凝血酶原复合物或凝血因子ix制剂的干热处理稳定剂的制作方法
专利名称：凝血酶原复合物或凝血因子ix制剂的干热处理稳定剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可防止凝血酶原复合物或凝血因子IX干热灭活病毒时凝血因子活性损失的稳定剂。具体而言，是凝血酶原复合物或凝血因子IX中加入蔗糖或/和精氨酸或其盐类，在干热灭活(80℃或者100℃)病毒时能保护凝血因子，提高凝血因子的回收率。
背景技术：
凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)，亦即凝血因子IX复合物，包含维生素K依赖性的凝血因子II、VII、IX、X及蛋白C、蛋白S等，因含有凝血因子IX可用于乙型血友病治疗，而且由于含有多种凝血因子，还可用于维生素K缺乏而继发的II、VII、IX、X因子低下所致出血和因肝脏疾患引起的凝血功能异常的治疗。凝血因子IX制剂是经纯化的含有高纯度凝血因子IX的制品，主要用于治疗乙型血友病，其成分单纯，可避免由于其他凝血因子活化诱发的血栓类副反应。
目前文献报道的无论是制备凝血因子IX还是凝血酶原复合物的方法，均以人血浆为原料，因此不能排除传染乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)或者其它致病病毒的可能性，为此制备工艺必须包括病毒灭活或去除方法。例如，在凝血因子IX和凝血酶原复合物的生产过程中，美国专利USP4379085中提到用巴氏灭活方法处理制品；C.M.Heldebrant等[Transfusion1985 25(6)510-515]比较了巴氏灭活(60℃，20小时)与干热灭活(98℃，30分钟)的灭活效果及制品灭活前后的半衰期等性质变化。余蓉等[《中国生物制品学杂志》1997(10)3148-152]采用有机溶剂/去污剂SD法进行凝血酶原复合物的病毒灭活。欧洲专利EP0860444中使用纳米膜过滤方法去除PCC中的病毒，特别是相对颗粒较小的非脂包膜病毒。
在以上各种病毒灭活/去除方法中，SD法的反应条件比较温和，对制品的限制也比较少，但其作用原理限制了它只作用于脂包膜病毒的灭活，对非脂包膜类病毒没有作用。纳米膜过滤法与制品的分子大小、构型、性质密切相关，如果制品分子量较大，选用孔径较小的纳米膜则无法将病毒与制品分离，孔径较大的膜又无法实现小病毒颗粒的去除，其适用范围有一定的局限性。因此目前能够同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒的最可靠方法是加热法。湿热法，如巴氏灭活法是运用最早的病毒灭活方法，可靠性强，但许多活性蛋白及酶类无法经受湿热条件下60℃/10小时的严酷条件，往往需要加入大量的稳定剂，高浓度的稳定剂可以减少制品生物活性的损失，但灭活病毒的效果也会受到影响，同时也增加了许多额外的生产步骤，提高了生产成本，延长了生产周期。而干热法(60-100℃/10分钟-72小时，特别是80℃/72小时或100℃/30分钟)对脂包膜和非脂包膜病毒都有效，且干热处理往往是生产的最后步骤，其成本低，可操作性和可控制性较强，因此越来越多的厂商选用干热法对制品进行病毒灭活。在干热灭活的各种制品中也需要加入一定量的稳定剂加以保护，例如氨基酸、寡糖、糖醇和人白蛋白以及各种无机盐、有机盐等。不同制品所用的稳定剂不一样，目前关于凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理方法也有报道，如日本专利JP62010019中提出干热处理时使用无机盐或有机盐，如氯化钠或枸橼酸钠等发挥保护作用。但实际使用中保护作用不够理想，实际干热处理前后的凝血因子活性回收率很难达到或超过70％，难以满足大生产的需要。至今未见有关将蔗糖或/和精氨酸用于凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂干热处理稳定剂的报道。
发明内容
本发明提供一种凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂干热处理的稳定剂，使制剂在80-100℃下干热处理过程中，凝血因子IX及II、VII、X受损少，活性回收率达70％以上。本发明稳定剂是指蔗糖或/和精氨酸或其盐，还可含有常用的甘氨酸、NaCl、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。在凝血因子IX或凝血酶原复合物中加入0.1-10％的蔗糖或/和0.1％-5％精氨酸或其盐，就能在80-100℃干热下，既能达到灭活病毒效果，又能减少制品中凝血因子的活性损失。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明稳定剂在干热灭活病毒时对凝血酶原复合物制剂或凝血因子IX制剂的保护作用作详细说明。
实施例1本发明稳定剂对凝血酶原复合物的保护作用。
1.凝血酶原复合物的制备按常规方法，冰冻血浆或去除冷沉淀的血浆上清用阴离子树脂DEAE-Sepharose A50吸附凝血酶原复合物，用含2M NaCl、0.02M柠檬酸三钠的洗脱液洗脱，所得的洗脱液用含有0.02M柠檬酸三钠，0.6％NaCl，pH6.6-7.8的超滤缓冲液进行超滤脱盐浓缩，得到凝血酶原复合物浓缩液。
2.加入稳定剂，制备凝血酶原复合物冻干制剂(直至干热处理)将按一定配比的蔗糖和精氨酸组成稳定剂(见表1)，分别加入上述制备的凝血酶原复合物，除菌、分装、冻干后经80℃/72小时、100℃/30分钟干热灭活病毒即为成品。
3.观察复溶后样品澄明度及凝血因子IX的活性回收率将上述制备的制品在室温下用注射用水进行复溶，以不加稳定剂和仅加甘氨酸作为稳定剂的凝血酶原复合物制品也经同样干热处理作为对照，观察复溶澄明度，检测凝血因子IX干热处理前后的效价，计算IX因子的活性回收率。结果见表1。
表1 不同稳定剂对干热处理制剂复溶后澄明度和凝血因子IX回收率的影响
从表1看出，没有加稳定剂的空白对照和以2％甘氨酸作为稳定剂的制品经80℃或100℃干热处理后，凝血因子IX回收率都不超过70％，而以不同配比的蔗糖和精氨酸为稳定剂的制剂，IX因子回收率均在80％以上。各冻干制品的外观虽无明显差别，但用注射用水复溶后，加入蔗糖和精氨酸的制品外观明显比空白对照及仅加甘氨酸作为稳定剂的制品更为清亮，说明本发明稳定剂能有效保护凝血酶原复合物及其凝血因子IX。
实施例2精氨酸对凝血因子IX制剂的保护试验按常规，从肝素亲和层析Sepharose CL-6B柱洗脱得到的凝血因子IX经超滤脱盐，所得溶液含有100IU/ml凝血因子IX，加入1％精氨酸。冻干后分别经80℃/72小时和100℃/30分钟干热处理，检测干热处理前后凝血因子IX的效价，计算活性回收率。与空白对照比较，未加精氨酸的空白对照凝血因子IX回收率分别为50.9％(80℃/72小时)和57.8％(100℃/30分钟)，而加入1％精氨酸的回收率分别为90.8％(80℃/72小时)和92.0％(100℃/30分钟)。结果表明以精氨酸作为稳定剂的制品在80℃和100℃干热处理中能有效保护凝血因子IX。
实施例3蔗糖对凝血因子IX的保护试验按常规方法，从肝素亲和层析Sepharose CL-6B柱洗脱得到的凝血因子IX经超滤浓缩，所得浓缩液含有80IU/ml凝血因子IX，加入1％蔗糖，除菌冻干后分别经80℃/72小时和100℃/30分钟干热处理，检测干热处理前后凝血因子IX的活性，计算其活性回收率。空白对照的凝血因子IX回收率分别为59.4％(80℃/72小时)和63.9％(100℃/30分钟)，加入1％蔗糖的回收率则为92.9％(80℃/72小时)和94.7％(100℃/30分钟)。结果表明以蔗糖作为稳定剂的制品在干热处理中能有效保护凝血因子IX。
实施例4精氨酸或蔗糖对凝血因子IX、II、VII、X干热处理的保护凝血酶原复合物冻干品，其中含凝血因子IX 15IU/ml，因子II 20IU/ml，因子VII 7IU/ml，因子X 20IU/ml，还含有0.01M柠檬酸三钠，0.05M NaCl，稳定剂蔗糖或精氨酸的含量见表2。经80℃72小时干热处理，并设空白对照和甘氨酸对照，观察干热处理对凝血因子II、VII、IX、X效价回收率，结果见表2。
表2 精氨酸或蔗糖对不同凝血因子干热处理效价回收率的影响(％)
由表2可见，与空白对照比较，2％甘氨酸能够在一定程度上保护凝血酶原复合物中II、VII、IX因子在80℃72小时条件下的活性，但X因子的活性回收率较低，而蔗糖、精氨酸能够更为有效地保护四种凝血因子免受长时间高温的损伤。
实施例5甘氨酸与甘氨酸+蔗糖或/和精氨酸对干热处理凝血因子IX回收率的影响试验经超滤后的凝血酶原复合物溶液，含因子IX 20IU/ml，0.01M柠檬酸三钠，0.5％NaCl，pH6.4-7.8，加入2％甘氨酸后再分别按表3加入蔗糖和精氨酸进行配制。分别经80℃/72小时、100℃/30分钟干热处理，检测干热处理前后凝血因子IX的活性，计算IX因子的活性回收率。与仅加甘氨酸的作对照比较。
表3 不同稳定剂配方对干热处理的凝血因子IX效价回收率的影响
从表3可以看出，甘氨酸虽能提高凝血酶原复合物制品的冻干质量，但在加入2％甘氨酸的情况下进一步加入蔗糖或/和精氨酸后能够更有效地保护干热处理下IX因子活性。
综上所述，本发明为凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理提供了有效的稳定剂。
权利要求
1.一种凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，包括氨基酸或/和糖类，其特征在于所说的糖为蔗糖，所说的氨基酸为精氨酸或其盐类，蔗糖含量0.1-10％，精氨酸或其盐类含量0.1-5％。
2.根据权利要求1所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于所说的精氨酸盐类为精氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于还含有0.1-10％甘氨酸。
4.根据权利要求1或2所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于还含有氯化钠、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于还含有氯化钠、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。
6.权利要求1、2、5所述干热处理稳定剂在制备凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中的应用。
7.权利要求3所述干热处理稳定剂在制备凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中的应用。
8.权利要求4所述干热处理稳定剂在制备凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种可防止凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂在干热灭活病毒时凝血因子活性损失的稳定剂。本发明稳定剂是指蔗糖或/和精氨酸或其盐，还可含有常用的甘氨酸、NaCl、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。实验证明，在凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中只要含有0.1－10％蔗糖或/和0.1－5％精氨酸或其盐，就能在80－100℃干热下既能有效灭活病毒，又能有效保护凝血因子的活性。因此本发明可用作凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理的稳定剂。
文档编号A61K38/43GK1524578SQ03151058
公开日2004年9月1日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者张美华, 王强, 彭柬, 潘文斌, 盛凤仙, 李玲 申请人:上海新兴医药股份有限公司
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可防止凝血酶原复合物或凝血因子IX干热灭活病毒时凝血因子活性损失的稳定剂。具体而言，是凝血酶原复合物或凝血因子IX中加入蔗糖或/和精氨酸或其盐类，在干热灭活(80℃或者100℃)病毒时能保护凝血因子，提高凝血因子的回收率。
背景技术：
凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)，亦即凝血因子IX复合物，包含维生素K依赖性的凝血因子II、VII、IX、X及蛋白C、蛋白S等，因含有凝血因子IX可用于乙型血友病治疗，而且由于含有多种凝血因子，还可用于维生素K缺乏而继发的II、VII、IX、X因子低下所致出血和因肝脏疾患引起的凝血功能异常的治疗。凝血因子IX制剂是经纯化的含有高纯度凝血因子IX的制品，主要用于治疗乙型血友病，其成分单纯，可避免由于其他凝血因子活化诱发的血栓类副反应。
目前文献报道的无论是制备凝血因子IX还是凝血酶原复合物的方法，均以人血浆为原料，因此不能排除传染乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)或者其它致病病毒的可能性，为此制备工艺必须包括病毒灭活或去除方法。例如，在凝血因子IX和凝血酶原复合物的生产过程中，美国专利USP4379085中提到用巴氏灭活方法处理制品；C.M.Heldebrant等[Transfusion1985 25(6)510-515]比较了巴氏灭活(60℃，20小时)与干热灭活(98℃，30分钟)的灭活效果及制品灭活前后的半衰期等性质变化。余蓉等[《中国生物制品学杂志》1997(10)3148-152]采用有机溶剂/去污剂SD法进行凝血酶原复合物的病毒灭活。欧洲专利EP0860444中使用纳米膜过滤方法去除PCC中的病毒，特别是相对颗粒较小的非脂包膜病毒。
在以上各种病毒灭活/去除方法中，SD法的反应条件比较温和，对制品的限制也比较少，但其作用原理限制了它只作用于脂包膜病毒的灭活，对非脂包膜类病毒没有作用。纳米膜过滤法与制品的分子大小、构型、性质密切相关，如果制品分子量较大，选用孔径较小的纳米膜则无法将病毒与制品分离，孔径较大的膜又无法实现小病毒颗粒的去除，其适用范围有一定的局限性。因此目前能够同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒的最可靠方法是加热法。湿热法，如巴氏灭活法是运用最早的病毒灭活方法，可靠性强，但许多活性蛋白及酶类无法经受湿热条件下60℃/10小时的严酷条件，往往需要加入大量的稳定剂，高浓度的稳定剂可以减少制品生物活性的损失，但灭活病毒的效果也会受到影响，同时也增加了许多额外的生产步骤，提高了生产成本，延长了生产周期。而干热法(60-100℃/10分钟-72小时，特别是80℃/72小时或100℃/30分钟)对脂包膜和非脂包膜病毒都有效，且干热处理往往是生产的最后步骤，其成本低，可操作性和可控制性较强，因此越来越多的厂商选用干热法对制品进行病毒灭活。在干热灭活的各种制品中也需要加入一定量的稳定剂加以保护，例如氨基酸、寡糖、糖醇和人白蛋白以及各种无机盐、有机盐等。不同制品所用的稳定剂不一样，目前关于凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理方法也有报道，如日本专利JP62010019中提出干热处理时使用无机盐或有机盐，如氯化钠或枸橼酸钠等发挥保护作用。但实际使用中保护作用不够理想，实际干热处理前后的凝血因子活性回收率很难达到或超过70％，难以满足大生产的需要。至今未见有关将蔗糖或/和精氨酸用于凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂干热处理稳定剂的报道。
发明内容
本发明提供一种凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂干热处理的稳定剂，使制剂在80-100℃下干热处理过程中，凝血因子IX及II、VII、X受损少，活性回收率达70％以上。本发明稳定剂是指蔗糖或/和精氨酸或其盐，还可含有常用的甘氨酸、NaCl、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。在凝血因子IX或凝血酶原复合物中加入0.1-10％的蔗糖或/和0.1％-5％精氨酸或其盐，就能在80-100℃干热下，既能达到灭活病毒效果，又能减少制品中凝血因子的活性损失。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明稳定剂在干热灭活病毒时对凝血酶原复合物制剂或凝血因子IX制剂的保护作用作详细说明。
实施例1本发明稳定剂对凝血酶原复合物的保护作用。
1.凝血酶原复合物的制备按常规方法，冰冻血浆或去除冷沉淀的血浆上清用阴离子树脂DEAE-Sepharose A50吸附凝血酶原复合物，用含2M NaCl、0.02M柠檬酸三钠的洗脱液洗脱，所得的洗脱液用含有0.02M柠檬酸三钠，0.6％NaCl，pH6.6-7.8的超滤缓冲液进行超滤脱盐浓缩，得到凝血酶原复合物浓缩液。
2.加入稳定剂，制备凝血酶原复合物冻干制剂(直至干热处理)将按一定配比的蔗糖和精氨酸组成稳定剂(见表1)，分别加入上述制备的凝血酶原复合物，除菌、分装、冻干后经80℃/72小时、100℃/30分钟干热灭活病毒即为成品。
3.观察复溶后样品澄明度及凝血因子IX的活性回收率将上述制备的制品在室温下用注射用水进行复溶，以不加稳定剂和仅加甘氨酸作为稳定剂的凝血酶原复合物制品也经同样干热处理作为对照，观察复溶澄明度，检测凝血因子IX干热处理前后的效价，计算IX因子的活性回收率。结果见表1。
表1 不同稳定剂对干热处理制剂复溶后澄明度和凝血因子IX回收率的影响
从表1看出，没有加稳定剂的空白对照和以2％甘氨酸作为稳定剂的制品经80℃或100℃干热处理后，凝血因子IX回收率都不超过70％，而以不同配比的蔗糖和精氨酸为稳定剂的制剂，IX因子回收率均在80％以上。各冻干制品的外观虽无明显差别，但用注射用水复溶后，加入蔗糖和精氨酸的制品外观明显比空白对照及仅加甘氨酸作为稳定剂的制品更为清亮，说明本发明稳定剂能有效保护凝血酶原复合物及其凝血因子IX。
实施例2精氨酸对凝血因子IX制剂的保护试验按常规，从肝素亲和层析Sepharose CL-6B柱洗脱得到的凝血因子IX经超滤脱盐，所得溶液含有100IU/ml凝血因子IX，加入1％精氨酸。冻干后分别经80℃/72小时和100℃/30分钟干热处理，检测干热处理前后凝血因子IX的效价，计算活性回收率。与空白对照比较，未加精氨酸的空白对照凝血因子IX回收率分别为50.9％(80℃/72小时)和57.8％(100℃/30分钟)，而加入1％精氨酸的回收率分别为90.8％(80℃/72小时)和92.0％(100℃/30分钟)。结果表明以精氨酸作为稳定剂的制品在80℃和100℃干热处理中能有效保护凝血因子IX。
实施例3蔗糖对凝血因子IX的保护试验按常规方法，从肝素亲和层析Sepharose CL-6B柱洗脱得到的凝血因子IX经超滤浓缩，所得浓缩液含有80IU/ml凝血因子IX，加入1％蔗糖，除菌冻干后分别经80℃/72小时和100℃/30分钟干热处理，检测干热处理前后凝血因子IX的活性，计算其活性回收率。空白对照的凝血因子IX回收率分别为59.4％(80℃/72小时)和63.9％(100℃/30分钟)，加入1％蔗糖的回收率则为92.9％(80℃/72小时)和94.7％(100℃/30分钟)。结果表明以蔗糖作为稳定剂的制品在干热处理中能有效保护凝血因子IX。
实施例4精氨酸或蔗糖对凝血因子IX、II、VII、X干热处理的保护凝血酶原复合物冻干品，其中含凝血因子IX 15IU/ml，因子II 20IU/ml，因子VII 7IU/ml，因子X 20IU/ml，还含有0.01M柠檬酸三钠，0.05M NaCl，稳定剂蔗糖或精氨酸的含量见表2。经80℃72小时干热处理，并设空白对照和甘氨酸对照，观察干热处理对凝血因子II、VII、IX、X效价回收率，结果见表2。
表2 精氨酸或蔗糖对不同凝血因子干热处理效价回收率的影响(％)
由表2可见，与空白对照比较，2％甘氨酸能够在一定程度上保护凝血酶原复合物中II、VII、IX因子在80℃72小时条件下的活性，但X因子的活性回收率较低，而蔗糖、精氨酸能够更为有效地保护四种凝血因子免受长时间高温的损伤。
实施例5甘氨酸与甘氨酸+蔗糖或/和精氨酸对干热处理凝血因子IX回收率的影响试验经超滤后的凝血酶原复合物溶液，含因子IX 20IU/ml，0.01M柠檬酸三钠，0.5％NaCl，pH6.4-7.8，加入2％甘氨酸后再分别按表3加入蔗糖和精氨酸进行配制。分别经80℃/72小时、100℃/30分钟干热处理，检测干热处理前后凝血因子IX的活性，计算IX因子的活性回收率。与仅加甘氨酸的作对照比较。
表3 不同稳定剂配方对干热处理的凝血因子IX效价回收率的影响
从表3可以看出，甘氨酸虽能提高凝血酶原复合物制品的冻干质量，但在加入2％甘氨酸的情况下进一步加入蔗糖或/和精氨酸后能够更有效地保护干热处理下IX因子活性。
综上所述，本发明为凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理提供了有效的稳定剂。
权利要求
1.一种凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，包括氨基酸或/和糖类，其特征在于所说的糖为蔗糖，所说的氨基酸为精氨酸或其盐类，蔗糖含量0.1-10％，精氨酸或其盐类含量0.1-5％。
2.根据权利要求1所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于所说的精氨酸盐类为精氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于还含有0.1-10％甘氨酸。
4.根据权利要求1或2所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于还含有氯化钠、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂，其特征在于还含有氯化钠、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。
6.权利要求1、2、5所述干热处理稳定剂在制备凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中的应用。
7.权利要求3所述干热处理稳定剂在制备凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中的应用。
8.权利要求4所述干热处理稳定剂在制备凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种可防止凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂在干热灭活病毒时凝血因子活性损失的稳定剂。本发明稳定剂是指蔗糖或/和精氨酸或其盐，还可含有常用的甘氨酸、NaCl、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种。实验证明，在凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂中只要含有0.1－10％蔗糖或/和0.1－5％精氨酸或其盐，就能在80－100℃干热下既能有效灭活病毒，又能有效保护凝血因子的活性。因此本发明可用作凝血酶原复合物或凝血因子IX制剂的干热处理的稳定剂。
文档编号A61K38/43GK1524578SQ03151058
公开日2004年9月1日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者张美华, 王强, 彭柬, 潘文斌, 盛凤仙, 李玲 申请人:上海新兴医药股份有限公司
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