蜂王浆中功能因子的分离方法
专利名称：蜂王浆中功能因子的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种蜂王浆中功能因子的分离方法。
背景技术：
蜂王浆是由蜂群中的青年哺育蜂分泌的、用于饲喂蜂王和蜜蜂小幼虫的浆状物。蜂王浆的化学成分非常复杂，早在十九世纪末，A.Von.Planta等人就开始了对蜂王浆化学成分的研究。直到二十世纪七十年代，随着现代分析化学技术的发展和进步，人们才对蜂王浆的化学成分有了比较全面的认识。新鲜蜂王浆一般含水分64.5％～68.5％，干物质35.5％～31.5％。干物质中，蛋白质12％～14％，碳水化合物8.5％～16％，脂类6％，灰分0.4％～2％，未确定物质2.84％～3％。
大量研究表明，蜂王浆能提高机体的非特异性免疫和特异性免疫功能、延缓衰老、促进生长、保肝护肝、降血脂、调节血压、调节血糖、抗肿瘤等医疗保健功能，从王浆中分离出不同的功能因子，使分离出的成分在某一功能方面具有优于王浆的特性，减少其他不明物质对人体的影响，提高其医疗保健功效，功能因子分离技术对于蜂王浆的精深加工和提高其附加值具有重要的现实意义和应用前景。
目前，蜂王浆中功能因子的分离方法主要有以下几种1)化学沉淀法利用强酸、强碱或其他化学变性剂导致蜂王浆中的不同组分发生沉淀，再通过过滤把不同组分分开。这种方法因为使用了强酸强碱或化学变性剂导致功能因子的变性，使其生物活性丧失而无法恢复，虽然把王浆的组分分离开，但其生产应用价值较低。
2)利用电泳方法利用不同的电泳缓冲液和电压，在电场作用下把蜂王浆的功能因子分离开，从电泳缓冲液或凝胶中把功能因子回收。该方法操作复杂、效率低，只适于试验研究，难于形成产业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种蜂王浆中功能因子的分离方法，利用膜技术对蜂王浆中的功能因子进行分离。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是1)将新鲜蜂王浆在-20℃冰箱中冷冻6～12个月，取出解冻，在王浆中加入纯净水，搅拌均匀；2)用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸为B组分；3)滤液进入膜分离装置，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分，浓缩液的浓度为15％～25％；4)滤液进入孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分，浓缩液的浓度为15％～25％；5)滤液进入孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分，浓缩液的浓度为15％～25％；6)滤液进入反渗透分离装置，水分滤出回收，收集浓缩液为F组分，浓缩液的浓度为15％～25％。
所采用的膜分离装置包括有机膜、陶瓷膜装置，膜组件形式包括中空纤维式、板框式和圆管式。
所采用的有机膜是醋酸纤维素或聚砜类、聚酯类高聚物膜材料。
本发明与现有技术相比，具有的有益的效果是1、以水作为膜分离的稀释溶剂，在整个分离过程中温度较低，其他操作条件温和，使蜂王浆中的活性功能因子得到很好保护，避免化学沉淀法对蜂王浆中的活性物质造成不良影响；2、通过膜分离，获得的功能因子与纯王浆相比具有更显著的、特定的医疗保健功能，同时可以剔除纯王浆中的某些成分对特定人群的不良影响，如过敏、激素等；3、在整个分离和干燥过程中，仅使用水作为流动相，且经反渗透后的水可回收利用，不使用和产生对环境不友好的物质，生态环保；4、操作方便，效率高，节约能源，适用于工业化生产。
具体实施例方式
下面是
具体实施例方式实施例1从蜂王浆中分离出促生长功能因子。选择优质新鲜商品蜂王浆10kg，生产出来后马上放到-20℃冰箱中冷冻6个月，取出解冻，往王浆中加入40kg纯净水，搅拌均匀，用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)，定为B组分；把滤液放入膜分离装置的料斗内，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分；把滤液加入到孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分；把滤液加入到孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分；把滤液加入到反渗透分离装置的料斗内，大部分的水分滤出回收，收集浓缩液为F组分。
把未经分离的同一批鲜王浆定为A组分，把A、B、C、D、E、F六个组分分别进行冷冻干燥，获得A、B、C、D、E、F六组成分。通过小白鼠喂养试验，确定王浆中的促生长功能因子，共设计7组小白鼠，购自浙江中医学院动物试验中心，体重18-22g的雄性小白鼠，各组随机分配，分别为a、b、c、d、e、f和m组，每组12只，分别用A、B、C、D、E、F组分饲喂a、b、c、d、e、f组小白鼠，以每kg体重每天0.25克的剂量进行灌胃饲养试验，m组为对照组，从2003年4月11日开始到5月11日结束，试验期1个月，具体试验数据及结果见下表表1 小白鼠促生长试验结果(单位g)
对表1的数据进行生物统计分析，见表2，结果表明试验小白鼠经过1个月的喂药处理，各试验组对小白鼠的促生长作用存在显著差异。
表2对表1的试验结果进行单因素方差分析组 计数 求和 平均 方差a 12299.424.95 3.253636b 12289.424.11667 5.876061c 12318.126.50833 3.259015d 12313.226.1 4.358182e 12320.526.70833 1.197197f 12336.128.00833 0.980833m 12306.225.51667 6.072424差异源SSdfMS F P-value F crit组间 139.2 6 17.45.0179273.05E-052.033296组内 343.289275 3.467567总计 482.4892 81进一步采用生物统计方法中的双样本t-检验，对a、b、c、d、e、f六组的的试验结果与m进行生统双样本t-检验，发现在六个组分中，只有f组的试验结果与m对照组的结果相差极显著，而a、b、c、d、e与m组的试验结果差异不显著，可见，F组分具有显著的促生长作用，可以利用F组分开发促生长的功能食品或药品。
实施例2从蜂王浆中分离出保护化学性肝损伤功能因子。选择优质新鲜商品蜂王浆10kg，生产出来后马上加到-20℃冰箱中冷冻6个月，取出解冻，往王浆中加入40kg纯净水，搅拌均匀，用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)，定为B组分；把滤液放入膜分离装置的料斗内，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分；把滤液加入到孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分；把滤液加入到孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分；把滤液加入到反渗透分离装置的料斗内，大部分的水分滤出回收，收集浓缩液为F组分。
把未经分离的同一批鲜王浆定为A组分，把A、B、C、D、E、F六个组分分别进行冷冻干燥，获得A、B、C、D、E、F六组成分。通过小白鼠喂养试验，建立酒精肝损伤模型，确定王浆中的保肝功能因子，共设计7组小白鼠，购自浙江中医学院动物试验中心，体重18-22g的雄性小白鼠，各组随机分配，分别为a、b、c、d、e、f、m(酒精模型对照)组，每组12只，分别用A、B、C、D、E、F组分饲喂a、b、c、d、e、f组小白鼠，小白鼠以每kg体重每天0.25克的剂量进行灌胃饲养试验，从2003年4月11日开始到5月11日结束，试验期1个月，用无水乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％(以蒸馏水稀释)，灌胃量12mL/kgBW(折合乙醇的剂量为4800mg/kgBW)。取各组小白鼠的肝脏0.5g加生理盐水5mL充分研磨成细浆(10％肝匀浆)，混匀后取浆液0.5mL加4％磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3000rpm离心10分钟，取上清液即为样品。测定各小白鼠肝脏组织的谷胱甘肽(GSH)含量，采用南京建成生物工程研究所提供的GSH测定试剂盒，测定方法参照试剂盒说明书。具体试验数据及结果见下表表3各试验组肝组织GSH含量测定结果(mg/gprot.)
对表3数据进行方差分析，结果见表4，可见不同处理对保护化学性肝损伤的作用差异显著。
表4对表3数据进行方差分析组计数 求和平均 方差a 12 3176.802264.73352159.519b 12 3132.297261.0247 3478.12c 12 2975.876247.9897490.4392d 12 4125.785343.81542552.614e 12 2678.337223.19481821.942f 12 2627.475218.9563485.1212m 12 2792.697232.72471449.962差异源 SS df MS F P-value F crit组间 130408.4 6 21734.73 12.23241.29E-092.218819组内 136814.9 771776.817总计 267223.2 83进一步采用生物统计方法中的双样本t-检验，对a、b、c、d、e、f六组的的试验结果与m进行生统双样本t-检验，发现在六个组分中，只有d组的试验结果与m对照组的结果相差极显著，a与m组相比差异显著，而b、c、e、f与m组的试验结果差异不显著，可见，D组分具有极显著的保护化学性肝损伤作用，可以利用F组分开发保肝护肝的功能食品或药品。
权利要求
1.蜂王浆中功能因子的分离方法，其特征在于1)将新鲜蜂王浆在-200℃冰箱中冷冻6～12个月，取出解冻，在王浆中加入纯净水，搅拌均匀；2)用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸组分B；3)滤液进入膜分离装置，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分，浓缩液的浓度为15％～25％；4)滤液进入孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分，浓缩液的浓度为15％～25％；5)滤液进入孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分，浓缩液的浓度为15％～25％；6)滤液进入反渗透分离装置.水分滤出回收，收集浓缩液为F组分，浓缩液的浓度为15％～25％。
2.根据权利要求1所述的蜂王浆中功能因子的分离方法，其特征在于所采用的膜分离装置包括有机膜、陶瓷膜装置，膜组件形式是中空纤维式、板框式和圆管式。
3.根据权利要求1或2所述的蜂王浆中功能因子的分离方法，其特征在于所采用的有机膜是醋酸纤维素或聚砜类、聚酯类高聚物膜材料。
全文摘要
本发明公开了蜂王浆中功能因子的分离方法。将新鲜蜂王浆冷冻后解冻，加纯净水搅拌均匀；用100目滤网过滤，分离出抗肿瘤因子10－羟基－2－癸烯酸为B组分；用100KDa的膜分离，收集浓度为15％～25％为C组分；用20KDa的膜分离，收集浓度为15％～25％为D组分；用0.6KDa的膜分离，收集浓度为15％～25％为E组分；用反渗透分离，收集浓度15％～25％为F组分。在分离过程中温度较低，操作条件温和，使蜂王浆中的活性功能因子得到很好保护，避免化学沉淀法对蜂王浆中的活性物质造成不良影响；通过膜分离，剔除纯王浆中的某些成分对特定人群的不良影响；仅使用水作为流动相，水可回收利用；操作方便，效率高，节约能源，适用于工业化生产。
文档编号A61K35/56GK1488281SQ0315040
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月15日 优先权日2003年8月15日
发明者苏松坤, 陈盛禄, 李言清 申请人:浙江大学
技术领域：
本发明涉及一种蜂王浆中功能因子的分离方法。
背景技术：
蜂王浆是由蜂群中的青年哺育蜂分泌的、用于饲喂蜂王和蜜蜂小幼虫的浆状物。蜂王浆的化学成分非常复杂，早在十九世纪末，A.Von.Planta等人就开始了对蜂王浆化学成分的研究。直到二十世纪七十年代，随着现代分析化学技术的发展和进步，人们才对蜂王浆的化学成分有了比较全面的认识。新鲜蜂王浆一般含水分64.5％～68.5％，干物质35.5％～31.5％。干物质中，蛋白质12％～14％，碳水化合物8.5％～16％，脂类6％，灰分0.4％～2％，未确定物质2.84％～3％。
大量研究表明，蜂王浆能提高机体的非特异性免疫和特异性免疫功能、延缓衰老、促进生长、保肝护肝、降血脂、调节血压、调节血糖、抗肿瘤等医疗保健功能，从王浆中分离出不同的功能因子，使分离出的成分在某一功能方面具有优于王浆的特性，减少其他不明物质对人体的影响，提高其医疗保健功效，功能因子分离技术对于蜂王浆的精深加工和提高其附加值具有重要的现实意义和应用前景。
目前，蜂王浆中功能因子的分离方法主要有以下几种1)化学沉淀法利用强酸、强碱或其他化学变性剂导致蜂王浆中的不同组分发生沉淀，再通过过滤把不同组分分开。这种方法因为使用了强酸强碱或化学变性剂导致功能因子的变性，使其生物活性丧失而无法恢复，虽然把王浆的组分分离开，但其生产应用价值较低。
2)利用电泳方法利用不同的电泳缓冲液和电压，在电场作用下把蜂王浆的功能因子分离开，从电泳缓冲液或凝胶中把功能因子回收。该方法操作复杂、效率低，只适于试验研究，难于形成产业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种蜂王浆中功能因子的分离方法，利用膜技术对蜂王浆中的功能因子进行分离。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是1)将新鲜蜂王浆在-20℃冰箱中冷冻6～12个月，取出解冻，在王浆中加入纯净水，搅拌均匀；2)用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸为B组分；3)滤液进入膜分离装置，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分，浓缩液的浓度为15％～25％；4)滤液进入孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分，浓缩液的浓度为15％～25％；5)滤液进入孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分，浓缩液的浓度为15％～25％；6)滤液进入反渗透分离装置，水分滤出回收，收集浓缩液为F组分，浓缩液的浓度为15％～25％。
所采用的膜分离装置包括有机膜、陶瓷膜装置，膜组件形式包括中空纤维式、板框式和圆管式。
所采用的有机膜是醋酸纤维素或聚砜类、聚酯类高聚物膜材料。
本发明与现有技术相比，具有的有益的效果是1、以水作为膜分离的稀释溶剂，在整个分离过程中温度较低，其他操作条件温和，使蜂王浆中的活性功能因子得到很好保护，避免化学沉淀法对蜂王浆中的活性物质造成不良影响；2、通过膜分离，获得的功能因子与纯王浆相比具有更显著的、特定的医疗保健功能，同时可以剔除纯王浆中的某些成分对特定人群的不良影响，如过敏、激素等；3、在整个分离和干燥过程中，仅使用水作为流动相，且经反渗透后的水可回收利用，不使用和产生对环境不友好的物质，生态环保；4、操作方便，效率高，节约能源，适用于工业化生产。
具体实施例方式
下面是
具体实施例方式实施例1从蜂王浆中分离出促生长功能因子。选择优质新鲜商品蜂王浆10kg，生产出来后马上放到-20℃冰箱中冷冻6个月，取出解冻，往王浆中加入40kg纯净水，搅拌均匀，用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)，定为B组分；把滤液放入膜分离装置的料斗内，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分；把滤液加入到孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分；把滤液加入到孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分；把滤液加入到反渗透分离装置的料斗内，大部分的水分滤出回收，收集浓缩液为F组分。
把未经分离的同一批鲜王浆定为A组分，把A、B、C、D、E、F六个组分分别进行冷冻干燥，获得A、B、C、D、E、F六组成分。通过小白鼠喂养试验，确定王浆中的促生长功能因子，共设计7组小白鼠，购自浙江中医学院动物试验中心，体重18-22g的雄性小白鼠，各组随机分配，分别为a、b、c、d、e、f和m组，每组12只，分别用A、B、C、D、E、F组分饲喂a、b、c、d、e、f组小白鼠，以每kg体重每天0.25克的剂量进行灌胃饲养试验，m组为对照组，从2003年4月11日开始到5月11日结束，试验期1个月，具体试验数据及结果见下表表1 小白鼠促生长试验结果(单位g)
对表1的数据进行生物统计分析，见表2，结果表明试验小白鼠经过1个月的喂药处理，各试验组对小白鼠的促生长作用存在显著差异。
表2对表1的试验结果进行单因素方差分析组 计数 求和 平均 方差a 12299.424.95 3.253636b 12289.424.11667 5.876061c 12318.126.50833 3.259015d 12313.226.1 4.358182e 12320.526.70833 1.197197f 12336.128.00833 0.980833m 12306.225.51667 6.072424差异源SSdfMS F P-value F crit组间 139.2 6 17.45.0179273.05E-052.033296组内 343.289275 3.467567总计 482.4892 81进一步采用生物统计方法中的双样本t-检验，对a、b、c、d、e、f六组的的试验结果与m进行生统双样本t-检验，发现在六个组分中，只有f组的试验结果与m对照组的结果相差极显著，而a、b、c、d、e与m组的试验结果差异不显著，可见，F组分具有显著的促生长作用，可以利用F组分开发促生长的功能食品或药品。
实施例2从蜂王浆中分离出保护化学性肝损伤功能因子。选择优质新鲜商品蜂王浆10kg，生产出来后马上加到-20℃冰箱中冷冻6个月，取出解冻，往王浆中加入40kg纯净水，搅拌均匀，用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)，定为B组分；把滤液放入膜分离装置的料斗内，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分；把滤液加入到孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分；把滤液加入到孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分；把滤液加入到反渗透分离装置的料斗内，大部分的水分滤出回收，收集浓缩液为F组分。
把未经分离的同一批鲜王浆定为A组分，把A、B、C、D、E、F六个组分分别进行冷冻干燥，获得A、B、C、D、E、F六组成分。通过小白鼠喂养试验，建立酒精肝损伤模型，确定王浆中的保肝功能因子，共设计7组小白鼠，购自浙江中医学院动物试验中心，体重18-22g的雄性小白鼠，各组随机分配，分别为a、b、c、d、e、f、m(酒精模型对照)组，每组12只，分别用A、B、C、D、E、F组分饲喂a、b、c、d、e、f组小白鼠，小白鼠以每kg体重每天0.25克的剂量进行灌胃饲养试验，从2003年4月11日开始到5月11日结束，试验期1个月，用无水乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％(以蒸馏水稀释)，灌胃量12mL/kgBW(折合乙醇的剂量为4800mg/kgBW)。取各组小白鼠的肝脏0.5g加生理盐水5mL充分研磨成细浆(10％肝匀浆)，混匀后取浆液0.5mL加4％磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3000rpm离心10分钟，取上清液即为样品。测定各小白鼠肝脏组织的谷胱甘肽(GSH)含量，采用南京建成生物工程研究所提供的GSH测定试剂盒，测定方法参照试剂盒说明书。具体试验数据及结果见下表表3各试验组肝组织GSH含量测定结果(mg/gprot.)
对表3数据进行方差分析，结果见表4，可见不同处理对保护化学性肝损伤的作用差异显著。
表4对表3数据进行方差分析组计数 求和平均 方差a 12 3176.802264.73352159.519b 12 3132.297261.0247 3478.12c 12 2975.876247.9897490.4392d 12 4125.785343.81542552.614e 12 2678.337223.19481821.942f 12 2627.475218.9563485.1212m 12 2792.697232.72471449.962差异源 SS df MS F P-value F crit组间 130408.4 6 21734.73 12.23241.29E-092.218819组内 136814.9 771776.817总计 267223.2 83进一步采用生物统计方法中的双样本t-检验，对a、b、c、d、e、f六组的的试验结果与m进行生统双样本t-检验，发现在六个组分中，只有d组的试验结果与m对照组的结果相差极显著，a与m组相比差异显著，而b、c、e、f与m组的试验结果差异不显著，可见，D组分具有极显著的保护化学性肝损伤作用，可以利用F组分开发保肝护肝的功能食品或药品。
权利要求
1.蜂王浆中功能因子的分离方法，其特征在于1)将新鲜蜂王浆在-200℃冰箱中冷冻6～12个月，取出解冻，在王浆中加入纯净水，搅拌均匀；2)用100目滤网过滤，分离出王浆中的抗肿瘤因子10-羟基-2-癸烯酸组分B；3)滤液进入膜分离装置，采用孔径为100KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.1MPa左右，收集浓缩液为C组分，浓缩液的浓度为15％～25％；4)滤液进入孔径为20KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.12MPa左右，收集浓缩液为D组分，浓缩液的浓度为15％～25％；5)滤液进入孔径为0.6KDa的膜分离柱进行分离，控制装置的压力为0.15MPa左右，收集浓缩液为E组分，浓缩液的浓度为15％～25％；6)滤液进入反渗透分离装置.水分滤出回收，收集浓缩液为F组分，浓缩液的浓度为15％～25％。
2.根据权利要求1所述的蜂王浆中功能因子的分离方法，其特征在于所采用的膜分离装置包括有机膜、陶瓷膜装置，膜组件形式是中空纤维式、板框式和圆管式。
3.根据权利要求1或2所述的蜂王浆中功能因子的分离方法，其特征在于所采用的有机膜是醋酸纤维素或聚砜类、聚酯类高聚物膜材料。
全文摘要
本发明公开了蜂王浆中功能因子的分离方法。将新鲜蜂王浆冷冻后解冻，加纯净水搅拌均匀；用100目滤网过滤，分离出抗肿瘤因子10－羟基－2－癸烯酸为B组分；用100KDa的膜分离，收集浓度为15％～25％为C组分；用20KDa的膜分离，收集浓度为15％～25％为D组分；用0.6KDa的膜分离，收集浓度为15％～25％为E组分；用反渗透分离，收集浓度15％～25％为F组分。在分离过程中温度较低，操作条件温和，使蜂王浆中的活性功能因子得到很好保护，避免化学沉淀法对蜂王浆中的活性物质造成不良影响；通过膜分离，剔除纯王浆中的某些成分对特定人群的不良影响；仅使用水作为流动相，水可回收利用；操作方便，效率高，节约能源，适用于工业化生产。
文档编号A61K35/56GK1488281SQ0315040
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月15日 优先权日2003年8月15日
发明者苏松坤, 陈盛禄, 李言清 申请人:浙江大学
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