一种基于骨髓间充质干细胞的组织工程化软骨的制作方法
专利名称：一种基于骨髓间充质干细胞的组织工程化软骨的制作方法
技术领域：
本发明涉及制造人体器官和组织的组织工程领域，特别是一种组织工程化软骨及其在关节软骨缺损修复中的应用。
背景技术：
软骨组织是一种无血管、无淋巴管和无神经支配的高度分化的终末组织，损伤后难以自身修复，损伤后如果得不到有效的治疗，往往会引起关节软骨的退变，最终导致骨性关节炎，出现疼痛、关节强直和功能障碍等症状。而现行的临床治疗方法如限制负重、红外热疗、电磁刺激以及关节腔内注射转化生长因子(TGF-β)等生物活性因子等均难以有效地修复软骨损伤，只能暂时减缓症状，不能有效地促进软骨修复和阻止软骨退变。而手术方法包括关节镜下软骨刮擦、钻孔、微骨折、自体骨膜或软骨膜移植以及自体或异体软骨瓣移植等都无法生成有软骨力学特征的透明软骨，往往达不到软骨应该承载负荷的力学要求，结果是在短期内症状缓解，但是长期观察的结果仍不理想。假体置换手术能较好地解决关节疼痛和功能障碍问题，但其寿命有限(10～15年)、容易松动下沉等缺点不适用于软骨损伤高发的青壮年患者。自1987年Vacanti等提出组织工程的概念以来，软骨因其简单的组织学特征使得软骨组织工程发展迅速，曹谊林成功地在裸鼠背上造出具有人耳廓外观的组织工程化软骨更是组织工程发展史上的一个重大的里程碑。1997年美国FDA批准了第一个可用于临床的组织工程化产品Carticel，显示了软骨组织工程化产品巨大的临床应用前景。尽管该产品已经在临床投入使用，也取得了较好的短期临床效果，但其需要两次手术、间隔周期长、费用昂贵以及长期效果不确定等缺点限制了在临床上的广泛推广。操作简便、周期短、费用低廉和疗效稳定的方法一直是科学家们苦苦追求的目标。其中种子细胞和支架材料是组织工程的两大关键因素。软骨组织工程的种子细胞主要是软骨细胞，但是其体内来源部位有限、体外增殖能力差、容易丧失表型等缺点限制了其在体外的大量扩增，难以达到所需要的细胞数量。骨髓间充质干细胞(MSCs)容易获取，体外增殖能力强，可稳定传代而不丧失其表型，体外在特定的培养条件或体内的固有的微环境下可以分化为骨、软骨、肌肉、脂肪以及神经等组织，是近来软骨组织工程种子细胞的研究热点，也有不少动物体内修复软骨缺损的成功报道。用于软骨组织工程的支架材料需要有良好的生物相容性、可控的降解性以及足够的力学特征来促进和支持新生软骨的再生，现今的软骨组织工程支架材料，如胶原、壳聚糖、聚合物等存在力学强度不够、代谢酸性产物聚积、降解速度过快等缺点，而无机生物材料，如多孔生物陶瓷，即β-磷酸三钙生物陶瓷(β-TCP)或α-TCP，因其良好的骨诱导特性和力学强度多用于骨组织的修复，但我们最近发现β-TCP也具有良好的软骨诱导特性，无论是复合软骨细胞还是复合MSCs，都能很好地修复关节软骨缺损。
发明内容
本发明的目的是通过组织工程的方法，以自体骨髓间充质干细胞为种子细胞，复合多孔生物陶瓷构建组织工程化软骨，修复人或动物关节软骨缺损或损伤。本发明是通过以下技术方案实现的1)种子细胞的培养、扩增和诱导用预肝素化的注射器无菌抽取骨髓5～10ml，用Percoll分离液密度梯度离心法分离MSCs，方法是在10ml离心管中，将5ml骨髓液轻轻滴加等体积密度为1073g/l的Percol分离液上，3000rpm离心20～30分钟，吸取界面处白色细胞环，在用含10％自身血浆液的L-DMEM原代培养，细胞集落长成后换用胎牛血清，既解决了原代培养困难的题，又能快速简便的体外大量扩增细胞。
2)支架材料准备将多孔生物陶瓷β-TCP或α-TCP。解多孔生物陶瓷材料预制成各种规格的圆片状，或根据需要预制成其它形状，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时消毒。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌干纱布吸干液体。
3)组织工程化软骨的构建将第8～15代名生产MSCs制成1～2×107/ml的细胞悬液，轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。将细胞一多孔陶瓷复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。再加培养液(含10％FBS；25ng/mlFGF；10ng/mlTGFB3，后二者为MSCs的促增殖剂和分化剂)，培养24小时4)体内植入手术暴露损伤关节面，修整创面使之与构建的复合物大小和形状一致，小心将复合物嵌入缺损区，并使之与周围组织密合，关闭关节囊，缝合伤口。术后4周内关节制动。
有益效果本发明提供了MSCs体外分离、扩增和与材料复合构建组织工程化软骨，以及应用该组织工程化软骨修复关节软骨损伤的方法，其特征是细胞来源方便、创伤小，构建的软骨组织机械强度高、与周围组织整合好。
具体实施例方式
实施例1 组织工程化软骨的构建1)骨髓间充质干细胞体外分离和培养的方法6月龄体重25Kg±的美利奴绵羊，氯胺酮0.01g/kg肌肉注射麻醉，髂后上嵴处剪毛消毒，用18gauge的骨穿针穿刺并抽吸骨髓液至含0.1ml(3000u/ml)肝素的注射器中，先离心(1000rpm×5min)，吸出血浆液，然后加入等体积的L-DMEM混匀，再用密度为1073g/l的Percol分离液900g×25分钟分离出有核细胞，洗涤离心后，用含10％自身血浆液的L-DMEM混匀，吹打均匀，以1×105/cm2的密度接种于培养瓶中，48小时后换液，去除未贴壁的细胞，细胞集落出现后再换用含10％胎牛血清的培养液。
2)体外细胞支架复合物构建β-TCP直径8mm，高为4mm，先用25KGY的60Co照射消毒，然后用75％的酒精浸泡消除表面张力，无血清培养液充分洗涤去除残余酒精，无菌纱布吸干。MSCs常规消化、收集，调整细胞浓度至3×107/ml，轻轻接种于β-TCP上，孵箱内放置6小时，再加培养液(含10％FBS；10ng/ml TGF-β3和25ng/ml FGF)，培养24小时后体内植入。
实施例2 组织工程化软骨在羊关节软骨缺损修复中的应用1)体内植入麻醉消毒后打开并暴露膝关节股骨内侧髁，在其负重区用外径为8mm的环钻钻孔至深度4mm，人为制造一大段全层关节软骨缺损，分别植入MSC-β-TCP复合物作为实验组，单纯β-TCP修复和缺损空置作为对照组。使植入物与缺损灶紧密结合，表面与相临面连续平整，缝合关闭伤口，制动2周后逐渐负重活动。
2)结果12周取材发现实验组织缺损区已有明显的半透明的新生软骨组织生成，组织学结果表现为β-TCP吸收明显，被软骨组织包围，植入的MSCs完全转化为软骨细胞并分泌大量的软骨基质，与软骨下骨交界处开始出现大量的血管化组织。24周时缺损修复区表面平整光滑，有透明的软骨组织生成，与周围正常软骨组织分界不明显，组织学结果显示β-TCP已基本吸收完全，软骨下骨组织也被完全修复，其上新生的软骨组织与周围软骨连接紧密，软骨外基质丰富，II型胶原免疫组化染色阳性明显，GAG的含量达到正常软骨组织的80％。而单纯材料组和空白对照组均无完全修复，出现少量纤维组织和纤维软骨。实验结果提示MSCs在修复大段全层软骨缺损的过程中有至关重要的作用，而β-TCP也起到了支持MSCs在其内分化为软骨细胞并为分泌的基质提供附着点的作用，在其吸收的部位及时被软骨基质或软骨化骨填充，从而也说明了β-TCP可作为修复骨软骨组织的一种理想的支架材料。
权利要求
1一种基于骨髓间充质干细胞的组织工程化软骨。其特征是由骨髓间充质干细胞(MSCs)与无机的多孔生物陶瓷复合构建而成。
2权利要求1中所述的骨髓间充质干细胞是种子细胞，其特征是可以来自自体。该细胞具有方便获取、体外增殖能力强、不易丧失表型以及在体外特定条件下或体内固有的微环境下向骨、软骨、肌腱和脂肪等间充质组织分化的特点。
3权利要求1中所述的支架材料是多孔生物陶瓷，可以是β-磷酸三钙(β-TCP)，也可以是α-磷酸三钙(α-TCP)，其特征是具有生物相容性好、降解速度可控、力学强度高等优点，可以根据缺损的实际大小、位置和形状预制。
4权利要求2中骨髓间充质干细胞的体外分离和培养是通过如下方法实现的首先分离出骨髓液中的血浆成分，利用其中的生物活性成分促进MSC的原代增殖。然后用密度梯度离心的方法分离出有核细胞，种植24小时后换液去除非贴壁细胞，有利于MSC的纯化。细胞集落长成后换用胎牛血清，既解决了原代培养困难的问题，又能快速简便地体外大量扩增细胞。
5权利要求3中所述的多孔生物陶瓷采用如下方法进行预处理25KGY60Co射线照射12小时，复合前先用75％的酒精浸泡10分钟，消除表面张力，然后用无血清的培养液反复冲洗掉残余的酒精，最后用无菌纱布吸干，放于6孔板中。
6权利要求1中所述的复合是采用如下方法实现的将培养的骨髓间充质干细胞以3×107/ml的细胞密度种植到β-TCP支架材料上，37℃、5％的CO2孵箱内放置6小时，以使细胞与支架材料紧密粘附，再加培养液培养24小时后体内植入。
7权利要求6中所述的培养基是市售DMEM，其特征是添加10％FBS、25ng/ml FGF、10ng/mlTGF-β3，其中FGF是MSCs的增殖剂，TGF-β3是MSCs的分化剂)。
8权利要求4种所述的自体骨髓血浆成分除含有200余种功能不同的蛋白成分，包括多酶系统(补体系统、凝血系统、纤溶系统和激肽原系统)、免疫球蛋白类、蛋白酶抑制物类、转输蛋白类、类脂蛋白类，以及一组和血红蛋白转输及代谢有关的蛋白质类等，还包括TGF-β、FGF等生物活性因子，它们具有促进MSCs增殖和分化的作用。
9权利要求1所述的组织工程化软骨可用于修复关节软骨损伤。其特征是新生组织具有良好的软骨细胞分化度、新生软骨具有适宜的机械强度、良好的组织相容性，并与周围正常组织实现生理性整合。
全文摘要
本发明是一种基于骨髓间充质干细胞的组织工程化软骨，属于组织工程领域。以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，多孔生物陶瓷作为支架材料，二者复合体体外培育时加入增殖剂和分化剂，体外培育一段时间后手术移植修复关节软骨缺损。本发明的特征在于应用骨髓间充质干细胞与多孔生物陶瓷复合构建组织工程化软骨，并修复关节软骨缺损，具有明显的临床应用前景。
文档编号A61L27/10GK1565643SQ03148150
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月3日 优先权日2003年7月3日
发明者王常勇, 张玉富, 郭希民, 段翠密, 赵强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
技术领域：
本发明涉及制造人体器官和组织的组织工程领域，特别是一种组织工程化软骨及其在关节软骨缺损修复中的应用。
背景技术：
软骨组织是一种无血管、无淋巴管和无神经支配的高度分化的终末组织，损伤后难以自身修复，损伤后如果得不到有效的治疗，往往会引起关节软骨的退变，最终导致骨性关节炎，出现疼痛、关节强直和功能障碍等症状。而现行的临床治疗方法如限制负重、红外热疗、电磁刺激以及关节腔内注射转化生长因子(TGF-β)等生物活性因子等均难以有效地修复软骨损伤，只能暂时减缓症状，不能有效地促进软骨修复和阻止软骨退变。而手术方法包括关节镜下软骨刮擦、钻孔、微骨折、自体骨膜或软骨膜移植以及自体或异体软骨瓣移植等都无法生成有软骨力学特征的透明软骨，往往达不到软骨应该承载负荷的力学要求，结果是在短期内症状缓解，但是长期观察的结果仍不理想。假体置换手术能较好地解决关节疼痛和功能障碍问题，但其寿命有限(10～15年)、容易松动下沉等缺点不适用于软骨损伤高发的青壮年患者。自1987年Vacanti等提出组织工程的概念以来，软骨因其简单的组织学特征使得软骨组织工程发展迅速，曹谊林成功地在裸鼠背上造出具有人耳廓外观的组织工程化软骨更是组织工程发展史上的一个重大的里程碑。1997年美国FDA批准了第一个可用于临床的组织工程化产品Carticel，显示了软骨组织工程化产品巨大的临床应用前景。尽管该产品已经在临床投入使用，也取得了较好的短期临床效果，但其需要两次手术、间隔周期长、费用昂贵以及长期效果不确定等缺点限制了在临床上的广泛推广。操作简便、周期短、费用低廉和疗效稳定的方法一直是科学家们苦苦追求的目标。其中种子细胞和支架材料是组织工程的两大关键因素。软骨组织工程的种子细胞主要是软骨细胞，但是其体内来源部位有限、体外增殖能力差、容易丧失表型等缺点限制了其在体外的大量扩增，难以达到所需要的细胞数量。骨髓间充质干细胞(MSCs)容易获取，体外增殖能力强，可稳定传代而不丧失其表型，体外在特定的培养条件或体内的固有的微环境下可以分化为骨、软骨、肌肉、脂肪以及神经等组织，是近来软骨组织工程种子细胞的研究热点，也有不少动物体内修复软骨缺损的成功报道。用于软骨组织工程的支架材料需要有良好的生物相容性、可控的降解性以及足够的力学特征来促进和支持新生软骨的再生，现今的软骨组织工程支架材料，如胶原、壳聚糖、聚合物等存在力学强度不够、代谢酸性产物聚积、降解速度过快等缺点，而无机生物材料，如多孔生物陶瓷，即β-磷酸三钙生物陶瓷(β-TCP)或α-TCP，因其良好的骨诱导特性和力学强度多用于骨组织的修复，但我们最近发现β-TCP也具有良好的软骨诱导特性，无论是复合软骨细胞还是复合MSCs，都能很好地修复关节软骨缺损。
发明内容
本发明的目的是通过组织工程的方法，以自体骨髓间充质干细胞为种子细胞，复合多孔生物陶瓷构建组织工程化软骨，修复人或动物关节软骨缺损或损伤。本发明是通过以下技术方案实现的1)种子细胞的培养、扩增和诱导用预肝素化的注射器无菌抽取骨髓5～10ml，用Percoll分离液密度梯度离心法分离MSCs，方法是在10ml离心管中，将5ml骨髓液轻轻滴加等体积密度为1073g/l的Percol分离液上，3000rpm离心20～30分钟，吸取界面处白色细胞环，在用含10％自身血浆液的L-DMEM原代培养，细胞集落长成后换用胎牛血清，既解决了原代培养困难的题，又能快速简便的体外大量扩增细胞。
2)支架材料准备将多孔生物陶瓷β-TCP或α-TCP。解多孔生物陶瓷材料预制成各种规格的圆片状，或根据需要预制成其它形状，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时消毒。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌干纱布吸干液体。
3)组织工程化软骨的构建将第8～15代名生产MSCs制成1～2×107/ml的细胞悬液，轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。将细胞一多孔陶瓷复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。再加培养液(含10％FBS；25ng/mlFGF；10ng/mlTGFB3，后二者为MSCs的促增殖剂和分化剂)，培养24小时4)体内植入手术暴露损伤关节面，修整创面使之与构建的复合物大小和形状一致，小心将复合物嵌入缺损区，并使之与周围组织密合，关闭关节囊，缝合伤口。术后4周内关节制动。
有益效果本发明提供了MSCs体外分离、扩增和与材料复合构建组织工程化软骨，以及应用该组织工程化软骨修复关节软骨损伤的方法，其特征是细胞来源方便、创伤小，构建的软骨组织机械强度高、与周围组织整合好。
具体实施例方式
实施例1 组织工程化软骨的构建1)骨髓间充质干细胞体外分离和培养的方法6月龄体重25Kg±的美利奴绵羊，氯胺酮0.01g/kg肌肉注射麻醉，髂后上嵴处剪毛消毒，用18gauge的骨穿针穿刺并抽吸骨髓液至含0.1ml(3000u/ml)肝素的注射器中，先离心(1000rpm×5min)，吸出血浆液，然后加入等体积的L-DMEM混匀，再用密度为1073g/l的Percol分离液900g×25分钟分离出有核细胞，洗涤离心后，用含10％自身血浆液的L-DMEM混匀，吹打均匀，以1×105/cm2的密度接种于培养瓶中，48小时后换液，去除未贴壁的细胞，细胞集落出现后再换用含10％胎牛血清的培养液。
2)体外细胞支架复合物构建β-TCP直径8mm，高为4mm，先用25KGY的60Co照射消毒，然后用75％的酒精浸泡消除表面张力，无血清培养液充分洗涤去除残余酒精，无菌纱布吸干。MSCs常规消化、收集，调整细胞浓度至3×107/ml，轻轻接种于β-TCP上，孵箱内放置6小时，再加培养液(含10％FBS；10ng/ml TGF-β3和25ng/ml FGF)，培养24小时后体内植入。
实施例2 组织工程化软骨在羊关节软骨缺损修复中的应用1)体内植入麻醉消毒后打开并暴露膝关节股骨内侧髁，在其负重区用外径为8mm的环钻钻孔至深度4mm，人为制造一大段全层关节软骨缺损，分别植入MSC-β-TCP复合物作为实验组，单纯β-TCP修复和缺损空置作为对照组。使植入物与缺损灶紧密结合，表面与相临面连续平整，缝合关闭伤口，制动2周后逐渐负重活动。
2)结果12周取材发现实验组织缺损区已有明显的半透明的新生软骨组织生成，组织学结果表现为β-TCP吸收明显，被软骨组织包围，植入的MSCs完全转化为软骨细胞并分泌大量的软骨基质，与软骨下骨交界处开始出现大量的血管化组织。24周时缺损修复区表面平整光滑，有透明的软骨组织生成，与周围正常软骨组织分界不明显，组织学结果显示β-TCP已基本吸收完全，软骨下骨组织也被完全修复，其上新生的软骨组织与周围软骨连接紧密，软骨外基质丰富，II型胶原免疫组化染色阳性明显，GAG的含量达到正常软骨组织的80％。而单纯材料组和空白对照组均无完全修复，出现少量纤维组织和纤维软骨。实验结果提示MSCs在修复大段全层软骨缺损的过程中有至关重要的作用，而β-TCP也起到了支持MSCs在其内分化为软骨细胞并为分泌的基质提供附着点的作用，在其吸收的部位及时被软骨基质或软骨化骨填充，从而也说明了β-TCP可作为修复骨软骨组织的一种理想的支架材料。
权利要求
1一种基于骨髓间充质干细胞的组织工程化软骨。其特征是由骨髓间充质干细胞(MSCs)与无机的多孔生物陶瓷复合构建而成。
2权利要求1中所述的骨髓间充质干细胞是种子细胞，其特征是可以来自自体。该细胞具有方便获取、体外增殖能力强、不易丧失表型以及在体外特定条件下或体内固有的微环境下向骨、软骨、肌腱和脂肪等间充质组织分化的特点。
3权利要求1中所述的支架材料是多孔生物陶瓷，可以是β-磷酸三钙(β-TCP)，也可以是α-磷酸三钙(α-TCP)，其特征是具有生物相容性好、降解速度可控、力学强度高等优点，可以根据缺损的实际大小、位置和形状预制。
4权利要求2中骨髓间充质干细胞的体外分离和培养是通过如下方法实现的首先分离出骨髓液中的血浆成分，利用其中的生物活性成分促进MSC的原代增殖。然后用密度梯度离心的方法分离出有核细胞，种植24小时后换液去除非贴壁细胞，有利于MSC的纯化。细胞集落长成后换用胎牛血清，既解决了原代培养困难的问题，又能快速简便地体外大量扩增细胞。
5权利要求3中所述的多孔生物陶瓷采用如下方法进行预处理25KGY60Co射线照射12小时，复合前先用75％的酒精浸泡10分钟，消除表面张力，然后用无血清的培养液反复冲洗掉残余的酒精，最后用无菌纱布吸干，放于6孔板中。
6权利要求1中所述的复合是采用如下方法实现的将培养的骨髓间充质干细胞以3×107/ml的细胞密度种植到β-TCP支架材料上，37℃、5％的CO2孵箱内放置6小时，以使细胞与支架材料紧密粘附，再加培养液培养24小时后体内植入。
7权利要求6中所述的培养基是市售DMEM，其特征是添加10％FBS、25ng/ml FGF、10ng/mlTGF-β3，其中FGF是MSCs的增殖剂，TGF-β3是MSCs的分化剂)。
8权利要求4种所述的自体骨髓血浆成分除含有200余种功能不同的蛋白成分，包括多酶系统(补体系统、凝血系统、纤溶系统和激肽原系统)、免疫球蛋白类、蛋白酶抑制物类、转输蛋白类、类脂蛋白类，以及一组和血红蛋白转输及代谢有关的蛋白质类等，还包括TGF-β、FGF等生物活性因子，它们具有促进MSCs增殖和分化的作用。
9权利要求1所述的组织工程化软骨可用于修复关节软骨损伤。其特征是新生组织具有良好的软骨细胞分化度、新生软骨具有适宜的机械强度、良好的组织相容性，并与周围正常组织实现生理性整合。
全文摘要
本发明是一种基于骨髓间充质干细胞的组织工程化软骨，属于组织工程领域。以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，多孔生物陶瓷作为支架材料，二者复合体体外培育时加入增殖剂和分化剂，体外培育一段时间后手术移植修复关节软骨缺损。本发明的特征在于应用骨髓间充质干细胞与多孔生物陶瓷复合构建组织工程化软骨，并修复关节软骨缺损，具有明显的临床应用前景。
文档编号A61L27/10GK1565643SQ03148150
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月3日 优先权日2003年7月3日
发明者王常勇, 张玉富, 郭希民, 段翠密, 赵强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
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