重组chBJS的制作方法
专利名称：重组chBJS的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法及其用途。
背景技术：
1.1982年Schauenstein等首先发现了鸡脾淋巴细胞分泌一种具有类似于哺乳动物白细胞介素-2样活性的细胞因子，1983年Schnetlzler等应用硫酸铵沉淀，碳酸氢铵重悬浮，Sephadex G-100凝胶过滤得到两类具有活性的分离物，其一分子量在9～11.5KDa之间，其二分子量在19.5～21.5Kda之间不等。Vainio等此后用同样方法得到了分子量为13KDa的分子，而且他们用等电聚焦估计鸡IL-2的PI为5.9。1987年Frederickson等应用Phenyl-sepharose、阴离子交换及superose-12过柱等方法，分离出两类具有活性的物质，其一分子量为14KDa，其二分子量约为26～30KDa，后者比前者活性更强，两者均具有低亲水性。1992年Myers等报道了一种从ConA刺激的鸡脾淋巴细胞CM中纯化鸡IL-2的“五步法”，即(1)凝胶过滤初步浓缩ConA刺激的鸡脾淋巴细胞悬液；(2)硫酸铵沉淀；(3)用Sephadex G-100层析；(4)反向高压液相层析(high performance liquidchromatography，HPLC)和(5)Phenyl-sepharose层析。所纯化的IL-2蛋白在还原条件下进行SDS-PAGE电泳，得到的蛋白有两个峰值，分子量约为36～39KDa和17.5～25KDa，将高峰的蛋白烷化还原，再用Sephadex G-100层析，可产生低分子量的峰。
1997年Sundick等用构建cDNA文库的方法首次从鸡脾脏中获得鸡IL-2基因，1998年Choi等把含信号序列长430个核苷酸的鸡IL-2基因克隆入PUC18载体和真核表达载体pcDNA3，分别在大肠杆菌和CHO-K1细胞中进行表达，得到的两种蛋白都具有鸡T淋巴细胞增殖的生物学活性。1999年Stepaniak等对鸡IL-2体外表达进行了比较深入的研究，将去除前导肽的鸡IL-2基因在大肠杆菌Pgex-2t系统中进行了表达，得到的蛋白具有鸡IL-2蛋白的生物学活性，但表达效率较低仅为63μg/L，且多为非可溶性蛋白，不利于蛋白的回收和纯化。为解决此问题，他们采用了pET32a+高效表达系统，将IL-2与硫氧还原蛋白在缺失硫代还原酶的大肠杆菌菌株中进行融合表达，结果发现蛋白表达量提高到4mg/L，而且绝大部分为可溶性蛋白，该学者同时将含前导肽的完整鸡IL-2基因克隆入真核表达载体pCR3.1+中，在肾成纤维细胞系中进行表达，结果发现该系统不但能稳定表达鸡IL-2蛋白，而且上清和经纯化的蛋白都具有完整的生物学活性，这说明鸡IL-2和哺乳动物IL-2相似，其活性并不依赖于前导序列。
2.成熟的鸡IL-2蛋白是由121个氨基酸组成。它和人IL-2具有相类似的生物学活性，如促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性等功能，在机体免疫中发挥重要作用。家禽中一些造成重大经济损失的疾病如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒、新城疫病毒、传染性贫血病病毒、禽骨髓成红细胞增多症病毒、禽流感病病毒以及球虫感染后大多伴有IL-2分泌异常，因此鸡IL-2可能在抗感染免疫中发挥重要作用。并且，研究发现，鸡IL-2在抗沙门氏菌和寄生虫的实验中效果明显。我们利用RT-PCR技术从脾淋巴细胞中扩增了3个不同品系鸡IL-2的cDNA片段，并实现了在原核和真核细胞中的高效表达，表达产物具有明显的生物学活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法及其用途。
重组chBJSTWO蛋白的制备方法的步骤如下1)自中国的仙居鸡、丝羽乌骨鸡和外来品种艾维茵肉鸡的脾淋巴细胞中克隆出chBJSTWO的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETA组建成胞内表达型表达载体pMET A/chBJSTWO；2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；4)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到chBJSTWO粗制品，PMAD11表达的chBJSTWO主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到chBJSTWO粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到chBJSTWO纯品；5)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。
重组chBJSTWO蛋白作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性；作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫系统功能的作用以及促生产作用。
本发明的优点(1)大肠杆菌表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在基因工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，且其稳定性好、生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的chBJSTWO蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到chBJSTWO粗制品，且目的蛋白具有良好的稳定性和生物学活性；(3)选用非分泌型酵母表达载体pMET A，表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，粗蛋白具有比较高的稳定性和生物学活性；(4)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单，得到的蛋白纯度高。(5)重组chBJSTWO作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物效果显著。
具体实施例方式
1 chBJSTWO基因克隆 用刀豆素(ConA)刺激鸡脾细胞，提取总RNA，通过RT-PCR方法分别扩增和克隆了我国仙居鸡、丝羽乌骨鸡和艾维茵肉鸡BJSTWOcDNA，将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector，测定chBJSTWOcDNA序列。
2 重组表达chBJSTWO基因工程大肠杆菌的构建 仙居鸡BJSTWO的PCR扩增产物亚克隆到一新型表达载体pBAD/His B中，构建成chBJSTWO原核表达质粒pBAD/His B/chBJSTWO，它能在大肠杆菌LMG194中表达，使chBJSTWO占菌体总蛋白的7～9％，表达率经100次以上传代不降低。
3 重组表达chBJSTWO基因工程酵母菌的构建将仙居鸡BJSTWO的PCR扩增产物亚克隆到一新型真核表达载体pMETαA和pMETA中，分别构建成chBJSTWO表达质粒pMETαA/chBJSTWO和pMETA/chBJSTWO，用BMDY作为基础培养基，用甲醇作为诱导剂，通过优化溶氧、震荡速度、发酵pH值等工艺参数，可以使chBJSTWO基因在P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16中得到表达，表达量分别占菌体总蛋白的15～20％和10～12％。，表达率经100次以上传代不降低。
4 重组chBJSTWO粗制品的制备及纯化工艺。
所建立的粗制品的制备及纯化工艺流程简单、稳定性好、活性高。本工艺具有以下特点(1)大肠杆菌表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，且其生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的chBJSTWO蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到chBJSTWO粗产品，且目的蛋白的具有良好的生物学活性；(3)选用非分泌型酵母表达载体pMET A，表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，且粗蛋白具有比较高的生物学活性；(4)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单，得到的蛋白纯度高。
5 粗制品或纯品加入磷酸缓冲液等助溶剂，用微空滤膜过滤除菌，可以作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
chBJSTWO的一个重要生物功能就是促进T淋巴细胞的增殖，我们用经有丝分裂原刺激的鸡脾T淋巴细胞作为靶细胞，用MTT法对chBJSTWO的活性进行了检测，证实表达产物具有较高的生物学活性，这种生物学活性与文献报道的一致。
本发明运用重组DNA技术，采用反转录PCR方法得到了一种重组chBJSTWO蛋白。经过下游纯化，中试规模下的产品达到了临床应用的质量要求。
实施例1.寡核苷酸引物的设计与合成根据Sundick等报道的鸡IL-2核苷酸序列设计了5’端和3’端一对引物。5’端引物引入Hind III酶切位点，3’端引物引入EcoRI酶切位点。合成以下两条引物5’端引物5’GCAAGCTTATAACTGGGACACTGCCATG3’3’端引物5’GCGAATTCAAATGTCATCTAGAAGTGACT3’实施例2.脾淋巴细胞的分离饲养至12日龄的三个不同品系的雏鸡点眼接种新城Lasota株疫苗(1个免疫剂量)，32日龄用新城疫Mukteswar株疫苗(1个免疫剂量)通过肌肉途径加强免疫，加强免疫4日后颈动脉放血处死动物。无菌采集脾脏、剪碎置于无Ca2+、Mg2+离子的PBS中(717mmol/L K2HPO4，283mmol/L KH2PO4，PH7.2)中，300×g4□离心10min，上清液移至含有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，500×g 4□离心30min，毛细管伸至单核细胞层中，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用PBS洗两次，再以RPMI1640培养液(不含犊牛血清)洗涤1次，台盼蓝(0.1％)染色活细胞计数后，用RPMI1640生长培养液(含10％的犊牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)将细胞分别配成2×106/ml的细胞悬液。细胞悬液中加入10μg/ml终浓度ConA，分装细胞培养板，5％二氧化碳培养箱40□培养20小时，收集单个核淋巴细胞。
实施例3.RT-PCR扩增目的基因片段采用Promega公司的SV Total RNA Isolation System提取单个核淋巴细胞mRNA，以收集的单个核淋巴细胞mRNA为模板，5’端和3’端合成引物，用ReverseTranscription System kit反转录合成chBJSTWOcDNA第一链；反转录产物在95□1min、56□45s、72□2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例4.测序载体的构建和序列测定用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T easy vector，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选。挑取阳性克隆，分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA自动测序仪测定每个品种鸡chBJSTWO基因核苷酸序列。每个品种鸡chBJSTWO基因核苷酸及推导氨基酸序列见表1、表2和表3。
1 ATAACTGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGA 692M M C K V L I F G C I S V A M L M691 CTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAG 1382 T T A Y G A S L S S E K W K T L Q T L I K D L1381 AAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTGCA 2072 E I L E N I K N K I H L E L Y T P T E T Q E C2071 CCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTG 2762 T Q Q T L Q C Y L G E V V T L K K E T E D D T2761 AAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAA 3452 E I K E E F V T A I Q N I E K N L K S L T G L3451 ATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATG 4142 N H T G S E C K I C E A N N K K K F P D F L H4141 AACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACTAATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTAT 4832 E L T N F V R Y L Q K - 4831 TTATTTAATTATTTAATTACAGATAATTTATATATTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTC 5521 TGGGACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATCATATTTGATCCTTTCTG 6211 TAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAAACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATG 6901 TGTTTACTGAAAGAATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTT 734表1.仙居鸡BJSTWO核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.1)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)1 ATAACTGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGA 692M M C K V L I F G C I S V A M L M691 CTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAG 1382 T T A Y G A S L S S E K W K T L Q T L I K D L1381 AAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTGCA 2072 E I L E N I K N K I H L E L Y T P T E T Q E C2071 CCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTG 2762 T Q Q T L Q C Y L G E V V T L K K E T E D D T276
1. AAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAA 3452 E I K E E F V T A I Q N I E K N L K S L T G L 3451 ATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATG 4142 N H T G S E C K I C E A N N K K K F P D F L H 4141 GACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACTAATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTAT 4832 G L T N F V R Y L Q K -4831 TTATTTAATTATTTAATTACAGATAATTTATATGTTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTC 5521 TGGGACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATCATATTTGATCCTTTCTG 6211 TAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAAACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATG 6901 TGTTTACTGAAAGAATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTT 734表2.丝羽乌骨鸡BJSTWO核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.2)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)1 ATAACTGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGA 692M M C K V L I F G C I S V A M L M691 CTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAG 1382 T T A Y G A S L S S A K R K P L Q T L I K D L1381 AAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTGCA 2072 E I L E N I K N K I H L E L Y T P T E T Q E C2071 CCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTG 2762 T Q Q T L Q C Y L G E V V T L K K E T E D D T2761 AAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAA 3452 E I K E E F V T A I Q N I E K N L K S L T G L3451 ATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATG 4142 N H T G S E C K I C E A N N K K K F P D F L H4141 AACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACTAATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTAT 4832 E L T N F V R Y L Q K - 4831 TTATTTAATTATTTAATTACAGATAATTTATATATTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTC 5521 TGGGACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATCATATTTGATCCTTTCTG 6211 TAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAAACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATG 6901 TGTTTACTGAAAGAATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTT 734表3.爱维茵肉鸡BJSTWO核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.3)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)实施例5.pBAD/His B/chBJSTWO表达载体构建、筛选及鉴定根据仙居鸡BJSTWO序列，在成熟蛋白序列两端合成上下游引物UP1(5’GGAATTCGCATCTCTATCATCAGCAAA3’)，5’端含EcoRI酶切位点；DOWN1(5’TTAAGCTTTTATTTTTGCAGATATCTCA C3’)，5’端含HandIII酶切位点；以pGEM-T-Easy/chBJSTWO为模板在95□1min、56□45s、72□2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、HandIII双酶切后，回收目的片段并克隆于表达质粒pBAD/His B的EcoRI+HandIII酶切窗口中，构建重组表达质粒pBAD/His B/chBJSTWO，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
实施例6.重组chBJSTWO的发酵生产(大肠杆菌)经鉴定的重组质粒转入LMG194宿主菌，挑取单克隆接种到含有氨苄青霉素和葡萄糖的RM培养基中，37□培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于RM培养基中，250rpm震荡培养2小时左右，使OD600≈0.5，按1∶100的比例加入20％浓度的L(+)-阿拉伯糖诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液，采用15％的SDS-PAGE鉴定，产物表达量可达7～9％。
实施例7.pMETαA/chBJSTWO和pMET A/chBJSTWO表达载体构建、筛选及鉴定根据仙居鸡BJSTWO序列在其成熟蛋白序列两端合成上下游引物上游引物同实例5中UP1；下游引物DOWN2(5’TTGGATCCTTATTTTTGCAGATATCTCAC3’)，5’端含BamHI酶切位点。以pGEM-T-Easy/chBJSTWO为模板进行PCR，扩增条件同实例5。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、BamHI双酶切后，回收目的片段并分别克隆于表达质粒pMETαA和pMETA强启动子下游的EcoRI+BamHI酶切窗口中，构建重组表达质粒，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
采用Choi等报道的方法制备PMAD11和PMAD16感受态细胞，分别取100μlPMAD11和100μl PMAD16酵母感受态细胞与2μg经KpnI酶切完全的pMETαA/chBJSTWO和pMET A/chBJSTWO混合，使用Bio-Rad Gene Pluser在375V/cm，25μF、250Ω的条件下进行转化，然后加入1ml室温的YPAD，28～30□孵育1h，1500×g室温离心3min收集菌体，重新悬于100μl 1×YNB，将菌液涂布于MD选择平板上，28～30□培养3～4天，观察转化子的生长情况。随机筛选MD平板上白色菌落，用Genomic DNA mini-prepkit提取酵母基因组DNA进行PCR扩增鉴定。
实施例8.重组chBJSTWO的发酵生产(酵母)分别挑取PCR鉴定为阳性的PMAD11和PMAD16克隆接种于20mL BMDY培养基中，28～30□，250r/min震荡培养16～18h至OD600＝2～10。室温，1500×g离心5min，收集菌体重悬于10mL BMMY培养基中。28～30□，250r/min继续震荡培养4天，每24小时补加5％的甲醇使甲醇终浓度为0.5％，离心分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定chBJSTWO表达水平，凝胶成像系统扫描显示chBJSTWO在PMAD11中的表达量为15～20％，在PMAD16中的表达量为10～12％。
实施例9.重组基因工程大肠杆菌的保存与稳定性工程菌加30％甘油，-70□保存。短期保存菌种可用LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例10.重组基因工程酵母菌的保存与稳定性工程菌加30％甘油，-70□保存。短期保存菌种可用YPAD平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例11.重组chBJSTWO粗蛋白的制备及分离纯化经大肠杆菌菌株LMG194表达的chBJSTWO主要以融合蛋白的形式存在，菌体经超声波破碎后，可以得到chBJSTWO粗制品，进一步用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统可以较快的得到chBJSTWO纯品。
含有pMETαA/chBJSTWO重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD11表达的chBJSTWO主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到chBJSTWO粗制品，含有pMETA/chBJSTWO重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD16表达的chBJSTWO主要存在酵母细胞内，经超声波裂解、离心去沉淀即可得到chBJSTWO粗制品，用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统可以较快的得到chBJSTWO纯品实施例12.重组chBJSTWO的鉴定SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，MTT法测定粗制品及纯品的生物学活性，大肠杆菌和P.methanolica酵母的表达产物不但具有刺激T淋巴细胞生长的活性，且活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液的活性。
实施例13.重组chBJSTWO理化性质及稳定性重组chBJSTWO对热较稳定，56□1小时、37□12小时或70□15分钟处理仍保留活性，4℃可保存1年以上，其活性在pH2～9范围内保持稳定。重组chBJSTWO对蛋白酶敏感，对DNA酶、RNA酶不敏感。
实施例14.重组chBJSTWO作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
用重组chBJSTWO，可以使鸡肠炎沙门氏菌器官侵入率降低51％～60％，以重组chBJSTWO注入鸡胚，同样可以显著降低孵化期鸡胚的沙门氏菌器官侵入率。在寄生虫方面，在以Eimeria tenella或E.acervulina感染鸡的前一天或感染后的第1天，用重组chBJSTWO皮下注射3周龄雏鸡后，可以明显降低(p＜0.05)球虫感染后卵囊的排出量。1日龄雏鸡口服重组chBJSTWO能显著增强NDV疫苗对NDV强毒的攻击，包括延迟疾病的发生、减轻呼吸道症状、降低死亡率等。用重组chBJSTWO和IBDV疫苗免疫鸡与单独使用IBDV疫苗免疫相比，二次免疫应答产生抗体的滴度升高、高水平抗体维持时间长、抗原的用量降低，且对鸡提供更好的免疫保护。
重组chBJSTWO具有促进鸡生长的功能。连续两天注射重组chBJSTWO蛋白的7日龄雏鸡比只注射生理盐水的鸡在12天内体重增加明显，增重范围在4～9％之间。感染Eimeria球虫的雏鸡，4天内体重下降，当注射重组chBJSTWO蛋白后，2～3天后体重增加。连续两天给鸡注射重组chBJSTWO蛋白，1天后人工感染Eimeria球虫，每天记录鸡的体重直到第12天，结果发现chBJSTWO处理的鸡在感染Eimeria球虫后出现体重下降较早(感染后4～5天)，其体重恢复快(感染后6～8天)。
权利要求
1.一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于它的步骤如下1)自中国的仙居鸡、丝羽乌骨鸡和外来品种艾维茵肉鸡的脾淋巴细胞中克隆出chBJSTWO的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETA组建成胞内表达型表达载体pMET A/chBJSTWO；2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；4)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到chBJSTWO粗制品，PMAD11表达的chBJSTWO主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到chBJSTWO粗制品；用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到chBJSTWO纯品；5)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。
2.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于上述所说的chBJSTWOcDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/chBJSTWO经转化大肠杆菌LMG194为chBJSTWO基因工程大肠杆菌，L(+)-阿拉伯糖诱导表达后，产物以融合蛋白的形式存在工程菌内。
3.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于上述所说的chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/chBJSTWO经电击转化酵母菌PMAD11为chBJSTWO基因工程酵母菌，甲醇诱导表达，产物以分泌物形式存在于工程菌培养基中；pMETαA/chBJSTWO转化酵母菌PMAD16，甲醇诱导表达，产物主要存在于工程菌内。
4.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于所说的通过发酵技术扩增大肠杆菌工程菌LMG194，用RM作为基础培养基，是通过破碎大肠杆菌菌体，用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统纯化产品。
5.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD16，用BMDY作为基础培养基，在表达不同时间加入氮源、碳源等营养素，是通过破碎酵母工程菌PMAD16菌体，用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统进行纯化。
6.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11，用BMDY作为基础培养基，在表达不同时间加入氮源、碳源等营养素，酵母工程菌PMAD11分泌物用Ni-NTAArgarose蛋白纯化系统进行纯化。
7.一种重组chBJSTWO蛋白的用途，其特征在于它作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性；作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫系统功能的作用以及促生产作用。
全文摘要
本发明公开了一种重组chBJS
文档编号A61P31/04GK1490409SQ0315052
公开日2004年4月21日 申请日期2003年8月20日 优先权日2003年8月20日
发明者周继勇, 陈吉刚, 王金勇, 吴建祥 申请人:浙江大学
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法及其用途。
背景技术：
1.1982年Schauenstein等首先发现了鸡脾淋巴细胞分泌一种具有类似于哺乳动物白细胞介素-2样活性的细胞因子，1983年Schnetlzler等应用硫酸铵沉淀，碳酸氢铵重悬浮，Sephadex G-100凝胶过滤得到两类具有活性的分离物，其一分子量在9～11.5KDa之间，其二分子量在19.5～21.5Kda之间不等。Vainio等此后用同样方法得到了分子量为13KDa的分子，而且他们用等电聚焦估计鸡IL-2的PI为5.9。1987年Frederickson等应用Phenyl-sepharose、阴离子交换及superose-12过柱等方法，分离出两类具有活性的物质，其一分子量为14KDa，其二分子量约为26～30KDa，后者比前者活性更强，两者均具有低亲水性。1992年Myers等报道了一种从ConA刺激的鸡脾淋巴细胞CM中纯化鸡IL-2的“五步法”，即(1)凝胶过滤初步浓缩ConA刺激的鸡脾淋巴细胞悬液；(2)硫酸铵沉淀；(3)用Sephadex G-100层析；(4)反向高压液相层析(high performance liquidchromatography，HPLC)和(5)Phenyl-sepharose层析。所纯化的IL-2蛋白在还原条件下进行SDS-PAGE电泳，得到的蛋白有两个峰值，分子量约为36～39KDa和17.5～25KDa，将高峰的蛋白烷化还原，再用Sephadex G-100层析，可产生低分子量的峰。
1997年Sundick等用构建cDNA文库的方法首次从鸡脾脏中获得鸡IL-2基因，1998年Choi等把含信号序列长430个核苷酸的鸡IL-2基因克隆入PUC18载体和真核表达载体pcDNA3，分别在大肠杆菌和CHO-K1细胞中进行表达，得到的两种蛋白都具有鸡T淋巴细胞增殖的生物学活性。1999年Stepaniak等对鸡IL-2体外表达进行了比较深入的研究，将去除前导肽的鸡IL-2基因在大肠杆菌Pgex-2t系统中进行了表达，得到的蛋白具有鸡IL-2蛋白的生物学活性，但表达效率较低仅为63μg/L，且多为非可溶性蛋白，不利于蛋白的回收和纯化。为解决此问题，他们采用了pET32a+高效表达系统，将IL-2与硫氧还原蛋白在缺失硫代还原酶的大肠杆菌菌株中进行融合表达，结果发现蛋白表达量提高到4mg/L，而且绝大部分为可溶性蛋白，该学者同时将含前导肽的完整鸡IL-2基因克隆入真核表达载体pCR3.1+中，在肾成纤维细胞系中进行表达，结果发现该系统不但能稳定表达鸡IL-2蛋白，而且上清和经纯化的蛋白都具有完整的生物学活性，这说明鸡IL-2和哺乳动物IL-2相似，其活性并不依赖于前导序列。
2.成熟的鸡IL-2蛋白是由121个氨基酸组成。它和人IL-2具有相类似的生物学活性，如促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性等功能，在机体免疫中发挥重要作用。家禽中一些造成重大经济损失的疾病如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒、新城疫病毒、传染性贫血病病毒、禽骨髓成红细胞增多症病毒、禽流感病病毒以及球虫感染后大多伴有IL-2分泌异常，因此鸡IL-2可能在抗感染免疫中发挥重要作用。并且，研究发现，鸡IL-2在抗沙门氏菌和寄生虫的实验中效果明显。我们利用RT-PCR技术从脾淋巴细胞中扩增了3个不同品系鸡IL-2的cDNA片段，并实现了在原核和真核细胞中的高效表达，表达产物具有明显的生物学活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法及其用途。
重组chBJSTWO蛋白的制备方法的步骤如下1)自中国的仙居鸡、丝羽乌骨鸡和外来品种艾维茵肉鸡的脾淋巴细胞中克隆出chBJSTWO的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETA组建成胞内表达型表达载体pMET A/chBJSTWO；2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；4)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到chBJSTWO粗制品，PMAD11表达的chBJSTWO主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到chBJSTWO粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到chBJSTWO纯品；5)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。
重组chBJSTWO蛋白作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性；作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫系统功能的作用以及促生产作用。
本发明的优点(1)大肠杆菌表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在基因工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，且其稳定性好、生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的chBJSTWO蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到chBJSTWO粗制品，且目的蛋白具有良好的稳定性和生物学活性；(3)选用非分泌型酵母表达载体pMET A，表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，粗蛋白具有比较高的稳定性和生物学活性；(4)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单，得到的蛋白纯度高。(5)重组chBJSTWO作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物效果显著。
具体实施例方式
1 chBJSTWO基因克隆 用刀豆素(ConA)刺激鸡脾细胞，提取总RNA，通过RT-PCR方法分别扩增和克隆了我国仙居鸡、丝羽乌骨鸡和艾维茵肉鸡BJSTWOcDNA，将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector，测定chBJSTWOcDNA序列。
2 重组表达chBJSTWO基因工程大肠杆菌的构建 仙居鸡BJSTWO的PCR扩增产物亚克隆到一新型表达载体pBAD/His B中，构建成chBJSTWO原核表达质粒pBAD/His B/chBJSTWO，它能在大肠杆菌LMG194中表达，使chBJSTWO占菌体总蛋白的7～9％，表达率经100次以上传代不降低。
3 重组表达chBJSTWO基因工程酵母菌的构建将仙居鸡BJSTWO的PCR扩增产物亚克隆到一新型真核表达载体pMETαA和pMETA中，分别构建成chBJSTWO表达质粒pMETαA/chBJSTWO和pMETA/chBJSTWO，用BMDY作为基础培养基，用甲醇作为诱导剂，通过优化溶氧、震荡速度、发酵pH值等工艺参数，可以使chBJSTWO基因在P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16中得到表达，表达量分别占菌体总蛋白的15～20％和10～12％。，表达率经100次以上传代不降低。
4 重组chBJSTWO粗制品的制备及纯化工艺。
所建立的粗制品的制备及纯化工艺流程简单、稳定性好、活性高。本工艺具有以下特点(1)大肠杆菌表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，且其生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的chBJSTWO蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到chBJSTWO粗产品，且目的蛋白的具有良好的生物学活性；(3)选用非分泌型酵母表达载体pMET A，表达的chBJSTWO蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波处理就可以得到chBJSTWO粗蛋白，且粗蛋白具有比较高的生物学活性；(4)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单，得到的蛋白纯度高。
5 粗制品或纯品加入磷酸缓冲液等助溶剂，用微空滤膜过滤除菌，可以作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
chBJSTWO的一个重要生物功能就是促进T淋巴细胞的增殖，我们用经有丝分裂原刺激的鸡脾T淋巴细胞作为靶细胞，用MTT法对chBJSTWO的活性进行了检测，证实表达产物具有较高的生物学活性，这种生物学活性与文献报道的一致。
本发明运用重组DNA技术，采用反转录PCR方法得到了一种重组chBJSTWO蛋白。经过下游纯化，中试规模下的产品达到了临床应用的质量要求。
实施例1.寡核苷酸引物的设计与合成根据Sundick等报道的鸡IL-2核苷酸序列设计了5’端和3’端一对引物。5’端引物引入Hind III酶切位点，3’端引物引入EcoRI酶切位点。合成以下两条引物5’端引物5’GCAAGCTTATAACTGGGACACTGCCATG3’3’端引物5’GCGAATTCAAATGTCATCTAGAAGTGACT3’实施例2.脾淋巴细胞的分离饲养至12日龄的三个不同品系的雏鸡点眼接种新城Lasota株疫苗(1个免疫剂量)，32日龄用新城疫Mukteswar株疫苗(1个免疫剂量)通过肌肉途径加强免疫，加强免疫4日后颈动脉放血处死动物。无菌采集脾脏、剪碎置于无Ca2+、Mg2+离子的PBS中(717mmol/L K2HPO4，283mmol/L KH2PO4，PH7.2)中，300×g4□离心10min，上清液移至含有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，500×g 4□离心30min，毛细管伸至单核细胞层中，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用PBS洗两次，再以RPMI1640培养液(不含犊牛血清)洗涤1次，台盼蓝(0.1％)染色活细胞计数后，用RPMI1640生长培养液(含10％的犊牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)将细胞分别配成2×106/ml的细胞悬液。细胞悬液中加入10μg/ml终浓度ConA，分装细胞培养板，5％二氧化碳培养箱40□培养20小时，收集单个核淋巴细胞。
实施例3.RT-PCR扩增目的基因片段采用Promega公司的SV Total RNA Isolation System提取单个核淋巴细胞mRNA，以收集的单个核淋巴细胞mRNA为模板，5’端和3’端合成引物，用ReverseTranscription System kit反转录合成chBJSTWOcDNA第一链；反转录产物在95□1min、56□45s、72□2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例4.测序载体的构建和序列测定用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T easy vector，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选。挑取阳性克隆，分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA自动测序仪测定每个品种鸡chBJSTWO基因核苷酸序列。每个品种鸡chBJSTWO基因核苷酸及推导氨基酸序列见表1、表2和表3。
1 ATAACTGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGA 692M M C K V L I F G C I S V A M L M691 CTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAG 1382 T T A Y G A S L S S E K W K T L Q T L I K D L1381 AAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTGCA 2072 E I L E N I K N K I H L E L Y T P T E T Q E C2071 CCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTG 2762 T Q Q T L Q C Y L G E V V T L K K E T E D D T2761 AAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAA 3452 E I K E E F V T A I Q N I E K N L K S L T G L3451 ATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATG 4142 N H T G S E C K I C E A N N K K K F P D F L H4141 AACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACTAATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTAT 4832 E L T N F V R Y L Q K - 4831 TTATTTAATTATTTAATTACAGATAATTTATATATTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTC 5521 TGGGACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATCATATTTGATCCTTTCTG 6211 TAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAAACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATG 6901 TGTTTACTGAAAGAATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTT 734表1.仙居鸡BJSTWO核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.1)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)1 ATAACTGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGA 692M M C K V L I F G C I S V A M L M691 CTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAG 1382 T T A Y G A S L S S E K W K T L Q T L I K D L1381 AAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTGCA 2072 E I L E N I K N K I H L E L Y T P T E T Q E C2071 CCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTG 2762 T Q Q T L Q C Y L G E V V T L K K E T E D D T276
1. AAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAA 3452 E I K E E F V T A I Q N I E K N L K S L T G L 3451 ATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATG 4142 N H T G S E C K I C E A N N K K K F P D F L H 4141 GACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACTAATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTAT 4832 G L T N F V R Y L Q K -4831 TTATTTAATTATTTAATTACAGATAATTTATATGTTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTC 5521 TGGGACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATCATATTTGATCCTTTCTG 6211 TAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAAACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATG 6901 TGTTTACTGAAAGAATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTT 734表2.丝羽乌骨鸡BJSTWO核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.2)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)1 ATAACTGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGA 692M M C K V L I F G C I S V A M L M691 CTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAG 1382 T T A Y G A S L S S A K R K P L Q T L I K D L1381 AAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTGCA 2072 E I L E N I K N K I H L E L Y T P T E T Q E C2071 CCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTG 2762 T Q Q T L Q C Y L G E V V T L K K E T E D D T2761 AAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAA 3452 E I K E E F V T A I Q N I E K N L K S L T G L3451 ATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATG 4142 N H T G S E C K I C E A N N K K K F P D F L H4141 AACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACTAATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTAT 4832 E L T N F V R Y L Q K - 4831 TTATTTAATTATTTAATTACAGATAATTTATATATTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTC 5521 TGGGACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATCATATTTGATCCTTTCTG 6211 TAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAAACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATG 6901 TGTTTACTGAAAGAATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTT 734表3.爱维茵肉鸡BJSTWO核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.3)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)实施例5.pBAD/His B/chBJSTWO表达载体构建、筛选及鉴定根据仙居鸡BJSTWO序列，在成熟蛋白序列两端合成上下游引物UP1(5’GGAATTCGCATCTCTATCATCAGCAAA3’)，5’端含EcoRI酶切位点；DOWN1(5’TTAAGCTTTTATTTTTGCAGATATCTCA C3’)，5’端含HandIII酶切位点；以pGEM-T-Easy/chBJSTWO为模板在95□1min、56□45s、72□2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、HandIII双酶切后，回收目的片段并克隆于表达质粒pBAD/His B的EcoRI+HandIII酶切窗口中，构建重组表达质粒pBAD/His B/chBJSTWO，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
实施例6.重组chBJSTWO的发酵生产(大肠杆菌)经鉴定的重组质粒转入LMG194宿主菌，挑取单克隆接种到含有氨苄青霉素和葡萄糖的RM培养基中，37□培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于RM培养基中，250rpm震荡培养2小时左右，使OD600≈0.5，按1∶100的比例加入20％浓度的L(+)-阿拉伯糖诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液，采用15％的SDS-PAGE鉴定，产物表达量可达7～9％。
实施例7.pMETαA/chBJSTWO和pMET A/chBJSTWO表达载体构建、筛选及鉴定根据仙居鸡BJSTWO序列在其成熟蛋白序列两端合成上下游引物上游引物同实例5中UP1；下游引物DOWN2(5’TTGGATCCTTATTTTTGCAGATATCTCAC3’)，5’端含BamHI酶切位点。以pGEM-T-Easy/chBJSTWO为模板进行PCR，扩增条件同实例5。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、BamHI双酶切后，回收目的片段并分别克隆于表达质粒pMETαA和pMETA强启动子下游的EcoRI+BamHI酶切窗口中，构建重组表达质粒，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
采用Choi等报道的方法制备PMAD11和PMAD16感受态细胞，分别取100μlPMAD11和100μl PMAD16酵母感受态细胞与2μg经KpnI酶切完全的pMETαA/chBJSTWO和pMET A/chBJSTWO混合，使用Bio-Rad Gene Pluser在375V/cm，25μF、250Ω的条件下进行转化，然后加入1ml室温的YPAD，28～30□孵育1h，1500×g室温离心3min收集菌体，重新悬于100μl 1×YNB，将菌液涂布于MD选择平板上，28～30□培养3～4天，观察转化子的生长情况。随机筛选MD平板上白色菌落，用Genomic DNA mini-prepkit提取酵母基因组DNA进行PCR扩增鉴定。
实施例8.重组chBJSTWO的发酵生产(酵母)分别挑取PCR鉴定为阳性的PMAD11和PMAD16克隆接种于20mL BMDY培养基中，28～30□，250r/min震荡培养16～18h至OD600＝2～10。室温，1500×g离心5min，收集菌体重悬于10mL BMMY培养基中。28～30□，250r/min继续震荡培养4天，每24小时补加5％的甲醇使甲醇终浓度为0.5％，离心分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定chBJSTWO表达水平，凝胶成像系统扫描显示chBJSTWO在PMAD11中的表达量为15～20％，在PMAD16中的表达量为10～12％。
实施例9.重组基因工程大肠杆菌的保存与稳定性工程菌加30％甘油，-70□保存。短期保存菌种可用LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例10.重组基因工程酵母菌的保存与稳定性工程菌加30％甘油，-70□保存。短期保存菌种可用YPAD平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例11.重组chBJSTWO粗蛋白的制备及分离纯化经大肠杆菌菌株LMG194表达的chBJSTWO主要以融合蛋白的形式存在，菌体经超声波破碎后，可以得到chBJSTWO粗制品，进一步用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统可以较快的得到chBJSTWO纯品。
含有pMETαA/chBJSTWO重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD11表达的chBJSTWO主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到chBJSTWO粗制品，含有pMETA/chBJSTWO重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD16表达的chBJSTWO主要存在酵母细胞内，经超声波裂解、离心去沉淀即可得到chBJSTWO粗制品，用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统可以较快的得到chBJSTWO纯品实施例12.重组chBJSTWO的鉴定SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，MTT法测定粗制品及纯品的生物学活性，大肠杆菌和P.methanolica酵母的表达产物不但具有刺激T淋巴细胞生长的活性，且活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液的活性。
实施例13.重组chBJSTWO理化性质及稳定性重组chBJSTWO对热较稳定，56□1小时、37□12小时或70□15分钟处理仍保留活性，4℃可保存1年以上，其活性在pH2～9范围内保持稳定。重组chBJSTWO对蛋白酶敏感，对DNA酶、RNA酶不敏感。
实施例14.重组chBJSTWO作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
用重组chBJSTWO，可以使鸡肠炎沙门氏菌器官侵入率降低51％～60％，以重组chBJSTWO注入鸡胚，同样可以显著降低孵化期鸡胚的沙门氏菌器官侵入率。在寄生虫方面，在以Eimeria tenella或E.acervulina感染鸡的前一天或感染后的第1天，用重组chBJSTWO皮下注射3周龄雏鸡后，可以明显降低(p＜0.05)球虫感染后卵囊的排出量。1日龄雏鸡口服重组chBJSTWO能显著增强NDV疫苗对NDV强毒的攻击，包括延迟疾病的发生、减轻呼吸道症状、降低死亡率等。用重组chBJSTWO和IBDV疫苗免疫鸡与单独使用IBDV疫苗免疫相比，二次免疫应答产生抗体的滴度升高、高水平抗体维持时间长、抗原的用量降低，且对鸡提供更好的免疫保护。
重组chBJSTWO具有促进鸡生长的功能。连续两天注射重组chBJSTWO蛋白的7日龄雏鸡比只注射生理盐水的鸡在12天内体重增加明显，增重范围在4～9％之间。感染Eimeria球虫的雏鸡，4天内体重下降，当注射重组chBJSTWO蛋白后，2～3天后体重增加。连续两天给鸡注射重组chBJSTWO蛋白，1天后人工感染Eimeria球虫，每天记录鸡的体重直到第12天，结果发现chBJSTWO处理的鸡在感染Eimeria球虫后出现体重下降较早(感染后4～5天)，其体重恢复快(感染后6～8天)。
权利要求
1.一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于它的步骤如下1)自中国的仙居鸡、丝羽乌骨鸡和外来品种艾维茵肉鸡的脾淋巴细胞中克隆出chBJSTWO的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/chBJSTWO；或者上述chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETA组建成胞内表达型表达载体pMET A/chBJSTWO；2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；4)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到chBJSTWO粗制品，PMAD11表达的chBJSTWO主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到chBJSTWO粗制品；用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到chBJSTWO纯品；5)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。
2.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于上述所说的chBJSTWOcDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/chBJSTWO经转化大肠杆菌LMG194为chBJSTWO基因工程大肠杆菌，L(+)-阿拉伯糖诱导表达后，产物以融合蛋白的形式存在工程菌内。
3.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于上述所说的chBJSTWOcDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/chBJSTWO经电击转化酵母菌PMAD11为chBJSTWO基因工程酵母菌，甲醇诱导表达，产物以分泌物形式存在于工程菌培养基中；pMETαA/chBJSTWO转化酵母菌PMAD16，甲醇诱导表达，产物主要存在于工程菌内。
4.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于所说的通过发酵技术扩增大肠杆菌工程菌LMG194，用RM作为基础培养基，是通过破碎大肠杆菌菌体，用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统纯化产品。
5.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD16，用BMDY作为基础培养基，在表达不同时间加入氮源、碳源等营养素，是通过破碎酵母工程菌PMAD16菌体，用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统进行纯化。
6.根据权利要求1所述的一种重组chBJSTWO蛋白的制备方法，其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11，用BMDY作为基础培养基，在表达不同时间加入氮源、碳源等营养素，酵母工程菌PMAD11分泌物用Ni-NTAArgarose蛋白纯化系统进行纯化。
7.一种重组chBJSTWO蛋白的用途，其特征在于它作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性；作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫系统功能的作用以及促生产作用。
全文摘要
本发明公开了一种重组chBJS
文档编号A61P31/04GK1490409SQ0315052
公开日2004年4月21日 申请日期2003年8月20日 优先权日2003年8月20日
发明者周继勇, 陈吉刚, 王金勇, 吴建祥 申请人:浙江大学
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