。
在传统中草药的使用中，药材自天然植物摘取后，通常会经过处理，以利后续储存。例如，熟地黄是由生地黄(或简称地黄)炮制而得。所谓炮制，是指药材根据医疗、调制及制剂的需要，经过加工处理的方法，其主要目的包括(1)降低或清除中药的毒性及副作用；(2)增强中药功效；(3)转变药物性能；(4)清洁药材，提高药物的纯度；(5)利于贮藏，保存药效；以及(6)矫味、矫臭及赋色。
相同地，本发明所使的其它药材也可经适当的步骤处理。例如，女贞子及黄精通常会以加潬(亦即，将药物迅速放入沸水中，经短暂加热后，立即取出的方法)或蒸(利用水蒸气或隔水加热药物的方法)的方式处理，之后将其干燥以利储存。此外，仙鹤草通常是以晒干的方式处理。
无须特别教示，上述的药材处理步骤为本领域技术人员所熟知，并且也涵盖于本发明的范畴内。在本发明的说明中，药材可以包括，但并不限于上述步骤而处理特定植物部位所得到的，或是得自传统民间或中草药店的药材。
一般而言，中草药都是以溶剂萃取法提取其中的有效成分，此为最常见及最常用的方法，而其中，水、甲醇、乙醇或丙酮是较常被使用的萃取溶剂。这些溶剂的特征在于它们的高极性。极性是分子的一种物理性质，分子极性的强弱，由分子的结构决定，并可用偶极矩及介电常数来比较。
上述溶剂中，水是高极性溶剂，其介电常数约为80，对于中草药植物细胞的穿透力大，但由于分子极性强且能形成氢键，因而沸点高、不易浓缩；此外，水萃取物具有易发霉的缺点。甲醇、乙醇及丙酮是属于亲水性的溶剂，其特征为极性较大，与水能混溶，其介电常数分别约为31.2、26.0及21.5；此类溶剂对中草药植物细胞的穿透力强，分子极性比水小，沸点也比水低。至于亲脂性的溶剂是指与水不能混溶、或混溶性低的溶剂，例如，石油醚(介电常数约为1.8)、苯(介电常数约为2.3)、乙醚(介电常数约为4.3)、氯仿(介电常数约为5.2)、乙酸乙酯(介电常数约为6.1)等，对中草药植物细胞的穿透力弱，沸点低。
不同于先前技术中所使用的高极性溶剂(例如，水)，本发明是使用低极性的溶剂作为萃取溶剂，来萃取女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或其混合物中抗病毒的有效成分。优选地，在本发明的中草药中，女贞子是指女贞的果实部位；黄精(包括，但并不限于黄精、滇黄精或多花黄精)是使用其根或茎部位；仙鹤草是使用其全草、根或芽部位；熟地黄是生地黄经蒸制后的块状根。上述一种或多种中草药材的混合物，也是在本发明的范畴内。
因此，本发明的主要目的在于提供一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，是藉由将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。
为了达成较佳的萃取效果，在进行本发明的萃取步骤前，可将上述一种或多种中草药材以捣碎、研磨、切碎等物理方式而尽可能使其变为较小颗粒，优选是以研磨的方式进行，更优选是将上述一种或多种中草药材研磨成粉末状，以利后续的萃取。
在本发明的内容中，名词“低极性”溶剂的定义是指介电常数约为10以下的溶剂，适合的例子包括，但并不限于，乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯或其混合物。
在本发明的一个优选具体实例中，低极性的溶剂是二氯甲烷、正己烷或正丁醇。
在上述一种或多种中草药材磨碎后，以及进行本发明的萃取步骤前，可视需要以甲醇或乙醇或其混合物而进行前萃取步骤。如上所述，虽然甲醇及乙醇是属于亲水性、高极性的溶剂(介电常数约为26至31)，但由于除了蛋白质、油脂及蜡之外，中草药植物细胞中的其它成分在甲醇或乙醇中均有一定程度的溶解度，因此，使用甲醇或乙醇或其混合物进行前萃取，可有助于后续本发明以低极性溶剂的萃取。
将上述一种或多种中草药材以低极性的溶剂萃取后，该萃取物即可加以调配作为各种广泛的应用。然而，为了使萃取物中有效成分的纯度提高，可视需要于本发明的萃取步骤后，进行各种的纯化步骤。将萃取物进行纯化的方法无须特别教示，为本领域普通技术人员所熟知，可使用的方法包括，例如层析法、结晶法、过滤法、沉淀法等，应视所欲达成的目的而决定。
在本发明的优选具体实例中，上述一种或多种中草药材在以至少一种低极性溶剂萃取之后，可进行纯化的步骤，例如利用过滤法，以移除不溶性的成分。在另一优选具体实例中，纯化步骤包括利用硅胶，以二氯甲烷/乙酸乙酯作为冲提液/洗脱液而进行。
本发明的另一的另一方面是提供一种制备具有抗病毒活性的中草药萃取物的方法，是将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。视需要，可于萃取前以甲醇或乙醇或其混合物进行前萃取步骤。同样地，在以低极性溶剂萃取之后，可将萃取物进行纯化的步骤，以得到较纯的有效成分。
本发明同时还提供一种活体外抗病毒活性的方法，其包括将本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物与病毒接触，藉此抑制病毒的活性。
在本发明的内容中，名词“病毒”特别是指小RNA病毒科(Picornaviridae)成员的病毒，尤其是肠病毒(Enterviruses)，特别是肠病毒71型。
本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，可以纯化及/或未纯化的形式使用，或优选地，与传统上用于配方技艺中的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂一起使用，可用于制造各种具有抗病毒功效的制品。为达这个目的，可以传统的方式而对该萃取物适当地赋形成为可乳化的浓缩液(例如，作为洗手乳、洗涤剂、洗衣精、洗发乳)、可涂布的糊状物(例如，作为涂料)、可直接喷洒的溶液(例如，作为喷剂)、稀释的溶液(例如，作为饮料、健康食品)、可充填的成分(例如，作为玩具、擦拭布)、可与载剂相混的粉末、可溶解的粉末、粉尘、颗粒，以及也可包覆在适合的包覆剂中(例如，作为空气过滤器、水滤材、口罩内容物或滤膜)。作为组合物的类型，则可根据所要的目的及主要的环境而选择，例如，喷洒、雾化、喷撒、散播、涂布或乳化等的施用方法。组合物也可包含另外的佐剂，例如，稳定剂、消泡剂、粘度调节剂、粘结剂或发粘剂或其它用于获得特殊效果的配方。
本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，通常是以组合物的形式使用，并可同时或连续地配合其它的物质使用，例如，其它对抗病毒的药物或其混合物或营养成分等，以达到增强抗病毒效果的协同活性。
视需要，也可将本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，调配成治疗或预防病毒(优选是肠病毒，更优选是肠病毒71型)的医药组合物，以治疗或预防肠病毒感染症或重症肠病毒感染症。本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物，可单独地或与医药上可接受的载体或赋形剂结合，以单一剂量或多剂量的形式而施药。医药上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂及赋形剂，可根据传统的技术而调配，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版，Gennaro编辑，Mack出版公司，Easton，PA(1995)中记载的技术。
医药组合物可特定地调配，以用于任何适合的给药途径，例如，口服、直肠、鼻、肺部、局部(包括颊以及舌下)、经皮、池内、腹膜内、阴道及非肠胃道(包括皮下、肌肉内、椎管内、静脉内以及皮内)途径。应了解的是，优选的给药途径将根据一般的症状及被治疗患者的年龄、要治疗症状的特性以及所选择的活性成分而决定。
用于口服施药的医药组合物可包括各类固体剂型，例如，胶囊、锭剂、糖衣锭、药丸、粉末以及颗粒。适合地，它们可根据在本领域中所熟知的方法，而与膜衣(例如，肠衣)一起制备，或者同时适当调配以提供活性成分的控制释放，例如，持续或延长的释放。
用于口服施药的液体剂型包括溶液、乳液、悬浮液、糖浆以及万能药。
用于非肠胃道施药的医药组合物包括无菌水溶液以及非水溶液的注射溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及使用前要再溶解于无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(粉针剂)。
其它适合的施药形式包括栓剂、喷剂、软膏、乳霜、凝胶、吸入剂、皮肤贴片、植入剂等等。
本发明制备的具有抗病毒活性的中草药萃取物的实际剂量，应根据施药的频率及模式、被治疗的患者的性别、年龄、体重以及一般状况、要治疗的症状的特性及严重性以及任何伴随的疾病等因素而决定。
具体实施例方式
本发明将藉由以下实施例进一步详细说明，但该等实施例仅用于举例说明，而非用于限定本发明的实施范畴。
实施例1女贞子萃取物的制备将1.5公斤新鲜女贞子(购自一般市场)，于室温中以乙醇进行前萃取(六次，每次2公升乙醇)，然后将萃取物以二氯甲烷(1-2公升)进行萃取。将萃取物通入装有硅胶柱，以二氯甲烷/乙酸乙酯(10∶1-1∶5)作为洗脱液洗脱，得到本发明的女贞子萃取物(80克)。
实施例2黄精萃取物的制备相同于实施例1的步骤，将等量的黄精以正己烷萃取及纯化，得到本发明的黄精萃取物。
实施例3仙鹤草萃取物的制备相同于实施例1的步骤，将等量的仙鹤草以正己烷萃取及纯化，得到本发明的仙鹤草萃取物。
实施例4熟地黄萃取物的制备相同于实施例1的步骤，将等量的熟地黄以二氯甲烷/正丁醇萃取及纯化，得到本发明的熟地黄萃取物。
实施例5细胞培养将横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma；RD)细胞(得自长庚医院病毒室)培养于含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养液中，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养。细胞继代培养时先以1×磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗两次，接着加入适量的0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA；Gibco)处理细胞，待细胞由培养皿表面脱落之后，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，将细胞均匀打散分置于培养皿中，置于含5％CO2的37℃培养箱中继续培养。
实施例6病毒培养将肠病毒71型的病毒株(Enterovirus 71/Tw/2231/98；得自长庚医院病毒室)，以不含胎牛血清的培养液稀释。将RD细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液，待细胞约九分满时，以1×PBS清洗一次，并加入前述稀释的病毒液，置于含5％CO2的35℃培养箱中吸附1小时之后，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，置于含5％CO2的35℃培养箱中培养。当95％以上的细胞出现变圆脱落的细胞病变时，收集上清液，经离心、冷冻、解冻后，置于-80℃冰箱保存。
实施例7毒性试验将实施例5所培养的细胞，培养于96孔的细胞培养盘，并与待测药物混合1小时之后，再加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，置于含5％CO2的35℃培养箱中培养3-4天。判读时加入5％福尔马林固定1-2小时，并以0.1％结晶紫(J.T.Baker)染色2-3分钟，以水冲洗后，测量OD570nm值。
实施例8中和试验将实施例5所培养的细胞，培养于96孔的细胞培养盘，并将定量的病毒液与待测萃取物混合后，加入培养液中吸附1小时，再加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，置于含5％CO2的35℃培养箱中培养3-4天。判读时加入5％福尔马林固定1-2小时，并以0.1％结晶紫染色2-3分钟，以水冲洗后，测量OD570nm值。
比较例相同于实施例1的步骤，将熟地黄、仙鹤草、黄柏、黄芩及黄精，以高极性的水进行萃取。
此外，将女贞子同实施例1的方法，以乙醇进行前萃取之后，将萃取物再以甲醇萃取，然后在乙酸乙酯∶水(1∶1)之间分层，得到有机相及水溶液相的萃取物。
将实施例1-4的本发明中草药萃取物以及比较例的萃取物，如实施例8的方法进行中和试验，以测定抑制病毒活性的能力。
在中和试验中，本发明以二氯甲烷萃取的女贞子萃取物，在0.66毫克/毫升的浓度，对肠病毒71型具有45％的抑制效果，本发明其它以低极性溶剂萃取的萃取物，例如，熟地黄的二氯甲烷/正丁醇萃取物，在0.1-0.25毫克/毫升的浓度，黄精的正己烷萃取物，在0.1-0.5毫克/毫升的浓度，以及仙鹤草的正己烷萃取物，在0.125-0.25毫克/毫升的浓度，对肠病毒71型均具有抑制效果；相较于其它高极性溶剂的萃取物，本发明的中草药萃取物具有明显的抗病毒活性。此外，相较于前述美国专利的背景技术，是以水作为溶剂而萃取，本发明也以水萃取女贞子作为比较例，结果，女贞子水溶性萃取物对于肠病毒71型并无抑制作用。
此外，在毒性试验中，本发明的女贞子萃取物对RD细胞的百分之五十致死剂量(LD50)为0.247毫克/毫升，也较其它萃取物显示更高的耐受性。
由上述实验结果可知，本发明制备的中草药萃取物可有效对抗肠病毒，特别是肠病毒71型，因此，将该等中草药萃取物应用于例如，空气滤清器、滤膜、口罩、洗手乳、水滤材、涂料、擦拭布等，可将病毒吸附于其上，一方面将病毒阻隔于前述材料上，避免病毒与人体接触而感染，另一方面，具有抗病毒活性的材料可令吸附于其上的病毒失活，使病毒失去感染力，藉此可杜绝病毒的传播途径，对于病毒传播的防治工作，将有极大的助益。因此，本发明实已具备产业利用性。
虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此，本发明的保护范围，当以权利要求书为准。
权利要求
1.一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，是藉由将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取而制成。
2.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中女贞子是木樨科植物女贞的果实。
3.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中黄精是包括百合科植物黄精、滇黄精或多花黄精的根或茎。
4.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中仙鹤草是蔷薇科多年生草本植物仙鹤草的全草、根或芽。
5.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中熟地黄是玄参科多年生草本植物地黄经蒸制后的块状根。
6.如权利要求1所述的中草药萃取物，在该萃取步骤之前，可视需要用选自由甲醇及乙醇所组成的族群中的溶剂进行前萃取。
7.如权利要求1所述的中草药萃取物，在该萃取步骤之后，还包括纯化步骤。
8.如权利要求7所述的中草药萃取物，其中该纯化步骤包括以硅胶进行纯化。
9.如权利要求8所述的中草药萃取物，其中该纯化步骤是以二氯甲烷/乙酸乙酯冲提而进行。
10.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中该低极性的溶剂包括介电常数约为10以下的溶剂。
11.如权利要求10所述的中草药萃取物，其中该低极性的溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇、乙醚或苯。
12.如权利要求11所述的中草药萃取物，其中该低极性的溶剂为二氯甲烷、正己烷或正丁醇。
13.如权利要求1所述的中草药萃取物，其中该病毒是小RNA病毒科的病毒。
14.如权利要求13所述的中草药萃取物，其中所述病毒是肠病毒。
15.如权利要求14所述的中草药萃取物，其中该病毒是肠病毒71型。
16.一种制备具有抗病毒活性的中草药萃取物的方法，是将包括磨碎的女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或上述材料的混合物，以至少一种低极性的溶剂萃取。
17.如权利要求16所述的方法，其中女贞子是木樨科植物女贞的果实。
18.如权利要求16所述的方法，其中黄精是包括百合科植物黄精、滇黄精或多花黄精的根或茎。
19.如权利要求16所述的方法，其中仙鹤草是蔷薇科多年生草本植物仙鹤草的全草、根或芽。
20.如权利要求16所述的方法，其中熟地黄是玄参科多年生草本植物地黄经蒸制后的块状根。
21.如权利要求16所述的方法，在该萃取步骤之前，可视需要用选自由甲醇及乙醇所组成的族群中的溶剂进行前萃取。
22.如权利要求16所述的方法，在该萃取步骤之后，还包括纯化步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中该纯化步骤包括以硅胶进行纯化。
24.如权利要求23所述的方法，其中该纯化步骤是以二氯甲烷/乙酸乙酯冲提而进行。
25.如权利要求16所述的方法，其中该低极性的溶剂包括介电常数约为10以下的溶剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中该低极性的溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇、乙醚或苯。
27.如权利要求26所述的方法，其中该低极性的溶剂是二氯甲烷、正己烷或正丁醇。
28.如权利要求16所述的方法，其中该病毒是小RNA病毒科的病毒。
29.如权利要求28所述的方法，其中该病毒是肠病毒。
30.如权利要求29所述的方法，其中该病毒是肠病毒71型。
31.一种活体外抗病毒活性的方法，其包括将权利要求1-12任一项的中草药萃取物与病毒接触，藉此抑制病毒的活性。
32.如权利要求31所述的方法，其中该病毒是小RNA病毒科的病毒。
33.如权利要求32所述的方法，其中该病毒是肠病毒。
34.如权利要求33所述的方法，其中该病毒是肠病毒71型。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗病毒活性的中草药萃取物，特别是以低极性溶剂萃取女贞子、黄精、仙鹤草、熟地黄或其混合物的萃取物。本发明还涉及该中草药萃取物的制备方法及应用。
文档编号A61P31/14GK1565595SQ0314657
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月4日 优先权日2003年7月4日
发明者罗立清, 陈联泰, 刘馨瑜 申请人:财团法人工业技术研究院
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