抗感冒特异性IgY和复合IgY及其新型制剂的制作方法
专利名称：抗感冒特异性IgY和复合IgY及其新型制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其新型制剂，特别是涉及一种抗感冒复合IgY及其新型制剂。
背景技术：
迄今为止，国内外并无特殊抗病毒药物，故对普通感冒治疗尚未能治本，只能治标，如用扑热息痛系列制剂、银翘解毒片等。除此之外，就是采取防治继发细菌感染的措施，通常都是使用抗生素等杀菌药品。然而，正如众所周知的，抗生素存在抗药性和副作用等一系列问题。现今广泛流行的各类治标感冒药对引致感冒的病原体——感冒病毒并无杀灭作用，都只有抑制或减少症状的作用；而且，毒副作用普遍都较大，甚至可能损害人的肝脏、大脑和心血管。
IgY(Immunoglobulin of Yoik)属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(为某些细菌或病毒)的状态或活性，并通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌或病毒的吞噬；它能与病毒结合，改变病毒表面的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒-IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。
由于IgY能够特异性与病原体结合并将其有效抑制，就可以克服抗病毒化学药物对病毒实际杀灭作用不大、而对人体毒副作用又十分明显的致命缺点，从而达到有的放矢地从发病根源上预防和治疗由各种感冒病毒病原体引发的普通感冒的目的。
技术内容本发明目的是制备一种直接针对普通感冒(common cold)病原体、有效抑制或杀死这些致病病原体的特异性IgY及其抗体制剂。
本发明目的是通过如下技术方案实现的1、培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体。
(1)代表性的各种血清型鼻病毒培养方法
将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒方法如下将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒。培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存。
(2)有代表性的各种血清型冠状病毒培养方法将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒。培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存。
(3)有代表性的各种血清型腺病毒的培养方法将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型7型、3型和4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。培养好的多种灭活腺病毒在4℃或-20℃保存。
2、制备引致普通感冒(Common cold)的致病病毒的复合抗原(1)将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物。
(2)将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物。
(3)将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物。
(4)接着将分别制成的鼻病毒混和物和冠状病毒混和物以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物。最佳比例为鼻病毒混和物冠状病毒混和物腺病毒混和物为5∶3∶2，(5)将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，最佳比例为1∶1。然后，加入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(CommonCold)致病病毒的复合抗原。
3、普通感冒继发感染细菌复合抗原的制备购买市售的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌(肺炎杆菌)、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌等6种细菌菌珠，用细菌培养基分别在细菌培养箱中常规培养。
将培养好的细菌按以下比例混合匀化肺炎双球菌占50-30％A型溶血性链球菌占5-15％金黄色葡萄球菌占5-5％
1型肺炎克雷伯杆菌占30-10％流感嗜血杆菌占5-15％绿脓杆菌占5-15％然后以1∶1比例或其它适当比例加入福氏佐剂，再放进高速匀浆机以10000～30000rpm转速高速匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，好制成含全菌和菌体成分的继发感染细菌特殊复合抗原。
4、制备致病病毒免疫蛋应用本公司已申请的专利技术(专利申请号00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的普通感冒致病病毒复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。
5、制备继发感染细菌免疫蛋应用本公司已申请的专利技术(专利申请号00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的感冒继发感染细菌复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。
以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；也可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
6、抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物的制备首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉成品；最后，将所制备的对应不同抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记。
7、抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的纯化采用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
应用SDS-PAGE电泳测定法，分别对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量为50％以上。
8、采用本发明人发明的特殊免疫激活方法和改进的工艺技术所制得的抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY，参照常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)进行活性检测。
检测结果显示，抗感冒致病病毒特异性IgY对前述7种有代表性的血清型的鼻病毒、2种有代表性血清型的冠状病毒以及3种有代表性血清型的腺病毒的抗体结合效价都达到了1∶128以上。同样，抗继发感冒细菌特异性IgY对有代表性的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌的抗体结合效价也都在1∶256以上。
将抗感冒致病病毒特异性IgY或抗继发感染细菌特异性IgY配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01-80％的溶剂，制成一种新型雾化剂；也可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种“抗感冒特异性复合IgY”，配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01-80％的复合溶剂，制成一种新型复合雾化剂；将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY或者抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY混合的“抗感冒特异性复合IgY”配以99.99-20％的辅料，可制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型，用于预防和治疗普通感冒以及继发感染。
制备抗感冒IgY，最大的困难在于感冒是由几百种不同的病毒引起的，其中鼻病毒有120多种，冠病毒有13种，腺病毒也有41种，使人们根本无从下手。为了探索出一条切实可行的途径，解决这个长期困扰医学界的大难题，发明人作了大量的试验研究工作。
(一)首先，在试验中，以2型鼻病毒株加入福氏佐剂制得抗原，再选用如前所述经我们特别进行品种改良的、具高免疫应答性的罗曼鸡，以这种抗原进行皮下和翅静脉注射，隔二周一次，共三次。然后从所得的免疫蛋中提取出抗2型鼻病毒IgY抗体。
(二)为了了解同种不同型的病毒之间是否存在抗原交叉，分别采用“ELISA法”检测抗2型鼻病毒IgY对2型鼻病毒和9型鼻病毒的抗休结合效价。试验表明，一抗2型鼻病毒IgY对同种不同型的9型鼻病毒仍有一定的抗体结合效价，也就是说，2型鼻病毒和9型鼻病毒之间有“抗原交叉”，它们之间存在“共同抗原决定簇”接着，我们依此方法又分别做了13型鼻病毒和41型鼻病毒，以及5型鼻病毒和17、42、49等鼻病毒之间存在“抗原交叉”的试验；从而，进步证实了大部分同种不同型的鼻病毒之间存在不同程度的“抗原交叉”。
(三)依此方法，又试验摸索同种不同型的冠病毒之间以及同种不同型的腺病毒之间所存在“抗原交叉”现象。在试验中发观冠病毒虽然有13种之多，但是依照以上方法进行“抗原交叉”试验，发观它们可划分为三组，每组的冠病毒之间都有不同程度的“抗原交叉”，即同组内的冠病毒具有一种“共同抗原决定簇”，即冠病毒共有三种“共同抗原决定簇”。
另外经研究，腺病毒的外部主要分α群抗原、β群抗原以及γ型抗原。而腺病毒已知的有41型，其中只有7种型与人类呼吸道感染有关试验中也发现，同具“α群抗原”和同具“β群抗原”以及同具“γ型抗原”的同组腺病毒之间也有明显的“抗原交叉”现象，同时，我们也查清7型、4型和3型为成人感冒常见病原，很明显，这3种腺病毒在众多腺病毒中间最具有代表性。
(四)这一系列试验结果和发现十分重要，使得试图通过制备一种复合抗病毒IgY，用来预防和治疗由种类繁多的病毒所引致的感冒的大胆设想成为可能。同时，发明人注意到，人们在患上感冒后，抵抗力普遍下降，往往会发生继发性细菌感染，于是发明人将已研究成功的抗咽喉炎IgY技术，同抗感冒病毒IgY研究巧妙地结合起来，创造性地研制成功一种抗感冒致病和抗继发感染细菌的复合IgY，既能对抗感冒，又能防止咽喉炎和扁桃腺炎等继发感染的发生。
(五)在大量试验的基础上，结合病理研究的成果，并应用现代分子生物学技术，对引起感冒的一系列鼻病毒、冠病毒、腺病毒进行认真的分析研究和科学筛选，从每种病毒中确定有代表性的几种主要致病病毒，然后混合共同组成复合抗原。我们在分析研究不同型的鼻病毒之间“抗原交叉”现象的基础上，选择有代表性的“IA型”“2型”、“5型”、“14型”、“23型”、“29型”、“31型”7种鼻病毒株作为代表另外，由于鼻病毒在致感冒微生物中所占比重较大，占15-70，将其在复合抗原中的比例提高至50％左右。同时，根据流行病学研究，有15-30％的感冒是由冠状病毒引起的，而如前所述冠病毒只有3种共同抗原，我们从具有“共同抗原决定簇”的每组中选定一种作为代表病毒株，分别为229E型和OC43型；而且，将冠状病毒在复合抗原中的比例定为30％左右。此外，我们进一步掌握到，有5％的感冒是由腺病毒中的7型、3型、4型等三型引起的。经我们反复研究筛选，选定7型腺病毒、3型腺病毒、4型腺病毒作为腺病毒代表病毒代表病毒株，并将其在复合抗原中的比例也定为20％左右。
(六)在免疫过程中，我们和抗咽喉炎复合IgY的制备一样，也相应采取了一系列强化免疫激活的措施，以确保获得一种包含多种类抗体的、高活性的特异性IgY。
在前述试验研究的基础上，发现鼻病毒(rhinoviras)在引致普通感冒的病原体中占15-70％，冠状病毒在引致普通感冒的病原体中占10-30％，另外，腺病毒在引致普通感冒的原体中也占有5％左右的比例。因此，选定鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒作为引致普通感冒的主要病原体。同时，根据从大量患者咽喉部位分泌物中检出的鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒的种类的检出几率，优选血清型1A、2、5、14、23、29、31型鼻病毒作为代表性的鼻病毒，优选血清型229E、OC43型冠状病毒作为代表性的冠病毒，优选血清型7型、3型和4型腺病毒作为代表性的腺病毒。这些代表性的鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒可以根据各地患者的普查情况依时依地作适当调整和变更。
由于本发明制备的特异性IgY最大特点是直接针对普通感冒的病原体发生特异性抑制作用，本发明又将实际应用的剂型和施药方式设计成直接施于病原体最集中的呼吸通道和肺部，因而作用直接、目标准确、治本断源、效果显著。同时，本发明从根本上改变了目前治疗感冒只能大量内服疗效并不确切、又会引致病原体耐药性的化学药品的状况，也克服了常规给药方式要使大量化学药物进入人体循环后才产生作用而会给人体带来种种不良影响的弊病。
本发明所制备的抗感冒致病病毒特异性IgY和复合IgY又是一种独特的纯天然生物制剂，使用十分安全，无任何毒副作用，由于它仅仅针对感冒的致病病原体直接作用，对有益菌却有很好的保护作用；同时，它完全不会诱发抗药菌株的产生，也不会象一般常规药物那样，将有益菌也和病原体一道杀灭而造成“菌群失调”；反过来，本发明的抗感冒病原体的特异性I，和复合IgY可以在呼吸道和肺部构建一种不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生态，形成一道人体天然保护屏障，达到既治疗又预防的双重目的。另外，本发明所制备的特异性IgY和复合IgY是一种多克隆抗体，它可以对几种不同的病原体以及有相同“共同抗原决定簇”其他病原体都会产生抑制作用，这一点对于由上百种病毒引致的普通感冒的防治特别有意义。
下面的实验例及实施例可以进一步阐述本发明。
实验例1按本发明技术内容第2条所述的方法培养血清型2型鼻病毒，然后以1∶1比例加入福氏佐剂制作抗原，再用这种抗原免疫鸡，并采用本发明技术内容第8条和第9条的方法制备抗2型鼻病毒指异性卵。最后，以分别以血清型乙型和9型鼻病毒为检测抗原，用常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测所制得的抗2型鼻病毒特异性卵对这两种不同抗原的抗体结合效价。结果如下表
从以上试验可以看出，采用本发明的免疫方法和制备技术制备的抗感冒病毒特异性IgY，除了对直接免疫的病原体有很高的抗体结合效价外，对没有直接免疫的、有“共同抗原决定簇”的同种不同型、不同亚型的其他病原体也有较高的抗体结合效价，提示仍具有很好的抑制作用。
实验例2按本发明所述的方法制备引致感冒的致病病毒复合抗原，再按本发明方法制备抗感冒致病病毒特异性卵。然后分别以血清型1A型、2型、5型、14型、23型、29型、31型鼻病毒，以及血清型229E型、OC43型冠状病毒，血清型7型、3型和4型腺病毒作为检测抗原，应用常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)逐一检测所制得的抗感冒致病病毒特异性IgY对这些病原体的抗体结合效价。检测结果为下表
从以上试验结果看出，采用本发明的方法制备的抗感冒致病病毒特异性IgY对引致普通感冒的一系列鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒都具有较强的抑制作用，完全达到预期的效果。
实验例3采用本发明方法制作感冒继发感染细菌复合抗原，然后用本发明方法制备抗继发感染细菌特异性IgY。将所制得的这种抗继发感染细菌特异性IgY和依本发明的方法制得的抗感冒致病病毒特异性IgY以2∶1比例混合，制成抗感冒复合IgY。再分别以肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型和2型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌作为检测抗原，检测所制得的复合IgY对这些有代表性的继发感染细菌的抗体结合效价。结果如下表
从上表看出，采用本发明的方法制备的抗感冒复合IgY，对直接免疫的感冒继发感染时常见致病菌带有理想的抗体结合效价，对没有直接免疫的、但与已免疫的细菌属同种不同型的致病菌(如2型肺炎克雷件杆菌)有一定的抗体结合效价，提示也有抑制作用。实施例1制备100g抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物及纯IgY(1)选具高免疫应答能力的良种鹅用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只母鹅，每次注射3ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸭所产的蛋标记后按常规方法分别选取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅200只，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，饲养2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅，并挑选其中40只。
(2)培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体。
A、培养有代表性的多种血清型鼻病毒将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱满和湿度培养箱中培养24、48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转带离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒。培养好的几种灭活鼻病毒在4℃或-20℃保存。
B、培养有代表性的多种血清型冠状病毒将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液100ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别来活这2种培养的冠状病毒。培养好的来活冠状病毒在4℃或-20℃保存。
C、培养有代表性的多种血清型腺病毒将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自病毒研究机构的血清型7型、3型和4型腺病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24、48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。培养好的多种活腺病毒在4℃或-20℃保存。
(3)制备引致普通感冒(Common cold)的致病病毒的复合抗原A、先将培养好的灭活的7种鼻病毒即血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物。
B、再将培养好的灭活2种冠状病毒即血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物。
C、再将培养好的灭活的3种腺病毒即血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物。
D、接着将分别制得的鼻病毒混和物和冠状病毒混和物以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合；最佳比例为鼻病毒混和物占50％比例，冠状病毒混和物占30％比例，腺病毒混和物占20％比例。这样，就可制得普通感冒病原体混合物。
E、最后，将以上制得的普通感冒病原体混合物按如1∶1的比例与福氏佐剂混匀。然后加入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原。
(4)分别对优选的特种母鹅进行强化免疫用所制取的普通感冒致病病毒复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达到了3～6ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋1000只；
(5)抗感冒致病病毒特异性鹅IgY的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拦均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时，将稀释液加入高速离心分离机中，以10000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗感冒致病病毒特异性鹅IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗感冒致病病毒特异性鹅IgY粗提物进行纯化，即得纯抗感冒病毒特异性鹅IgY。实施例2抗普通感冒致病病毒IgY雾化剂的制备感冒致病病毒特异性IgY干粉300g加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配30升抗感冒致病病毒IgY组合溶液抗感冒病病毒特异性IgY 300g阿斯巴甜36g香橙香精90g水蜜桃香精 30g生理盐水加至30升先调制生理盐水25升，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着，加生理盐水至30升，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；经细菌过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗感冒致病病毒IgY喷雾剂，每支装20ml。实施例3制备抗普通感冒致病病毒IgY手揿定量压力喷雾罐抗感冒致病病毒特异性IgY干粉300g加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配200升抗感冒致病病毒IgY组合溶液；
抗感冒病病毒特异性IgY300g阿斯巴甜 240g香橙香精 600g水蜜桃香精 200g薄荷香精 1400g蒸馏水 加至200升先取蒸馏水180升，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着加蒸馏水至200升，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；溶液调配好后，必须在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐20000支，每支喷雾罐灌足10ml后，必须再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。实施例4制备抗感冒病毒和继发感染的复合IgY定量常压喷雾罐取抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉200重量份，抗感冒继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉100重量份，将二者加入搅拌机充分搅拌混合均匀，制得抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份。
按以下配方调配200重量份抗感冒特异性复合IgY组合溶液；抗感冒病病毒特异性复合IgY 300重量份阿斯巴甜240重量份香橙香精600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精1400重量份蒸馏水 加至200体积分先取蒸馏水180体积份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200体积份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐20000支，每支10ml，每支灌装满10ml。
权利要求
1.一种抗感冒特异性IgY，其特征在于抗感冒特异性IgY的制备方法包括下列步骤A.培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体(1)有代表性的各种血清型鼻病毒培养方法将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒，收获病毒方法如下将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；在加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒；培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存；(2)有代表性的各种血清型冠状病毒培养方法将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒炎研究机构的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素索DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒；培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存；(3)有代表性的各种血清型腺病毒的培养方法将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱终培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究所的血清型7型、3型和4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞培养病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时将培养瓶冻容三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒；培养好的多种灭活腺病毒在4℃或-20℃保存；B.制备引致普通感冒的致病病毒的复合抗原(1)将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混合物；(2)将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混合物；(3)将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混合物；(4)接着将分别制成的鼻病毒混合物和冠状病毒混合物以及腺病毒混合物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物；(5)将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，然后，加入高速匀浆机中以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原；C.普通感冒继发感染细菌复合抗原的制备购买示售的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌等6种细菌菌株，用细菌培养基分别在细菌培养箱中常规培养；将培养好的细菌按以下比例混合匀化肺炎双球菌 50-30％A型溶血性链球菌 5-15％金黄色葡萄球菌 5-5％1型肺炎克雷伯杆菌30-10％流感嗜血杆菌 5-15％绿脓杆菌 5-15％然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再放进高速匀浆机以10000-30000rpm转速高速匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制成含全菌和菌体成分的继发感染细菌特殊复合抗原；D.制备致病病毒免疫蛋将采用上述方法制备的普通感冒致病病毒复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；E.制备继发感染细菌免疫蛋将采用上述方法制备的感冒继发感染细菌复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；F.抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗体物的制备首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH值至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉成品，然后进行编码标记；G.抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的纯化分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
2.如权利要求1所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于作为抗原成分的其中的鼻病毒可以用1-6种常见鼻病毒组成；如果只采用一种有代表性的鼻病毒，则将这种鼻病毒培养好后灭活，再与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这种优选的鼻病毒作为感冒有代表性的病原体；如果采用两种有代表性的鼻病毒时，则先将这两种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10的比例混合后，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这两种鼻病毒混合物作为感冒有代表性的病原体；如果采用三种有代表性的鼻病毒时，则先将这三种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这三种鼻病毒组成有代表性的感冒病原体；如果采用四种有代表性的鼻病毒时，则先将这四种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒和腺病毒混合，单纯由这四种鼻病毒组成有代表性的感冒病原体混合物；如果采用五种有代表性的鼻病毒时，则先将这五种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒其中一种混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这五种鼻病毒组感冒成有代表性的病原体混合物；如果采用六种有代表性的鼻病毒时，则先将这六种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这六种鼻病毒组成感冒有代表性的病原体混合物。
3.如权利要求2所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于作为抗原成分的其中的冠状病毒可以由1-6种有代表性的冠状病毒组成，采用相同的方法以不同的比例混合，再与鼻病毒、腺病毒混合。
4.如权利要求2所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于作为抗原成分的其中的腺病毒可以用1-6种有代表性的腺病毒组成，采用相同的方法以不同的比例混合，再与鼻病毒、冠状病毒混合。
5.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于制作抗原时其中鼻病毒混合物和冠状病毒混合物以及腺病毒混合物之间的最佳比例为5∶3∶2。
6.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于制作抗原时其中致普通感冒病原体混合物按1∶1的比例与福氏佐剂混匀。
7.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于制作抗原时其中致普通感冒病原体混合物按1∶1的比例与福氏佐剂混匀。
8.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于其中免疫方法和免疫注射的数量和频率可根据实际情况适当调整和变化。
9.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于其中免疫方法和免疫注射的数量和频率可根据实际情况适当调整和变化。
10.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于其中免疫方法和免疫注射的数量和频率可根据实际情况适当调整和变化。
11.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
12.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
13.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
14.如权利要求7所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
15.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
16.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
17.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
18.如权利要求7所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
19.如权利要求15所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
20.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
21.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
22.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
23.如权利要求7所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
24.如权利要求15所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
25.如权利要求19所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
26.一种抗感冒特异性IgY制剂，其特征在于该制剂中每升含有抗感冒特异性IgY可为0.1-200克。
27.一种抗感冒特异性复合IgY制剂，其特征在于该制剂中每升含有抗感冒特异性复合IgY可为0.1-200克。
28.一种抗感冒特异性IgY雾化剂的制备方法，其特征在于该方法为抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份加入小型搅拌机中充分混合；按以下配方调配30000重量份抗感冒特异性IgY组合溶液；抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY 300重量份阿斯巴甜 36重量份香橙香精 90重量份水蜜桃香精30重量份生理盐水 加至30000重量份先调制生理盐水25000重量份，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着，加生理盐水至30000重量份，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；经过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗感冒特异性IgY喷雾剂，每支装10-20ml。
29.一种抗感冒特异性IgY压力喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗致病病菌毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份加入小型搅拌机中充分混合；按以下配方调配200000重量份抗感冒特异性IgY组合溶液抗感冒致病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀；测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；溶液调配好后，在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐，每支喷雾罐灌足10-20ml后，再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。
30.一种抗感冒特异性IgY常压喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份，加入小型搅拌机中充分混合，按以下配方调配200000重量份抗感冒特异性IgY组合溶液抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY 300重量阿斯巴甜 240重量份香橙香精 500重量份水蜜桃香精200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精、搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐，每支罐装满10-20ml。
31.一种抗感冒特异性IgY口含片的制备方法，其特征在于抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY与常规片剂辅料的比例为0.01-20∶99.99-80；先将IgY干粉与常规辅料充分混匀，按常规生产工艺制成片剂原料，再在压片机上压制成口含片。
全文摘要
本发明公开一种抗感冒复合IgY及其新型制剂。本发明技术方案如下培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体，优选引致普通感冒继发感染的主要致病细菌；制备普通感冒继发感染细菌复合抗原和普通感冒抗原；制备致病病毒免疫蛋制备抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物；分别对特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。本发明的抗感冒病原体的特异性IgY和复合IgY可以在呼吸道和肺部构建一种不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生态，形成一道人体天然保护屏障，达到既治疗又预防的双重目的。
文档编号A61P31/12GK1481900SQ03148880
公开日2004年3月17日 申请日期2003年6月16日 优先权日2003年6月16日
发明者包晟, 胡义结, 杨荣, 包 晟 申请人:雅臣药业集团(远东)有限公司
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其新型制剂，特别是涉及一种抗感冒复合IgY及其新型制剂。
背景技术：
迄今为止，国内外并无特殊抗病毒药物，故对普通感冒治疗尚未能治本，只能治标，如用扑热息痛系列制剂、银翘解毒片等。除此之外，就是采取防治继发细菌感染的措施，通常都是使用抗生素等杀菌药品。然而，正如众所周知的，抗生素存在抗药性和副作用等一系列问题。现今广泛流行的各类治标感冒药对引致感冒的病原体——感冒病毒并无杀灭作用，都只有抑制或减少症状的作用；而且，毒副作用普遍都较大，甚至可能损害人的肝脏、大脑和心血管。
IgY(Immunoglobulin of Yoik)属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(为某些细菌或病毒)的状态或活性，并通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌或病毒的吞噬；它能与病毒结合，改变病毒表面的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒-IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。
由于IgY能够特异性与病原体结合并将其有效抑制，就可以克服抗病毒化学药物对病毒实际杀灭作用不大、而对人体毒副作用又十分明显的致命缺点，从而达到有的放矢地从发病根源上预防和治疗由各种感冒病毒病原体引发的普通感冒的目的。
技术内容本发明目的是制备一种直接针对普通感冒(common cold)病原体、有效抑制或杀死这些致病病原体的特异性IgY及其抗体制剂。
本发明目的是通过如下技术方案实现的1、培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体。
(1)代表性的各种血清型鼻病毒培养方法
将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒方法如下将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒。培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存。
(2)有代表性的各种血清型冠状病毒培养方法将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒。培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存。
(3)有代表性的各种血清型腺病毒的培养方法将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型7型、3型和4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。培养好的多种灭活腺病毒在4℃或-20℃保存。
2、制备引致普通感冒(Common cold)的致病病毒的复合抗原(1)将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物。
(2)将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物。
(3)将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物。
(4)接着将分别制成的鼻病毒混和物和冠状病毒混和物以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物。最佳比例为鼻病毒混和物冠状病毒混和物腺病毒混和物为5∶3∶2，(5)将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，最佳比例为1∶1。然后，加入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(CommonCold)致病病毒的复合抗原。
3、普通感冒继发感染细菌复合抗原的制备购买市售的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌(肺炎杆菌)、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌等6种细菌菌珠，用细菌培养基分别在细菌培养箱中常规培养。
将培养好的细菌按以下比例混合匀化肺炎双球菌占50-30％A型溶血性链球菌占5-15％金黄色葡萄球菌占5-5％
1型肺炎克雷伯杆菌占30-10％流感嗜血杆菌占5-15％绿脓杆菌占5-15％然后以1∶1比例或其它适当比例加入福氏佐剂，再放进高速匀浆机以10000～30000rpm转速高速匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，好制成含全菌和菌体成分的继发感染细菌特殊复合抗原。
4、制备致病病毒免疫蛋应用本公司已申请的专利技术(专利申请号00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的普通感冒致病病毒复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。
5、制备继发感染细菌免疫蛋应用本公司已申请的专利技术(专利申请号00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的感冒继发感染细菌复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。
以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；也可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
6、抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物的制备首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉成品；最后，将所制备的对应不同抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记。
7、抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的纯化采用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
应用SDS-PAGE电泳测定法，分别对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量为50％以上。
8、采用本发明人发明的特殊免疫激活方法和改进的工艺技术所制得的抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY，参照常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)进行活性检测。
检测结果显示，抗感冒致病病毒特异性IgY对前述7种有代表性的血清型的鼻病毒、2种有代表性血清型的冠状病毒以及3种有代表性血清型的腺病毒的抗体结合效价都达到了1∶128以上。同样，抗继发感冒细菌特异性IgY对有代表性的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌的抗体结合效价也都在1∶256以上。
将抗感冒致病病毒特异性IgY或抗继发感染细菌特异性IgY配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01-80％的溶剂，制成一种新型雾化剂；也可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种“抗感冒特异性复合IgY”，配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01-80％的复合溶剂，制成一种新型复合雾化剂；将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY或者抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY混合的“抗感冒特异性复合IgY”配以99.99-20％的辅料，可制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型，用于预防和治疗普通感冒以及继发感染。
制备抗感冒IgY，最大的困难在于感冒是由几百种不同的病毒引起的，其中鼻病毒有120多种，冠病毒有13种，腺病毒也有41种，使人们根本无从下手。为了探索出一条切实可行的途径，解决这个长期困扰医学界的大难题，发明人作了大量的试验研究工作。
(一)首先，在试验中，以2型鼻病毒株加入福氏佐剂制得抗原，再选用如前所述经我们特别进行品种改良的、具高免疫应答性的罗曼鸡，以这种抗原进行皮下和翅静脉注射，隔二周一次，共三次。然后从所得的免疫蛋中提取出抗2型鼻病毒IgY抗体。
(二)为了了解同种不同型的病毒之间是否存在抗原交叉，分别采用“ELISA法”检测抗2型鼻病毒IgY对2型鼻病毒和9型鼻病毒的抗休结合效价。试验表明，一抗2型鼻病毒IgY对同种不同型的9型鼻病毒仍有一定的抗体结合效价，也就是说，2型鼻病毒和9型鼻病毒之间有“抗原交叉”，它们之间存在“共同抗原决定簇”接着，我们依此方法又分别做了13型鼻病毒和41型鼻病毒，以及5型鼻病毒和17、42、49等鼻病毒之间存在“抗原交叉”的试验；从而，进步证实了大部分同种不同型的鼻病毒之间存在不同程度的“抗原交叉”。
(三)依此方法，又试验摸索同种不同型的冠病毒之间以及同种不同型的腺病毒之间所存在“抗原交叉”现象。在试验中发观冠病毒虽然有13种之多，但是依照以上方法进行“抗原交叉”试验，发观它们可划分为三组，每组的冠病毒之间都有不同程度的“抗原交叉”，即同组内的冠病毒具有一种“共同抗原决定簇”，即冠病毒共有三种“共同抗原决定簇”。
另外经研究，腺病毒的外部主要分α群抗原、β群抗原以及γ型抗原。而腺病毒已知的有41型，其中只有7种型与人类呼吸道感染有关试验中也发现，同具“α群抗原”和同具“β群抗原”以及同具“γ型抗原”的同组腺病毒之间也有明显的“抗原交叉”现象，同时，我们也查清7型、4型和3型为成人感冒常见病原，很明显，这3种腺病毒在众多腺病毒中间最具有代表性。
(四)这一系列试验结果和发现十分重要，使得试图通过制备一种复合抗病毒IgY，用来预防和治疗由种类繁多的病毒所引致的感冒的大胆设想成为可能。同时，发明人注意到，人们在患上感冒后，抵抗力普遍下降，往往会发生继发性细菌感染，于是发明人将已研究成功的抗咽喉炎IgY技术，同抗感冒病毒IgY研究巧妙地结合起来，创造性地研制成功一种抗感冒致病和抗继发感染细菌的复合IgY，既能对抗感冒，又能防止咽喉炎和扁桃腺炎等继发感染的发生。
(五)在大量试验的基础上，结合病理研究的成果，并应用现代分子生物学技术，对引起感冒的一系列鼻病毒、冠病毒、腺病毒进行认真的分析研究和科学筛选，从每种病毒中确定有代表性的几种主要致病病毒，然后混合共同组成复合抗原。我们在分析研究不同型的鼻病毒之间“抗原交叉”现象的基础上，选择有代表性的“IA型”“2型”、“5型”、“14型”、“23型”、“29型”、“31型”7种鼻病毒株作为代表另外，由于鼻病毒在致感冒微生物中所占比重较大，占15-70，将其在复合抗原中的比例提高至50％左右。同时，根据流行病学研究，有15-30％的感冒是由冠状病毒引起的，而如前所述冠病毒只有3种共同抗原，我们从具有“共同抗原决定簇”的每组中选定一种作为代表病毒株，分别为229E型和OC43型；而且，将冠状病毒在复合抗原中的比例定为30％左右。此外，我们进一步掌握到，有5％的感冒是由腺病毒中的7型、3型、4型等三型引起的。经我们反复研究筛选，选定7型腺病毒、3型腺病毒、4型腺病毒作为腺病毒代表病毒代表病毒株，并将其在复合抗原中的比例也定为20％左右。
(六)在免疫过程中，我们和抗咽喉炎复合IgY的制备一样，也相应采取了一系列强化免疫激活的措施，以确保获得一种包含多种类抗体的、高活性的特异性IgY。
在前述试验研究的基础上，发现鼻病毒(rhinoviras)在引致普通感冒的病原体中占15-70％，冠状病毒在引致普通感冒的病原体中占10-30％，另外，腺病毒在引致普通感冒的原体中也占有5％左右的比例。因此，选定鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒作为引致普通感冒的主要病原体。同时，根据从大量患者咽喉部位分泌物中检出的鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒的种类的检出几率，优选血清型1A、2、5、14、23、29、31型鼻病毒作为代表性的鼻病毒，优选血清型229E、OC43型冠状病毒作为代表性的冠病毒，优选血清型7型、3型和4型腺病毒作为代表性的腺病毒。这些代表性的鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒可以根据各地患者的普查情况依时依地作适当调整和变更。
由于本发明制备的特异性IgY最大特点是直接针对普通感冒的病原体发生特异性抑制作用，本发明又将实际应用的剂型和施药方式设计成直接施于病原体最集中的呼吸通道和肺部，因而作用直接、目标准确、治本断源、效果显著。同时，本发明从根本上改变了目前治疗感冒只能大量内服疗效并不确切、又会引致病原体耐药性的化学药品的状况，也克服了常规给药方式要使大量化学药物进入人体循环后才产生作用而会给人体带来种种不良影响的弊病。
本发明所制备的抗感冒致病病毒特异性IgY和复合IgY又是一种独特的纯天然生物制剂，使用十分安全，无任何毒副作用，由于它仅仅针对感冒的致病病原体直接作用，对有益菌却有很好的保护作用；同时，它完全不会诱发抗药菌株的产生，也不会象一般常规药物那样，将有益菌也和病原体一道杀灭而造成“菌群失调”；反过来，本发明的抗感冒病原体的特异性I，和复合IgY可以在呼吸道和肺部构建一种不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生态，形成一道人体天然保护屏障，达到既治疗又预防的双重目的。另外，本发明所制备的特异性IgY和复合IgY是一种多克隆抗体，它可以对几种不同的病原体以及有相同“共同抗原决定簇”其他病原体都会产生抑制作用，这一点对于由上百种病毒引致的普通感冒的防治特别有意义。
下面的实验例及实施例可以进一步阐述本发明。
实验例1按本发明技术内容第2条所述的方法培养血清型2型鼻病毒，然后以1∶1比例加入福氏佐剂制作抗原，再用这种抗原免疫鸡，并采用本发明技术内容第8条和第9条的方法制备抗2型鼻病毒指异性卵。最后，以分别以血清型乙型和9型鼻病毒为检测抗原，用常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测所制得的抗2型鼻病毒特异性卵对这两种不同抗原的抗体结合效价。结果如下表
从以上试验可以看出，采用本发明的免疫方法和制备技术制备的抗感冒病毒特异性IgY，除了对直接免疫的病原体有很高的抗体结合效价外，对没有直接免疫的、有“共同抗原决定簇”的同种不同型、不同亚型的其他病原体也有较高的抗体结合效价，提示仍具有很好的抑制作用。
实验例2按本发明所述的方法制备引致感冒的致病病毒复合抗原，再按本发明方法制备抗感冒致病病毒特异性卵。然后分别以血清型1A型、2型、5型、14型、23型、29型、31型鼻病毒，以及血清型229E型、OC43型冠状病毒，血清型7型、3型和4型腺病毒作为检测抗原，应用常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)逐一检测所制得的抗感冒致病病毒特异性IgY对这些病原体的抗体结合效价。检测结果为下表
从以上试验结果看出，采用本发明的方法制备的抗感冒致病病毒特异性IgY对引致普通感冒的一系列鼻病毒和冠状病毒以及腺病毒都具有较强的抑制作用，完全达到预期的效果。
实验例3采用本发明方法制作感冒继发感染细菌复合抗原，然后用本发明方法制备抗继发感染细菌特异性IgY。将所制得的这种抗继发感染细菌特异性IgY和依本发明的方法制得的抗感冒致病病毒特异性IgY以2∶1比例混合，制成抗感冒复合IgY。再分别以肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型和2型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌作为检测抗原，检测所制得的复合IgY对这些有代表性的继发感染细菌的抗体结合效价。结果如下表
从上表看出，采用本发明的方法制备的抗感冒复合IgY，对直接免疫的感冒继发感染时常见致病菌带有理想的抗体结合效价，对没有直接免疫的、但与已免疫的细菌属同种不同型的致病菌(如2型肺炎克雷件杆菌)有一定的抗体结合效价，提示也有抑制作用。实施例1制备100g抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物及纯IgY(1)选具高免疫应答能力的良种鹅用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只母鹅，每次注射3ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸭所产的蛋标记后按常规方法分别选取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅200只，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，饲养2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅，并挑选其中40只。
(2)培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体。
A、培养有代表性的多种血清型鼻病毒将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱满和湿度培养箱中培养24、48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转带离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒。培养好的几种灭活鼻病毒在4℃或-20℃保存。
B、培养有代表性的多种血清型冠状病毒将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液100ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别来活这2种培养的冠状病毒。培养好的来活冠状病毒在4℃或-20℃保存。
C、培养有代表性的多种血清型腺病毒将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自病毒研究机构的血清型7型、3型和4型腺病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24、48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。培养好的多种活腺病毒在4℃或-20℃保存。
(3)制备引致普通感冒(Common cold)的致病病毒的复合抗原A、先将培养好的灭活的7种鼻病毒即血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物。
B、再将培养好的灭活2种冠状病毒即血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物。
C、再将培养好的灭活的3种腺病毒即血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物。
D、接着将分别制得的鼻病毒混和物和冠状病毒混和物以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合；最佳比例为鼻病毒混和物占50％比例，冠状病毒混和物占30％比例，腺病毒混和物占20％比例。这样，就可制得普通感冒病原体混合物。
E、最后，将以上制得的普通感冒病原体混合物按如1∶1的比例与福氏佐剂混匀。然后加入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原。
(4)分别对优选的特种母鹅进行强化免疫用所制取的普通感冒致病病毒复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达到了3～6ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋1000只；
(5)抗感冒致病病毒特异性鹅IgY的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拦均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时，将稀释液加入高速离心分离机中，以10000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗感冒致病病毒特异性鹅IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗感冒致病病毒特异性鹅IgY粗提物进行纯化，即得纯抗感冒病毒特异性鹅IgY。实施例2抗普通感冒致病病毒IgY雾化剂的制备感冒致病病毒特异性IgY干粉300g加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配30升抗感冒致病病毒IgY组合溶液抗感冒病病毒特异性IgY 300g阿斯巴甜36g香橙香精90g水蜜桃香精 30g生理盐水加至30升先调制生理盐水25升，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着，加生理盐水至30升，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；经细菌过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗感冒致病病毒IgY喷雾剂，每支装20ml。实施例3制备抗普通感冒致病病毒IgY手揿定量压力喷雾罐抗感冒致病病毒特异性IgY干粉300g加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配200升抗感冒致病病毒IgY组合溶液；
抗感冒病病毒特异性IgY300g阿斯巴甜 240g香橙香精 600g水蜜桃香精 200g薄荷香精 1400g蒸馏水 加至200升先取蒸馏水180升，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着加蒸馏水至200升，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；溶液调配好后，必须在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐20000支，每支喷雾罐灌足10ml后，必须再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。实施例4制备抗感冒病毒和继发感染的复合IgY定量常压喷雾罐取抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉200重量份，抗感冒继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉100重量份，将二者加入搅拌机充分搅拌混合均匀，制得抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份。
按以下配方调配200重量份抗感冒特异性复合IgY组合溶液；抗感冒病病毒特异性复合IgY 300重量份阿斯巴甜240重量份香橙香精600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精1400重量份蒸馏水 加至200体积分先取蒸馏水180体积份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200体积份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐20000支，每支10ml，每支灌装满10ml。
权利要求
1.一种抗感冒特异性IgY，其特征在于抗感冒特异性IgY的制备方法包括下列步骤A.培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体(1)有代表性的各种血清型鼻病毒培养方法将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒，收获病毒方法如下将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；在加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒；培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存；(2)有代表性的各种血清型冠状病毒培养方法将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒炎研究机构的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素索DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒；培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存；(3)有代表性的各种血清型腺病毒的培养方法将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱终培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究所的血清型7型、3型和4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞培养病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时将培养瓶冻容三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒；培养好的多种灭活腺病毒在4℃或-20℃保存；B.制备引致普通感冒的致病病毒的复合抗原(1)将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混合物；(2)将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混合物；(3)将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混合物；(4)接着将分别制成的鼻病毒混合物和冠状病毒混合物以及腺病毒混合物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物；(5)将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，然后，加入高速匀浆机中以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原；C.普通感冒继发感染细菌复合抗原的制备购买示售的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌等6种细菌菌株，用细菌培养基分别在细菌培养箱中常规培养；将培养好的细菌按以下比例混合匀化肺炎双球菌 50-30％A型溶血性链球菌 5-15％金黄色葡萄球菌 5-5％1型肺炎克雷伯杆菌30-10％流感嗜血杆菌 5-15％绿脓杆菌 5-15％然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再放进高速匀浆机以10000-30000rpm转速高速匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制成含全菌和菌体成分的继发感染细菌特殊复合抗原；D.制备致病病毒免疫蛋将采用上述方法制备的普通感冒致病病毒复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；E.制备继发感染细菌免疫蛋将采用上述方法制备的感冒继发感染细菌复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；F.抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗体物的制备首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH值至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉成品，然后进行编码标记；G.抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的纯化分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
2.如权利要求1所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于作为抗原成分的其中的鼻病毒可以用1-6种常见鼻病毒组成；如果只采用一种有代表性的鼻病毒，则将这种鼻病毒培养好后灭活，再与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这种优选的鼻病毒作为感冒有代表性的病原体；如果采用两种有代表性的鼻病毒时，则先将这两种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10的比例混合后，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这两种鼻病毒混合物作为感冒有代表性的病原体；如果采用三种有代表性的鼻病毒时，则先将这三种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这三种鼻病毒组成有代表性的感冒病原体；如果采用四种有代表性的鼻病毒时，则先将这四种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒和腺病毒混合，单纯由这四种鼻病毒组成有代表性的感冒病原体混合物；如果采用五种有代表性的鼻病毒时，则先将这五种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒其中一种混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这五种鼻病毒组感冒成有代表性的病原体混合物；如果采用六种有代表性的鼻病毒时，则先将这六种鼻病毒培养好后灭活，再按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后与冠状病毒、腺病毒混合，或者仅与冠状病毒、腺病毒其中一种混合；也可不与冠状病毒、腺病毒混合，单纯由这六种鼻病毒组成感冒有代表性的病原体混合物。
3.如权利要求2所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于作为抗原成分的其中的冠状病毒可以由1-6种有代表性的冠状病毒组成，采用相同的方法以不同的比例混合，再与鼻病毒、腺病毒混合。
4.如权利要求2所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于作为抗原成分的其中的腺病毒可以用1-6种有代表性的腺病毒组成，采用相同的方法以不同的比例混合，再与鼻病毒、冠状病毒混合。
5.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于制作抗原时其中鼻病毒混合物和冠状病毒混合物以及腺病毒混合物之间的最佳比例为5∶3∶2。
6.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于制作抗原时其中致普通感冒病原体混合物按1∶1的比例与福氏佐剂混匀。
7.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于制作抗原时其中致普通感冒病原体混合物按1∶1的比例与福氏佐剂混匀。
8.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于其中免疫方法和免疫注射的数量和频率可根据实际情况适当调整和变化。
9.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于其中免疫方法和免疫注射的数量和频率可根据实际情况适当调整和变化。
10.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于其中免疫方法和免疫注射的数量和频率可根据实际情况适当调整和变化。
11.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
12.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
13.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
14.如权利要求7所述的抗感冒特异性IgY，可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
15.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
16.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
17.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
18.如权利要求7所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
19.如权利要求15所述的抗感冒特异性IgY，其特征在于可将抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗感冒特异性复合IgY。
20.如权利要求1、2、3或4所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
21.如权利要求5所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
22.如权利要求6所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
23.如权利要求7所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
24.如权利要求15所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
25.如权利要求19所述的抗感冒特异性IgY和抗感冒特异性复合IgY，其特征在于可以将0.01-80％这种抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物或纯化物以及抗感冒特异性复合IgY粗提物或纯化物分别配以99.99-20％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型。
26.一种抗感冒特异性IgY制剂，其特征在于该制剂中每升含有抗感冒特异性IgY可为0.1-200克。
27.一种抗感冒特异性复合IgY制剂，其特征在于该制剂中每升含有抗感冒特异性复合IgY可为0.1-200克。
28.一种抗感冒特异性IgY雾化剂的制备方法，其特征在于该方法为抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份加入小型搅拌机中充分混合；按以下配方调配30000重量份抗感冒特异性IgY组合溶液；抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY 300重量份阿斯巴甜 36重量份香橙香精 90重量份水蜜桃香精30重量份生理盐水 加至30000重量份先调制生理盐水25000重量份，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着，加生理盐水至30000重量份，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；经过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗感冒特异性IgY喷雾剂，每支装10-20ml。
29.一种抗感冒特异性IgY压力喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗致病病菌毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份加入小型搅拌机中充分混合；按以下配方调配200000重量份抗感冒特异性IgY组合溶液抗感冒致病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀；测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；溶液调配好后，在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐，每支喷雾罐灌足10-20ml后，再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。
30.一种抗感冒特异性IgY常压喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY干粉300重量份，加入小型搅拌机中充分混合，按以下配方调配200000重量份抗感冒特异性IgY组合溶液抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY 300重量阿斯巴甜 240重量份香橙香精 500重量份水蜜桃香精200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精、搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐，每支罐装满10-20ml。
31.一种抗感冒特异性IgY口含片的制备方法，其特征在于抗感冒致病病毒特异性IgY或抗感冒特异性复合IgY与常规片剂辅料的比例为0.01-20∶99.99-80；先将IgY干粉与常规辅料充分混匀，按常规生产工艺制成片剂原料，再在压片机上压制成口含片。
全文摘要
本发明公开一种抗感冒复合IgY及其新型制剂。本发明技术方案如下培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体，优选引致普通感冒继发感染的主要致病细菌；制备普通感冒继发感染细菌复合抗原和普通感冒抗原；制备致病病毒免疫蛋制备抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物；分别对特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。本发明的抗感冒病原体的特异性IgY和复合IgY可以在呼吸道和肺部构建一种不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生态，形成一道人体天然保护屏障，达到既治疗又预防的双重目的。
文档编号A61P31/12GK1481900SQ03148880
公开日2004年3月17日 申请日期2003年6月16日 优先权日2003年6月16日
发明者包晟, 胡义结, 杨荣, 包 晟 申请人:雅臣药业集团(远东)有限公司
最新回复(0)