抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用的制作方法
专利名称：抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用的制作方法
本
发明内容
关于多种具有特异性抗感染功能的IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)产品、制备技术及其具体应用。具体而言，主要是指抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用。
背景技术：
1、口腔和上呼吸道感染口腔和上呼吸道(鼻、咽、喉)是除皮肤外，人体各系统中与外部环境接触最频繁，接触面积最大的部位，因此极为容易被外部环境中的致病微生物所感染。仅口腔中存在的细菌即有400种之多，其中包括有益菌和一些致病菌，它们可粘附到口腔粘膜与牙齿表面，生长繁殖。在正常状态下，口腔各种类微生物之间以及他们与宿主之间维持着一种有益的动态平衡。但是在一些体内外因素的影响下(如免疫力下降、抗生素滥用导致内源有益菌被杀灭、外源病菌攻击等)，这种平衡被破坏，致病微生物大量繁殖并引起感染[1]。
变形链球菌、乳杆菌、放线菌等可引起龋齿，并进一步引起牙髓病和根尖周病；牙龈卟啉单胞菌、螺旋体、梭形杆菌等感染可引起牙龈炎、牙周炎和口腔粘膜疾病(如坏死性龈口炎)[2]；另外，单纯疱疹病毒、假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等亦可单独或混合感染口腔粘膜，引起不同种类的口腔粘膜疾病。各种慢性口腔病灶(如牙龈炎、牙周炎、牙髓病、坏死性龈口炎等)中的病菌(主要是链球菌，特别是草绿色链球菌)及其产生的毒素可通过血液循环或淋巴系统转运至机体其他部位，引起继发性的其他疾病。其中关系较为密切的有细菌性心内膜炎、风湿性或类风湿性关节炎等[3，4]。因此，口腔健康和卫生是保证机体整体健康的一个重要组成部分。
多种病毒和病菌可引起急性上呼吸道感染，不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症，应积极防治。急性上呼吸道感染约有70％-80％由病毒引起。主要有流感病毒(甲、乙、丙)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、风疹病毒。细菌感染可直接或继病毒感染之后发生，以溶血性链球菌为多见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌和葡萄球菌等。偶见革兰阴性杆菌。其感染的主要表现为感冒、咽喉炎或扁桃腺炎[5]。
目前防治口腔感染的方法有口腔及牙齿清洁(如刷牙、超声洗牙、口香糖等)、全身或局部给氟、使用抗生素或化学药品等。防治上呼吸道感染主要用抗生素、抗病毒药物(可选择药物较少)、对症治疗和疫苗(主要是流感疫苗)等方法。但是疫苗预防的方法目前还不成熟，且价格较昂贵。经常性的使用化学药品和抗生素容易导致耐药性致病菌的产生，并且由于其作用的非特异性，将破坏体内正常的菌群平衡，造成继发感染和其他疾病的发生；化学药品和抗生素对人体还存在一定的直接危害(如长期给氟可能会导致氟牙和其他的潜在副作用)。
2、鸡IgY被动免疫方法是直接应用特异性抗体中和致病微生物及其产生的毒素。因为它简单易行、特异性作用，特别是通过消化道和呼吸道进行的被动免疫还能避免主动免疫(即疫苗)某些副作用，具有较高的安全性和有效性，正日益受到人们的关注。从1980年代末至今，国内外已有大量研究资料证实运用多克隆抗体(简称多抗)和单克隆抗体(简称单抗)被动免疫防治疾病的有效性[6，7，8，9]。
被动免疫方法中特异性抗体的来源有人类免疫球蛋白、牛初乳、鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)和单克隆抗体。多克隆抗体能识别病毒病菌表面更多的抗原表位，使之难以通过变异来逃避抗体的中和作用，且制备方法简便、成本较低。
在自然状态下，IgY从母鸡血液转运到蛋黄中，以保护未来的小鸡免受各种感染性疾病。以特异性抗原人工免疫后的蛋鸡是大规模生产特异性多克隆抗体的最好来源[9]。与其他方法相比，鸡IgY提取工艺较简单，并且鸡蛋是人们的日常食品，基本不存在毒性的问题。每个蛋黄中可以提取出100毫克左右的IgY，而一只蛋鸡每年可产280枚鸡蛋，也就是说一只蛋鸡免疫接种后每年可得到约30克的抗体(其中的抗原特异性抗体可达到总IgY的10％，具体比例因抗原种类和其他因素而异)，相当于12只兔子一年的抗体产量。IgY的生产成本比哺乳动物IgG低10倍以上[10，11]。
鸡IgY在结构、功能上与哺乳动物IgG相似，分子量为180kD，等电点5.7-7.6。对酸性环境和温度的稳定性较哺乳动物IgG稍差，但亦很稳定。4℃保存5年、室温下6个月、或37℃1个月对其抗体活性没有显著影响；65℃时活性保持24小时以上，70℃加热90分钟后活性显著下降；能耐酸、耐碱和耐高压，PH值4-11时相当稳定，PH降至2-3时活性迅速下降，IgY在400Mpa高压下和温度低于60℃处理30分钟仍保持部分活性。马培松、刘岩松等在37℃，PH2.8，低浓度胃蛋白酶处理1.5小时后以酶联法检测，IgY活性仅降低25％[10、11、12]。
目前国内外已有不少鸡IgY用于预防和治疗各种感染性疾病的研究报道。研究较多的病种有小儿轮状病毒腹泻及其他一些消化道感染、幽门螺杆菌感染相关疾病、龋齿及相关口腔疾病、绿脓杆菌引起的继发性感染、咽喉炎及其他上呼吸道感染等[13，14， 15、16]。其中，关于鸡IgY抗轮状病毒、幽门螺杆菌、绿脓杆菌、龋齿变形链球菌的研究已有专利申请(中国专利公开号CN1201693A、CN1250056A、CN1208732A、CN1307061A)。但是，在致病菌及其抗原的选择、特异性IgY的制备与纯化技术和终产品配方选择上仍存在较大分歧；在IgY产量和具体实验结果上，不同的研究工作之间亦存在着很大的差异。特别需要注意的是，口腔与上呼吸道感染涉及的致病微生物种类较多，发病机制复杂，选择针对菌种一直是本领域热点和难点问题。以前的有关IgY研究工作相当零散，在特异性抗原选择上比较单一，并且对IgY具体应用的产品配方选择上没有给予足够重视。
发明内容
本发明的目的是，在充分比较和分析近年来国内外相关研究进展的基础之上，提出更加安全高效的抗原选择和终产品配方，并进一步优化IgY制备、纯化工艺方法，实现其大规模、低成本与环保型生产。同时，提供几种针对主要的口腔与上呼吸道感染病症的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)产品。
以下对本发明所采取的IgY产品制备工艺进行叙述，关于几种主要的抗口腔与上呼吸道感染IgY产品及其配方的研究情况，将在后面的具体实施例中逐个予以详细说明。
制备人工免疫特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)采取以下步骤1、制备抗原针对某个病种选择致病菌或病毒的最佳种类(或菌/毒株)；各种类(或菌/毒株)分别培养扩增；以合适方法分别制备颗粒抗原或提取抗原。
2、免疫母鸡各种病菌/病毒毒抗原分别免疫母鸡。参照Farrelly等的方法[17]，初次免疫取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次。收集的超免疫蛋按各菌/毒种抗原种类于4摄氏度分别冷藏保鲜。
3、IgY制备各种菌/毒种IgY抗体分别提取。取分类好的超免疫鸡蛋，75％乙醇仔细檫洗消毒后，去蛋壳，用蛋黄分离器尽量去除蛋白，之后将蛋黄于无菌滤纸上滚动吸干，刺破蛋黄膜，收集蛋黄；按1∶10比例加入4℃预冷的去离子水稀释，充分匀化，澄清过夜；取上清，负压抽滤脱脂，50％饱和硫酸铵沉淀，4℃ 8000r/min离心20min，沉淀用0.1M PBS重悬后经Sepharose S-200凝胶滤过纯化；纯化抗体溶液超滤浓缩，经过滤除菌后分装保存于4℃，或冷冻干燥后保存。
4、IgY纯度鉴定与蛋白含量测定。纯度鉴定用SDS-PAGE法(Laemmli体系)；含量测定用福林-酚试剂法。
5、IgY抗体效价检测。采用ELISA法检测，以各对应菌/毒种抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。检测依常规进行。
6、抗体混合按不同病种，将几种与其特征性菌/毒种抗原相对应的IgY以最合适的比例混合。
7、产品配方取以上制备的IgY抗体混合物，按不同的产品配方加入辅料与其他物质，制成各种特异性抗口腔或呼吸道感染的IgY产品。
本发明分别制备抗每种致病菌/病毒的IgY抗体，然后根据这些致病菌/病毒在某种病症发生中的作用大小，选择最佳的IgY抗体组合。这种抗体组合既可保证主要抗原特异性抗体的有效量，又能保证针对其他抗原的广谱作用，从而最大可能地提高疗效。特别是针对几种主要口腔与上呼吸道感染病症的抗体优化组合。
研究发现，致病微生物的粘附是宿主感染发生的必须条件，通过抑制对粘附起主要作用的致病菌表面抗原可以有效防止感染[2]。因此，本发明中在抗原选择上以含有致病菌表面抗原的细胞壁和外膜碎片为主，既提高了有效IgY的含量，又保持了抗原制备工艺的简易性。
本发明在IgY制备中采取硫酸铵沉淀法[18]，既提高了IgY收率，减低生产成本，又避免了制备工艺使用有机物对环境污染问题。
3次免疫强化后，ELISA方法检测，蛋黄中的特异性IgY抗体效价达10-5以上；经福林-酚法检测，蛋黄总蛋白回收率达90％以上；平均每只鸡蛋可得到IgY 100毫克左右，SDS-PAGE检测纯度高达95％，脂含量低于1％；整个制备过程IgY抗体活性降低比例低于5％。这些鉴定结果充分证明了本发明所采用IgY制备工艺的有效性。
根据所选定各口腔与上呼吸道感染病种的国内外防治研究结果，本发明进行了IgY及其配方组合物的体外致病菌/病毒抑制实验和初步动物实验，针对不同的应用，反复试验并初步确定了几种IgY应用的最佳配方。
以下实施例将更为具体地描述本发明的详细内容，但本发明的内容不仅限于此。
实施例1预防龋齿的IgY制备及其产品配方龋齿是人群中普遍存在的感染性疾病，根据第二次全国口腔流行病学调查数据，我国50％以上的人群患有不同程度的龋齿。并且龋齿是引起口臭的主要原因之一。目前主要采用全身或局部给氟的方法(主要是牙膏中加氟)防治龋齿。但是长期用氟存在对人体的安全隐患问题。国内外大量的研究工作表明，使用特异性鸡IgY被动免疫防龋是一种安全、有效的潜在替代手段[2，19，20]。
变形链球菌对牙釉质和牙本质均具粘附作用，是龋齿的主要致病菌，其中以血清c、e、f型(人类牙菌斑中的总检出率为90％，但三者间具有血清交叉反应)和d/g型(亦称远缘链球菌、茸毛链球菌，人类牙菌斑中的检出率达9％)为主，但后者的产酸能力更强，因此破坏性可能更大；而乳杆菌则对牙本质具粘附作用，在浅龋(釉质龋)向深龋(牙本质龋)发展的过程中起重要作用[21]。
本实施例分别制备变形链球菌的两种亚型(血清c型和d/g型)和乳杆菌的IgY抗体，并按一定比例混合制成产品。
1、抗原制备将变型链球菌标准菌株Ingbritt(血清c型)、远缘链球菌S.sobrinus 6715(血清g型)、乳杆菌标准菌株ATCC4356分别接种于含蔗糖的TS(pH7.0)培养液中，95％N2、5％CO2厌氧培养，37℃培养48h，各自离心收集菌体，PBS洗涤后调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的IgY抗体，按c∶g∶乳杆菌＝3∶1∶1的比例混合，即为抗龋齿IgY溶液，冻干保存。
5、预防龋齿IgY产品配方加入防腐剂、湿润剂、或其他辅助成分。
喷雾剂1以上制备的抗龋齿IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
喷雾剂2以上制备的抗龋齿IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，木糖醇50克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
簌口液以上制备的抗龋齿IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，木糖醇50克，无菌水溶解后，加入100甘油，定容至1000毫升。
口香糖；胶基40千克，50摄氏度软化后，加入木糖醇30千克，山梨糖醇20千克，乳酸钙10千克，薄荷0.1千克，水果香精适量，山梨酸钾20克，和以上制备的抗龋齿IgY50克，充分搅拌均匀。共100千克。
实施例2治疗牙周病(牙龈炎、牙周炎)及口腔粘膜病的IgY制备及其产品配方牙周病和口腔粘膜病都是由于多种口腔致病菌混合感染而引起的，口腔中的菌群平衡对这两种疾病的发生起着极为重要的作用。
牙周病是一组由细菌(牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌等)感染引起的、以牙周组织的损害和毁坏为特征的慢性疾病。它是造成牙齿大量缺失、影响口腔健康的常见病。根据发病的部位和病变性质，牙周病又分为牙龈炎和牙周炎。牙周病灶的长期存在还可能会引起细菌性心内膜炎等全身性继发感染(特别是草绿色链球菌及其产生的毒素)。并且，与龋齿一样，牙周病是引起口臭另一个重要原因[1]。口腔粘膜病是指除肿瘤以外，发生在口腔粘膜和软组织的疾病。口腔粘膜病病种较多，患病率较低，病损多种多样，病因复杂。其中由于局部感染引起的口腔粘膜病有口腔螺旋体和梭形杆菌引起(最近亦有报道患处中间普里沃菌增多)的坏死性龈口炎；假丝酵母菌感染引起的雪口或鹅口疮(多发于婴幼儿)；由金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等球菌性感染所引起的膜性口炎等[3]。
针对优选抗原种类的鸡IgY组合可有效抑制以上主要致病菌，从而维护口腔菌群的良性平衡，避免口腔疾病的发生。
1、抗原制备分别培养扩增牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌、中间普里沃菌、草绿色链球菌、假丝酵母菌(采用口腔标准菌株或分离菌株)。调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的各IgY抗体，按牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌、中间普里沃菌、草绿色链球菌、假丝酵母菌的顺序，以2∶2∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。
5、产品配方喷雾剂以上制备的抗口腔及牙周感染IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
簌口液以上制备的抗口腔及牙周感染IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，加入100毫升甘油，定容至1000毫升。
实施例3预防、治疗流行性感冒及其并发症的IgY制备及其产品配方流行性感冒是一种急性上呼吸道感染，具有季节复发性，而且可引起其他呼吸道并发症，主要由流感病毒感染引起，细菌感染可直接或继病毒感染之后发生，以溶血性链球菌为多见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌和葡萄球菌等。偶见革兰阴性杆菌。其感染的主要表现为感冒、咽喉炎或扁桃腺炎。
1、抗原制备根据WHO公布的2002年流行的流感病毒代表株，选择A1、A3、B型流感病毒，常规鸡胚传代法扩增，血凝法测病毒滴度，三种型别病毒等比例混合后，调节浓度至血凝效价为1∶640和1∶800。
溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌各自培养扩增，调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡流感病毒抗原和其他致病菌抗原分别免疫，过程如下取流感病毒抗原，于育龄Leghorn种鸡(SPF级)翅下静脉注射免疫，每次每只动物5毫升，病毒血凝效价为1∶800，每周一次，连续5周；初免后4周于鸡翅根处肌注加强免疫一次，每侧0.5毫升，共1毫升，病毒血凝效价为1∶640。抗体效价达到平台峰值后(约5×10-4)，开始收集超免疫蛋。收集的超免疫蛋于4摄氏度冷藏保鲜。
取以上制备的各致病菌抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的IgY抗体，按流感病毒、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的顺序以3∶2∶1∶1的比例混合。
5、产品配方喷雾剂以上制备的抗流感IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
实施例4治疗咽喉炎的IgY制备及其产品配方咽喉炎是耳鼻喉科常见病，多由病菌感染或其他上呼吸道疾病所致的并发感染引起。以溶血性链球菌为主，其次为肺炎球菌和葡萄球菌等。
1、抗原制备溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌各自培养扩增，调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的IgY抗体，按溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的顺序以3∶1∶1的比例混合。
5、产品配方喷雾剂以上制备的抗咽喉炎IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
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权利要求
1.人工免疫制备的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)用于预防龋齿、治疗牙周病及口腔粘膜病、预防及治疗流行性感冒、治疗咽喉炎。
2.一种人工免疫鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)制备工艺方法，其过程包括选择抗原菌/病毒种类、制备抗原、IgY提取纯化、IgY检测鉴定、抗体比例混合。其特征是，在尽可能提高所制备IgY的针对性和有效性的同时，充分保证了整个制备工艺的简易、高效与低成本，并适合于大规模生产。
3.根据权利要求2所述的制备工艺方法，其特征是根据各类别病菌/病毒在某病症中的作用主次选择最佳抗原菌/病毒种类；在抗原选择上以含有致病菌表面抗原的细胞壁和外膜碎片为主；分别制备纯化与保存针对每种致病菌/病毒的IgY抗体；IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法；IgY纯度鉴定、蛋白含量测定和IgY抗体效价检测分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)、福林-酚试剂法和ELISA法；根据这些致病菌/病毒在某种病症发生中的作用大小，选择最佳的IgY抗体组合及其比例。
4.一种抗龋齿IgY产品。其特征是，抗变型链球菌Ingbritt(血清c型)、远缘链球菌S.sobrinus(血清g型)和乳杆菌的IgY抗体以3∶1∶1的比例混合。
5.一种治疗牙周病及口腔粘膜病的IgY产品。其特征是，抗牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌、中间普里沃菌、草绿色链球菌、假丝酵母菌的IgY抗体，以2∶2∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。
6.一种预防、治疗流行性感冒IgY产品。其特征是，抗流感病毒、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的IgY抗体，以3∶2∶1∶1的比例混合。
7.一种治疗咽喉炎的IgY产品。其特征是，抗溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的IgY抗体，以3∶1∶1的比例混合。
8.多种用于抗口腔及上呼吸道感染IgY产品的配方，其特征是，IgY产品中加入防腐剂、湿润剂、香味剂和/或其他辅助成分。
9.根据权利要求8所述的配方，其特征是，苯甲酸钠或山梨酸钾作为防腐剂，甘油作为湿润剂和蛋白稳定剂，薄荷作为香味剂。
10.根据权利要求8所述的配方，其特征是，抗龋齿IgY产品中加入木糖醇作为辅助抑菌成分。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及多种具有特异性抗感染功能的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备技术、应用产品配方和具体应用领域。
文档编号A61P1/02GK1569229SQ03149558
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月17日 优先权日2003年7月17日
发明者叶少军, 周锋, 陈如雷, 尹娟 申请人:叶少军
本
发明内容
关于多种具有特异性抗感染功能的IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)产品、制备技术及其具体应用。具体而言，主要是指抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用。
背景技术：
1、口腔和上呼吸道感染口腔和上呼吸道(鼻、咽、喉)是除皮肤外，人体各系统中与外部环境接触最频繁，接触面积最大的部位，因此极为容易被外部环境中的致病微生物所感染。仅口腔中存在的细菌即有400种之多，其中包括有益菌和一些致病菌，它们可粘附到口腔粘膜与牙齿表面，生长繁殖。在正常状态下，口腔各种类微生物之间以及他们与宿主之间维持着一种有益的动态平衡。但是在一些体内外因素的影响下(如免疫力下降、抗生素滥用导致内源有益菌被杀灭、外源病菌攻击等)，这种平衡被破坏，致病微生物大量繁殖并引起感染[1]。
变形链球菌、乳杆菌、放线菌等可引起龋齿，并进一步引起牙髓病和根尖周病；牙龈卟啉单胞菌、螺旋体、梭形杆菌等感染可引起牙龈炎、牙周炎和口腔粘膜疾病(如坏死性龈口炎)[2]；另外，单纯疱疹病毒、假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等亦可单独或混合感染口腔粘膜，引起不同种类的口腔粘膜疾病。各种慢性口腔病灶(如牙龈炎、牙周炎、牙髓病、坏死性龈口炎等)中的病菌(主要是链球菌，特别是草绿色链球菌)及其产生的毒素可通过血液循环或淋巴系统转运至机体其他部位，引起继发性的其他疾病。其中关系较为密切的有细菌性心内膜炎、风湿性或类风湿性关节炎等[3，4]。因此，口腔健康和卫生是保证机体整体健康的一个重要组成部分。
多种病毒和病菌可引起急性上呼吸道感染，不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症，应积极防治。急性上呼吸道感染约有70％-80％由病毒引起。主要有流感病毒(甲、乙、丙)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、风疹病毒。细菌感染可直接或继病毒感染之后发生，以溶血性链球菌为多见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌和葡萄球菌等。偶见革兰阴性杆菌。其感染的主要表现为感冒、咽喉炎或扁桃腺炎[5]。
目前防治口腔感染的方法有口腔及牙齿清洁(如刷牙、超声洗牙、口香糖等)、全身或局部给氟、使用抗生素或化学药品等。防治上呼吸道感染主要用抗生素、抗病毒药物(可选择药物较少)、对症治疗和疫苗(主要是流感疫苗)等方法。但是疫苗预防的方法目前还不成熟，且价格较昂贵。经常性的使用化学药品和抗生素容易导致耐药性致病菌的产生，并且由于其作用的非特异性，将破坏体内正常的菌群平衡，造成继发感染和其他疾病的发生；化学药品和抗生素对人体还存在一定的直接危害(如长期给氟可能会导致氟牙和其他的潜在副作用)。
2、鸡IgY被动免疫方法是直接应用特异性抗体中和致病微生物及其产生的毒素。因为它简单易行、特异性作用，特别是通过消化道和呼吸道进行的被动免疫还能避免主动免疫(即疫苗)某些副作用，具有较高的安全性和有效性，正日益受到人们的关注。从1980年代末至今，国内外已有大量研究资料证实运用多克隆抗体(简称多抗)和单克隆抗体(简称单抗)被动免疫防治疾病的有效性[6，7，8，9]。
被动免疫方法中特异性抗体的来源有人类免疫球蛋白、牛初乳、鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)和单克隆抗体。多克隆抗体能识别病毒病菌表面更多的抗原表位，使之难以通过变异来逃避抗体的中和作用，且制备方法简便、成本较低。
在自然状态下，IgY从母鸡血液转运到蛋黄中，以保护未来的小鸡免受各种感染性疾病。以特异性抗原人工免疫后的蛋鸡是大规模生产特异性多克隆抗体的最好来源[9]。与其他方法相比，鸡IgY提取工艺较简单，并且鸡蛋是人们的日常食品，基本不存在毒性的问题。每个蛋黄中可以提取出100毫克左右的IgY，而一只蛋鸡每年可产280枚鸡蛋，也就是说一只蛋鸡免疫接种后每年可得到约30克的抗体(其中的抗原特异性抗体可达到总IgY的10％，具体比例因抗原种类和其他因素而异)，相当于12只兔子一年的抗体产量。IgY的生产成本比哺乳动物IgG低10倍以上[10，11]。
鸡IgY在结构、功能上与哺乳动物IgG相似，分子量为180kD，等电点5.7-7.6。对酸性环境和温度的稳定性较哺乳动物IgG稍差，但亦很稳定。4℃保存5年、室温下6个月、或37℃1个月对其抗体活性没有显著影响；65℃时活性保持24小时以上，70℃加热90分钟后活性显著下降；能耐酸、耐碱和耐高压，PH值4-11时相当稳定，PH降至2-3时活性迅速下降，IgY在400Mpa高压下和温度低于60℃处理30分钟仍保持部分活性。马培松、刘岩松等在37℃，PH2.8，低浓度胃蛋白酶处理1.5小时后以酶联法检测，IgY活性仅降低25％[10、11、12]。
目前国内外已有不少鸡IgY用于预防和治疗各种感染性疾病的研究报道。研究较多的病种有小儿轮状病毒腹泻及其他一些消化道感染、幽门螺杆菌感染相关疾病、龋齿及相关口腔疾病、绿脓杆菌引起的继发性感染、咽喉炎及其他上呼吸道感染等[13，14， 15、16]。其中，关于鸡IgY抗轮状病毒、幽门螺杆菌、绿脓杆菌、龋齿变形链球菌的研究已有专利申请(中国专利公开号CN1201693A、CN1250056A、CN1208732A、CN1307061A)。但是，在致病菌及其抗原的选择、特异性IgY的制备与纯化技术和终产品配方选择上仍存在较大分歧；在IgY产量和具体实验结果上，不同的研究工作之间亦存在着很大的差异。特别需要注意的是，口腔与上呼吸道感染涉及的致病微生物种类较多，发病机制复杂，选择针对菌种一直是本领域热点和难点问题。以前的有关IgY研究工作相当零散，在特异性抗原选择上比较单一，并且对IgY具体应用的产品配方选择上没有给予足够重视。
发明内容
本发明的目的是，在充分比较和分析近年来国内外相关研究进展的基础之上，提出更加安全高效的抗原选择和终产品配方，并进一步优化IgY制备、纯化工艺方法，实现其大规模、低成本与环保型生产。同时，提供几种针对主要的口腔与上呼吸道感染病症的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)产品。
以下对本发明所采取的IgY产品制备工艺进行叙述，关于几种主要的抗口腔与上呼吸道感染IgY产品及其配方的研究情况，将在后面的具体实施例中逐个予以详细说明。
制备人工免疫特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)采取以下步骤1、制备抗原针对某个病种选择致病菌或病毒的最佳种类(或菌/毒株)；各种类(或菌/毒株)分别培养扩增；以合适方法分别制备颗粒抗原或提取抗原。
2、免疫母鸡各种病菌/病毒毒抗原分别免疫母鸡。参照Farrelly等的方法[17]，初次免疫取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次。收集的超免疫蛋按各菌/毒种抗原种类于4摄氏度分别冷藏保鲜。
3、IgY制备各种菌/毒种IgY抗体分别提取。取分类好的超免疫鸡蛋，75％乙醇仔细檫洗消毒后，去蛋壳，用蛋黄分离器尽量去除蛋白，之后将蛋黄于无菌滤纸上滚动吸干，刺破蛋黄膜，收集蛋黄；按1∶10比例加入4℃预冷的去离子水稀释，充分匀化，澄清过夜；取上清，负压抽滤脱脂，50％饱和硫酸铵沉淀，4℃ 8000r/min离心20min，沉淀用0.1M PBS重悬后经Sepharose S-200凝胶滤过纯化；纯化抗体溶液超滤浓缩，经过滤除菌后分装保存于4℃，或冷冻干燥后保存。
4、IgY纯度鉴定与蛋白含量测定。纯度鉴定用SDS-PAGE法(Laemmli体系)；含量测定用福林-酚试剂法。
5、IgY抗体效价检测。采用ELISA法检测，以各对应菌/毒种抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。检测依常规进行。
6、抗体混合按不同病种，将几种与其特征性菌/毒种抗原相对应的IgY以最合适的比例混合。
7、产品配方取以上制备的IgY抗体混合物，按不同的产品配方加入辅料与其他物质，制成各种特异性抗口腔或呼吸道感染的IgY产品。
本发明分别制备抗每种致病菌/病毒的IgY抗体，然后根据这些致病菌/病毒在某种病症发生中的作用大小，选择最佳的IgY抗体组合。这种抗体组合既可保证主要抗原特异性抗体的有效量，又能保证针对其他抗原的广谱作用，从而最大可能地提高疗效。特别是针对几种主要口腔与上呼吸道感染病症的抗体优化组合。
研究发现，致病微生物的粘附是宿主感染发生的必须条件，通过抑制对粘附起主要作用的致病菌表面抗原可以有效防止感染[2]。因此，本发明中在抗原选择上以含有致病菌表面抗原的细胞壁和外膜碎片为主，既提高了有效IgY的含量，又保持了抗原制备工艺的简易性。
本发明在IgY制备中采取硫酸铵沉淀法[18]，既提高了IgY收率，减低生产成本，又避免了制备工艺使用有机物对环境污染问题。
3次免疫强化后，ELISA方法检测，蛋黄中的特异性IgY抗体效价达10-5以上；经福林-酚法检测，蛋黄总蛋白回收率达90％以上；平均每只鸡蛋可得到IgY 100毫克左右，SDS-PAGE检测纯度高达95％，脂含量低于1％；整个制备过程IgY抗体活性降低比例低于5％。这些鉴定结果充分证明了本发明所采用IgY制备工艺的有效性。
根据所选定各口腔与上呼吸道感染病种的国内外防治研究结果，本发明进行了IgY及其配方组合物的体外致病菌/病毒抑制实验和初步动物实验，针对不同的应用，反复试验并初步确定了几种IgY应用的最佳配方。
以下实施例将更为具体地描述本发明的详细内容，但本发明的内容不仅限于此。
实施例1预防龋齿的IgY制备及其产品配方龋齿是人群中普遍存在的感染性疾病，根据第二次全国口腔流行病学调查数据，我国50％以上的人群患有不同程度的龋齿。并且龋齿是引起口臭的主要原因之一。目前主要采用全身或局部给氟的方法(主要是牙膏中加氟)防治龋齿。但是长期用氟存在对人体的安全隐患问题。国内外大量的研究工作表明，使用特异性鸡IgY被动免疫防龋是一种安全、有效的潜在替代手段[2，19，20]。
变形链球菌对牙釉质和牙本质均具粘附作用，是龋齿的主要致病菌，其中以血清c、e、f型(人类牙菌斑中的总检出率为90％，但三者间具有血清交叉反应)和d/g型(亦称远缘链球菌、茸毛链球菌，人类牙菌斑中的检出率达9％)为主，但后者的产酸能力更强，因此破坏性可能更大；而乳杆菌则对牙本质具粘附作用，在浅龋(釉质龋)向深龋(牙本质龋)发展的过程中起重要作用[21]。
本实施例分别制备变形链球菌的两种亚型(血清c型和d/g型)和乳杆菌的IgY抗体，并按一定比例混合制成产品。
1、抗原制备将变型链球菌标准菌株Ingbritt(血清c型)、远缘链球菌S.sobrinus 6715(血清g型)、乳杆菌标准菌株ATCC4356分别接种于含蔗糖的TS(pH7.0)培养液中，95％N2、5％CO2厌氧培养，37℃培养48h，各自离心收集菌体，PBS洗涤后调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的IgY抗体，按c∶g∶乳杆菌＝3∶1∶1的比例混合，即为抗龋齿IgY溶液，冻干保存。
5、预防龋齿IgY产品配方加入防腐剂、湿润剂、或其他辅助成分。
喷雾剂1以上制备的抗龋齿IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
喷雾剂2以上制备的抗龋齿IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，木糖醇50克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
簌口液以上制备的抗龋齿IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，木糖醇50克，无菌水溶解后，加入100甘油，定容至1000毫升。
口香糖；胶基40千克，50摄氏度软化后，加入木糖醇30千克，山梨糖醇20千克，乳酸钙10千克，薄荷0.1千克，水果香精适量，山梨酸钾20克，和以上制备的抗龋齿IgY50克，充分搅拌均匀。共100千克。
实施例2治疗牙周病(牙龈炎、牙周炎)及口腔粘膜病的IgY制备及其产品配方牙周病和口腔粘膜病都是由于多种口腔致病菌混合感染而引起的，口腔中的菌群平衡对这两种疾病的发生起着极为重要的作用。
牙周病是一组由细菌(牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌等)感染引起的、以牙周组织的损害和毁坏为特征的慢性疾病。它是造成牙齿大量缺失、影响口腔健康的常见病。根据发病的部位和病变性质，牙周病又分为牙龈炎和牙周炎。牙周病灶的长期存在还可能会引起细菌性心内膜炎等全身性继发感染(特别是草绿色链球菌及其产生的毒素)。并且，与龋齿一样，牙周病是引起口臭另一个重要原因[1]。口腔粘膜病是指除肿瘤以外，发生在口腔粘膜和软组织的疾病。口腔粘膜病病种较多，患病率较低，病损多种多样，病因复杂。其中由于局部感染引起的口腔粘膜病有口腔螺旋体和梭形杆菌引起(最近亦有报道患处中间普里沃菌增多)的坏死性龈口炎；假丝酵母菌感染引起的雪口或鹅口疮(多发于婴幼儿)；由金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等球菌性感染所引起的膜性口炎等[3]。
针对优选抗原种类的鸡IgY组合可有效抑制以上主要致病菌，从而维护口腔菌群的良性平衡，避免口腔疾病的发生。
1、抗原制备分别培养扩增牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌、中间普里沃菌、草绿色链球菌、假丝酵母菌(采用口腔标准菌株或分离菌株)。调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的各IgY抗体，按牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌、中间普里沃菌、草绿色链球菌、假丝酵母菌的顺序，以2∶2∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。
5、产品配方喷雾剂以上制备的抗口腔及牙周感染IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
簌口液以上制备的抗口腔及牙周感染IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，加入100毫升甘油，定容至1000毫升。
实施例3预防、治疗流行性感冒及其并发症的IgY制备及其产品配方流行性感冒是一种急性上呼吸道感染，具有季节复发性，而且可引起其他呼吸道并发症，主要由流感病毒感染引起，细菌感染可直接或继病毒感染之后发生，以溶血性链球菌为多见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌和葡萄球菌等。偶见革兰阴性杆菌。其感染的主要表现为感冒、咽喉炎或扁桃腺炎。
1、抗原制备根据WHO公布的2002年流行的流感病毒代表株，选择A1、A3、B型流感病毒，常规鸡胚传代法扩增，血凝法测病毒滴度，三种型别病毒等比例混合后，调节浓度至血凝效价为1∶640和1∶800。
溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌各自培养扩增，调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡流感病毒抗原和其他致病菌抗原分别免疫，过程如下取流感病毒抗原，于育龄Leghorn种鸡(SPF级)翅下静脉注射免疫，每次每只动物5毫升，病毒血凝效价为1∶800，每周一次，连续5周；初免后4周于鸡翅根处肌注加强免疫一次，每侧0.5毫升，共1毫升，病毒血凝效价为1∶640。抗体效价达到平台峰值后(约5×10-4)，开始收集超免疫蛋。收集的超免疫蛋于4摄氏度冷藏保鲜。
取以上制备的各致病菌抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的IgY抗体，按流感病毒、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的顺序以3∶2∶1∶1的比例混合。
5、产品配方喷雾剂以上制备的抗流感IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
实施例4治疗咽喉炎的IgY制备及其产品配方咽喉炎是耳鼻喉科常见病，多由病菌感染或其他上呼吸道疾病所致的并发感染引起。以溶血性链球菌为主，其次为肺炎球菌和葡萄球菌等。
1、抗原制备溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌各自培养扩增，调节菌浓度至2×109CFU/ml。超声破碎，1000g离心10分钟，去除大的细菌碎片和全细胞；60000g离心20分钟，去上清，收集沉淀(细胞壁与外膜)，PBS离心洗涤一次，加入PBS制成悬液，调节蛋白浓度为1600微克/毫升。
2、免疫母鸡取以上制备的抗原溶液，加入等量福氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，多点肌肉或皮下注射育龄Leghorn种鸡(SPF级)，每点0.5毫升(约400微克抗原)；每间隔2周再加强免疫一次，共2-3次，加强免疫改用福氏不完全佐剂。抗体效价达到平台峰值后，开始收集超免疫蛋。并每周检测抗体效价，当抗体效价趋于下降时，再加强免疫一次(开始收集超免疫蛋三个月后，每月加强免疫一次)。收集的超免疫蛋于4摄氏度分类冷藏保鲜。
3、IgY抗体提取纯化、检测、鉴定IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法。纯度鉴定与蛋白含量测定分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)和福林-酚试剂法。IgY抗体效价检测采用ELISA法，以抗原溶液包被酶联板，二抗采用生物素标记的鼠抗鸡IgY轻链单抗。
4、抗体混合取纯化后的IgY抗体，按溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的顺序以3∶1∶1的比例混合。
5、产品配方喷雾剂以上制备的抗咽喉炎IgY 4克，薄荷1克，苯甲酸钠0.1克，无菌水溶解后，定容至1000毫升。
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权利要求
1.人工免疫制备的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)用于预防龋齿、治疗牙周病及口腔粘膜病、预防及治疗流行性感冒、治疗咽喉炎。
2.一种人工免疫鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)制备工艺方法，其过程包括选择抗原菌/病毒种类、制备抗原、IgY提取纯化、IgY检测鉴定、抗体比例混合。其特征是，在尽可能提高所制备IgY的针对性和有效性的同时，充分保证了整个制备工艺的简易、高效与低成本，并适合于大规模生产。
3.根据权利要求2所述的制备工艺方法，其特征是根据各类别病菌/病毒在某病症中的作用主次选择最佳抗原菌/病毒种类；在抗原选择上以含有致病菌表面抗原的细胞壁和外膜碎片为主；分别制备纯化与保存针对每种致病菌/病毒的IgY抗体；IgY提取纯化采用水稀释、饱和硫酸铵沉淀与Sepharose S-200凝胶过滤相结合的方法；IgY纯度鉴定、蛋白含量测定和IgY抗体效价检测分别采用SDS-PAGE法(Laemmli体系)、福林-酚试剂法和ELISA法；根据这些致病菌/病毒在某种病症发生中的作用大小，选择最佳的IgY抗体组合及其比例。
4.一种抗龋齿IgY产品。其特征是，抗变型链球菌Ingbritt(血清c型)、远缘链球菌S.sobrinus(血清g型)和乳杆菌的IgY抗体以3∶1∶1的比例混合。
5.一种治疗牙周病及口腔粘膜病的IgY产品。其特征是，抗牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌/伴放线嗜血杆菌、口腔螺旋体、梭形杆菌、中间普里沃菌、草绿色链球菌、假丝酵母菌的IgY抗体，以2∶2∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。
6.一种预防、治疗流行性感冒IgY产品。其特征是，抗流感病毒、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的IgY抗体，以3∶2∶1∶1的比例混合。
7.一种治疗咽喉炎的IgY产品。其特征是，抗溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的IgY抗体，以3∶1∶1的比例混合。
8.多种用于抗口腔及上呼吸道感染IgY产品的配方，其特征是，IgY产品中加入防腐剂、湿润剂、香味剂和/或其他辅助成分。
9.根据权利要求8所述的配方，其特征是，苯甲酸钠或山梨酸钾作为防腐剂，甘油作为湿润剂和蛋白稳定剂，薄荷作为香味剂。
10.根据权利要求8所述的配方，其特征是，抗龋齿IgY产品中加入木糖醇作为辅助抑菌成分。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及多种具有特异性抗感染功能的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备技术、应用产品配方和具体应用领域。
文档编号A61P1/02GK1569229SQ03149558
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月17日 优先权日2003年7月17日
发明者叶少军, 周锋, 陈如雷, 尹娟 申请人:叶少军
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