蚌肉提取物的制备方法及含有它们的药物组合物及其应用的制作方法
专利名称：蚌肉提取物的制备方法及含有它们的药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从蚌肉中制备抗肿瘤和镇痛活性成分的方法以及含有蚌肉提取物的药物组合物。
本发明还涉及蚌肉提取物在制备抗肿瘤药物和镇痛药物中的应用。
背景技术：
由于癌症严重地危害人类的生命及健康，各国均投入大量的人力物力致力于抗癌药物的研究，目前化学合成的抗癌药物存在较严重的细胞毒性，因此，从天然的动、植物中寻找高效、低毒的抗癌活性成分已成为研究的热点。这些研究始于上世纪50年代以后，1958～1980年美国国家癌症协会(NCI)策划并实施了从35000种植物中筛选安全有效的抗癌药物的计划；日本、韩国、德国等国也进行了大量的研究工作，取得了令人鼓舞的结果。我国的传统医药经过几千年的医疗实践验证，在世界上逐渐被更多的人们所认识和利用，正在发挥自己的优势。近年来在中药抗癌有效成分及其制剂的研究方面也取得了长足的进展，如植物药中的生物碱类、苷类、黄酮类和多糖类等；动物药中鲨鱼软骨提取物、斑蟊素、蚕宝素、白蚁干粉及蟾酥等。这些成分目前被临床证实具有较强的抗肿瘤作用。自20世纪60年代开始海洋药物的研究逐渐成为研究的热点，各国学者于20世纪70、80年代开始开展了大规模的筛选，用现代科学方法分离鉴定了许多结构新颖、作用独特的生物活性物质，90年代随着海洋药物研究的日益深入，多种海洋药物已进入临床试验阶段，如肽类的膜海鞘素、蛤素、海兔毒肽、海扇糖蛋白；脂质类的鲨肝醇、鱼肝油酸钠、海兔醚；及苷类、多糖类等。但这些产物抗癌的临床疗效仍难以令人满意，而且很多天然物质的来源受限，致使成本较高，临床应用较少。
镇痛药是医院临床上最常用的药物之一，目前临床上主要使用的镇痛为吗啡、哌替啶等，这些药物虽然镇痛效果好，但有强的药物耐受和依赖性，能严重损害人的身心健康。寻找安全有效、成瘾性较低的镇痛药物一直是新药研究不懈追求的目标。近年来，随着分子生物学技术在疼痛机制和镇痛药理研究中的应用，各种与疼痛传导相关的受体及其选择性配体的研究取得了一定的进展。人们更加认识到疼痛是一个极其复杂的动态过程，涉及多靶标相互作用的神经传导/神经调节系统，从而为寻找新型镇痛药物奠定了基础。以新的分子靶标为基础寻找设计镇痛药物，有望摆脱传统的麻醉镇痛药和NASID(阿司匹林类)的局限。
此外，近年吸毒已成为一个严重的社会问题，它严重危害人的身心健康和社会稳定，而要戒除毒瘾，其有效方法之一，是应用一种既无成瘾性，而镇痛效果又好的药物。因此人们一直致力于寻找一种无成瘾性的镇痛及戒毒良药。自本世纪70年代首次在动物脑内发现内源性阿片肽以来，引起了人们对镇痛多肽的极大兴趣。近年来的研究发现，小分子多肽绝大部分来源于动物(包括人类)，由于其含量微少，无法进行产业化生产；尤其令人遗憾的是经药理和生理实验研究发现，这些来源于动、植物的镇痛的小分子多肽绝大部分也具有一定的药物依赖性。
蛤(蚌)类的药用在中医临床中具有悠久的历史。《神农本草经》是我国第一部系统的药学专著，该书中记载“文蛤，主恶疮，蚀五痔”，这里的“恶疮”、“五痔”可能包括了一些恶性肿瘤如溃烂于体表的癌瘤及直肠癌等。李时珍在《本草纲目》中对蚌蛤类的药用做了进一步的阐述，共记载蚌蛤类药29种附方118个。“味咸、平微寒、无毒，去肋下坚满、疬、一切疮肿，消疝积块，瘿疾结核；化痰消积，除湿肿水嗽，明目，擦阴疮湿疮痛痒”，以上病症可能包括了一些恶性肿瘤在内。
曾有实验室报道，利用河蚌提取的河蚌多糖(Mpa)具有一定的抗瘤和抗炎作用，但Mpa的作用强度较低，在小鼠发挥抗炎作用需5g/kg以上，使Mpa的来源和临床应用受限。
河蚌为水生软体动物，其肉质柔软，极易腐烂变质，蚌肉一般在出水后数小时就变质发臭。在河蚌的体内含有多种酶类，例如，在河蚌的胃内有一特殊的结构“晶杆体”，它有搅拌食物和分泌糖原酶的作用，在胃的周围还有一对褐色葡萄状的消化腺，这是河蚌的肝脏，有肝管通到胃内，肝脏内含有淀粉酶和糖原酶，也起消化作用(戈贤平等，淡水珍珠养殖新技术，上海科学技术出版社，2002年8月)。这些酶类在河蚌体内起重要作用，同时研究发现，这些酶类也与河蚌体内含有的抗肿瘤和镇痛活性成分的生物学活性密切相关。因此，在制备蚌肉提取物的过程中如何保持河蚌体内各种酶类的高活性从而获得具有较高生物学活性的提取物将十分重要。
中国专利CN1067579C中公开了一种治疗肿瘤的药物，它是利用从淡水河蚌中提取的蚌质素与黄芪、丹参、昆布、香菇制成的一种组合物，其中蚌质素的制备方法是将淡水河蚌的软体组织匀浆后，用苯甲酸溶液进行防腐处理，加入盐酸调PH至4.0，再加入60％乙醇，体积比为1∶0.5搅拌后过滤，滤液以3000转/分离心取沉淀物，恒温50℃干燥后即得蚌(质)素。
中国专利CN1079238C公开一种具有镇痛和抑制肿瘤作用的蚌类提取物的制备方法，其采用酸和醇处理蚌肉后，将上清液再以碱处理，取碱处理后的沉淀得到蚌类提取物，在该方法中，处理过程中加入40～75％的乙醇，将会导致大部分的蛋白沉淀，同时在该方法中，酸、醇处理的时间为1～24小时，碱处理的PH值高达PH8～13，这些条件对于天然酶活性的保持均十分不利。在该专利说明书中，还公开了另一种提取蚌类提取物的方法，其采用酸、水在加热条件下处理蚌肉，取上清液获得蚌肉提取物，在该种方法中，酸、水处理加热的温度为48～88℃，处理时间为0.5～4.5小时，在此条件下，同样将导致大部分的蛋白变性。由于该方法采用有机溶剂提取，制备得到蚌肉提取物微溶于水或低浓度乙醇，难溶于乙醚、丙酮等有机溶剂，这使得其在制药领域的应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蚌肉提取物的制备方法，该方法采用将蚌肉组织在常温下酶解自溶的方法，充分保留了蚌肉中含有的各种天然酶的活性，同时通过蚌肉组织中含有的各种酶类的作用，酶解生物大分子，获得小分子的物质，由该方法获得的蚌肉提取物具有较高的抗肿瘤活性和镇痛活性，其在体外和动物体内均表现出较高的抑制肿瘤细胞生长、抗炎及增强腹腔巨噬细胞吞噬作用的活性，同时具有较强的镇痛作用，而且不具有阿片类药物的成瘾性，毒性较低。
本发明的另一目的在于提供含有本发明蚌肉提取物的药物组合物。
本发明的再一目的在于提供蚌肉提取物在制备治疗肿瘤药物和镇痛药物中的应用。
根据本发明的一方面，蚌肉提取物的原料来自于三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和褶纹冠蚌(Cristariaplicata)，将新鲜的蚌肉组织切成小块，加入防腐剂进行防腐处理后，调节PH至2.8～3.9进行酸化处理，将酸化后的材料在恒温下放置一段时间，使蚌肉组织进行酶解自溶，收集自溶后的液体进行离心纯化，即获得本发明的蚌肉提取物。
在本发明的制备方法中，针对本发明特有的酶解自溶步骤需要较长时间，而蚌肉组织极易腐烂变质的特点，使用防腐剂以防止蚌肉组织的酶解自溶的过程中腐烂变质。使用的防腐剂可以选自苯甲酸钠、尼泊金乙酯和氯仿，优选为苯甲酸钠；在酸化处理中，用于调节溶液PH值的酸可以是盐酸、硫酸、乙酸等，优选使用36％盐酸调节PH值；酸化的PH值优选为PH3.0～3.5；蚌肉组织酶解自溶的温度为20～40℃，优选为30～35℃；时间为30～100天，优选为50～90天。
在本发明的制备方法中，纯化的步骤包括，将自溶后的液体以5,000转/分离心30分钟，取上清液，调节PH为6.5～7.5，以10,000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后可获得本发明的蚌肉提取物原料药。
根据本发明的另一方面，依照上述方法制备的蚌肉提取物在270nm附近有最大吸收，经初步成分分析，其中含有氨基酸和蛋白质、糖类和甾体，不含酚类和脂类，琼脂糖凝胶电泳显示其中无核酸存在。本发明方法制备的蚌肉提取物含有天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明蚌肉提取物。以预定剂量的本发明的蚌肉提取物原料药加入药学上可接受的载体或赋形剂或其他可选的成分，制成适于口服的胶囊剂、扁囊剂或片剂，也可以制成针剂。
使用的药学上可接受的载体可以是包括但不限于标准药用载体，例如，磷酸盐缓冲生理盐水液、含有聚山梨醇酯80、水的油/水混悬液和各种类型的湿润剂的磷酸盐缓冲生理盐水，其他载体还包括灭菌溶液、片剂、包衣片和胶囊。
使用的赋形剂包括但不限于淀粉、牛奶、糖、特种粘土、明胶、硬脂酸或盐(包括硬脂酸镁、钙)，滑石粉、植物脂肪或植物油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。
其他可选的成分包括但不限于调味品和色素或其他添加剂，含有上述成分的组合物可以按照常规方法配制。
根据本发明的再一方面，提供依照本发明方法制备的蚌肉提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤包括但不限于各种实体瘤、肉瘤、血液系统肿瘤，例如，肝癌、胃癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、骨肉瘤、结直肠癌等。
根据本发明的再一方面，提供依照本发明方法制备的蚌肉提取物在制备镇痛药物中的应用。
本发明的制备方法充分保留了蚌肉中所含抗癌活性成分和镇痛成分的生物学活性，蚌肉组织防腐后，经酸化并在常温下经长达数月的自溶处理后，保持了蚌肉组织中含有的天然酶的活性，使生物大分子在酶的作用下充分水解，释放出具有高效抗肿瘤和镇痛活性的生物分子，经体外细胞试验证实，蚌肉提取物对肝癌和肺癌细胞具有较强的抑制作用，同时其还具有抗炎及增强腹腔巨噬细胞吞噬作用；动物体内实验结果表明，蚌肉提取物对小鼠肝癌、肺癌、艾氏腹水癌(乳腺癌)的抑瘤率均在50％以上；同时蚌肉提取物具有较强的镇痛作用，没有成瘾性；而且其毒性极低，其在小鼠静注的半数致死量LD50为4.02g/kg，对血液系统无明显影响。
由于在本发明的制备方法中采用了酸水提取，未使用任何有机溶剂，因此制备的蚌肉提取物具有极好的水溶性，适于各种剂型的药物制备。
具体实施例方式
下面，通过对本发明具体实施方式
的描述，详细说明但不限制本发明。
实施例1蚌肉提取物的制备1、预处理捕捞新鲜三角帆蚌或褶纹冠蚌，除去鳃和排泄器官，取蚌肉组织，放入无菌容器内，随机检查蚌肉各项卫生指标，肉眼观察外观不正常、变质者作不合格处理。对初选合格的蚌肉再进行细菌和病毒学指标检验，合格者备用。
2、切块和防腐取检验合格蚌肉组织，用绞肉机切成小块，取切块的蚌肉放入容器内，称重后，加入蚌肉重量0.3％的苯甲酸钠，搅拌均匀。
3、酸化取防腐处理后的蚌肉组织，用36％盐酸溶液调节PH至3.5后，置于封闭容器中静置。
4、自溶将装有酸化后的蚌肉组织的封闭容器放置在恒温室内，保持容器内温度恒定在30～35℃，放置90天，观察容器内的蚌肉组织已全部自溶为液体。
5、纯化取自溶后的液体，过滤，过滤后的液体于5,000转/分钟离心30分钟后，取上清液，以NaOH调节PH为6.5～7.5。
以上获得的上清液经10000道尔顿分子量的聚偏二氟乙烯中空纤维超滤膜过滤，将该滤液过0.22μ的微孔滤膜后，将获得的滤液冻干，即得蚌肉提取物原料药(下称BR01)。
获得的BR01再溶解后，进行透析，进一步获得分子量约为1500道尔顿的分子，蛋白电泳进一步确定其分子量范围，冻干获得小分子量的原料药(下称BR02)。
实施例2蚌肉提取物(下称BR01)的理化性质测定依照上述方法制备的蚌肉提取物为微黄色粉末，溶于水，微溶于乙醇，在270nm附近有最大吸收，经初步成分分析，其中含有氨基酸和蛋白质、糖类和甾体，不含酚类和脂类，琼脂糖凝胶电泳显示其中无核酸存在。
称取冻干的样品14.60mg，以6N HCL进行水解后蒸干，再溶解定容至50ml体积，测定水解氨基酸，采用日立835-50型氨基酸分析仪，进样量50微升，结果如下(重量百分数)氨基酸名称 含量(W％)天门冬氨酸ASP2.76苏氨酸THR1.24丝氨酸SER1.30谷氨酸GLU4.02甘氨酸GLY1.78丙氨酸ALA1.71胱氨酸CYS0.47缬氨酸VAL1.56蛋氨酸MET0.97异亮氨酸ILE 1.65亮氨酸LEU2.50酪氨酸TYR1.02苯丙氯酸PHE 1.35赖氨酸LYS1.96氨NH30.79组氨酸HIS0.42色氨酸TRP---精氨酸ARG2.24脯氨酸PRO1.44总量 29.18将样品溶解后，采用日立835-50型氨基酸分析仪进行游离氨基酸测定，发现蚌肉提取物中含有天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。
实施例3蚌肉提取物(下称BR01)给药量的确定以上述方法制备的蚌肉提取物BR01初步鉴定为多肽化合物，为微黄色粉末，每100mg中多肽含量为≥15mg，按照实验动物与人用药量转换因子计算方法计算，以等效剂量的1、2、4倍量为小鼠低剂量、中剂量和高剂量。
BR01成人拟临床用法用量成人每天用药量为800mg，若成人以70kg体重计算，则成人日最大用药量为11.43mg/kg，参考陈奇主编的《中药药理研究方法学》中的剂量换算法。
换算得到小鼠每日用量等效量为(800/70)×(0.06/0.11)×(70/0.02)1/3＝95mg/kg低剂量95×1＝95mg/kg中剂量95×2＝190mg/kg高剂量95×4＝380mg/kg实施例4蚌肉提取物对癌细胞的抑制作用一、蚌肉提取物BR01对离体培养肝癌细胞生长的抑制作用1材料与方法1.1实验材料人肝癌细胞系7402细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供，细胞培养于RPMI1640培养液(购于华美生物工程公司)，并添加含10％小牛血清及青霉素100μ/ml、链霉素100μ/ml、BR01按照实施例1所述的方法制备，丝裂霉素C(mitomycinC，MMC)、噻唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-211)-2，5-diplengl-tetnazdiumbromide，Thidzoglblue(MTT)]购于华美生物工程公司。酶联免疫检测仪(DG3022--II型)系华东电子管厂产品。
1.2MTT法检测细胞增殖参照文献方法进行。在96孔培养板中接种7402细胞5×103/100μL，同时加入各种梯度浓度的药物，阴性对照组以等体积生理盐水代替药物，空白对照孔只加入培养液。每种药物浓度设置3个平行复孔。细胞置于37℃，5％CO2及饱和湿度的孵箱中培养48h，然后每孔加入不同浓度的MTT20μL，在同样条件下继续孵育4～6h。倾去上清液，每孔加入DMSO150μL，在混合振荡仪上振荡10min，用酶联检测仪测定570nm波长的吸光度值，计算细胞杀伤率。
2实验结果
2.1BR01对7402细胞增殖的影响 用MTT法观察了BR01对7402细胞的增殖的影响。当用不同浓度的BR01处理7402细胞时，可见BR01对7402细胞的增殖有明显的抑制作用。IC50为61.93mg/L(95％可信限45.83～83.70mg/L)，与阴性对照比差异有显著性(P＜0.01)增殖抑制作用有良好的剂量效应关系(Γ＝0.9751)。说明BR01可直接抑制肝癌细胞系7402的增殖。
表1 BR01对7402细胞增殖的抑制作用组别 浓度(mg/L) A570nm值抑制率对照 0 0.317±0.016MMC 5.0 0.282±0.017Δ11.0410.00.159±0.019ΔΔ49.8425.00.127±0.011ΔΔ59.94BR0112.50.299±0.0155.6825.00.231±0.012ΔΔ27.1350.00.183±0.018ΔΔ42.27100 0.113±0.014ΔΔ64.35n＝8，x±s.与对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
二、BR01对人肺癌A549细胞增殖的作用1材料与方法1.1实验材料人肺癌细胞系A549细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供，细胞培养于RPMI1640培养液(购于华美生物工程公司)，并添加含10％小牛血清及青霉素100μ/ml、链霉素100μ/ml、BR01按照实施例1所述的方法制备，丝裂霉素C(mitomycinC，MMC)、噻唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-211)-2，5-diplengl-tetnazdiumbromide，Thidzoglblue(MTT)]购于华美生物工程公司。酶联免疫检测仪(DG3022--II型)系华东电子管厂产品。
1.2MTT法检测细胞增殖参照文献方法进行。在96孔培养板中接种A549细胞5×103/100μL，同时加入各种梯度浓度的药物，阴性对照组以等体积生理盐水代替药物，空白对照孔只加入培养液。每种药物浓度设置3个平行复孔。细胞置于37℃，5％CO2及饱和湿度的孵箱中培养48h，然后每孔加入不同浓度的MTT20μL，在同样条件下继续孵育4～6h。倾去上清液，每孔加入DMSO150μL，在混合振荡仪上振荡10min，用酶联检测仪测定570nm波长的吸光度值，计算细胞杀伤率。
2实验结果2.1BR01对A549细胞增殖的影响用MTT法观察了BR01对A549细胞的增殖的影响。当用不同浓度的BR01处理A549细胞时，可见BR01对A549细胞的增殖有明显的抑制作用。IC50为56.85mg/L(95％可信限40.85～79.11mg/L)，与阴性对照比差异有显著性(P＜0.01)，增殖抑制作用有良好的剂量效应关系(Γ＝0.9685)。说明BR01可直接抑制人肺癌细胞系A549的增殖。
表2 BR01对A549细胞增殖的抑制作用浓度(mg/L) A570nm值 抑制率0 0.794±0.1018 0.752±0.094 5.2816 0.661±0.046Δ16.7532 0.427±0.038ΔΔ46.2264 0.379±0.020ΔΔ52.27128 0.239±0.008ΔΔ68.90n＝8，x±s.与对照组比较，ΔP＜O.05，ΔΔP＜O.O1。
实施例5蚌肉提取物动物体内抑癌实验一、BR01对裸鼠荷人肝癌的抑制作用1.方法复苏的肝癌细胞株7402进行扩大培养。BALB/C裸鼠60只，每只裸鼠右侧颈背皮下接种1.8×106个/ml癌细胞0.4ml，称重后完全随机分为5组，每组12只。(1)对照组生理盐水0.1ml/10g·d。(2)BR01高剂量组200.0mg/kg·d。(3)BR01中剂量组100.0mg/kg·d。(4)BR01低剂量组50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射5-Fu，剂量为10mg/kg。于接种癌细胞后第10天开始给药，连续灌胃21天，每天灌胃一次。每周称体重一次，同时测量最大瘤径和最小瘤径。停药后次日处死动物。裸鼠处死后剥瘤块，称重。
2.结果
2.1对肿瘤生长的影响各组裸鼠于给药前测量一次，给药后每隔一周测量一次瘤的最大径和最小径，按公式(长径+短径)/2求平均瘤径。结果见表3。高中低剂量BR01均可明显抑制肿瘤的生长。
表3 BR01对肿瘤瘤径的影响给药后瘤径/cm组别 给药前瘤径/cm 第1周 第2周 第3周control0.18±0.04 0.89±0.24 1.36±0.45 1.92±0.515-Fu 0.18±0.05 0.85±0.21**0.97±0.37** 0.63±0.24**BR01(低) 0.19±0.06 0.87±0.25**1.247±0.43** 1.89±0.41**BR01(中) 0.17±0.05 0.74±0.31**1.01±0.34** 0.91±0.37**BR01(高) 0.18±0.06 0.69±0.33* 0.91±0.36** 0.77±0.41**x±s，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
2.2对肿瘤的抑制作用裸鼠处死后称取的瘤重，按以下公式求出抑瘤率 表4 BR01对肿瘤的抑制作用组别瘤重/mg抑瘤率(％)对照组 1310.2±424.5 ---5-Fu457.5±129.7** 65.1BR01(低)1034.9±378.4**21.0BR01(中)654.7±252.6** 48.0BR01(高)509.1±213.5** 61.1x±s，n＝8，*P＜0.01，与对照组比较。
BR01对裸鼠荷人肝癌均有明显的抑制作用(P＜0.01)，其中，高剂量BR01组的抑瘤率比其他几组略高。经方差分析，各组之间的治疗效果有显著的剂量依赖性(P＜0.01)。
(二)BR01对H22(肝癌)荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用1.方法复苏的肝癌细胞株H22进行扩大培养。清洁级昆明鼠60只，每只鼠右侧颈背皮下接种1.8×106个/ml癌细胞0.4ml，称重后完全随机分为5组，每组12只。(1)对照组生理盐水0.1ml/10g·d。(2)BR01高剂量组200.0mg/kg·d。(3)BR01中剂量组100.0mg/kg·d。(4)BR01低剂量组50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射5-Fu，剂量为10mg/kg。于接种癌细胞护第10天开始给药，连续灌胃21天，每天灌胃一次。每周称体重一次，停药后次日处死动物。小鼠处死后剥瘤块，称重，记录脾脏重量，并检验血常规白细胞数量。
2.结果2.1对肿瘤生长的影响表5 BR01对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用组别n 剂量平均瘤重肿瘤抑制率(mg/kg) (g) (％)阴性对照15 0 2.13±0.96---5-Fu10 10 0.87±0.64** 59.2BR0110 50 1.68±0.97** 21.110 100 1.35±0.81** 36.610 200 0.92±0.79** 56.8x±s，**P＜0.01，与对照组比较。
2.2对荷瘤小鼠脾脏的影响表6 BR01对H22荷瘤小鼠脾脏质量的影响组别 n剂量 脾重指数(mg/kg) (mg/10g)control 150 63.86±16.195-Fu1010 41.36±8.12ΔΔBR011050 71.42±21.13**1010073.31±19.17**1020074.27±21.29**与阴性对照组比，ΔΔP＜0.01；**与阳性对照相比，P＜0.01.
2.3荷瘤小鼠血液系统的影响表7 BR01对H22荷瘤小鼠白细胞数目的影响组别n 剂量 白细胞数目(mg/kg)(×109L-1)control 15 0 10.2±2.115-Fu10 10 5.1±1.04##BR0110 50 9.87±2.33**10 10010.6±2.47**10 20012.3±2.49**与阳性对照相比，**P＜0.01；与阴性对照相比，##P＜0.001(三)BR01治疗对荷Lewis肺癌小鼠的影响1、方法复苏的肺癌细胞株Lewis肺癌细胞进行扩大培养。BALB/C裸鼠60只，每只裸鼠右侧颈背皮下接种1.8×106个/ml癌细胞0.4ml，称重后完全随机分为5组，每组12只。(1)对照组生理盐水0.1ml/10g·d。(2)BR01高剂量组200.0mg/kg·d。(3)BR01中剂量组100.0mg/kg·d。(4)BR01低剂量组50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射环磷酰胺(Cy)，剂量为0.02mg/kg。于接种癌细胞后第10天开始给药，连续灌胃21天，每天灌胃一次。每周称体重一次。停药后次日处死动物，裸鼠处死后剥瘤块，称重，记录脾脏重量并检查血液常规白细胞数量。
2、结果BR01治疗给药对Lewis肺癌小鼠生存时间的影响BALB/C裸鼠接种Lewis肺癌瘤细胞2天后，按表8分组，ig给药，每日一次，连续15天。观察时间为45天。表8表明，BR01可明显提高荷瘤小鼠生存时间和生命延长率，且与阳性对照药环磷酰胺(Cy)相似。
表8 BR01治疗对荷瘤小鼠生存时间的影响(n＝30)组别 剂量生存时间(mg/kg/d) (d)肿瘤对照 --- 22.9±4.8BR01 50 24.7±4.6100 30.1±6.0**200 35.3±6.5**Cy 0.0234.6±6.9**与肿瘤组比较，**P＜0.01表9 BR01治疗7天对荷瘤小鼠瘤重的影响组别剂量 动物数 瘤重(mg/kg/d) (始/末) (g)肿瘤对照--- 30/301.66±0.48BR015030/301.56±0.52100 30/301.45±0.51200 30/301.14±0.30**Cy 0.02 30/300.79±0.28**与肿瘤组比较，**P＜0.01
表10 BR01治疗15天对荷瘤小鼠瘤重的影响组别剂量 动物数 瘤重(mg/kg/d)(始/末) (g)肿瘤对照--- 30/30 3.70±0.99BR0150 30/30 3 29±0.80100 30/30 2.40±0.54200 30/30 1.82±0.53**Cy 0.02 30/30 0.99±0.31**与肿瘤组比较，**P＜0.01实施例6蚌肉提取物BR01对免疫功能的影响1、BR01可显著增强环磷酰胺造成的免疫低下模型小鼠DTH及PFC的作用以环磷酰胺造成小鼠免疫低下模型，迟发性过敏反应(DTH)采用二硝基氟苯(DNFB)致敏小鼠耳片法；抗体水平测定采用SRBC诱导的空斑形成细胞(PFC)法，结果如表11和表12表11在Cy-抑制的小鼠中BR01对DTH反应的影响组别 剂量(mg/kg) 肿胀(R-L)(mg)对照 --- 9.54±1.53**Cy 50s.c. 5.43±1.12Cy+BR0150 7.30±0.92*Cy+BR01100 8.89±1.60**Cy+BR01200 10.58±1.17**Cy+LNT 510.24±1.50**x±s，＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，与Cy模型组比较，R-L＝右耳重量—左耳重量表12Cy-抑制的小鼠中BR01对空斑形成细胞(PFC)应答SRBC的影响组别 剂量(mg/kg) A(×103)值(413)对照 ---21.0±10.7**Cy 50s.c. 9.8±4.9Cy+BR01 50 28.3±17.7*Cy+BR01 100112.4±12.4**Cy+BR01 200157.4±24.8**Cy+LNT 5 139.1±19.4**x±s，＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，与Cy模型组比较结果表明，BR01可使Cy造成低下的DTH反应增强，对低下的PFC反应亦有所加强，说明BR01对免疫低下模型小鼠有较好的免疫抑制恢复作用，这提示BR01对增强机体细胞免疫能力及机体抗肿瘤能力可能有益。
2、BR01对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响及抗炎作用BR01对小鼠灌胃给药，可显著增强腹腔巨噬细胞(M)吞噬能力；对大鼠和小鼠给药时，对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀具有一定的抗炎作用，结果见表13和表14表13 BR01对小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响组别 剂量(mg/kg.d) 吞噬百分数(x±s％) 吞噬指数对照 0 13.8±3.18 0.18±0.03BR01 50×7 33.40±8.23*0.44±0.03*x±s，＝10，*P＜0.05，与对照组比较表14 BR01在小鼠中对二甲苯引起的耳廓肿胀的影响组别右耳重量左耳重量 R-L对照6.86±1.05 3.11±0.28 3.75±1.08BR014.88±1.16*3.56±0.72*1.32±0.59*x±s，＝10，*P＜0.05，与对照组比较实施例7BR01的镇痛活性研究以实施例1方法制备的蚌肉提取物BR01粉末制备粉针制剂，用普通注射用水溶解后可用于肌肉或皮下注射。
A、对小鼠的镇痛作用用临床推荐有效剂量换算BR01(400mg/次)，阿斯匹林(Asp，500mg/次)的小鼠等效剂量分别为50mg/kg和60mg/kg，给药30min后ip0.6％Hac，观察小鼠在15min内的扭体次数，以吗啡(Morphine)为对照。测试结果见表15。BR01能显著减少小鼠的扭体次数。
表15 BR01对ip 0.6％Hac诱发小鼠扭体的影响(x±s)组别 动物数 剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水15 0 43.8±7.2Asp 15 60 16.7±6.3**BR0115 50 15.1±5.9**Morphine5 5 8.4±1.3**与生盐水比较**P＜0.01B、对大鼠ip4％Nacl所致扭体抑制作用用临床推荐有效剂量换算BR01(400mg/次)，阿斯匹林(Asp，500mg/次)的大鼠等效剂量分别为42mg/kg和35mg/kg，给药30min后ip4％NaCl，观察小鼠在15min内的扭体次数，以吗啡(Morphine)为对照。测试结果见表16。BR01能显著减少大鼠的扭体次数。
表16 BR01对ip 4％NaCl诱发大鼠扭体的影响(x±S)组别 动物数剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水 10 024.5±5.7Asp 10 35 8.9±3.6**BR01 10 42 9.7±4.2**Morphine 10 17.3±3.4**与生盐水比较**P＜0.01由以上结果可见，BR01在小鼠和大鼠中均表现出明显的镇痛活性。
实施例8阿片受体拮抗剂对BR01的镇痛活性影响A.预先30min给小鼠sc5mg/kg盐酸纳络酮，观察BR01和吗啡(Morphine)对小鼠ip 0.6％乙酸的扭体反应，结果见表17表17纳络酮对BR01镇痛的影响(x±s)组别 动物数 剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水15 0 43.8±7.2BR0115 50 14.5±6.1**Morphine15 5 41.1±9.7与生盐水比较**P＜0.01B.预先30min给大鼠sc 2mg/kg盐酸纳络酮，观察BR01和吗啡(Morphine)对大鼠ip 4％NaCl的扭体反应，结果见表18表18纳络酮对BR01镇痛的影响(x±s)组别 动物数 剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水 10 0 25.1±5.5BR01 10 42 10.2±3.7**Morphine 10 1 22.8±4.8与生盐水比较**P＜0.01由以上结果可见，BR01的镇痛作用与阿片受体无关，因此可能不具阿片类药物的成瘾性。
实施例9蚌肉提取物BR01的毒性实验试验动物清洁级昆明种小鼠，体重20-22g，8周龄，粤检证字第2001A034号，雌雄各关。清洁级SD大鼠，8周龄，体重180-220g，粤检证字第2002A305号，雌雄各半。由第一军医大学实验动物研究中心提供。
条件动物进入实验室后，雌雄分开，大笼每放养5只，适应性饲养5天；小鼠每笼10只，适应性1天，观察动物活动、进食、大小便均无异常后启用。实验动物由专人饲养管理。动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温控制在25℃，相对湿度为40-60％。动物室按常规定期消毒。
给药途径 灌胃，与拟推荐的临床用药途径一致。
给药体积 ig，小鼠0.4ml/10g；大鼠，ig，2.0ml/100g。
药物BR01按照实施例1的方法制备实验方法1、小鼠急性毒性试验取昆明小鼠20只，雌雄各半。禁食12h(饮水不限)后，按最大浓度(30mg蛋白/ml)和最大给药体积(0.4ml/10g)灌胃，每日给药3次，间隔时间为6小时。给药后小鼠自由进食饮水。药后24h内严密观察受试动物的情况，以后每天观察3次，连续7天，记录动物的一般生理指标、行为活动、精神状态及动物存活情况。于第8天将小鼠处死，解剖后肉眼观察其心、肝、脾、肾、脑、胃、肠等主要脏器的病理学改变。
2、大鼠急性毒性试验取SD大鼠20只，雌雄各半。禁食12h(饮水不限)后，按最大浓度30mg蛋白/ml)和最大给药体积(2.0ml/100g)给大鼠灌服BR01溶液，一天内给药3次，给药间隔时间为6小时，给药后观察7天，每天记录大鼠的一般生理指标、行为活动、精神状态及动物存活情况。于第8天将大鼠处死，解剖后肉眼观察其心、肝、脾、肾、脑、胃、肠等主要脏器的病理学改变。
结果以最大浓度和最大给药体积小鼠大鼠igBR01溶液，一日3次。经7天观察，无动物死亡。各给药组动物均无生理异常表现，皮毛光滑，饮食正常，大小便正常，眼、鼻无异常分泌物，粘膜无充血。呼吸、心跳正常。处死后解剖肉眼检查，未发现心、肝、脾、肾、脑、胃、肠等主要脏器有病理学改变。
以上实验结果表有小鼠一日3次ig给药BR01的最大耐受量为3.6g蛋白/kg；大鼠灌胃的最大耐受量为1.8g蛋白/kg。分别为临床拟用量(0.8g蛋白/70kg)的315倍、157.5倍。
结论大、小鼠一天3次以最大约药体积和最大浓度给药后，无动物死亡，亦未见任何毒性反应。测得小鼠ig的最大耐受量为3.6g蛋白/kg，相当于成人临床拟用药量的315倍。大鼠一天3次灌胃给药的最在耐受量为1.8g蛋白/kg，相当于成人临床拟用药量的157.5倍。结果表明，BR01对大、小鼠未见明显的急性毒性作用。
由以上结果可见，BR01具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，并且可增强免疫系统的功能，而且毒副作用很低。
BR01具有较强的镇痛活性，而且无成瘾性，此外，值得注意的是，由BR01中进一步分离的分子量在1500道尔顿以下的成分(BR02)在动物试验中表现出较强的镇痛活性，因此提示河蚌及蚌肉提取物中发挥镇痛作用的是小分子多肽。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的权利要求所定义的范围。
权利要求
1.蚌肉提取物的制备方法，包括以下步骤1)取新鲜蚌类，去除鳃和排泄器官，取蚌肉组织；2)将蚌肉组织切块，加入防腐剂进行防腐处理；3)在经防腐处理后的蚌肉组织中加入酸，调节PH值至2.8～3.9进行酸化；4)将酸化后的蚌肉组织置于恒温下一段时间直至蚌肉组织自溶；5)收集自溶后的液体，获得所述蚌肉提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蚌类为三角帆蚌或褶纹冠蚌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)所述防腐剂选自苯甲酸钠、尼泊金乙酯和氯仿。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述防腐剂为苯甲酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)所述酸为36％盐酸，所述酸化的PH值为3.0～3.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)所述自溶的温度为20～40℃，时间为30～100天。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤4)所述自溶的温度为30～35℃，时间为50～90天。
8.根据权利要求1所述的方法，其中进一步包括下述分离纯化步骤6)将蚌肉提取物以5000转/分钟离心30分钟，取上清液；7)调节上清液PH为6.5～7.5，以10000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后可获得蚌肉提取物原料药。
9.一种由权利要求1所述方法制备的蚌肉提取物。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有治疗有效量的蚌肉提取物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中进一步包括药学上可接受的载体和赋形剂。
12.权利要求1方法制备的蚌肉提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
13.权利要求1方法制备的蚌肉提取物在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从蚌肉中制备抗肿瘤和镇痛活性成分方法以及含有蚌肉提取物的药物组合物，本发明还涉及蚌肉提取物在制备抗肿瘤药物和镇痛药物中的应用。将新鲜的蚌肉组织切成小块，加入防腐剂进行防腐处理后，调节pH至2.8～3.9进行酸化处理，将酸化后的材料在恒温下放置一段时间，使蚌肉组织进行酶解自溶，收集自溶后的液体进行离心纯化，即获得本发明的蚌肉提取物。由该方法获得的蚌肉提取物具有较高的抗肿瘤和镇痛活性，其在体外和动物体内均表现出较高的抑制肿瘤细胞生长、抗炎及增强腹腔巨噬细胞吞噬作用的活性，具有较好的镇痛作用，没有成瘾性，而且毒性较低。
文档编号A61P35/00GK1517099SQ0315017
公开日2004年8月4日 申请日期2003年7月21日 优先权日2003年1月8日
发明者李文新, 王在民 申请人:李文新, 王在民
技术领域：
本发明涉及一种从蚌肉中制备抗肿瘤和镇痛活性成分的方法以及含有蚌肉提取物的药物组合物。
本发明还涉及蚌肉提取物在制备抗肿瘤药物和镇痛药物中的应用。
背景技术：
由于癌症严重地危害人类的生命及健康，各国均投入大量的人力物力致力于抗癌药物的研究，目前化学合成的抗癌药物存在较严重的细胞毒性，因此，从天然的动、植物中寻找高效、低毒的抗癌活性成分已成为研究的热点。这些研究始于上世纪50年代以后，1958～1980年美国国家癌症协会(NCI)策划并实施了从35000种植物中筛选安全有效的抗癌药物的计划；日本、韩国、德国等国也进行了大量的研究工作，取得了令人鼓舞的结果。我国的传统医药经过几千年的医疗实践验证，在世界上逐渐被更多的人们所认识和利用，正在发挥自己的优势。近年来在中药抗癌有效成分及其制剂的研究方面也取得了长足的进展，如植物药中的生物碱类、苷类、黄酮类和多糖类等；动物药中鲨鱼软骨提取物、斑蟊素、蚕宝素、白蚁干粉及蟾酥等。这些成分目前被临床证实具有较强的抗肿瘤作用。自20世纪60年代开始海洋药物的研究逐渐成为研究的热点，各国学者于20世纪70、80年代开始开展了大规模的筛选，用现代科学方法分离鉴定了许多结构新颖、作用独特的生物活性物质，90年代随着海洋药物研究的日益深入，多种海洋药物已进入临床试验阶段，如肽类的膜海鞘素、蛤素、海兔毒肽、海扇糖蛋白；脂质类的鲨肝醇、鱼肝油酸钠、海兔醚；及苷类、多糖类等。但这些产物抗癌的临床疗效仍难以令人满意，而且很多天然物质的来源受限，致使成本较高，临床应用较少。
镇痛药是医院临床上最常用的药物之一，目前临床上主要使用的镇痛为吗啡、哌替啶等，这些药物虽然镇痛效果好，但有强的药物耐受和依赖性，能严重损害人的身心健康。寻找安全有效、成瘾性较低的镇痛药物一直是新药研究不懈追求的目标。近年来，随着分子生物学技术在疼痛机制和镇痛药理研究中的应用，各种与疼痛传导相关的受体及其选择性配体的研究取得了一定的进展。人们更加认识到疼痛是一个极其复杂的动态过程，涉及多靶标相互作用的神经传导/神经调节系统，从而为寻找新型镇痛药物奠定了基础。以新的分子靶标为基础寻找设计镇痛药物，有望摆脱传统的麻醉镇痛药和NASID(阿司匹林类)的局限。
此外，近年吸毒已成为一个严重的社会问题，它严重危害人的身心健康和社会稳定，而要戒除毒瘾，其有效方法之一，是应用一种既无成瘾性，而镇痛效果又好的药物。因此人们一直致力于寻找一种无成瘾性的镇痛及戒毒良药。自本世纪70年代首次在动物脑内发现内源性阿片肽以来，引起了人们对镇痛多肽的极大兴趣。近年来的研究发现，小分子多肽绝大部分来源于动物(包括人类)，由于其含量微少，无法进行产业化生产；尤其令人遗憾的是经药理和生理实验研究发现，这些来源于动、植物的镇痛的小分子多肽绝大部分也具有一定的药物依赖性。
蛤(蚌)类的药用在中医临床中具有悠久的历史。《神农本草经》是我国第一部系统的药学专著，该书中记载“文蛤，主恶疮，蚀五痔”，这里的“恶疮”、“五痔”可能包括了一些恶性肿瘤如溃烂于体表的癌瘤及直肠癌等。李时珍在《本草纲目》中对蚌蛤类的药用做了进一步的阐述，共记载蚌蛤类药29种附方118个。“味咸、平微寒、无毒，去肋下坚满、疬、一切疮肿，消疝积块，瘿疾结核；化痰消积，除湿肿水嗽，明目，擦阴疮湿疮痛痒”，以上病症可能包括了一些恶性肿瘤在内。
曾有实验室报道，利用河蚌提取的河蚌多糖(Mpa)具有一定的抗瘤和抗炎作用，但Mpa的作用强度较低，在小鼠发挥抗炎作用需5g/kg以上，使Mpa的来源和临床应用受限。
河蚌为水生软体动物，其肉质柔软，极易腐烂变质，蚌肉一般在出水后数小时就变质发臭。在河蚌的体内含有多种酶类，例如，在河蚌的胃内有一特殊的结构“晶杆体”，它有搅拌食物和分泌糖原酶的作用，在胃的周围还有一对褐色葡萄状的消化腺，这是河蚌的肝脏，有肝管通到胃内，肝脏内含有淀粉酶和糖原酶，也起消化作用(戈贤平等，淡水珍珠养殖新技术，上海科学技术出版社，2002年8月)。这些酶类在河蚌体内起重要作用，同时研究发现，这些酶类也与河蚌体内含有的抗肿瘤和镇痛活性成分的生物学活性密切相关。因此，在制备蚌肉提取物的过程中如何保持河蚌体内各种酶类的高活性从而获得具有较高生物学活性的提取物将十分重要。
中国专利CN1067579C中公开了一种治疗肿瘤的药物，它是利用从淡水河蚌中提取的蚌质素与黄芪、丹参、昆布、香菇制成的一种组合物，其中蚌质素的制备方法是将淡水河蚌的软体组织匀浆后，用苯甲酸溶液进行防腐处理，加入盐酸调PH至4.0，再加入60％乙醇，体积比为1∶0.5搅拌后过滤，滤液以3000转/分离心取沉淀物，恒温50℃干燥后即得蚌(质)素。
中国专利CN1079238C公开一种具有镇痛和抑制肿瘤作用的蚌类提取物的制备方法，其采用酸和醇处理蚌肉后，将上清液再以碱处理，取碱处理后的沉淀得到蚌类提取物，在该方法中，处理过程中加入40～75％的乙醇，将会导致大部分的蛋白沉淀，同时在该方法中，酸、醇处理的时间为1～24小时，碱处理的PH值高达PH8～13，这些条件对于天然酶活性的保持均十分不利。在该专利说明书中，还公开了另一种提取蚌类提取物的方法，其采用酸、水在加热条件下处理蚌肉，取上清液获得蚌肉提取物，在该种方法中，酸、水处理加热的温度为48～88℃，处理时间为0.5～4.5小时，在此条件下，同样将导致大部分的蛋白变性。由于该方法采用有机溶剂提取，制备得到蚌肉提取物微溶于水或低浓度乙醇，难溶于乙醚、丙酮等有机溶剂，这使得其在制药领域的应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蚌肉提取物的制备方法，该方法采用将蚌肉组织在常温下酶解自溶的方法，充分保留了蚌肉中含有的各种天然酶的活性，同时通过蚌肉组织中含有的各种酶类的作用，酶解生物大分子，获得小分子的物质，由该方法获得的蚌肉提取物具有较高的抗肿瘤活性和镇痛活性，其在体外和动物体内均表现出较高的抑制肿瘤细胞生长、抗炎及增强腹腔巨噬细胞吞噬作用的活性，同时具有较强的镇痛作用，而且不具有阿片类药物的成瘾性，毒性较低。
本发明的另一目的在于提供含有本发明蚌肉提取物的药物组合物。
本发明的再一目的在于提供蚌肉提取物在制备治疗肿瘤药物和镇痛药物中的应用。
根据本发明的一方面，蚌肉提取物的原料来自于三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和褶纹冠蚌(Cristariaplicata)，将新鲜的蚌肉组织切成小块，加入防腐剂进行防腐处理后，调节PH至2.8～3.9进行酸化处理，将酸化后的材料在恒温下放置一段时间，使蚌肉组织进行酶解自溶，收集自溶后的液体进行离心纯化，即获得本发明的蚌肉提取物。
在本发明的制备方法中，针对本发明特有的酶解自溶步骤需要较长时间，而蚌肉组织极易腐烂变质的特点，使用防腐剂以防止蚌肉组织的酶解自溶的过程中腐烂变质。使用的防腐剂可以选自苯甲酸钠、尼泊金乙酯和氯仿，优选为苯甲酸钠；在酸化处理中，用于调节溶液PH值的酸可以是盐酸、硫酸、乙酸等，优选使用36％盐酸调节PH值；酸化的PH值优选为PH3.0～3.5；蚌肉组织酶解自溶的温度为20～40℃，优选为30～35℃；时间为30～100天，优选为50～90天。
在本发明的制备方法中，纯化的步骤包括，将自溶后的液体以5,000转/分离心30分钟，取上清液，调节PH为6.5～7.5，以10,000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后可获得本发明的蚌肉提取物原料药。
根据本发明的另一方面，依照上述方法制备的蚌肉提取物在270nm附近有最大吸收，经初步成分分析，其中含有氨基酸和蛋白质、糖类和甾体，不含酚类和脂类，琼脂糖凝胶电泳显示其中无核酸存在。本发明方法制备的蚌肉提取物含有天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明蚌肉提取物。以预定剂量的本发明的蚌肉提取物原料药加入药学上可接受的载体或赋形剂或其他可选的成分，制成适于口服的胶囊剂、扁囊剂或片剂，也可以制成针剂。
使用的药学上可接受的载体可以是包括但不限于标准药用载体，例如，磷酸盐缓冲生理盐水液、含有聚山梨醇酯80、水的油/水混悬液和各种类型的湿润剂的磷酸盐缓冲生理盐水，其他载体还包括灭菌溶液、片剂、包衣片和胶囊。
使用的赋形剂包括但不限于淀粉、牛奶、糖、特种粘土、明胶、硬脂酸或盐(包括硬脂酸镁、钙)，滑石粉、植物脂肪或植物油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。
其他可选的成分包括但不限于调味品和色素或其他添加剂，含有上述成分的组合物可以按照常规方法配制。
根据本发明的再一方面，提供依照本发明方法制备的蚌肉提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤包括但不限于各种实体瘤、肉瘤、血液系统肿瘤，例如，肝癌、胃癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、骨肉瘤、结直肠癌等。
根据本发明的再一方面，提供依照本发明方法制备的蚌肉提取物在制备镇痛药物中的应用。
本发明的制备方法充分保留了蚌肉中所含抗癌活性成分和镇痛成分的生物学活性，蚌肉组织防腐后，经酸化并在常温下经长达数月的自溶处理后，保持了蚌肉组织中含有的天然酶的活性，使生物大分子在酶的作用下充分水解，释放出具有高效抗肿瘤和镇痛活性的生物分子，经体外细胞试验证实，蚌肉提取物对肝癌和肺癌细胞具有较强的抑制作用，同时其还具有抗炎及增强腹腔巨噬细胞吞噬作用；动物体内实验结果表明，蚌肉提取物对小鼠肝癌、肺癌、艾氏腹水癌(乳腺癌)的抑瘤率均在50％以上；同时蚌肉提取物具有较强的镇痛作用，没有成瘾性；而且其毒性极低，其在小鼠静注的半数致死量LD50为4.02g/kg，对血液系统无明显影响。
由于在本发明的制备方法中采用了酸水提取，未使用任何有机溶剂，因此制备的蚌肉提取物具有极好的水溶性，适于各种剂型的药物制备。
具体实施例方式
下面，通过对本发明具体实施方式
的描述，详细说明但不限制本发明。
实施例1蚌肉提取物的制备1、预处理捕捞新鲜三角帆蚌或褶纹冠蚌，除去鳃和排泄器官，取蚌肉组织，放入无菌容器内，随机检查蚌肉各项卫生指标，肉眼观察外观不正常、变质者作不合格处理。对初选合格的蚌肉再进行细菌和病毒学指标检验，合格者备用。
2、切块和防腐取检验合格蚌肉组织，用绞肉机切成小块，取切块的蚌肉放入容器内，称重后，加入蚌肉重量0.3％的苯甲酸钠，搅拌均匀。
3、酸化取防腐处理后的蚌肉组织，用36％盐酸溶液调节PH至3.5后，置于封闭容器中静置。
4、自溶将装有酸化后的蚌肉组织的封闭容器放置在恒温室内，保持容器内温度恒定在30～35℃，放置90天，观察容器内的蚌肉组织已全部自溶为液体。
5、纯化取自溶后的液体，过滤，过滤后的液体于5,000转/分钟离心30分钟后，取上清液，以NaOH调节PH为6.5～7.5。
以上获得的上清液经10000道尔顿分子量的聚偏二氟乙烯中空纤维超滤膜过滤，将该滤液过0.22μ的微孔滤膜后，将获得的滤液冻干，即得蚌肉提取物原料药(下称BR01)。
获得的BR01再溶解后，进行透析，进一步获得分子量约为1500道尔顿的分子，蛋白电泳进一步确定其分子量范围，冻干获得小分子量的原料药(下称BR02)。
实施例2蚌肉提取物(下称BR01)的理化性质测定依照上述方法制备的蚌肉提取物为微黄色粉末，溶于水，微溶于乙醇，在270nm附近有最大吸收，经初步成分分析，其中含有氨基酸和蛋白质、糖类和甾体，不含酚类和脂类，琼脂糖凝胶电泳显示其中无核酸存在。
称取冻干的样品14.60mg，以6N HCL进行水解后蒸干，再溶解定容至50ml体积，测定水解氨基酸，采用日立835-50型氨基酸分析仪，进样量50微升，结果如下(重量百分数)氨基酸名称 含量(W％)天门冬氨酸ASP2.76苏氨酸THR1.24丝氨酸SER1.30谷氨酸GLU4.02甘氨酸GLY1.78丙氨酸ALA1.71胱氨酸CYS0.47缬氨酸VAL1.56蛋氨酸MET0.97异亮氨酸ILE 1.65亮氨酸LEU2.50酪氨酸TYR1.02苯丙氯酸PHE 1.35赖氨酸LYS1.96氨NH30.79组氨酸HIS0.42色氨酸TRP---精氨酸ARG2.24脯氨酸PRO1.44总量 29.18将样品溶解后，采用日立835-50型氨基酸分析仪进行游离氨基酸测定，发现蚌肉提取物中含有天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。
实施例3蚌肉提取物(下称BR01)给药量的确定以上述方法制备的蚌肉提取物BR01初步鉴定为多肽化合物，为微黄色粉末，每100mg中多肽含量为≥15mg，按照实验动物与人用药量转换因子计算方法计算，以等效剂量的1、2、4倍量为小鼠低剂量、中剂量和高剂量。
BR01成人拟临床用法用量成人每天用药量为800mg，若成人以70kg体重计算，则成人日最大用药量为11.43mg/kg，参考陈奇主编的《中药药理研究方法学》中的剂量换算法。
换算得到小鼠每日用量等效量为(800/70)×(0.06/0.11)×(70/0.02)1/3＝95mg/kg低剂量95×1＝95mg/kg中剂量95×2＝190mg/kg高剂量95×4＝380mg/kg实施例4蚌肉提取物对癌细胞的抑制作用一、蚌肉提取物BR01对离体培养肝癌细胞生长的抑制作用1材料与方法1.1实验材料人肝癌细胞系7402细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供，细胞培养于RPMI1640培养液(购于华美生物工程公司)，并添加含10％小牛血清及青霉素100μ/ml、链霉素100μ/ml、BR01按照实施例1所述的方法制备，丝裂霉素C(mitomycinC，MMC)、噻唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-211)-2，5-diplengl-tetnazdiumbromide，Thidzoglblue(MTT)]购于华美生物工程公司。酶联免疫检测仪(DG3022--II型)系华东电子管厂产品。
1.2MTT法检测细胞增殖参照文献方法进行。在96孔培养板中接种7402细胞5×103/100μL，同时加入各种梯度浓度的药物，阴性对照组以等体积生理盐水代替药物，空白对照孔只加入培养液。每种药物浓度设置3个平行复孔。细胞置于37℃，5％CO2及饱和湿度的孵箱中培养48h，然后每孔加入不同浓度的MTT20μL，在同样条件下继续孵育4～6h。倾去上清液，每孔加入DMSO150μL，在混合振荡仪上振荡10min，用酶联检测仪测定570nm波长的吸光度值，计算细胞杀伤率。
2实验结果
2.1BR01对7402细胞增殖的影响 用MTT法观察了BR01对7402细胞的增殖的影响。当用不同浓度的BR01处理7402细胞时，可见BR01对7402细胞的增殖有明显的抑制作用。IC50为61.93mg/L(95％可信限45.83～83.70mg/L)，与阴性对照比差异有显著性(P＜0.01)增殖抑制作用有良好的剂量效应关系(Γ＝0.9751)。说明BR01可直接抑制肝癌细胞系7402的增殖。
表1 BR01对7402细胞增殖的抑制作用组别 浓度(mg/L) A570nm值抑制率对照 0 0.317±0.016MMC 5.0 0.282±0.017Δ11.0410.00.159±0.019ΔΔ49.8425.00.127±0.011ΔΔ59.94BR0112.50.299±0.0155.6825.00.231±0.012ΔΔ27.1350.00.183±0.018ΔΔ42.27100 0.113±0.014ΔΔ64.35n＝8，x±s.与对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
二、BR01对人肺癌A549细胞增殖的作用1材料与方法1.1实验材料人肺癌细胞系A549细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供，细胞培养于RPMI1640培养液(购于华美生物工程公司)，并添加含10％小牛血清及青霉素100μ/ml、链霉素100μ/ml、BR01按照实施例1所述的方法制备，丝裂霉素C(mitomycinC，MMC)、噻唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-211)-2，5-diplengl-tetnazdiumbromide，Thidzoglblue(MTT)]购于华美生物工程公司。酶联免疫检测仪(DG3022--II型)系华东电子管厂产品。
1.2MTT法检测细胞增殖参照文献方法进行。在96孔培养板中接种A549细胞5×103/100μL，同时加入各种梯度浓度的药物，阴性对照组以等体积生理盐水代替药物，空白对照孔只加入培养液。每种药物浓度设置3个平行复孔。细胞置于37℃，5％CO2及饱和湿度的孵箱中培养48h，然后每孔加入不同浓度的MTT20μL，在同样条件下继续孵育4～6h。倾去上清液，每孔加入DMSO150μL，在混合振荡仪上振荡10min，用酶联检测仪测定570nm波长的吸光度值，计算细胞杀伤率。
2实验结果2.1BR01对A549细胞增殖的影响用MTT法观察了BR01对A549细胞的增殖的影响。当用不同浓度的BR01处理A549细胞时，可见BR01对A549细胞的增殖有明显的抑制作用。IC50为56.85mg/L(95％可信限40.85～79.11mg/L)，与阴性对照比差异有显著性(P＜0.01)，增殖抑制作用有良好的剂量效应关系(Γ＝0.9685)。说明BR01可直接抑制人肺癌细胞系A549的增殖。
表2 BR01对A549细胞增殖的抑制作用浓度(mg/L) A570nm值 抑制率0 0.794±0.1018 0.752±0.094 5.2816 0.661±0.046Δ16.7532 0.427±0.038ΔΔ46.2264 0.379±0.020ΔΔ52.27128 0.239±0.008ΔΔ68.90n＝8，x±s.与对照组比较，ΔP＜O.05，ΔΔP＜O.O1。
实施例5蚌肉提取物动物体内抑癌实验一、BR01对裸鼠荷人肝癌的抑制作用1.方法复苏的肝癌细胞株7402进行扩大培养。BALB/C裸鼠60只，每只裸鼠右侧颈背皮下接种1.8×106个/ml癌细胞0.4ml，称重后完全随机分为5组，每组12只。(1)对照组生理盐水0.1ml/10g·d。(2)BR01高剂量组200.0mg/kg·d。(3)BR01中剂量组100.0mg/kg·d。(4)BR01低剂量组50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射5-Fu，剂量为10mg/kg。于接种癌细胞后第10天开始给药，连续灌胃21天，每天灌胃一次。每周称体重一次，同时测量最大瘤径和最小瘤径。停药后次日处死动物。裸鼠处死后剥瘤块，称重。
2.结果
2.1对肿瘤生长的影响各组裸鼠于给药前测量一次，给药后每隔一周测量一次瘤的最大径和最小径，按公式(长径+短径)/2求平均瘤径。结果见表3。高中低剂量BR01均可明显抑制肿瘤的生长。
表3 BR01对肿瘤瘤径的影响给药后瘤径/cm组别 给药前瘤径/cm 第1周 第2周 第3周control0.18±0.04 0.89±0.24 1.36±0.45 1.92±0.515-Fu 0.18±0.05 0.85±0.21**0.97±0.37** 0.63±0.24**BR01(低) 0.19±0.06 0.87±0.25**1.247±0.43** 1.89±0.41**BR01(中) 0.17±0.05 0.74±0.31**1.01±0.34** 0.91±0.37**BR01(高) 0.18±0.06 0.69±0.33* 0.91±0.36** 0.77±0.41**x±s，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
2.2对肿瘤的抑制作用裸鼠处死后称取的瘤重，按以下公式求出抑瘤率 表4 BR01对肿瘤的抑制作用组别瘤重/mg抑瘤率(％)对照组 1310.2±424.5 ---5-Fu457.5±129.7** 65.1BR01(低)1034.9±378.4**21.0BR01(中)654.7±252.6** 48.0BR01(高)509.1±213.5** 61.1x±s，n＝8，*P＜0.01，与对照组比较。
BR01对裸鼠荷人肝癌均有明显的抑制作用(P＜0.01)，其中，高剂量BR01组的抑瘤率比其他几组略高。经方差分析，各组之间的治疗效果有显著的剂量依赖性(P＜0.01)。
(二)BR01对H22(肝癌)荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用1.方法复苏的肝癌细胞株H22进行扩大培养。清洁级昆明鼠60只，每只鼠右侧颈背皮下接种1.8×106个/ml癌细胞0.4ml，称重后完全随机分为5组，每组12只。(1)对照组生理盐水0.1ml/10g·d。(2)BR01高剂量组200.0mg/kg·d。(3)BR01中剂量组100.0mg/kg·d。(4)BR01低剂量组50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射5-Fu，剂量为10mg/kg。于接种癌细胞护第10天开始给药，连续灌胃21天，每天灌胃一次。每周称体重一次，停药后次日处死动物。小鼠处死后剥瘤块，称重，记录脾脏重量，并检验血常规白细胞数量。
2.结果2.1对肿瘤生长的影响表5 BR01对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用组别n 剂量平均瘤重肿瘤抑制率(mg/kg) (g) (％)阴性对照15 0 2.13±0.96---5-Fu10 10 0.87±0.64** 59.2BR0110 50 1.68±0.97** 21.110 100 1.35±0.81** 36.610 200 0.92±0.79** 56.8x±s，**P＜0.01，与对照组比较。
2.2对荷瘤小鼠脾脏的影响表6 BR01对H22荷瘤小鼠脾脏质量的影响组别 n剂量 脾重指数(mg/kg) (mg/10g)control 150 63.86±16.195-Fu1010 41.36±8.12ΔΔBR011050 71.42±21.13**1010073.31±19.17**1020074.27±21.29**与阴性对照组比，ΔΔP＜0.01；**与阳性对照相比，P＜0.01.
2.3荷瘤小鼠血液系统的影响表7 BR01对H22荷瘤小鼠白细胞数目的影响组别n 剂量 白细胞数目(mg/kg)(×109L-1)control 15 0 10.2±2.115-Fu10 10 5.1±1.04##BR0110 50 9.87±2.33**10 10010.6±2.47**10 20012.3±2.49**与阳性对照相比，**P＜0.01；与阴性对照相比，##P＜0.001(三)BR01治疗对荷Lewis肺癌小鼠的影响1、方法复苏的肺癌细胞株Lewis肺癌细胞进行扩大培养。BALB/C裸鼠60只，每只裸鼠右侧颈背皮下接种1.8×106个/ml癌细胞0.4ml，称重后完全随机分为5组，每组12只。(1)对照组生理盐水0.1ml/10g·d。(2)BR01高剂量组200.0mg/kg·d。(3)BR01中剂量组100.0mg/kg·d。(4)BR01低剂量组50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射环磷酰胺(Cy)，剂量为0.02mg/kg。于接种癌细胞后第10天开始给药，连续灌胃21天，每天灌胃一次。每周称体重一次。停药后次日处死动物，裸鼠处死后剥瘤块，称重，记录脾脏重量并检查血液常规白细胞数量。
2、结果BR01治疗给药对Lewis肺癌小鼠生存时间的影响BALB/C裸鼠接种Lewis肺癌瘤细胞2天后，按表8分组，ig给药，每日一次，连续15天。观察时间为45天。表8表明，BR01可明显提高荷瘤小鼠生存时间和生命延长率，且与阳性对照药环磷酰胺(Cy)相似。
表8 BR01治疗对荷瘤小鼠生存时间的影响(n＝30)组别 剂量生存时间(mg/kg/d) (d)肿瘤对照 --- 22.9±4.8BR01 50 24.7±4.6100 30.1±6.0**200 35.3±6.5**Cy 0.0234.6±6.9**与肿瘤组比较，**P＜0.01表9 BR01治疗7天对荷瘤小鼠瘤重的影响组别剂量 动物数 瘤重(mg/kg/d) (始/末) (g)肿瘤对照--- 30/301.66±0.48BR015030/301.56±0.52100 30/301.45±0.51200 30/301.14±0.30**Cy 0.02 30/300.79±0.28**与肿瘤组比较，**P＜0.01
表10 BR01治疗15天对荷瘤小鼠瘤重的影响组别剂量 动物数 瘤重(mg/kg/d)(始/末) (g)肿瘤对照--- 30/30 3.70±0.99BR0150 30/30 3 29±0.80100 30/30 2.40±0.54200 30/30 1.82±0.53**Cy 0.02 30/30 0.99±0.31**与肿瘤组比较，**P＜0.01实施例6蚌肉提取物BR01对免疫功能的影响1、BR01可显著增强环磷酰胺造成的免疫低下模型小鼠DTH及PFC的作用以环磷酰胺造成小鼠免疫低下模型，迟发性过敏反应(DTH)采用二硝基氟苯(DNFB)致敏小鼠耳片法；抗体水平测定采用SRBC诱导的空斑形成细胞(PFC)法，结果如表11和表12表11在Cy-抑制的小鼠中BR01对DTH反应的影响组别 剂量(mg/kg) 肿胀(R-L)(mg)对照 --- 9.54±1.53**Cy 50s.c. 5.43±1.12Cy+BR0150 7.30±0.92*Cy+BR01100 8.89±1.60**Cy+BR01200 10.58±1.17**Cy+LNT 510.24±1.50**x±s，＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，与Cy模型组比较，R-L＝右耳重量—左耳重量表12Cy-抑制的小鼠中BR01对空斑形成细胞(PFC)应答SRBC的影响组别 剂量(mg/kg) A(×103)值(413)对照 ---21.0±10.7**Cy 50s.c. 9.8±4.9Cy+BR01 50 28.3±17.7*Cy+BR01 100112.4±12.4**Cy+BR01 200157.4±24.8**Cy+LNT 5 139.1±19.4**x±s，＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，与Cy模型组比较结果表明，BR01可使Cy造成低下的DTH反应增强，对低下的PFC反应亦有所加强，说明BR01对免疫低下模型小鼠有较好的免疫抑制恢复作用，这提示BR01对增强机体细胞免疫能力及机体抗肿瘤能力可能有益。
2、BR01对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响及抗炎作用BR01对小鼠灌胃给药，可显著增强腹腔巨噬细胞(M)吞噬能力；对大鼠和小鼠给药时，对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀具有一定的抗炎作用，结果见表13和表14表13 BR01对小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响组别 剂量(mg/kg.d) 吞噬百分数(x±s％) 吞噬指数对照 0 13.8±3.18 0.18±0.03BR01 50×7 33.40±8.23*0.44±0.03*x±s，＝10，*P＜0.05，与对照组比较表14 BR01在小鼠中对二甲苯引起的耳廓肿胀的影响组别右耳重量左耳重量 R-L对照6.86±1.05 3.11±0.28 3.75±1.08BR014.88±1.16*3.56±0.72*1.32±0.59*x±s，＝10，*P＜0.05，与对照组比较实施例7BR01的镇痛活性研究以实施例1方法制备的蚌肉提取物BR01粉末制备粉针制剂，用普通注射用水溶解后可用于肌肉或皮下注射。
A、对小鼠的镇痛作用用临床推荐有效剂量换算BR01(400mg/次)，阿斯匹林(Asp，500mg/次)的小鼠等效剂量分别为50mg/kg和60mg/kg，给药30min后ip0.6％Hac，观察小鼠在15min内的扭体次数，以吗啡(Morphine)为对照。测试结果见表15。BR01能显著减少小鼠的扭体次数。
表15 BR01对ip 0.6％Hac诱发小鼠扭体的影响(x±s)组别 动物数 剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水15 0 43.8±7.2Asp 15 60 16.7±6.3**BR0115 50 15.1±5.9**Morphine5 5 8.4±1.3**与生盐水比较**P＜0.01B、对大鼠ip4％Nacl所致扭体抑制作用用临床推荐有效剂量换算BR01(400mg/次)，阿斯匹林(Asp，500mg/次)的大鼠等效剂量分别为42mg/kg和35mg/kg，给药30min后ip4％NaCl，观察小鼠在15min内的扭体次数，以吗啡(Morphine)为对照。测试结果见表16。BR01能显著减少大鼠的扭体次数。
表16 BR01对ip 4％NaCl诱发大鼠扭体的影响(x±S)组别 动物数剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水 10 024.5±5.7Asp 10 35 8.9±3.6**BR01 10 42 9.7±4.2**Morphine 10 17.3±3.4**与生盐水比较**P＜0.01由以上结果可见，BR01在小鼠和大鼠中均表现出明显的镇痛活性。
实施例8阿片受体拮抗剂对BR01的镇痛活性影响A.预先30min给小鼠sc5mg/kg盐酸纳络酮，观察BR01和吗啡(Morphine)对小鼠ip 0.6％乙酸的扭体反应，结果见表17表17纳络酮对BR01镇痛的影响(x±s)组别 动物数 剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水15 0 43.8±7.2BR0115 50 14.5±6.1**Morphine15 5 41.1±9.7与生盐水比较**P＜0.01B.预先30min给大鼠sc 2mg/kg盐酸纳络酮，观察BR01和吗啡(Morphine)对大鼠ip 4％NaCl的扭体反应，结果见表18表18纳络酮对BR01镇痛的影响(x±s)组别 动物数 剂量(mg/kg) 扭体次数生理盐水 10 0 25.1±5.5BR01 10 42 10.2±3.7**Morphine 10 1 22.8±4.8与生盐水比较**P＜0.01由以上结果可见，BR01的镇痛作用与阿片受体无关，因此可能不具阿片类药物的成瘾性。
实施例9蚌肉提取物BR01的毒性实验试验动物清洁级昆明种小鼠，体重20-22g，8周龄，粤检证字第2001A034号，雌雄各关。清洁级SD大鼠，8周龄，体重180-220g，粤检证字第2002A305号，雌雄各半。由第一军医大学实验动物研究中心提供。
条件动物进入实验室后，雌雄分开，大笼每放养5只，适应性饲养5天；小鼠每笼10只，适应性1天，观察动物活动、进食、大小便均无异常后启用。实验动物由专人饲养管理。动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温控制在25℃，相对湿度为40-60％。动物室按常规定期消毒。
给药途径 灌胃，与拟推荐的临床用药途径一致。
给药体积 ig，小鼠0.4ml/10g；大鼠，ig，2.0ml/100g。
药物BR01按照实施例1的方法制备实验方法1、小鼠急性毒性试验取昆明小鼠20只，雌雄各半。禁食12h(饮水不限)后，按最大浓度(30mg蛋白/ml)和最大给药体积(0.4ml/10g)灌胃，每日给药3次，间隔时间为6小时。给药后小鼠自由进食饮水。药后24h内严密观察受试动物的情况，以后每天观察3次，连续7天，记录动物的一般生理指标、行为活动、精神状态及动物存活情况。于第8天将小鼠处死，解剖后肉眼观察其心、肝、脾、肾、脑、胃、肠等主要脏器的病理学改变。
2、大鼠急性毒性试验取SD大鼠20只，雌雄各半。禁食12h(饮水不限)后，按最大浓度30mg蛋白/ml)和最大给药体积(2.0ml/100g)给大鼠灌服BR01溶液，一天内给药3次，给药间隔时间为6小时，给药后观察7天，每天记录大鼠的一般生理指标、行为活动、精神状态及动物存活情况。于第8天将大鼠处死，解剖后肉眼观察其心、肝、脾、肾、脑、胃、肠等主要脏器的病理学改变。
结果以最大浓度和最大给药体积小鼠大鼠igBR01溶液，一日3次。经7天观察，无动物死亡。各给药组动物均无生理异常表现，皮毛光滑，饮食正常，大小便正常，眼、鼻无异常分泌物，粘膜无充血。呼吸、心跳正常。处死后解剖肉眼检查，未发现心、肝、脾、肾、脑、胃、肠等主要脏器有病理学改变。
以上实验结果表有小鼠一日3次ig给药BR01的最大耐受量为3.6g蛋白/kg；大鼠灌胃的最大耐受量为1.8g蛋白/kg。分别为临床拟用量(0.8g蛋白/70kg)的315倍、157.5倍。
结论大、小鼠一天3次以最大约药体积和最大浓度给药后，无动物死亡，亦未见任何毒性反应。测得小鼠ig的最大耐受量为3.6g蛋白/kg，相当于成人临床拟用药量的315倍。大鼠一天3次灌胃给药的最在耐受量为1.8g蛋白/kg，相当于成人临床拟用药量的157.5倍。结果表明，BR01对大、小鼠未见明显的急性毒性作用。
由以上结果可见，BR01具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，并且可增强免疫系统的功能，而且毒副作用很低。
BR01具有较强的镇痛活性，而且无成瘾性，此外，值得注意的是，由BR01中进一步分离的分子量在1500道尔顿以下的成分(BR02)在动物试验中表现出较强的镇痛活性，因此提示河蚌及蚌肉提取物中发挥镇痛作用的是小分子多肽。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的权利要求所定义的范围。
权利要求
1.蚌肉提取物的制备方法，包括以下步骤1)取新鲜蚌类，去除鳃和排泄器官，取蚌肉组织；2)将蚌肉组织切块，加入防腐剂进行防腐处理；3)在经防腐处理后的蚌肉组织中加入酸，调节PH值至2.8～3.9进行酸化；4)将酸化后的蚌肉组织置于恒温下一段时间直至蚌肉组织自溶；5)收集自溶后的液体，获得所述蚌肉提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蚌类为三角帆蚌或褶纹冠蚌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)所述防腐剂选自苯甲酸钠、尼泊金乙酯和氯仿。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述防腐剂为苯甲酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)所述酸为36％盐酸，所述酸化的PH值为3.0～3.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)所述自溶的温度为20～40℃，时间为30～100天。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤4)所述自溶的温度为30～35℃，时间为50～90天。
8.根据权利要求1所述的方法，其中进一步包括下述分离纯化步骤6)将蚌肉提取物以5000转/分钟离心30分钟，取上清液；7)调节上清液PH为6.5～7.5，以10000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后可获得蚌肉提取物原料药。
9.一种由权利要求1所述方法制备的蚌肉提取物。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有治疗有效量的蚌肉提取物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中进一步包括药学上可接受的载体和赋形剂。
12.权利要求1方法制备的蚌肉提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
13.权利要求1方法制备的蚌肉提取物在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从蚌肉中制备抗肿瘤和镇痛活性成分方法以及含有蚌肉提取物的药物组合物，本发明还涉及蚌肉提取物在制备抗肿瘤药物和镇痛药物中的应用。将新鲜的蚌肉组织切成小块，加入防腐剂进行防腐处理后，调节pH至2.8～3.9进行酸化处理，将酸化后的材料在恒温下放置一段时间，使蚌肉组织进行酶解自溶，收集自溶后的液体进行离心纯化，即获得本发明的蚌肉提取物。由该方法获得的蚌肉提取物具有较高的抗肿瘤和镇痛活性，其在体外和动物体内均表现出较高的抑制肿瘤细胞生长、抗炎及增强腹腔巨噬细胞吞噬作用的活性，具有较好的镇痛作用，没有成瘾性，而且毒性较低。
文档编号A61P35/00GK1517099SQ0315017
公开日2004年8月4日 申请日期2003年7月21日 优先权日2003年1月8日
发明者李文新, 王在民 申请人:李文新, 王在民
最新回复(0)