一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法
专利名称：一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法
技术领域：
本发明属组织工程学领域，具体涉及一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。
背景技术：
构建组织工程化心肌组织，支架材料至关重要。心肌细胞和心肌组织的特性要求支架材料不仅要有良好的生物相容性和可降解性，而且要有适合心肌细胞生长发育和生理功能发挥，因此对支架材料的要求要比培养一般的组织更高。目前，构建组织工程化心肌组织的支架材料主要有两种，一种是人工合成的各种聚合物，如聚乳酸等，另一种是天然的各种生物大分子，如各种胶原等。用这两类支架材料人们都已在体外构建出组织工程化跳动的心肌组织，但质量上仍不理想。天然心肌的细胞外基质为心肌细胞的生长发育和和功能发挥提供了最好的环境，根据这一假定人们开始用类似于天然心肌细胞外基质的支架材料构建组织工程化心肌。心肌的基质部分主要由胶原组成，除此之外还含有少量的弹性蛋白、层粘连蛋白(laminin)和纤维粘连蛋白。胶原中85％是I型，其次是III和V型。这些细胞外基质不仅为心脏中的各种细胞提供附着点，而且还是传递心肌细胞收缩力的网络，并阻止心肌细胞的滑动等。心脏中细胞外基质的微小改变都将会影响心脏功能的发挥。心脏中细胞外基质的组成和比例为心肌细胞的生长、发育和功能的发挥提供了最好的环境。Thomas Eschenhagen等用I型胶原，再添加细胞外基质(ECM，主要成分laminin、V型胶原等)和鸡胚抽提物等的混合物作为构建心肌的支架材料。用这种支架材料可构建出类似于天然组织的一致跳动的工程化心肌组织。这一实验表明用类似于心肌细胞外基质组成成分的基质作为支架有利于心肌细胞的发育和功能的发挥。另有实验研究表明层粘连蛋白的存在对于心肌细胞形态表型的发育至关重要，在涂有层粘连蛋白的表面接种的心肌细胞可以发育成类似体内心肌的结构，因此ECM中层粘连蛋白的作用是其作用的主要体现。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。该支架原始形态是一种液态水凝胶，主要组成成份包括液态胶原(I型和III型等)、弹性蛋白、层粘连蛋白、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清等。各种组份按如下比例和方式混合形成等渗的溶液胶原和弹性蛋白1∶1混合得混合物1，在2×DMEM中添加20％的马血清和4％的鸡胚抽提物得混合物2，混合物1和混合物2再按1∶1的比例混合得混合物3，混合物3用0.1M的NaOH中和成中性得混合物4，混合物4中添加1％的laminin得混合物5，混合物即为支架材料。将支架材料与心肌细胞混合，轻轻吹打，使细胞在材料中分布均匀，然后将混合液滴入硅胶制成的环形凹槽中，槽宽在2-8mm，槽深3-9mm。在37℃条件下各组分相互作用即可形成一定形状的心肌细胞-支架构建物。该方法中心肌细胞先与液态的水凝胶混合可使心肌细胞比较均匀地分布在支架材料中。与预先成型的支架材料相比，可使心肌细胞与支架材料共定位，从而保证心肌细胞与材料的有效整合。
有益效果与Thomas Eschenhagen在实验中使用的支架材料相比，本发明的支架材料用层粘连蛋白代替含有该成分但价格昂贵的ECM，同时进一步添加了弹性蛋白和III型胶原，这样该种支架材料更加类似于心肌基质的天然组成，更有利于心肌细胞的发育和功能的发挥。
具体实施例方式
实施例1模拟心肌细胞外基质的支架的制备胶原来自猪皮，主要由I型和III型构成。市售的猪皮，去除脂肪、杂物等，剪碎溶于0.1％醋酸。2000转离心去除未溶解的杂物。上清溶液中胶原用4M的NaCl沉淀出来。沉淀出的胶原装入透析袋中透析去除其中的NaCl。去除NaCl的胶原再次溶于0.1％醋酸即可得所需的胶原溶液。胶原和弹性蛋白(Sigma公司)1∶1混合得混合物1，在2×DMEM(Gibco BRL或Sigma公司)中添加20％的马血清(北京元亨圣马生物技术研究所)和4％的鸡胚抽提物(自制)得混合物2，混合物1和混合物2再按1∶1的比例混合得混合物3，混合物3用0.1M的NaOH中和成中性得混合物4，混合物4中添加1％的laminin(Sigma公司)得混合物5，混合物即为支架材料。
实施例2应用模拟心肌细胞外基质的支架构建组织工程化心肌按实施例I构建支架材料。将新分离的新生大鼠(1-2天)心肌细胞与支架材料混合使其终浓度为2×106/ml左右。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液(DMEM，含10％马血清)。心肌细胞与胶原的混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。形成的环状心肌细胞-胶原条带在环形槽中培养7天后，取出给以力的拉伸作用，7天后取材进行形态学和组织学检测。
结果构建的心肌细胞-胶原条带可一致跳动。组织学研究表明条带中的心肌细胞形成类似于天然成体心肌组织样组织。电镜观察显示心肌细胞中发育出完整的肌小节结构。
权利要求
1一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。根据天然心肌细胞外基质的主要组成分按适当的比例和步骤混合而成，具有促进心肌细胞生长和跳动的生物学特性和力学性能。
2权利要求1中所述的支架材料，其特征是组成成分主要有I型、III胶原、弹性蛋白、laminin、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清。
3权利要求2中所述的胶原可以来自猪皮或其他动物的皮肤组织。
4权利要求1中所述的适当的比例和步骤其特征是胶原和弹性蛋白1∶1混合得混合物1，2×DMEM中添加20％的胎牛血清和4％的鸡胚抽提物得混合物2，混合物1和混合物2再按1∶1的比例混合得混合物3，混合物3用0.1M的NaOH中和成中性得混合物4，混合物4中添加1％的laminin得混合物5，混合物5即为支架材料。
5权利要求1中所述的支架，其特征是可以应用于组织工程化心肌的构建，也可以应用于骨骼肌、皮肤等组织的组织工程。
6权利要求4中所述的组织工程化心肌的构建是将支架材料与分离的心肌细胞混合。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液。心肌细胞-胶原混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。
7权利要求5中所述的混合液中，心肌细胞的浓度可以是1～2×106/ml之间。
8权利要求1中所述的心肌细胞可以是大鼠、小鼠、其他动物，也可以是人。
全文摘要
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。该支架在组成上尽量模拟心肌细胞的细胞外基质成分。它的原始形态为一种液态水凝胶，主要由液态胶原(I型和III型等)、弹性蛋白、层粘连蛋白、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清等组成。将这些成分按适当的比例混合即可形成类似于天然心肌组成的支架材料，与心肌细胞混合后可铸成各种形状心肌细胞－支架材料构建物。用这种支架材料可构建出一致跳动的组织工程化心肌组织。
文档编号A61L27/00GK1565649SQ03147949
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月30日 优先权日2003年6月30日
发明者王常勇, 赵云山, 郭希民, 段翠密 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
技术领域：
本发明属组织工程学领域，具体涉及一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。
背景技术：
构建组织工程化心肌组织，支架材料至关重要。心肌细胞和心肌组织的特性要求支架材料不仅要有良好的生物相容性和可降解性，而且要有适合心肌细胞生长发育和生理功能发挥，因此对支架材料的要求要比培养一般的组织更高。目前，构建组织工程化心肌组织的支架材料主要有两种，一种是人工合成的各种聚合物，如聚乳酸等，另一种是天然的各种生物大分子，如各种胶原等。用这两类支架材料人们都已在体外构建出组织工程化跳动的心肌组织，但质量上仍不理想。天然心肌的细胞外基质为心肌细胞的生长发育和和功能发挥提供了最好的环境，根据这一假定人们开始用类似于天然心肌细胞外基质的支架材料构建组织工程化心肌。心肌的基质部分主要由胶原组成，除此之外还含有少量的弹性蛋白、层粘连蛋白(laminin)和纤维粘连蛋白。胶原中85％是I型，其次是III和V型。这些细胞外基质不仅为心脏中的各种细胞提供附着点，而且还是传递心肌细胞收缩力的网络，并阻止心肌细胞的滑动等。心脏中细胞外基质的微小改变都将会影响心脏功能的发挥。心脏中细胞外基质的组成和比例为心肌细胞的生长、发育和功能的发挥提供了最好的环境。Thomas Eschenhagen等用I型胶原，再添加细胞外基质(ECM，主要成分laminin、V型胶原等)和鸡胚抽提物等的混合物作为构建心肌的支架材料。用这种支架材料可构建出类似于天然组织的一致跳动的工程化心肌组织。这一实验表明用类似于心肌细胞外基质组成成分的基质作为支架有利于心肌细胞的发育和功能的发挥。另有实验研究表明层粘连蛋白的存在对于心肌细胞形态表型的发育至关重要，在涂有层粘连蛋白的表面接种的心肌细胞可以发育成类似体内心肌的结构，因此ECM中层粘连蛋白的作用是其作用的主要体现。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。该支架原始形态是一种液态水凝胶，主要组成成份包括液态胶原(I型和III型等)、弹性蛋白、层粘连蛋白、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清等。各种组份按如下比例和方式混合形成等渗的溶液胶原和弹性蛋白1∶1混合得混合物1，在2×DMEM中添加20％的马血清和4％的鸡胚抽提物得混合物2，混合物1和混合物2再按1∶1的比例混合得混合物3，混合物3用0.1M的NaOH中和成中性得混合物4，混合物4中添加1％的laminin得混合物5，混合物即为支架材料。将支架材料与心肌细胞混合，轻轻吹打，使细胞在材料中分布均匀，然后将混合液滴入硅胶制成的环形凹槽中，槽宽在2-8mm，槽深3-9mm。在37℃条件下各组分相互作用即可形成一定形状的心肌细胞-支架构建物。该方法中心肌细胞先与液态的水凝胶混合可使心肌细胞比较均匀地分布在支架材料中。与预先成型的支架材料相比，可使心肌细胞与支架材料共定位，从而保证心肌细胞与材料的有效整合。
有益效果与Thomas Eschenhagen在实验中使用的支架材料相比，本发明的支架材料用层粘连蛋白代替含有该成分但价格昂贵的ECM，同时进一步添加了弹性蛋白和III型胶原，这样该种支架材料更加类似于心肌基质的天然组成，更有利于心肌细胞的发育和功能的发挥。
具体实施例方式
实施例1模拟心肌细胞外基质的支架的制备胶原来自猪皮，主要由I型和III型构成。市售的猪皮，去除脂肪、杂物等，剪碎溶于0.1％醋酸。2000转离心去除未溶解的杂物。上清溶液中胶原用4M的NaCl沉淀出来。沉淀出的胶原装入透析袋中透析去除其中的NaCl。去除NaCl的胶原再次溶于0.1％醋酸即可得所需的胶原溶液。胶原和弹性蛋白(Sigma公司)1∶1混合得混合物1，在2×DMEM(Gibco BRL或Sigma公司)中添加20％的马血清(北京元亨圣马生物技术研究所)和4％的鸡胚抽提物(自制)得混合物2，混合物1和混合物2再按1∶1的比例混合得混合物3，混合物3用0.1M的NaOH中和成中性得混合物4，混合物4中添加1％的laminin(Sigma公司)得混合物5，混合物即为支架材料。
实施例2应用模拟心肌细胞外基质的支架构建组织工程化心肌按实施例I构建支架材料。将新分离的新生大鼠(1-2天)心肌细胞与支架材料混合使其终浓度为2×106/ml左右。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液(DMEM，含10％马血清)。心肌细胞与胶原的混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。形成的环状心肌细胞-胶原条带在环形槽中培养7天后，取出给以力的拉伸作用，7天后取材进行形态学和组织学检测。
结果构建的心肌细胞-胶原条带可一致跳动。组织学研究表明条带中的心肌细胞形成类似于天然成体心肌组织样组织。电镜观察显示心肌细胞中发育出完整的肌小节结构。
权利要求
1一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。根据天然心肌细胞外基质的主要组成分按适当的比例和步骤混合而成，具有促进心肌细胞生长和跳动的生物学特性和力学性能。
2权利要求1中所述的支架材料，其特征是组成成分主要有I型、III胶原、弹性蛋白、laminin、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清。
3权利要求2中所述的胶原可以来自猪皮或其他动物的皮肤组织。
4权利要求1中所述的适当的比例和步骤其特征是胶原和弹性蛋白1∶1混合得混合物1，2×DMEM中添加20％的胎牛血清和4％的鸡胚抽提物得混合物2，混合物1和混合物2再按1∶1的比例混合得混合物3，混合物3用0.1M的NaOH中和成中性得混合物4，混合物4中添加1％的laminin得混合物5，混合物5即为支架材料。
5权利要求1中所述的支架，其特征是可以应用于组织工程化心肌的构建，也可以应用于骨骼肌、皮肤等组织的组织工程。
6权利要求4中所述的组织工程化心肌的构建是将支架材料与分离的心肌细胞混合。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液。心肌细胞-胶原混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。
7权利要求5中所述的混合液中，心肌细胞的浓度可以是1～2×106/ml之间。
8权利要求1中所述的心肌细胞可以是大鼠、小鼠、其他动物，也可以是人。
全文摘要
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。该支架在组成上尽量模拟心肌细胞的细胞外基质成分。它的原始形态为一种液态水凝胶，主要由液态胶原(I型和III型等)、弹性蛋白、层粘连蛋白、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清等组成。将这些成分按适当的比例混合即可形成类似于天然心肌组成的支架材料，与心肌细胞混合后可铸成各种形状心肌细胞－支架材料构建物。用这种支架材料可构建出一致跳动的组织工程化心肌组织。
文档编号A61L27/00GK1565649SQ03147949
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月30日 优先权日2003年6月30日
发明者王常勇, 赵云山, 郭希民, 段翠密 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
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