一种组织工程化骨的制造方法
专利名称：一种组织工程化骨的制造方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种组织工程化骨的制造方法。
背景技术：
临床上多种原因常常造成骨组织腔隙性缺损，如无菌性炎症造成的股骨头坏死，上颌窦肿瘤术后遗留的腔隙以及拔牙牙齿拔除后产生的牙槽窝等。对这些缺损的治疗目前尚没有理想的方法。股骨头坏死大多等到骨皮质或关节面塌陷后进行人工关节置换，后者无法实现关节功能的生理性恢复，而且会引起许多并发症；上颌窦肿瘤切除术后留下的缺损往往采用转移肌皮瓣修复或不修复，两者都会造成面形的改变，令患者难以接受，甚至有生不如死的感觉；拔牙术后留下的牙槽窝目前多不修复，自然愈合，但实际上往往导致骨化水平低，骨量不足，为日后的镶牙等修复治疗带来困难。
自体骨移植是治疗腔隙性骨缺损的最佳途径，但因来源有限而受到限制。既往研究中曾开发出多种生物相容性和机械力学特性良好的生物学材料用于骨缺损腔隙填塞，但实践证明其效果并不理想，单纯的修复材料移植后材料骨化能力差，达不到预期的效果。近年组织工程学研究表明，将具有生物活性的支架材料与细胞结合起来构建一种组织工程化的组织有望实现缺损的生理性修复。其中的种子细胞可以是成骨细胞或骨膜细胞。但实际上这两种细胞都存在取材困难、体外培养容易丢失表型、不能连续传代获得足够数量等问题。骨髓间充质干细胞能够在体外连续传代、大量扩增而不丧失其表型和多向分化能力(包括向成骨细胞的分化)。这种特性使其成为骨组织工程种子细胞的理想选择。
组织工程技术的兴起为软骨组织的生理性修复带来了希望。国内外文献相继报道有采用该技术构建软骨，在裸鼠和具有免疫力的小鼠、大鼠、兔、猪等动物体内取得成功的例子。但这些研究所采用的支架材料均是聚合物或胶原等有机大分子。而聚合物在体内降解时会造成酸性产物堆积，给软骨组织新生带来不利的影响；胶原或凝胶类材料则遇水后容易形变，不足以对软骨的新生提供持续有力的支撑。以上两种不足严重限制了软骨组织工程产品的开发和应用。
珊瑚羟基磷灰石人造骨是以特定的天然优质海洋珊瑚为原料，采用专利技术，经过一系列复杂的热液置换反应，将珊瑚中的矿物成分转换为羟基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙结构，最后得到物理结构和无机成分与人体骨相似的产品，可为新骨组织的生长提供天然的通道和容纳场所。其产品主要的特点是1)物理结构和化学组成与人体骨相似；2)具有很好的生物相容性、骨传导性和一定的骨诱导性；3)愈合时间与自体骨移植相等；4)无自体骨移植带来的痛苦、额外费用和血肿、感染、出血等疾病；5)现代工艺制作，有颗粒、块状、异形等多种形式、多种规格。其中颗粒状材料的微结构模拟了自然骨片的结构，孔与孔之间相互连通，具有特别好的通透性。这种天然的孔状结构可以促进结缔组织的快速生长和紧随其后的骨沉积。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程化骨的制造方法，其特征是以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，与珊瑚-羟基磷灰石颗粒复合构建组织工程化骨。本发明选用自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，该细胞可取自患者自体骨髓或经药物动员后的血液，创伤小，不会造成二次创伤，容易被患者接受，同时该细胞在体外易培养、扩增能力强，而表型不易丢失，在一定的诱导条件下容易向成骨细胞表型分化。支架材料采用珊瑚-羟基磷灰石颗粒，该材料的基本成分-磷酸钙和羟基磷灰石也是天然骨组织的主要无机组分，因此具有优良的生物相容性和机械力学特性和骨传到活性。另外，在加工上材料预制成颗粒状，由于设计成多孔结构，既提高了材料的力学性能，又增加了细胞的长入性，有利于新生骨组织的形成。
本发明的技术方案是1)自体骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增局麻下无菌抽取骨髓5～10ml，采用密度梯度离心法用1073g/l的percol分离有核细胞，置于培养瓶或培养板中，在含10～20％胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞克隆长出并60～75％汇合时用0.25％的胰蛋白酶消化1∶2传代。以后每2～3天换液，细胞65～70％汇合时1∶2或1∶3传代。收集第8～15代细胞用于构建。
2)珊瑚-羟基磷灰石支架材料的预处理可珊瑚-羟基磷灰石材料预制成各种规格的颗粒状，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时消毒。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌于纱布吸干液体。
3)组织工程化骨的构建将第8～15代骨髓间充质干细胞制成1～2×107/ml的细胞悬液，轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。将细胞-材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。然后转移入旋转式生物反应器内进行三维立体培养。旋转速度15~50rpm。
4)体内植入将经体外培育的细胞-材料复合体机械填塞入暴露的骨缺损腔隙内，用骨模瓣、肌皮瓣或粘膜瓣覆盖创面，紧密缝合伤口。
有益效果本发明提供用于治疗某些腔隙性骨缺损的组织工程化骨。所述骨缺损可以是无菌性炎症造成的股骨头坏死，肿瘤等术后造成的大快腔隙性骨缺损或拔牙后留下的牙槽窝等，需要填充腔隙以恢复形态或保留功能。本发明所构建的组织工程化骨机械强度高，体内骨化能力强。由于自体骨髓间充质干细胞取材方便、容易扩增，珊瑚-羟基磷灰石支架材料便于产业化生产，构建方法操作方便，易于实施，因此，本发明具有广阔的临床应用前景。
具体实施例方式
用可粒状组织工程化骨修复犬牙槽窝实施例1犬自体骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增将12只成年家犬戊巴比妥钠静脉给药麻醉后用预肝素化的针管自髂脊抽取骨髓5～10ml，采用密度梯度离心法用1073g/l的percol分离有核细胞，500g，20～30rpm离心15分钟，小心吸取界面处的白色细胞环置于培养瓶或培养板中，在含10～20％胎牛血清的DMEM培养基中培养。待细胞克隆长出并60～75％汇合时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞并1∶2传代。以后每2～3天换液，细胞65～70％汇合时1∶2或1∶3传代。收集第8～15代细胞用于构建。
实施例2组织工程化骨颗粒的构建将第8～15代犬骨髓间充质干细胞制成1～2×107/ml的细胞悬液，滴加在支架材料颗粒上，并轻轻翻转材料，使细胞在所有材料颗粒上分布尽量均匀。将细胞-材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。然后转移入旋转式生物反应器内进行三维立体培养。旋转速度15~50rpm。
实施例3组织工程化骨颗粒的体内植入戊巴比妥钠静脉给药麻醉后拔除A7、B7、C7、D7，A7和D7作为对照组，直接拉拢缝合创面，不作填塞修复；B7和C7作为实验组植入对应的上述自体细胞-材料复合体，每个牙槽窝植入体积以与周围正常牙槽骨高度平齐为准。
结果术后3个月后取材，大体观察发现实验组牙槽窝表面高度与周围正常牙槽脊高度接近，而对照组牙槽窝表面高度明显低于周围牙槽脊水平。X线照片显示实验组牙槽窝为高密度影，其高点与周围牙槽骨平齐，而对照组牙槽窝仅有部分高密度影，其高度明显低于周围正常的牙槽骨。组织学检测发现，实验组牙槽窝内新生组织为骨组织，对照组在牙槽窝底部有少许骨组织形成，表面有较厚的纤维结缔组织覆盖。该实验结果证实采用本发明构建的组织工程化骨颗粒充填牙槽窝可有效保持拔牙后牙槽窝的骨面高度，有利于后期的种植、镶牙等修复治疗。
权利要求
1.一种组织工程化骨的制造方法，其特征是以骨髓间充质干细胞为种子细胞与颗粒状珊瑚-羟基磷灰石复合构建组织工程化骨。
2.权利要求1中所述的骨髓间充质干细胞为自体骨髓间充质干细胞，采用密度梯度离心法用1073g/l的percol分离获得，体外培养扩增5～10代后收集细胞，用于构建。细胞的培养代数视缺损大小而定。
3.权利要求1中所述的支架材料是珊瑚-羟基磷灰石多孔材料。该材料的基本成分——磷酸钙和羟基磷灰石也是天然骨组织的主要无机组分，因此具有优良的生物相容性和机械力学特性。
4.权利要求1中所述的珊瑚-羟基磷灰石支架材料具有多孔的微结构，既提高了材料的力学性能，又增加了细胞的长入性，有利于新生骨组织的形成。在加工上预制成不同规格的颗粒状，颗粒的直径可以在1～5mm之间，孔径可以在200μ～500μ之间，孔隙率可以在35～55％之间。
5.权利要求1中所述的构建方法是应用组织工程技术，将骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石颗粒复合后先静置6～8小时，使细胞爬入材料内部贴附在材料空洞内表面；再在反应器内孵育48小时。
6.权利要求5中所述的孵育，其条件是将复合体与含10～20％胎牛血清的DMEM培养基混合，置于反应器中，反应器置于CO2细胞培养箱内，旋转速度为15～50rpm。
7.权利要求5中所述的反应器可以是旋转式生物反应器，也可以是其它类似的动态立体培养装置。
8.权利要求1所述的组织工程化骨可以修复腔隙性骨缺损，可以是拔牙后留下的牙槽窝，或是股骨头坏死但关节面尚未塌陷、还可以是上和窦肿瘤切除后留下的骨性腔隙，也可以是创伤或疾病等其它原因造成的骨性腔隙。所构建的组织工程化骨可以填塞这些骨缺损腔隙，实现功能性治疗。
全文摘要
本发明涉及一种组织工程化骨的制造方法，属组织工程领域。采用一种无机生物支架材料(珊瑚－羟基磷灰石)与组织细胞(骨髓间充质干细胞)复合构建骨组织。所构建的颗粒状骨组织填塞于骨缺损腔隙，可实现腔隙性骨损伤的功能性修复，具有明显的临床应用前景。
文档编号A61L27/12GK1565644SQ0314791
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者郭希民, 王常勇, 段翠密, 赵强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
技术领域：
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种组织工程化骨的制造方法。
背景技术：
临床上多种原因常常造成骨组织腔隙性缺损，如无菌性炎症造成的股骨头坏死，上颌窦肿瘤术后遗留的腔隙以及拔牙牙齿拔除后产生的牙槽窝等。对这些缺损的治疗目前尚没有理想的方法。股骨头坏死大多等到骨皮质或关节面塌陷后进行人工关节置换，后者无法实现关节功能的生理性恢复，而且会引起许多并发症；上颌窦肿瘤切除术后留下的缺损往往采用转移肌皮瓣修复或不修复，两者都会造成面形的改变，令患者难以接受，甚至有生不如死的感觉；拔牙术后留下的牙槽窝目前多不修复，自然愈合，但实际上往往导致骨化水平低，骨量不足，为日后的镶牙等修复治疗带来困难。
自体骨移植是治疗腔隙性骨缺损的最佳途径，但因来源有限而受到限制。既往研究中曾开发出多种生物相容性和机械力学特性良好的生物学材料用于骨缺损腔隙填塞，但实践证明其效果并不理想，单纯的修复材料移植后材料骨化能力差，达不到预期的效果。近年组织工程学研究表明，将具有生物活性的支架材料与细胞结合起来构建一种组织工程化的组织有望实现缺损的生理性修复。其中的种子细胞可以是成骨细胞或骨膜细胞。但实际上这两种细胞都存在取材困难、体外培养容易丢失表型、不能连续传代获得足够数量等问题。骨髓间充质干细胞能够在体外连续传代、大量扩增而不丧失其表型和多向分化能力(包括向成骨细胞的分化)。这种特性使其成为骨组织工程种子细胞的理想选择。
组织工程技术的兴起为软骨组织的生理性修复带来了希望。国内外文献相继报道有采用该技术构建软骨，在裸鼠和具有免疫力的小鼠、大鼠、兔、猪等动物体内取得成功的例子。但这些研究所采用的支架材料均是聚合物或胶原等有机大分子。而聚合物在体内降解时会造成酸性产物堆积，给软骨组织新生带来不利的影响；胶原或凝胶类材料则遇水后容易形变，不足以对软骨的新生提供持续有力的支撑。以上两种不足严重限制了软骨组织工程产品的开发和应用。
珊瑚羟基磷灰石人造骨是以特定的天然优质海洋珊瑚为原料，采用专利技术，经过一系列复杂的热液置换反应，将珊瑚中的矿物成分转换为羟基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙结构，最后得到物理结构和无机成分与人体骨相似的产品，可为新骨组织的生长提供天然的通道和容纳场所。其产品主要的特点是1)物理结构和化学组成与人体骨相似；2)具有很好的生物相容性、骨传导性和一定的骨诱导性；3)愈合时间与自体骨移植相等；4)无自体骨移植带来的痛苦、额外费用和血肿、感染、出血等疾病；5)现代工艺制作，有颗粒、块状、异形等多种形式、多种规格。其中颗粒状材料的微结构模拟了自然骨片的结构，孔与孔之间相互连通，具有特别好的通透性。这种天然的孔状结构可以促进结缔组织的快速生长和紧随其后的骨沉积。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程化骨的制造方法，其特征是以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，与珊瑚-羟基磷灰石颗粒复合构建组织工程化骨。本发明选用自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，该细胞可取自患者自体骨髓或经药物动员后的血液，创伤小，不会造成二次创伤，容易被患者接受，同时该细胞在体外易培养、扩增能力强，而表型不易丢失，在一定的诱导条件下容易向成骨细胞表型分化。支架材料采用珊瑚-羟基磷灰石颗粒，该材料的基本成分-磷酸钙和羟基磷灰石也是天然骨组织的主要无机组分，因此具有优良的生物相容性和机械力学特性和骨传到活性。另外，在加工上材料预制成颗粒状，由于设计成多孔结构，既提高了材料的力学性能，又增加了细胞的长入性，有利于新生骨组织的形成。
本发明的技术方案是1)自体骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增局麻下无菌抽取骨髓5～10ml，采用密度梯度离心法用1073g/l的percol分离有核细胞，置于培养瓶或培养板中，在含10～20％胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞克隆长出并60～75％汇合时用0.25％的胰蛋白酶消化1∶2传代。以后每2～3天换液，细胞65～70％汇合时1∶2或1∶3传代。收集第8～15代细胞用于构建。
2)珊瑚-羟基磷灰石支架材料的预处理可珊瑚-羟基磷灰石材料预制成各种规格的颗粒状，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时消毒。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌于纱布吸干液体。
3)组织工程化骨的构建将第8～15代骨髓间充质干细胞制成1～2×107/ml的细胞悬液，轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。将细胞-材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。然后转移入旋转式生物反应器内进行三维立体培养。旋转速度15~50rpm。
4)体内植入将经体外培育的细胞-材料复合体机械填塞入暴露的骨缺损腔隙内，用骨模瓣、肌皮瓣或粘膜瓣覆盖创面，紧密缝合伤口。
有益效果本发明提供用于治疗某些腔隙性骨缺损的组织工程化骨。所述骨缺损可以是无菌性炎症造成的股骨头坏死，肿瘤等术后造成的大快腔隙性骨缺损或拔牙后留下的牙槽窝等，需要填充腔隙以恢复形态或保留功能。本发明所构建的组织工程化骨机械强度高，体内骨化能力强。由于自体骨髓间充质干细胞取材方便、容易扩增，珊瑚-羟基磷灰石支架材料便于产业化生产，构建方法操作方便，易于实施，因此，本发明具有广阔的临床应用前景。
具体实施例方式
用可粒状组织工程化骨修复犬牙槽窝实施例1犬自体骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增将12只成年家犬戊巴比妥钠静脉给药麻醉后用预肝素化的针管自髂脊抽取骨髓5～10ml，采用密度梯度离心法用1073g/l的percol分离有核细胞，500g，20～30rpm离心15分钟，小心吸取界面处的白色细胞环置于培养瓶或培养板中，在含10～20％胎牛血清的DMEM培养基中培养。待细胞克隆长出并60～75％汇合时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞并1∶2传代。以后每2～3天换液，细胞65～70％汇合时1∶2或1∶3传代。收集第8～15代细胞用于构建。
实施例2组织工程化骨颗粒的构建将第8～15代犬骨髓间充质干细胞制成1～2×107/ml的细胞悬液，滴加在支架材料颗粒上，并轻轻翻转材料，使细胞在所有材料颗粒上分布尽量均匀。将细胞-材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。然后转移入旋转式生物反应器内进行三维立体培养。旋转速度15~50rpm。
实施例3组织工程化骨颗粒的体内植入戊巴比妥钠静脉给药麻醉后拔除A7、B7、C7、D7，A7和D7作为对照组，直接拉拢缝合创面，不作填塞修复；B7和C7作为实验组植入对应的上述自体细胞-材料复合体，每个牙槽窝植入体积以与周围正常牙槽骨高度平齐为准。
结果术后3个月后取材，大体观察发现实验组牙槽窝表面高度与周围正常牙槽脊高度接近，而对照组牙槽窝表面高度明显低于周围牙槽脊水平。X线照片显示实验组牙槽窝为高密度影，其高点与周围牙槽骨平齐，而对照组牙槽窝仅有部分高密度影，其高度明显低于周围正常的牙槽骨。组织学检测发现，实验组牙槽窝内新生组织为骨组织，对照组在牙槽窝底部有少许骨组织形成，表面有较厚的纤维结缔组织覆盖。该实验结果证实采用本发明构建的组织工程化骨颗粒充填牙槽窝可有效保持拔牙后牙槽窝的骨面高度，有利于后期的种植、镶牙等修复治疗。
权利要求
1.一种组织工程化骨的制造方法，其特征是以骨髓间充质干细胞为种子细胞与颗粒状珊瑚-羟基磷灰石复合构建组织工程化骨。
2.权利要求1中所述的骨髓间充质干细胞为自体骨髓间充质干细胞，采用密度梯度离心法用1073g/l的percol分离获得，体外培养扩增5～10代后收集细胞，用于构建。细胞的培养代数视缺损大小而定。
3.权利要求1中所述的支架材料是珊瑚-羟基磷灰石多孔材料。该材料的基本成分——磷酸钙和羟基磷灰石也是天然骨组织的主要无机组分，因此具有优良的生物相容性和机械力学特性。
4.权利要求1中所述的珊瑚-羟基磷灰石支架材料具有多孔的微结构，既提高了材料的力学性能，又增加了细胞的长入性，有利于新生骨组织的形成。在加工上预制成不同规格的颗粒状，颗粒的直径可以在1～5mm之间，孔径可以在200μ～500μ之间，孔隙率可以在35～55％之间。
5.权利要求1中所述的构建方法是应用组织工程技术，将骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石颗粒复合后先静置6～8小时，使细胞爬入材料内部贴附在材料空洞内表面；再在反应器内孵育48小时。
6.权利要求5中所述的孵育，其条件是将复合体与含10～20％胎牛血清的DMEM培养基混合，置于反应器中，反应器置于CO2细胞培养箱内，旋转速度为15～50rpm。
7.权利要求5中所述的反应器可以是旋转式生物反应器，也可以是其它类似的动态立体培养装置。
8.权利要求1所述的组织工程化骨可以修复腔隙性骨缺损，可以是拔牙后留下的牙槽窝，或是股骨头坏死但关节面尚未塌陷、还可以是上和窦肿瘤切除后留下的骨性腔隙，也可以是创伤或疾病等其它原因造成的骨性腔隙。所构建的组织工程化骨可以填塞这些骨缺损腔隙，实现功能性治疗。
全文摘要
本发明涉及一种组织工程化骨的制造方法，属组织工程领域。采用一种无机生物支架材料(珊瑚－羟基磷灰石)与组织细胞(骨髓间充质干细胞)复合构建骨组织。所构建的颗粒状骨组织填塞于骨缺损腔隙，可实现腔隙性骨损伤的功能性修复，具有明显的临床应用前景。
文档编号A61L27/12GK1565644SQ0314791
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者郭希民, 王常勇, 段翠密, 赵强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
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