黑骨藤提取物，其药物组合物及其药物用途的制作方法
专利名称：黑骨藤提取物，其药物组合物及其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备免疫抑制剂或抗炎药物的用途。
背景技术：
黑骨藤学名为西南杠柳(Periploca forrestii Schltr.)，是萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca L.)植物，在我国西南部地区称之为黑骨藤。根据民间用药经验，其根可药用，具有通经络、祛风湿、舒筋、活血等功能，可用于治疗跌打损伤、关节疼痛、月经不调、口腔炎、乳腺炎等疾病。黑骨藤既可单独使用，也可入复方。在苗药爹拉枪中，黑骨藤与大风藤、追风伞配伍，主治风寒湿痹，肩臂腰腿疼痛。
本发明人经过广泛深入的研究发现，通过以下描述的方法得到的黑骨藤提取物能够明显地抑制小鼠脾细胞增殖反应、迟发型超敏反应和多种炎症反应，具有显著的免疫抑制和抗炎作用，并显示出良好的治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病，以及炎性疾病，如风湿性关节炎的药物作用。基于以上发现本发明得以完成。
发明内容
本发明的一方面涉及黑骨藤提取物，该提取物有明显的免疫抑制和抗炎活性，对自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎、肾病综合症、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病具有治疗作用。
本发明进一步涉及黑骨藤提取物，其特征在于该提取物是通过将黑骨藤用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取得到的。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包括作为活性成分的本发明黑骨藤提取物及一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明还涉及黑骨藤提取物用于制备治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、肾病综合症、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病以及炎性疾病如风湿性关节炎的药物的用途。
本发明还涉及制备黑骨藤提取物的方法，其包括将黑骨藤用有机溶剂、含水有机溶剂或水进行提取。
进一步地，黑骨藤提取物可按如下方法得到将新鲜采集的黑骨藤全植株晾干粉碎，得到黑骨藤粗粉。黑骨藤粗粉用有机溶剂、含水有机溶剂或水多次渗滤或加热回流提取，提取液浓缩干燥后得到黑骨藤提取物。所用有机溶剂选自醇类如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；酮类如丙酮；卤代烷类如氯仿、二氯甲烷等；酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯等；醚类如乙醚；烷烃类如石油醚、汽油等。
根据本发明，本发明的黑骨藤提取物可按如下方法鉴别(1)醋酐浓硫酸试验(Liebermann-Burchard反应)黑骨藤提取物以适量95％乙醇浸取，取浸出液将乙醇蒸干，残渣中加入1毫升冰醋酸使其溶解，再加1毫升醋酐，最后滴入1滴浓硫酸。试管颜色依次经黄—红—紫—蓝—墨绿进行变化，表示有黑骨藤甾醇或甾体皂苷存在。
(2)3，5-二硝基苯甲酸反应(Kedde反应)黑骨藤提取物以适量95％乙醇浸取，取浸出液1ml于试管中，加入3-4滴3，5-二硝基苯甲酸试剂(按以下方法制备1g 3，5-二硝基苯甲酸溶于50ml甲醇，再加50ml 2N氢氧化钠溶液，用时新配)，产生紫红色。
(3)黑骨藤提取物以适量95％乙醇浸取，浸出液为待测液。取黑骨藤原药材5g，粉碎后加50ml 70％乙醇回流提取30分钟，提取液减压蒸干后再用5ml 95％乙醇溶解，作为对照液。待测液和对照液点样于硅胶G薄层板，以展开剂A(氯仿/丙酮，95∶5)或展开剂B(氯仿/乙酸乙酯，60∶40)展开，用25％磷钼酸乙醇溶液显色，待测液和对照液具有相同的显色斑点。
根据本发明，本发明黑骨藤提取物可单独或以药物组合物形式使用，给药方式可根据具体情况而定，并可通过口服、非肠道或局部给药，给药剂型可以是例如片剂、胶囊、膏剂、贴剂、注射剂等。
具体实施例方式
下面的实施例和生物活性实验是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1黑骨藤石油醚提取物的制备将黑骨藤全植株干品5kg粉碎后，用石油醚加热回流提取，每次用石油醚20L，提取三次，合并提取液，减压蒸发至干，得到石油醚提取物230g，其具有前述的定性反应特征。
实施例2黑骨藤乙醇提取物的制备将黑骨藤全植株干品5kg粉碎后，用无水乙醇加热回流提取，每次用乙醇20L，提取三次，合并提取液，减压蒸发至干，得到乙醇提取物450g，其具有前述的定性反应特征。
实施例3黑骨藤水提取物的制备将黑骨藤全植株干品5kg粉碎后，用水加热回流提取，每次用水20L，提取三次，合并提取液，减压浓缩至5L，加无水乙醇35L，静置沉淀，离心除去沉淀物后，上清液减压蒸发至干，得到水提取物200g，其具有前述的定性反应特征。
实施例4黑骨藤提取物(HGTA)的生物活性实验观察指标小鼠脾细胞增殖反应(体外、体内)；二硝基氯苯诱导小鼠迟发型超敏反应(免疫抑制作用)；大鼠速发型Arthus反应(免疫抗炎作用)；巴豆油诱发小鼠耳肿胀试验(抗急性炎症作用)。
生物活性实验中所采用的黑骨藤提取物均为按照实施例2的方法用乙醇作为提取溶剂得到的提取物。
1.黑骨藤提取物对小鼠脾细胞增殖反应的影响(1)黑骨藤提取物体外应用对小鼠脾细胞增殖反应的影响处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液，用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度为5×106细胞/ml，取50μl不同浓度(具体浓度见表1所列)的得自实施例2的黑骨藤提取物、50μl Con A(终浓度为0.5μg/ml)和100μl细胞悬液依次加入96孔板内，对照组用1640培养液代替Con A或/和药物，置于37℃、5％CO2孵温箱孵育56小时，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，继续培养至72小时，以多道细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，80℃烘干后，将玻璃纤维滤纸置于闪烁液内，用液体闪烁计数仪测cpm值。每个样品作4个平行孔，结果用平均cpm值表示。
实验结果表明(表1)，黑骨藤提取物在10μg/ml～500μg/ml浓度范围内，对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应有显著的抑制作用，并有明显的量效关系。
表1、黑骨藤提取物体外给药对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应的影响组别 浓度(μg/ml)3H-TdR掺入值(cpm，x±s)1640 - 135±54Con A0.513618±3272Con A+HGTA 10 7999±1704**50 3240±1498**1002019±904**2001866±354**300567±292**50026±4****P＜0.01，与Con A对照组比较，单因素方差分析Dunnett多重比较，n＝4。HGTA黑骨藤提取物(2)口服黑骨藤提取物对小鼠脾细胞增殖反应的影响Balb/c小鼠，雌性，6-8周。随机分成3组即对照组、黑骨藤提取物0.5g/kg和1.0g/kg两个剂量组，每组8只。给药组每天一次口服给药，共5天。对照组用等体积的生理盐水代替。第6天处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)培养液调整细胞浓度为5×106/ml，取100μl细胞悬液和等量1640或Con A(终浓度0.5μg/ml)加入96孔培养板内，于5％CO2、37℃温箱孵育54小时，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，继续培养至72小时，以多道细胞收集仪收集细胞于滤纸上，干燥后以液体闪烁计数仪测cpm值。每个样品作8个平行孔，结果用平均cpm值表示。
实验结果表明(表2)，口服给予0.5g/kg或1g/kg黑骨藤提取物，对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应有显著的抑制作用，并有剂量依赖关系。
表2、口服黑骨藤提取物对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应的影响剂量3H-TdR掺入值(cpm，x±s)组别(g/kg) Con A(-)Con A(0.5ug/ml)对照组 0 279±98 37713±11083HGTA 0.5489+271 27158±11116*1.0276±134 16532±3850**HGTA黑骨藤提取物，连续口服5天。*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较，单因素方差分析Dunnett多重比较，n＝8。
(3)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物通过体外、体内给药均具有抑制小鼠脾细胞增殖反应的作用，表明其具有抑制小鼠机体免疫功能的作用。上述结果提示黑骨藤提取物对于以免疫功能亢进为特征的自身免疫性疾病可能具有较好的治疗作用。
2.黑骨藤提取物对卵白蛋白诱发的大鼠急性Arthus反应的影响(1)方法及结果Wistar雌性大鼠，体重190±10g。每组7-8只，自由进食进水。模型+黑骨藤提取物组肌肉注射0.5ml 1.7％卵白蛋白、石蜡油与6.3％百日咳疫苗NaCl溶液制成的混合乳状液免疫动物。免疫当日灌胃(ig)给予黑骨藤提取物，每只1.0ml(0.5g/kg)，每天一次，共7天。模型组注射抗原同上，免疫当日灌胃等量双蒸水每天一次，共7天。非免疫对照组肌肉注射等体积溶剂，当日灌胃等量双蒸水，每天一次，共7天。各组动物均于末次给药后1h，用游标卡尺测量左足垫厚度，然后在左脚掌注射0.2ml 1.0％卵白蛋白NaCl溶液加强免疫。加强免疫后于不同时间再次测量左足垫厚度。用加强免疫前后左足垫厚度自身差值表示炎症程度。结果见表3。
表3、黑骨藤提取物对卵白蛋白诱发的大鼠急性Arthus反应的影响左足自身差值(mm，x±SD)测量时间非免疫对照组模型组(n＝7)模型+HGTA(n＝7)(h)(n＝8)11.28±0.47 1.64±0.50.93±0.33##21.41±0.47 1.85±0.3*1.09±0.35##41.55±0.43 1.84±0.31.26±0.27##61.33±0.41 1.54±0.31.07±0.36#81.15±0.33 1.28±0.20.77±0.34##12 0.89±0.22 0.88±0.20.38±0.36##24 0.46±0.25 0.76±0.30.25±0.39#HGTA黑骨藤提取物，0.5g/kg，口服，每天一次，共7天。*P＜0.05，与非免疫对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较，t检验。
(2)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物口服给药可抑制大鼠速发型Arthus反应，表明黑骨藤提取物可能具有免疫抗炎作用。上述结果提示黑骨藤提取物对自身免疫性炎症性疾病如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病等疾病可能具有一定的治疗作用。
3.黑骨藤提取物对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响(1)方法与结果昆明种小鼠，雄性，19-22g，用2％巴豆油混合致炎剂涂敷右耳，左耳为正常对照，每只0.1ml，正反两面各涂0.05ml。致炎后，灌胃黑骨藤提取物一次，8h后称耳重。或于致炎当天上午、傍晚及次日上午各灌胃黑骨藤提取物一次，共给药3次，32h后称耳重。结果见表4。
表4、黑骨藤提取物对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响组别 耳肿胀率(％)(n＝5)剂量(g/kg)8h32h正常CON /7.2±5.2 3.2±1.7模型CON /95.1±21.7** 64.7±19.3**醋酸泼尼松0.045 44.0±11.7## 25.8±25.0#HGTA 0.559.3±24.0# 26.6±18.9#1.065.7±14.029.1±9.4#**P＜0.05，与正常对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与模型对照组比较，t检验。
HGTA黑骨藤提取物(2)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物对巴豆油所致小鼠耳肿胀具有抑制作用，提示其对炎性疾病如风湿性关节炎等具有治疗作用。
4.黑骨藤提取物对迟发型超敏反应的影响(1)方法及结果昆明种小鼠，4-5周，雄性。小鼠腹部用12％硫化钠溶液脱毛，24h后腹部涂5％二硝基氯苯丙酮(DNBC)溶液，每只0.02ml，使之致敏。致敏后第6天口服给药，每天一次，共5天。致敏后第9天每只小鼠用0.02ml 2.5％的DNBC涂耳壳(单面)攻击，48h后测小鼠耳肿胀率。结果见表5。
表5、黑骨藤提取物对小鼠迟发型超敏反应的影响分组 剂量(g/kg)动物数(n) 耳肿胀率(％)正常组 - 82.6±3.4攻击组 - 89.16±8.11模型组 - 840.6±16.2**泼尼松 0.045 812.7±9.7##HGTA 0.25622.4±12.5#0.50820.2±12.4#**P＜0.05，与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，与模型对照组比较，t检验。
HGTA黑骨藤提取物(2)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物对小鼠迟发型超敏反应具有明显的抑制作用，提示其是一种免疫抑制剂，对自身免疫性炎症性疾病如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病和炎性疾病如风湿性关节炎等可能具有一定的治疗作用。
权利要求
1.黑骨藤提取物，其中黑骨藤为萝摩科杠柳属植物西南杠柳的全植株。
2.黑骨藤提取物，其特征在于该提取物是通过将黑骨藤用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取得到的。
3.制备权利要求1所述黑骨藤提取物的方法，包括用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取黑骨藤。
4.权利要求3所述的方法，其中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚和汽油。
5.药物组合物，其包括作为活性成分的权利要求1的黑骨藤提取物和一种或多种药用载体或赋形剂。
6.权利要求1的黑骨藤提取物用于制备治疗自身免疫性疾病的药物的用途。
7.权利要求6所述的用途，其中所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
8.权利要求1的黑骨藤提取物用于制备治疗炎性疾病的药物的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中的炎性疾病为风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物，以及该提取物同于制备治疗自身免疫性疾病或抗炎药物的用途，所述的自身疾病性疾病包括类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎和免疫性血管病，所述的炎性疾病包括风湿性关节炎等。
文档编号A61P29/00GK1569088SQ03146799
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月11日 优先权日2003年7月11日
发明者张永祥, 姚志伟, 齐春会, 赵修南, 魏昌华, 周文霞, 赵毅民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
技术领域：
本发明涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备免疫抑制剂或抗炎药物的用途。
背景技术：
黑骨藤学名为西南杠柳(Periploca forrestii Schltr.)，是萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca L.)植物，在我国西南部地区称之为黑骨藤。根据民间用药经验，其根可药用，具有通经络、祛风湿、舒筋、活血等功能，可用于治疗跌打损伤、关节疼痛、月经不调、口腔炎、乳腺炎等疾病。黑骨藤既可单独使用，也可入复方。在苗药爹拉枪中，黑骨藤与大风藤、追风伞配伍，主治风寒湿痹，肩臂腰腿疼痛。
本发明人经过广泛深入的研究发现，通过以下描述的方法得到的黑骨藤提取物能够明显地抑制小鼠脾细胞增殖反应、迟发型超敏反应和多种炎症反应，具有显著的免疫抑制和抗炎作用，并显示出良好的治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病，以及炎性疾病，如风湿性关节炎的药物作用。基于以上发现本发明得以完成。
发明内容
本发明的一方面涉及黑骨藤提取物，该提取物有明显的免疫抑制和抗炎活性，对自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎、肾病综合症、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病具有治疗作用。
本发明进一步涉及黑骨藤提取物，其特征在于该提取物是通过将黑骨藤用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取得到的。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包括作为活性成分的本发明黑骨藤提取物及一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明还涉及黑骨藤提取物用于制备治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、肾病综合症、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病以及炎性疾病如风湿性关节炎的药物的用途。
本发明还涉及制备黑骨藤提取物的方法，其包括将黑骨藤用有机溶剂、含水有机溶剂或水进行提取。
进一步地，黑骨藤提取物可按如下方法得到将新鲜采集的黑骨藤全植株晾干粉碎，得到黑骨藤粗粉。黑骨藤粗粉用有机溶剂、含水有机溶剂或水多次渗滤或加热回流提取，提取液浓缩干燥后得到黑骨藤提取物。所用有机溶剂选自醇类如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；酮类如丙酮；卤代烷类如氯仿、二氯甲烷等；酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯等；醚类如乙醚；烷烃类如石油醚、汽油等。
根据本发明，本发明的黑骨藤提取物可按如下方法鉴别(1)醋酐浓硫酸试验(Liebermann-Burchard反应)黑骨藤提取物以适量95％乙醇浸取，取浸出液将乙醇蒸干，残渣中加入1毫升冰醋酸使其溶解，再加1毫升醋酐，最后滴入1滴浓硫酸。试管颜色依次经黄—红—紫—蓝—墨绿进行变化，表示有黑骨藤甾醇或甾体皂苷存在。
(2)3，5-二硝基苯甲酸反应(Kedde反应)黑骨藤提取物以适量95％乙醇浸取，取浸出液1ml于试管中，加入3-4滴3，5-二硝基苯甲酸试剂(按以下方法制备1g 3，5-二硝基苯甲酸溶于50ml甲醇，再加50ml 2N氢氧化钠溶液，用时新配)，产生紫红色。
(3)黑骨藤提取物以适量95％乙醇浸取，浸出液为待测液。取黑骨藤原药材5g，粉碎后加50ml 70％乙醇回流提取30分钟，提取液减压蒸干后再用5ml 95％乙醇溶解，作为对照液。待测液和对照液点样于硅胶G薄层板，以展开剂A(氯仿/丙酮，95∶5)或展开剂B(氯仿/乙酸乙酯，60∶40)展开，用25％磷钼酸乙醇溶液显色，待测液和对照液具有相同的显色斑点。
根据本发明，本发明黑骨藤提取物可单独或以药物组合物形式使用，给药方式可根据具体情况而定，并可通过口服、非肠道或局部给药，给药剂型可以是例如片剂、胶囊、膏剂、贴剂、注射剂等。
具体实施例方式
下面的实施例和生物活性实验是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1黑骨藤石油醚提取物的制备将黑骨藤全植株干品5kg粉碎后，用石油醚加热回流提取，每次用石油醚20L，提取三次，合并提取液，减压蒸发至干，得到石油醚提取物230g，其具有前述的定性反应特征。
实施例2黑骨藤乙醇提取物的制备将黑骨藤全植株干品5kg粉碎后，用无水乙醇加热回流提取，每次用乙醇20L，提取三次，合并提取液，减压蒸发至干，得到乙醇提取物450g，其具有前述的定性反应特征。
实施例3黑骨藤水提取物的制备将黑骨藤全植株干品5kg粉碎后，用水加热回流提取，每次用水20L，提取三次，合并提取液，减压浓缩至5L，加无水乙醇35L，静置沉淀，离心除去沉淀物后，上清液减压蒸发至干，得到水提取物200g，其具有前述的定性反应特征。
实施例4黑骨藤提取物(HGTA)的生物活性实验观察指标小鼠脾细胞增殖反应(体外、体内)；二硝基氯苯诱导小鼠迟发型超敏反应(免疫抑制作用)；大鼠速发型Arthus反应(免疫抗炎作用)；巴豆油诱发小鼠耳肿胀试验(抗急性炎症作用)。
生物活性实验中所采用的黑骨藤提取物均为按照实施例2的方法用乙醇作为提取溶剂得到的提取物。
1.黑骨藤提取物对小鼠脾细胞增殖反应的影响(1)黑骨藤提取物体外应用对小鼠脾细胞增殖反应的影响处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液，用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度为5×106细胞/ml，取50μl不同浓度(具体浓度见表1所列)的得自实施例2的黑骨藤提取物、50μl Con A(终浓度为0.5μg/ml)和100μl细胞悬液依次加入96孔板内，对照组用1640培养液代替Con A或/和药物，置于37℃、5％CO2孵温箱孵育56小时，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，继续培养至72小时，以多道细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，80℃烘干后，将玻璃纤维滤纸置于闪烁液内，用液体闪烁计数仪测cpm值。每个样品作4个平行孔，结果用平均cpm值表示。
实验结果表明(表1)，黑骨藤提取物在10μg/ml～500μg/ml浓度范围内，对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应有显著的抑制作用，并有明显的量效关系。
表1、黑骨藤提取物体外给药对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应的影响组别 浓度(μg/ml)3H-TdR掺入值(cpm，x±s)1640 - 135±54Con A0.513618±3272Con A+HGTA 10 7999±1704**50 3240±1498**1002019±904**2001866±354**300567±292**50026±4****P＜0.01，与Con A对照组比较，单因素方差分析Dunnett多重比较，n＝4。HGTA黑骨藤提取物(2)口服黑骨藤提取物对小鼠脾细胞增殖反应的影响Balb/c小鼠，雌性，6-8周。随机分成3组即对照组、黑骨藤提取物0.5g/kg和1.0g/kg两个剂量组，每组8只。给药组每天一次口服给药，共5天。对照组用等体积的生理盐水代替。第6天处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)培养液调整细胞浓度为5×106/ml，取100μl细胞悬液和等量1640或Con A(终浓度0.5μg/ml)加入96孔培养板内，于5％CO2、37℃温箱孵育54小时，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，继续培养至72小时，以多道细胞收集仪收集细胞于滤纸上，干燥后以液体闪烁计数仪测cpm值。每个样品作8个平行孔，结果用平均cpm值表示。
实验结果表明(表2)，口服给予0.5g/kg或1g/kg黑骨藤提取物，对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应有显著的抑制作用，并有剂量依赖关系。
表2、口服黑骨藤提取物对Balb/c小鼠脾细胞增殖反应的影响剂量3H-TdR掺入值(cpm，x±s)组别(g/kg) Con A(-)Con A(0.5ug/ml)对照组 0 279±98 37713±11083HGTA 0.5489+271 27158±11116*1.0276±134 16532±3850**HGTA黑骨藤提取物，连续口服5天。*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较，单因素方差分析Dunnett多重比较，n＝8。
(3)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物通过体外、体内给药均具有抑制小鼠脾细胞增殖反应的作用，表明其具有抑制小鼠机体免疫功能的作用。上述结果提示黑骨藤提取物对于以免疫功能亢进为特征的自身免疫性疾病可能具有较好的治疗作用。
2.黑骨藤提取物对卵白蛋白诱发的大鼠急性Arthus反应的影响(1)方法及结果Wistar雌性大鼠，体重190±10g。每组7-8只，自由进食进水。模型+黑骨藤提取物组肌肉注射0.5ml 1.7％卵白蛋白、石蜡油与6.3％百日咳疫苗NaCl溶液制成的混合乳状液免疫动物。免疫当日灌胃(ig)给予黑骨藤提取物，每只1.0ml(0.5g/kg)，每天一次，共7天。模型组注射抗原同上，免疫当日灌胃等量双蒸水每天一次，共7天。非免疫对照组肌肉注射等体积溶剂，当日灌胃等量双蒸水，每天一次，共7天。各组动物均于末次给药后1h，用游标卡尺测量左足垫厚度，然后在左脚掌注射0.2ml 1.0％卵白蛋白NaCl溶液加强免疫。加强免疫后于不同时间再次测量左足垫厚度。用加强免疫前后左足垫厚度自身差值表示炎症程度。结果见表3。
表3、黑骨藤提取物对卵白蛋白诱发的大鼠急性Arthus反应的影响左足自身差值(mm，x±SD)测量时间非免疫对照组模型组(n＝7)模型+HGTA(n＝7)(h)(n＝8)11.28±0.47 1.64±0.50.93±0.33##21.41±0.47 1.85±0.3*1.09±0.35##41.55±0.43 1.84±0.31.26±0.27##61.33±0.41 1.54±0.31.07±0.36#81.15±0.33 1.28±0.20.77±0.34##12 0.89±0.22 0.88±0.20.38±0.36##24 0.46±0.25 0.76±0.30.25±0.39#HGTA黑骨藤提取物，0.5g/kg，口服，每天一次，共7天。*P＜0.05，与非免疫对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较，t检验。
(2)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物口服给药可抑制大鼠速发型Arthus反应，表明黑骨藤提取物可能具有免疫抗炎作用。上述结果提示黑骨藤提取物对自身免疫性炎症性疾病如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病等疾病可能具有一定的治疗作用。
3.黑骨藤提取物对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响(1)方法与结果昆明种小鼠，雄性，19-22g，用2％巴豆油混合致炎剂涂敷右耳，左耳为正常对照，每只0.1ml，正反两面各涂0.05ml。致炎后，灌胃黑骨藤提取物一次，8h后称耳重。或于致炎当天上午、傍晚及次日上午各灌胃黑骨藤提取物一次，共给药3次，32h后称耳重。结果见表4。
表4、黑骨藤提取物对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响组别 耳肿胀率(％)(n＝5)剂量(g/kg)8h32h正常CON /7.2±5.2 3.2±1.7模型CON /95.1±21.7** 64.7±19.3**醋酸泼尼松0.045 44.0±11.7## 25.8±25.0#HGTA 0.559.3±24.0# 26.6±18.9#1.065.7±14.029.1±9.4#**P＜0.05，与正常对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与模型对照组比较，t检验。
HGTA黑骨藤提取物(2)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物对巴豆油所致小鼠耳肿胀具有抑制作用，提示其对炎性疾病如风湿性关节炎等具有治疗作用。
4.黑骨藤提取物对迟发型超敏反应的影响(1)方法及结果昆明种小鼠，4-5周，雄性。小鼠腹部用12％硫化钠溶液脱毛，24h后腹部涂5％二硝基氯苯丙酮(DNBC)溶液，每只0.02ml，使之致敏。致敏后第6天口服给药，每天一次，共5天。致敏后第9天每只小鼠用0.02ml 2.5％的DNBC涂耳壳(单面)攻击，48h后测小鼠耳肿胀率。结果见表5。
表5、黑骨藤提取物对小鼠迟发型超敏反应的影响分组 剂量(g/kg)动物数(n) 耳肿胀率(％)正常组 - 82.6±3.4攻击组 - 89.16±8.11模型组 - 840.6±16.2**泼尼松 0.045 812.7±9.7##HGTA 0.25622.4±12.5#0.50820.2±12.4#**P＜0.05，与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，与模型对照组比较，t检验。
HGTA黑骨藤提取物(2)讨论上述实验结果表明，黑骨藤提取物对小鼠迟发型超敏反应具有明显的抑制作用，提示其是一种免疫抑制剂，对自身免疫性炎症性疾病如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病和炎性疾病如风湿性关节炎等可能具有一定的治疗作用。
权利要求
1.黑骨藤提取物，其中黑骨藤为萝摩科杠柳属植物西南杠柳的全植株。
2.黑骨藤提取物，其特征在于该提取物是通过将黑骨藤用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取得到的。
3.制备权利要求1所述黑骨藤提取物的方法，包括用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取黑骨藤。
4.权利要求3所述的方法，其中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚和汽油。
5.药物组合物，其包括作为活性成分的权利要求1的黑骨藤提取物和一种或多种药用载体或赋形剂。
6.权利要求1的黑骨藤提取物用于制备治疗自身免疫性疾病的药物的用途。
7.权利要求6所述的用途，其中所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
8.权利要求1的黑骨藤提取物用于制备治疗炎性疾病的药物的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中的炎性疾病为风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物，以及该提取物同于制备治疗自身免疫性疾病或抗炎药物的用途，所述的自身疾病性疾病包括类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎和免疫性血管病，所述的炎性疾病包括风湿性关节炎等。
文档编号A61P29/00GK1569088SQ03146799
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月11日 优先权日2003年7月11日
发明者张永祥, 姚志伟, 齐春会, 赵修南, 魏昌华, 周文霞, 赵毅民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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