一种含亚麻酸生物制剂的制备方法
专利名称：一种含亚麻酸生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程领域，特别提供了一种高含量γ-亚麻酸生物制剂的大规模生产方法制备方法。
γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid GLA)是人体必需脂肪酸，不能由人体合成而只能从食物中获得，它是合成前列腺类物质的前体，对人体的生理功能有重要的调节作用。人体由于缺乏γ-亚麻酸可导致机体代谢紊乱而引起多种疾病，如高血压、糖尿病、癌症、病毒感染、以及皮肤老化等。因此，对γ-亚麻酸生理作用的研究以及开发自然资源的研究受到了广泛的重视。由于自然资源的限制，γ-亚麻酸的生产已从植物转向微生物，微生物具有不受自然条件限制，产品质量稳定，成本低廉等特点。如中国专利ZL91106190.8和已经公开的中国专利申请95111964.8，提供了一种用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata生物发酵制备的以γ-亚麻酸为主要成分的生物制剂及生物制剂的制备方法，该生物制剂不仅含有γ-亚麻酸而且还含有微生物多糖、SOD酶、氨基酸、维生素等多种营养成分和生理活性物质，对改善血液粘稠度具有明显作用。但是，在所提供的制备方法中，特别是在发酵培养的过程中，主要以的蔗糖为碳源、尿素为氮源，价格昂贵；不仅如此，由于尿素容易挥发，在灭菌过程中温度、时间较难掌握，使培养基中含氮量及PH不稳定，必须采用灭菌后重新调PH方法或者尿素分消法，给生产带来许多不便，同时也直接影响到菌体的产量；最后，按照专利中提到的菌种、培养基、培养条件进行简单的放大生产，不能生产出所要求的产品，如专利申请95111964.8的实施例中最大作到500ml发酵罐，可以进一步放大到一吨的发酵罐，五吨的发酵罐就不能生产出合格产品了。
本发明的目的在于提供一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其生产成本低廉，产率高，并且产品品质好。
本发明提供了一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于(1)、菌种采用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422；(2)、制备过程是——菌种培养将斜面菌种进行活化，接至茄形瓶中进行扩大培养；——种液培养将制成的孢子悬浮液接于种子罐中进行培养；培养基为以重量计蔗糖2-4％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为28-30℃，风量1∶0.05-0.3V/V，搅拌速度180-250rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间18-24小时；——发酵罐培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养；培养基为以重量计糖蜜8-12％、豆饼粉0.8-1.5％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为25-28℃，风量1∶0.05-0.5V/V，搅拌速度150-180rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间80-96小时；——菌体收集、水洗、干燥。
本发明所使用的刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422)，是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的，保藏号为3.154的刺孢小克银汉霉，经物理化学方法进行复合诱变，在高浓度碳源培养基上筛选出有明显形态变化的菌落，再经摇瓶复筛获得各项生产指标最佳的菌株，其生物量较原始菌株提高25-30％，脂肪提高10-15％，γ-亚麻酸提高10-15％。诱变的具体方法为将幼龄的菌丝制得原生质体，经紫外线处理15-30秒，再将所获得的菌丝用硫酸二乙酯处理30-60分钟，将处理后的菌悬液在高浓度碳源的培养基上培养，挑菌落形态有明显差异的菌株经摇瓶复筛获得，其复合诱变所获得的变异株与原始菌株相比，具有生长速度快，孢子量多，菌丝粗壮等特点。在PDA培养基上28℃培养，2天菌落直径为2-3厘米，菌丝为灰白色，有部分分生孢子形成。3-4天菌落直径为4-7厘米，分生孢子大量形成，菌落为珠母灰色。显微镜下观察，菌丝粗壮多分枝，直径为15-25μm，分生孢子梗直立，分生孢子为球形或椭圆形，上有长刺。孢子直径为8.75-12.5μm，分生孢子聚伞状，梅花状或不规则状。
本发明中使用的碳源主要为蔗糖生产中的残渣糖蜜，不仅价格是蔗糖的1/6，并且其中含有多种维生素及生长因子，可免去维生素B1的添加，使原料成本大幅度下降。
本发明中使用的氮源主要为豆饼粉，不仅价格低廉，同时含氮量稳定，缓冲性强，生产操作易掌握，产量稳定。
本发明中添加微量的锌可明显增加菌体内不饱和脂肪酸的不饱和度，增加产品的有效组分含量。
本发明生物制剂可应用于心脑血管疾病的预防和治疗，也可用于保健食品和饲料添加剂。
总之，本发明中利用工农业生产中的废弃物糖蜜和豆饼粉作原料，可以降低原料成本4/5-4/6，并采用高产诱变菌株，及适合于该菌株生理代谢特点的工艺，缩短发酵时间24-48小时，使能源消耗降低1/5-1/4，在生产操作上简便易行，并且产品各项生产指标稳定。下面通过实施例详述本发明。
实施例15吨发酵罐生产制取菌体
(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。
(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。
(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度250rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。
(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜350kg、豆饼粉30kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、硫酸锌3.5g、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.1V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.044Mpa，培养时间96小时。
(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体110kg，脂肪含量38％，γ-亚麻酸含量12.2％。
实施例25吨发酵罐生产制取菌体(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。
(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。
(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度150rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。
(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜350kg、豆饼粉30kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、硫酸锌3.5g、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.25V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.04Mpa，培养时间96小时。
(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体112kg，脂肪含量35％，γ-亚麻酸含量14.3％。
实施例35吨发酵罐生产制取菌体(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。
(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。
(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度150rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。
(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜420kg、豆饼粉40kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.3V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.04Mpa，培养时间96小时。
(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体120kg，脂肪含量36％，γ-亚麻酸含量11.2％。
权利要求
1.一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于(1)、菌种采用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422；(2)、制备过程是——菌种培养将斜面菌种进行活化，接至茄形瓶中进行扩大培养；——种液培养将制成的孢子悬浮液接于种子罐中进行培养；培养基为以重量计蔗糖2-4％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为28-30℃，风量1∶0.05-0.3V/V，搅拌速度180-250rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间18-24小时；——发酵罐培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养；培养基为以重量计糖蜜8-12％、豆饼粉0.8-1.5％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为25-28℃，风量1∶0.05-0.5V/V，搅拌速度150-180rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间80-96小时；——菌体收集、水洗、干燥。
全文摘要
一种含γ－亚麻酸生物制剂的制备方法,其特征在于:采用保藏号CGMCC No.0422的刺孢小克银汉霉为菌种;发酵罐培养基为以重量计:蔗糖2—4%、磷酸氢二铵0.01—0.025%、硫酸镁0.01—0.03%、氯化钾0.01—0.03%、硫酸锌0.00005—0.0001%、柠檬酸0.05—0.1%;培养温度为28—30℃,风量1∶0.05—0.3V/V,搅拌速度180—250rPm,罐压0.04—0.06MPa,培养时间18—24小时。本发明生产成本低廉,产率高,并且产品品质好。
文档编号A61K31/185GK1255540SQ9912252
公开日2000年6月7日 申请日期1999年11月12日 优先权日1999年11月12日
发明者朱宏, 花红英 申请人:沈阳大有生物工程有限责任公司
技术领域：
本发明涉及微生物工程领域，特别提供了一种高含量γ-亚麻酸生物制剂的大规模生产方法制备方法。
γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid GLA)是人体必需脂肪酸，不能由人体合成而只能从食物中获得，它是合成前列腺类物质的前体，对人体的生理功能有重要的调节作用。人体由于缺乏γ-亚麻酸可导致机体代谢紊乱而引起多种疾病，如高血压、糖尿病、癌症、病毒感染、以及皮肤老化等。因此，对γ-亚麻酸生理作用的研究以及开发自然资源的研究受到了广泛的重视。由于自然资源的限制，γ-亚麻酸的生产已从植物转向微生物，微生物具有不受自然条件限制，产品质量稳定，成本低廉等特点。如中国专利ZL91106190.8和已经公开的中国专利申请95111964.8，提供了一种用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata生物发酵制备的以γ-亚麻酸为主要成分的生物制剂及生物制剂的制备方法，该生物制剂不仅含有γ-亚麻酸而且还含有微生物多糖、SOD酶、氨基酸、维生素等多种营养成分和生理活性物质，对改善血液粘稠度具有明显作用。但是，在所提供的制备方法中，特别是在发酵培养的过程中，主要以的蔗糖为碳源、尿素为氮源，价格昂贵；不仅如此，由于尿素容易挥发，在灭菌过程中温度、时间较难掌握，使培养基中含氮量及PH不稳定，必须采用灭菌后重新调PH方法或者尿素分消法，给生产带来许多不便，同时也直接影响到菌体的产量；最后，按照专利中提到的菌种、培养基、培养条件进行简单的放大生产，不能生产出所要求的产品，如专利申请95111964.8的实施例中最大作到500ml发酵罐，可以进一步放大到一吨的发酵罐，五吨的发酵罐就不能生产出合格产品了。
本发明的目的在于提供一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其生产成本低廉，产率高，并且产品品质好。
本发明提供了一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于(1)、菌种采用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422；(2)、制备过程是——菌种培养将斜面菌种进行活化，接至茄形瓶中进行扩大培养；——种液培养将制成的孢子悬浮液接于种子罐中进行培养；培养基为以重量计蔗糖2-4％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为28-30℃，风量1∶0.05-0.3V/V，搅拌速度180-250rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间18-24小时；——发酵罐培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养；培养基为以重量计糖蜜8-12％、豆饼粉0.8-1.5％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为25-28℃，风量1∶0.05-0.5V/V，搅拌速度150-180rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间80-96小时；——菌体收集、水洗、干燥。
本发明所使用的刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422)，是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的，保藏号为3.154的刺孢小克银汉霉，经物理化学方法进行复合诱变，在高浓度碳源培养基上筛选出有明显形态变化的菌落，再经摇瓶复筛获得各项生产指标最佳的菌株，其生物量较原始菌株提高25-30％，脂肪提高10-15％，γ-亚麻酸提高10-15％。诱变的具体方法为将幼龄的菌丝制得原生质体，经紫外线处理15-30秒，再将所获得的菌丝用硫酸二乙酯处理30-60分钟，将处理后的菌悬液在高浓度碳源的培养基上培养，挑菌落形态有明显差异的菌株经摇瓶复筛获得，其复合诱变所获得的变异株与原始菌株相比，具有生长速度快，孢子量多，菌丝粗壮等特点。在PDA培养基上28℃培养，2天菌落直径为2-3厘米，菌丝为灰白色，有部分分生孢子形成。3-4天菌落直径为4-7厘米，分生孢子大量形成，菌落为珠母灰色。显微镜下观察，菌丝粗壮多分枝，直径为15-25μm，分生孢子梗直立，分生孢子为球形或椭圆形，上有长刺。孢子直径为8.75-12.5μm，分生孢子聚伞状，梅花状或不规则状。
本发明中使用的碳源主要为蔗糖生产中的残渣糖蜜，不仅价格是蔗糖的1/6，并且其中含有多种维生素及生长因子，可免去维生素B1的添加，使原料成本大幅度下降。
本发明中使用的氮源主要为豆饼粉，不仅价格低廉，同时含氮量稳定，缓冲性强，生产操作易掌握，产量稳定。
本发明中添加微量的锌可明显增加菌体内不饱和脂肪酸的不饱和度，增加产品的有效组分含量。
本发明生物制剂可应用于心脑血管疾病的预防和治疗，也可用于保健食品和饲料添加剂。
总之，本发明中利用工农业生产中的废弃物糖蜜和豆饼粉作原料，可以降低原料成本4/5-4/6，并采用高产诱变菌株，及适合于该菌株生理代谢特点的工艺，缩短发酵时间24-48小时，使能源消耗降低1/5-1/4，在生产操作上简便易行，并且产品各项生产指标稳定。下面通过实施例详述本发明。
实施例15吨发酵罐生产制取菌体
(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。
(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。
(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度250rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。
(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜350kg、豆饼粉30kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、硫酸锌3.5g、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.1V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.044Mpa，培养时间96小时。
(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体110kg，脂肪含量38％，γ-亚麻酸含量12.2％。
实施例25吨发酵罐生产制取菌体(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。
(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。
(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度150rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。
(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜350kg、豆饼粉30kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、硫酸锌3.5g、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.25V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.04Mpa，培养时间96小时。
(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体112kg，脂肪含量35％，γ-亚麻酸含量14.3％。
实施例35吨发酵罐生产制取菌体(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。
(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。
(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度150rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。
(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜420kg、豆饼粉40kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.3V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.04Mpa，培养时间96小时。
(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体120kg，脂肪含量36％，γ-亚麻酸含量11.2％。
权利要求
1.一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于(1)、菌种采用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422；(2)、制备过程是——菌种培养将斜面菌种进行活化，接至茄形瓶中进行扩大培养；——种液培养将制成的孢子悬浮液接于种子罐中进行培养；培养基为以重量计蔗糖2-4％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为28-30℃，风量1∶0.05-0.3V/V，搅拌速度180-250rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间18-24小时；——发酵罐培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养；培养基为以重量计糖蜜8-12％、豆饼粉0.8-1.5％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为25-28℃，风量1∶0.05-0.5V/V，搅拌速度150-180rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间80-96小时；——菌体收集、水洗、干燥。
全文摘要
一种含γ－亚麻酸生物制剂的制备方法,其特征在于:采用保藏号CGMCC No.0422的刺孢小克银汉霉为菌种;发酵罐培养基为以重量计:蔗糖2—4%、磷酸氢二铵0.01—0.025%、硫酸镁0.01—0.03%、氯化钾0.01—0.03%、硫酸锌0.00005—0.0001%、柠檬酸0.05—0.1%;培养温度为28—30℃,风量1∶0.05—0.3V/V,搅拌速度180—250rPm,罐压0.04—0.06MPa,培养时间18—24小时。本发明生产成本低廉,产率高,并且产品品质好。
文档编号A61K31/185GK1255540SQ9912252
公开日2000年6月7日 申请日期1999年11月12日 优先权日1999年11月12日
发明者朱宏, 花红英 申请人:沈阳大有生物工程有限责任公司
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