格尔德霉素在制备治疗严重急性呼吸综合症(sars)药物中的应用的制作方法
专利名称：格尔德霉素在制备治疗严重急性呼吸综合症(sars)药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及格尔德霉素(Geldanamycin)在制备治疗严重急性呼吸综合症(SARS)药物中的应用。
2003年上半年，我国及世界二十余个国家遭遇了突发性的严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome，英文缩写SARS)(以下简称SARS)的袭击，该病由SARS冠状病毒所致，传染性极强，传染快，潜伏期短，仅有2～14天，感染人数多，发病死亡率高，危害极大，且尚无特效抗病毒药物。
格尔德霉素是由中国医学科学院医药生物技术研究所于湖北省武汉市珞珈山地区土壤中分离的格尔德霉素产生菌(放线菌C-3559)的发酵液中分离纯化的具有广谱抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次级代谢产物。
放线菌C-3559属于链霉菌的吸水类群，黑漆链霉菌，S.atrolaccus Yen 1957。其形态特征包括基丝不断裂，只有气丝形成孢子链，孢子丝呈紧密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑，培养特征包括孢子成熟后，孢子丝自溶使菌落表面形成黑色粘性湿斑(吸水现象)。
生理特征包括1.碳源利用在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖和肌醇等碳源的培养基生长良好。2.其它生理特征纤维素不利用，牛奶胨化，硝酸盐还原阴性。细胞壁化学特征包括含LL-DAP属细胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。
格尔德霉素的提取、分离方法1.发酵液过滤后滤液上X5大孔吸附树脂柱，吸附完毕水冲后，用80％丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黄色沉淀为格尔德霉素粗品。
2.上述格尔德霉素粗品，再用大孔吸附柱进行第二次层析，用80％丙酮洗下有效部分，纯度在90％以上，放在冰箱中析出黄色针状结晶，即为纯度达95％以上的格尔德霉素。再进行二次重结晶，纯度可达98％以上的格尔德霉素。提取回收率可达30％～35％。
对采用上述方法在放线菌C-3559的发酵液中提取分离的单一有效组分，即C-3559活性组份理化性质的测定及鉴别对活性组份进行稳定性、熔点、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及1HNMR及18CNMR及DEPT谱等波谱的测定，并进行了文献资料的检索，发现它与苯安沙霉素类中的格尔德霉素相同。
将两者的性质列表比较于下表
根据上述数据，我们推断活性组分C-3559应有与格尔德霉素相同的结构。
用2003年2月北京SARS病流行期间由军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心病毒室从北京病人肺组织分离的病毒BJ01株及其敏感的Vero-E6细胞，按《新药(西药)临床前研究指导原则》中体外抗病毒药效试验部分的规定，检测格尔德霉素(以下简称C-3559)对Vero-E6细胞的毒性和在Vero-E6细胞内对SARS冠状病毒的抑制效果。重复实验表明格尔德霉素(C-3559)在Vero-E6细胞内抑制SARS冠状病毒的IC50为0.34～1.57umol/L，阳性对照药利巴韦林的IC50为52.0ug/ml。说明格尔德霉素(C-3559)能明显抑制SARS冠状病毒复制。
下面是针对本发明格尔德霉素进行的药物体外抗SARS冠状病毒药效检测报告。
一.试验目的检测C-3559体外抗SARS冠状病毒的作用。检测单位军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心病毒室。
二.材料1.受试药C-3559(纯度＞98％)，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供。
2.阳性对照药物利巴韦林(病毒唑)注射液，0.1g/ml，山东新华制药股份有限公司生产，批准文号H19993063，批号02100020。临床用途用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎与支气管炎。临床成人日用量为一次0.5g，一日2次。
3.细胞Vero-E6细胞，本室细胞库保存。用含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃5％CO2培养箱培养2-3天，传代一次。
4.病毒株SARS冠状病毒，2003年2月SARS冠状病毒流行期间，由本室从北京病人肺组织中分离病毒BJ01株，第5代。
5.试剂DMEM培养基和胎牛血清，Gibco BRL公司产品，批号分别为31600-026和16000-36。
6.仪器96孔细胞培养板，Corning公司。生物倒置显微镜XDS-1B型，重庆光学仪器厂。
三.方法与结果(1)药品的配制方法受试药C-3559，黄色粉末，用DMSO配制成10mmol/L母液，0.22μm一次性针头式滤器过滤除菌，4℃保存。阳性对照药用纯水配制成10mg/ml母液。使用时用细胞生长液配制成所需浓度。
2.C-3559对Vero-E6细胞的毒性作用每毫升30～40万个Vero-E6细胞接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，置37℃ 5％CO2培养箱培养24h，加入不同浓度的测试药，测试药倍比稀释为80～5μmol/L，每个浓度4孔，每孔0.1ml，同时设无药物细胞对照组，培养5天，以观察细胞形态变化(CPE)为指标，每天在倒置显镜下观察记录CPE，完全形态变化为4；75％为3；50％为2；25％为1；无形态变化为0。按照REED-MUENCH方法，计算该药对Vero-E6细胞的最大无毒浓度(TD0)为20μmol/L和半数中毒浓度(TD50)为30μmol/L。阳性对照药利巴韦林的TD0和TD50为大于6000μg/ml。试验重复二次，结果一致。
3.SARS冠状病毒毒力测定(微量法)SARS冠状病毒BJ01株第5代病毒液用DMEM维持液连续10倍稀释10-1～10-10。将稀释的不同浓度的病毒液接种到已长成单层的Vero-E6细胞96孔培养板孔内，每个浓度4孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照，置37℃5％CO2培养箱中培养，连续观察CPE 5～7天，记录结果。按照REED-MUENCH方法计算半数感染剂量(TCID50)。
4.C-3559对SARS冠状病毒的抑制试验(细胞形态变化法)将每毫升30～40万个Vero-E6细胞接种到96孔培养板，37℃5％CO2培养箱中培养24h，弃掉生长液，将SARS冠状病毒BJ01株第5代病毒液，用DMEM维持液稀释为10～100个TCID50/0.1ml，每孔0.1ml接种Vero-E6细胞，吸附2小时，弃掉病毒液。加入不同浓度药液，测试药倍比稀释为20～0.3μmol/L，每孔0.1ml。同时设立正常细胞对照、病毒对照和阳性药物对照组。37℃培养，每天观察细胞形态变化。试验以病毒对照孔完全形态变化时为最终观察时间，记录CPE.按REED-MUENCH方法计算C-3559的半数有效浓度(IC50).试验重复二次，结果见下表。
C-3559抗SARS病毒IC50
小结C-3559在VERO-E6细胞内抑SARS冠状病毒的IC50为0.34～1.57μmol/L，阳性对照药利巴韦林的IC50为52.0μg/ml。
4.结论(1)C-3559对Vero-E6细胞的毒性C-3559加入Vero-E6细胞中培养5天，以细胞形态变化为指标，C-3559的TD0为20μmol/L，TD50为30μmol/L。
(2)C-3559在Vero-E6细胞中对SARS冠状病毒的抑制作用C-3559抑制SARS冠状病毒的IC50为0.34～1.57μmol/L；试验表明C-3559可明显抑制SARS冠状病毒复制；平均IC50为0.96μmol/L。
(3)C-3559的治疗指数(TI)为19～88。
(4)阳性对照药利巴韦林的IC50为52.0μg/ml，TI＞115。注IC50＝抑制50％细胞病变或蚀斑形成的药物浓度。
治疗指数＝TD50/IC50
权利要求
1.格尔德霉素在制备治疗严重急性呼吸综合症(SARS)药物中的应用。
全文摘要
格尔德霉素在制备治疗严重急性呼吸综合症药物中的应用。以细胞病变法格尔德霉素对SARS冠状病毒的抑制试验表明格尔德霉素对SARS冠状病毒复制具有明显抑制作用，IC
文档编号A61P31/14GK1460474SQ0314659
公开日2003年12月10日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者陶佩珍, 娄志贤, 姚天爵 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所
技术领域：
本发明涉及格尔德霉素(Geldanamycin)在制备治疗严重急性呼吸综合症(SARS)药物中的应用。
2003年上半年，我国及世界二十余个国家遭遇了突发性的严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome，英文缩写SARS)(以下简称SARS)的袭击，该病由SARS冠状病毒所致，传染性极强，传染快，潜伏期短，仅有2～14天，感染人数多，发病死亡率高，危害极大，且尚无特效抗病毒药物。
格尔德霉素是由中国医学科学院医药生物技术研究所于湖北省武汉市珞珈山地区土壤中分离的格尔德霉素产生菌(放线菌C-3559)的发酵液中分离纯化的具有广谱抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次级代谢产物。
放线菌C-3559属于链霉菌的吸水类群，黑漆链霉菌，S.atrolaccus Yen 1957。其形态特征包括基丝不断裂，只有气丝形成孢子链，孢子丝呈紧密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑，培养特征包括孢子成熟后，孢子丝自溶使菌落表面形成黑色粘性湿斑(吸水现象)。
生理特征包括1.碳源利用在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖和肌醇等碳源的培养基生长良好。2.其它生理特征纤维素不利用，牛奶胨化，硝酸盐还原阴性。细胞壁化学特征包括含LL-DAP属细胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。
格尔德霉素的提取、分离方法1.发酵液过滤后滤液上X5大孔吸附树脂柱，吸附完毕水冲后，用80％丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黄色沉淀为格尔德霉素粗品。
2.上述格尔德霉素粗品，再用大孔吸附柱进行第二次层析，用80％丙酮洗下有效部分，纯度在90％以上，放在冰箱中析出黄色针状结晶，即为纯度达95％以上的格尔德霉素。再进行二次重结晶，纯度可达98％以上的格尔德霉素。提取回收率可达30％～35％。
对采用上述方法在放线菌C-3559的发酵液中提取分离的单一有效组分，即C-3559活性组份理化性质的测定及鉴别对活性组份进行稳定性、熔点、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及1HNMR及18CNMR及DEPT谱等波谱的测定，并进行了文献资料的检索，发现它与苯安沙霉素类中的格尔德霉素相同。
将两者的性质列表比较于下表
根据上述数据，我们推断活性组分C-3559应有与格尔德霉素相同的结构。
用2003年2月北京SARS病流行期间由军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心病毒室从北京病人肺组织分离的病毒BJ01株及其敏感的Vero-E6细胞，按《新药(西药)临床前研究指导原则》中体外抗病毒药效试验部分的规定，检测格尔德霉素(以下简称C-3559)对Vero-E6细胞的毒性和在Vero-E6细胞内对SARS冠状病毒的抑制效果。重复实验表明格尔德霉素(C-3559)在Vero-E6细胞内抑制SARS冠状病毒的IC50为0.34～1.57umol/L，阳性对照药利巴韦林的IC50为52.0ug/ml。说明格尔德霉素(C-3559)能明显抑制SARS冠状病毒复制。
下面是针对本发明格尔德霉素进行的药物体外抗SARS冠状病毒药效检测报告。
一.试验目的检测C-3559体外抗SARS冠状病毒的作用。检测单位军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心病毒室。
二.材料1.受试药C-3559(纯度＞98％)，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供。
2.阳性对照药物利巴韦林(病毒唑)注射液，0.1g/ml，山东新华制药股份有限公司生产，批准文号H19993063，批号02100020。临床用途用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎与支气管炎。临床成人日用量为一次0.5g，一日2次。
3.细胞Vero-E6细胞，本室细胞库保存。用含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃5％CO2培养箱培养2-3天，传代一次。
4.病毒株SARS冠状病毒，2003年2月SARS冠状病毒流行期间，由本室从北京病人肺组织中分离病毒BJ01株，第5代。
5.试剂DMEM培养基和胎牛血清，Gibco BRL公司产品，批号分别为31600-026和16000-36。
6.仪器96孔细胞培养板，Corning公司。生物倒置显微镜XDS-1B型，重庆光学仪器厂。
三.方法与结果(1)药品的配制方法受试药C-3559，黄色粉末，用DMSO配制成10mmol/L母液，0.22μm一次性针头式滤器过滤除菌，4℃保存。阳性对照药用纯水配制成10mg/ml母液。使用时用细胞生长液配制成所需浓度。
2.C-3559对Vero-E6细胞的毒性作用每毫升30～40万个Vero-E6细胞接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，置37℃ 5％CO2培养箱培养24h，加入不同浓度的测试药，测试药倍比稀释为80～5μmol/L，每个浓度4孔，每孔0.1ml，同时设无药物细胞对照组，培养5天，以观察细胞形态变化(CPE)为指标，每天在倒置显镜下观察记录CPE，完全形态变化为4；75％为3；50％为2；25％为1；无形态变化为0。按照REED-MUENCH方法，计算该药对Vero-E6细胞的最大无毒浓度(TD0)为20μmol/L和半数中毒浓度(TD50)为30μmol/L。阳性对照药利巴韦林的TD0和TD50为大于6000μg/ml。试验重复二次，结果一致。
3.SARS冠状病毒毒力测定(微量法)SARS冠状病毒BJ01株第5代病毒液用DMEM维持液连续10倍稀释10-1～10-10。将稀释的不同浓度的病毒液接种到已长成单层的Vero-E6细胞96孔培养板孔内，每个浓度4孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照，置37℃5％CO2培养箱中培养，连续观察CPE 5～7天，记录结果。按照REED-MUENCH方法计算半数感染剂量(TCID50)。
4.C-3559对SARS冠状病毒的抑制试验(细胞形态变化法)将每毫升30～40万个Vero-E6细胞接种到96孔培养板，37℃5％CO2培养箱中培养24h，弃掉生长液，将SARS冠状病毒BJ01株第5代病毒液，用DMEM维持液稀释为10～100个TCID50/0.1ml，每孔0.1ml接种Vero-E6细胞，吸附2小时，弃掉病毒液。加入不同浓度药液，测试药倍比稀释为20～0.3μmol/L，每孔0.1ml。同时设立正常细胞对照、病毒对照和阳性药物对照组。37℃培养，每天观察细胞形态变化。试验以病毒对照孔完全形态变化时为最终观察时间，记录CPE.按REED-MUENCH方法计算C-3559的半数有效浓度(IC50).试验重复二次，结果见下表。
C-3559抗SARS病毒IC50
小结C-3559在VERO-E6细胞内抑SARS冠状病毒的IC50为0.34～1.57μmol/L，阳性对照药利巴韦林的IC50为52.0μg/ml。
4.结论(1)C-3559对Vero-E6细胞的毒性C-3559加入Vero-E6细胞中培养5天，以细胞形态变化为指标，C-3559的TD0为20μmol/L，TD50为30μmol/L。
(2)C-3559在Vero-E6细胞中对SARS冠状病毒的抑制作用C-3559抑制SARS冠状病毒的IC50为0.34～1.57μmol/L；试验表明C-3559可明显抑制SARS冠状病毒复制；平均IC50为0.96μmol/L。
(3)C-3559的治疗指数(TI)为19～88。
(4)阳性对照药利巴韦林的IC50为52.0μg/ml，TI＞115。注IC50＝抑制50％细胞病变或蚀斑形成的药物浓度。
治疗指数＝TD50/IC50
权利要求
1.格尔德霉素在制备治疗严重急性呼吸综合症(SARS)药物中的应用。
全文摘要
格尔德霉素在制备治疗严重急性呼吸综合症药物中的应用。以细胞病变法格尔德霉素对SARS冠状病毒的抑制试验表明格尔德霉素对SARS冠状病毒复制具有明显抑制作用，IC
文档编号A61P31/14GK1460474SQ0314659
公开日2003年12月10日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者陶佩珍, 娄志贤, 姚天爵 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所
最新回复(0)