23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肿瘤和艾滋病药物中的应用的制作方法
专利名称：23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肿瘤和艾滋病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌及爱滋病药物中的用途。此外，本发明涉及了含有23-羟基白桦酸作为活性成分的药物组合物，以及这些药物组合物在制备治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌及爱滋病药物中的应用。
背景技术：
已有文献报道，白桦酸可选择性地杀灭人黑色素瘤细胞[Nature Medicine，1995；1(10)1645-1651]；白桦酸及其某些衍生物的抗癌活性已经通过用皮下植入小鼠肉瘤180细胞的裸鼠(JP 87,301,580)、其体外抑制P388淋巴细胞白血病细胞的生长(Planta Medica，1988；511-513)，特别是通过抑制鸟氨酸脱羧酶发生作用(WO95/04526)等得以证明。中国专利(申请号为99813476.0)公开了新的白桦酸衍生物(对C-2，C-3，C-17，C-20和/或C-29位进行结构修饰)对肿瘤细胞的抑制作用及其在治疗临床癌症中的应用。Lee等(WO96/39033)公开了白桦酸和二氢白桦酸酰基衍生物具有明显的抗HIV活性。在对C3-OH、C17-COOH和C20-外亚甲基进行了结构修饰后，发现白桦酸和二氢白桦酸衍生物对急性感染H9淋巴细胞具有抗HIV活性，其EC50值分别小于1.7×10-5μM。
23-羟基白桦酸为来源于中药白头翁(Pulsatilla chinensis)中的五环三萜类化合物，是中药白头翁的特征性成分，文献[化学学报，1983；41(8)739-745]中已公开了该化合物的结构，其结构式为
分子式为C30H48O4，类白色粉状物，分子量为472，易溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂。
本研究小组以前曾报道了23-羟基白桦酸体外和体内抗黑色素瘤作用[中国肿瘤临床与康复，2000；7(1)5-7]，并对人白血病细胞K-562和HL-60、鳞癌HeLa细胞[Planta Medica，2002；68183-186；Life Science，2002；721-9]及对人胃癌细胞SGC-7901、人卵巢癌细胞Vo[东南大学学报(医学报)，2001；20(3)141-144]具明显的抑制作用。但尚未见报道其对其它肿瘤细胞及爱滋病病毒的抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供23-羟基白桦酸的新用途即在制药中的新应用。
实际上，本发明涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防脑神经胶质瘤药物中的应用。
也涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肠道肿瘤药物中的应用。
还涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
还涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
更涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防爱滋病药物中的应用。
本发明涉及的23-羟基白桦酸是这样得到的将白头翁根粗粉用15～95％的乙醇渗漉或回流提取，过滤，滤液回收至无醇味，然后再加水稀释，过滤，滤液加入盐酸或硫酸调至pH1～3，加热回流10分钟～2小时，得沉淀物，放冷，抽滤或过滤，水洗固体物至中性，低温烘干，得粗品。粗品用乙酸乙酯等有机溶媒进行索式提取，回收提取液至适量，放置，得类白色粉状的23-羟基白桦酸。
1.动物急性毒性试验(1)口服给药健康雄性小鼠，体重18～25克，用23-羟基白桦酸水溶液(混悬)灌胃5.0g/kg，连续一周，未见小鼠死亡。
(2)注射给药健康雄性小鼠，体重18～25克，用23-羟基白桦酸水溶液进行腹腔注射，连续一周，观察动物死亡情况。23-羟基白桦酸的LD50值为2.13±0.65g/kg。
2.23-羟基白桦酸对几种肿瘤细胞的抑制作用将1、5、10、20、50、100和200×10-7mol/L浓度的样品及阳性对照药5-氟脲嘧啶200μl分别作用于含肿瘤细胞的96孔板中(3×103/孔)，培养3天，每孔加入5mg/ml MTT 20μl继续培养4小时，轻轻吸去上清液，加入1mmol/LHCl-异丙醇(1∶10)，用核酸蛋白检测仪于波长750nm下进行检测，经统计学处理，计算出肿瘤细胞生长抑制率并列于表1。
表1.23-羟基白桦酸对几种肿瘤细胞生长的抑制作用(IC5010-7mol/L)肿瘤细胞株 23-羟基白桦酸 5-氟尿嘧啶*肠癌细胞 LoVo 34.32.0HT-29 8.2 8.5HCT-116 28.57.6肺癌细胞 A549 41.28.3SPC-A411.75.2PGCL318.51.8肝癌细胞 HepA 52.27.3Bel-7404 63.44.5SMMC-7721 22.010.6*阳性对照药3.23-羟基白桦酸对小鼠S-180和脑神经胶质瘤的抑制作用在无菌条件下取S-180小鼠的实体肿块，用剪刀剪成小碎块，用玻璃匀浆器加生理盐水磨成匀浆，给每只小鼠皮下接种2.5×106细胞。共分5组，包括空白对照组(生理盐水)、阳性药对照组(氟脲嘧啶)、0.02g/kg、0.10g/kg和0.40g/kg组，每组20只小鼠，于接种后24小时灌胃给药，连续给药10天，两周后，摘取实体瘤，称重。体内抑瘤结果列于表2。
表2.23-羟基白桦酸对小鼠S-180的抑制作用
与空白对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01
另用小鼠肾囊膜法(SRC)进行脑神经胶质瘤的药效学实验，在以上同样剂量下，23-羟基白桦酸的抑瘤率为50～70％。
4.23-羟基白桦酸对HIV病毒的抑制作用将H9T淋巴细胞株在含有10％小牛血清的培养基中，在5％CO2、37℃的条件下连续培养。试验样品溶解于二甲亚砜中，配制成200、40、8和1.6μg/ml的不同浓度。取部分H9T淋巴细胞用爱滋病毒(HIV-1)进行感染，达到104感染单位/ml。另取等量的H9T淋巴细胞加入同样量的培养基，测定细胞毒活性(IC50)。然后置于37℃和5％CO2中培养4小时，取出，分别洗涤3次，分别加入24孔的平板上，加入不同浓度的试验液，阴性对照组加入等量的培养液，以AZT作阳性对照。然后把平板置37℃和5％CO2中培养4天。收集去除细胞后的上清液作P24抗原检测，通过测定HIV的壳蛋白的数量直接测定HIV的存在，计算EC50值。经上述方法测定，23-羟基白桦酸的IC50值为152μg/ml，EC50值为2.24μg/ml，治疗指数TI50(IC50/EC50)为67.8。
从以上结果，可以得出本发明的优点在于(1).本发明对已知化合物23-羟基白桦酸发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2).本发明的23-羟基白桦酸安全无毒，药理作用强，预示着良好的药用前景。
(3).本发明的物质原料中药白头翁资源丰富、价廉，制备工艺简单。
(4).本发明23-羟基白桦酸可作为活性成分与药学上可接受的赋型剂一起用于制备药物组合物，该药物组合物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂等肠道给药的剂型和注射液等肠外给药剂型，如针剂等。根据剂型的不同，该药物组合物使用的赋型剂也不同，常用赋型剂包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。其中稀释剂为乳糖、淀粉、糊精、微晶纤维素、微粉硅胶等，湿润剂为水和50～85％不同浓度的乙醇。含有本发明23-羟基白桦酸的药物组合物的优选剂型是口服剂，最好为胶囊。给药剂量为20～400mg/人/次，每天1～3次。
下面将描述本发明的实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
具体实施例方式
实施例1称取白头翁根干燥粗粉1.0kg，用3000ml的15％乙醇渗漉，合并乙醇渗漉液，减压回收至无醇味，过滤，滤液用盐酸调至pH2，加热30分钟，得沉淀物，放冷，过滤，水洗，干燥，得粗品。粗品用乙酸乙酯索氏回流，回流液浓缩至适量，放置，抽滤，得23-羟基白桦酸38.2g。
实施例2称取白头翁根干燥粗粉1.0kg，用3000ml的60％乙醇渗漉，合并乙醇渗漉液，减压回收至无醇味，过滤，滤液用盐酸调至pH2，加热30分钟，得沉淀物，放冷，过滤，水洗，干燥，得粗品。粗品用乙酸乙酯索氏回流，回流液浓缩至适量，放置，抽滤，得23-羟基白桦酸51.0g。
实施例3称取白头翁根干燥粗粉1.0kg，用3000ml的95％乙醇渗漉，合并提取液，减压回收至无醇味，过滤，滤液用盐酸调至pH2，加热30分钟，得沉淀物，放冷，过滤，水洗，干燥，得粗品。粗品用乙酸乙酯索氏回流，回流液浓缩至适量，放置，抽滤，得23-羟基白桦酸45.6g。
实施例4取本发明的23-羟基白桦酸20mg和微粉硅胶280mg，充分混合均匀，过筛，加入适量的硬脂酸镁，混匀，用干法造粒机制粒，过筛，筛取40～80目之间的颗粒，装入胶囊，每粒装0.3g。
实施例5按照实施例4所述方法制备胶囊，不同的是使用400mg本发明的23-羟基白桦酸、100mg微粉硅胶和适量的硬脂酸镁，每粒胶囊装0.5g。
实施例6按本技术领域技术人员公知的方法制备23-羟基白桦酸的片剂，其中所述片剂按实际需要制成含20～200mg的23-羟基白桦酸。取本发明的23-羟基白桦酸150g、微粉硅胶420g、无水乳糖380g、氧化硅30g，混合30分钟后，再筛入200g硬脂酸镁，继续混匀，最后用12/32英寸的标准凹冲压成片。
权利要求
1.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防脑神经胶质瘤药物中的应用。
2.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肠道肿瘤药物中的应用。
3.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
4.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
5.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防爱滋病药物中的应用。
6.根据权利要求1～5中任一所述的以23-羟基白桦酸作为活性成分的药物组合物。
7.根据权利要求1～4，23-羟基白桦酸可用于制备治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌及肝癌的药物。
8.根据权利要求5，23-羟基白桦酸可用于制备治疗或预防爱滋病的药物。
全文摘要
本发明涉及23－羟基白桦酸在制药领域中的新用途。该物质可作为脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌细胞及HIV病毒的抑制剂；本发明还涉及含有该化合物用于治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌及爱滋病的药物组合物。
文档编号A61P31/00GK1491651SQ0315290
公开日2004年4月28日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者叶文才, 范春林, 赵守训 申请人:叶文才
技术领域：
本发明涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌及爱滋病药物中的用途。此外，本发明涉及了含有23-羟基白桦酸作为活性成分的药物组合物，以及这些药物组合物在制备治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌及爱滋病药物中的应用。
背景技术：
已有文献报道，白桦酸可选择性地杀灭人黑色素瘤细胞[Nature Medicine，1995；1(10)1645-1651]；白桦酸及其某些衍生物的抗癌活性已经通过用皮下植入小鼠肉瘤180细胞的裸鼠(JP 87,301,580)、其体外抑制P388淋巴细胞白血病细胞的生长(Planta Medica，1988；511-513)，特别是通过抑制鸟氨酸脱羧酶发生作用(WO95/04526)等得以证明。中国专利(申请号为99813476.0)公开了新的白桦酸衍生物(对C-2，C-3，C-17，C-20和/或C-29位进行结构修饰)对肿瘤细胞的抑制作用及其在治疗临床癌症中的应用。Lee等(WO96/39033)公开了白桦酸和二氢白桦酸酰基衍生物具有明显的抗HIV活性。在对C3-OH、C17-COOH和C20-外亚甲基进行了结构修饰后，发现白桦酸和二氢白桦酸衍生物对急性感染H9淋巴细胞具有抗HIV活性，其EC50值分别小于1.7×10-5μM。
23-羟基白桦酸为来源于中药白头翁(Pulsatilla chinensis)中的五环三萜类化合物，是中药白头翁的特征性成分，文献[化学学报，1983；41(8)739-745]中已公开了该化合物的结构，其结构式为
分子式为C30H48O4，类白色粉状物，分子量为472，易溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂。
本研究小组以前曾报道了23-羟基白桦酸体外和体内抗黑色素瘤作用[中国肿瘤临床与康复，2000；7(1)5-7]，并对人白血病细胞K-562和HL-60、鳞癌HeLa细胞[Planta Medica，2002；68183-186；Life Science，2002；721-9]及对人胃癌细胞SGC-7901、人卵巢癌细胞Vo[东南大学学报(医学报)，2001；20(3)141-144]具明显的抑制作用。但尚未见报道其对其它肿瘤细胞及爱滋病病毒的抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供23-羟基白桦酸的新用途即在制药中的新应用。
实际上，本发明涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防脑神经胶质瘤药物中的应用。
也涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肠道肿瘤药物中的应用。
还涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
还涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
更涉及23-羟基白桦酸在制备治疗或预防爱滋病药物中的应用。
本发明涉及的23-羟基白桦酸是这样得到的将白头翁根粗粉用15～95％的乙醇渗漉或回流提取，过滤，滤液回收至无醇味，然后再加水稀释，过滤，滤液加入盐酸或硫酸调至pH1～3，加热回流10分钟～2小时，得沉淀物，放冷，抽滤或过滤，水洗固体物至中性，低温烘干，得粗品。粗品用乙酸乙酯等有机溶媒进行索式提取，回收提取液至适量，放置，得类白色粉状的23-羟基白桦酸。
1.动物急性毒性试验(1)口服给药健康雄性小鼠，体重18～25克，用23-羟基白桦酸水溶液(混悬)灌胃5.0g/kg，连续一周，未见小鼠死亡。
(2)注射给药健康雄性小鼠，体重18～25克，用23-羟基白桦酸水溶液进行腹腔注射，连续一周，观察动物死亡情况。23-羟基白桦酸的LD50值为2.13±0.65g/kg。
2.23-羟基白桦酸对几种肿瘤细胞的抑制作用将1、5、10、20、50、100和200×10-7mol/L浓度的样品及阳性对照药5-氟脲嘧啶200μl分别作用于含肿瘤细胞的96孔板中(3×103/孔)，培养3天，每孔加入5mg/ml MTT 20μl继续培养4小时，轻轻吸去上清液，加入1mmol/LHCl-异丙醇(1∶10)，用核酸蛋白检测仪于波长750nm下进行检测，经统计学处理，计算出肿瘤细胞生长抑制率并列于表1。
表1.23-羟基白桦酸对几种肿瘤细胞生长的抑制作用(IC5010-7mol/L)肿瘤细胞株 23-羟基白桦酸 5-氟尿嘧啶*肠癌细胞 LoVo 34.32.0HT-29 8.2 8.5HCT-116 28.57.6肺癌细胞 A549 41.28.3SPC-A411.75.2PGCL318.51.8肝癌细胞 HepA 52.27.3Bel-7404 63.44.5SMMC-7721 22.010.6*阳性对照药3.23-羟基白桦酸对小鼠S-180和脑神经胶质瘤的抑制作用在无菌条件下取S-180小鼠的实体肿块，用剪刀剪成小碎块，用玻璃匀浆器加生理盐水磨成匀浆，给每只小鼠皮下接种2.5×106细胞。共分5组，包括空白对照组(生理盐水)、阳性药对照组(氟脲嘧啶)、0.02g/kg、0.10g/kg和0.40g/kg组，每组20只小鼠，于接种后24小时灌胃给药，连续给药10天，两周后，摘取实体瘤，称重。体内抑瘤结果列于表2。
表2.23-羟基白桦酸对小鼠S-180的抑制作用
与空白对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01
另用小鼠肾囊膜法(SRC)进行脑神经胶质瘤的药效学实验，在以上同样剂量下，23-羟基白桦酸的抑瘤率为50～70％。
4.23-羟基白桦酸对HIV病毒的抑制作用将H9T淋巴细胞株在含有10％小牛血清的培养基中，在5％CO2、37℃的条件下连续培养。试验样品溶解于二甲亚砜中，配制成200、40、8和1.6μg/ml的不同浓度。取部分H9T淋巴细胞用爱滋病毒(HIV-1)进行感染，达到104感染单位/ml。另取等量的H9T淋巴细胞加入同样量的培养基，测定细胞毒活性(IC50)。然后置于37℃和5％CO2中培养4小时，取出，分别洗涤3次，分别加入24孔的平板上，加入不同浓度的试验液，阴性对照组加入等量的培养液，以AZT作阳性对照。然后把平板置37℃和5％CO2中培养4天。收集去除细胞后的上清液作P24抗原检测，通过测定HIV的壳蛋白的数量直接测定HIV的存在，计算EC50值。经上述方法测定，23-羟基白桦酸的IC50值为152μg/ml，EC50值为2.24μg/ml，治疗指数TI50(IC50/EC50)为67.8。
从以上结果，可以得出本发明的优点在于(1).本发明对已知化合物23-羟基白桦酸发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2).本发明的23-羟基白桦酸安全无毒，药理作用强，预示着良好的药用前景。
(3).本发明的物质原料中药白头翁资源丰富、价廉，制备工艺简单。
(4).本发明23-羟基白桦酸可作为活性成分与药学上可接受的赋型剂一起用于制备药物组合物，该药物组合物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂等肠道给药的剂型和注射液等肠外给药剂型，如针剂等。根据剂型的不同，该药物组合物使用的赋型剂也不同，常用赋型剂包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。其中稀释剂为乳糖、淀粉、糊精、微晶纤维素、微粉硅胶等，湿润剂为水和50～85％不同浓度的乙醇。含有本发明23-羟基白桦酸的药物组合物的优选剂型是口服剂，最好为胶囊。给药剂量为20～400mg/人/次，每天1～3次。
下面将描述本发明的实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
具体实施例方式
实施例1称取白头翁根干燥粗粉1.0kg，用3000ml的15％乙醇渗漉，合并乙醇渗漉液，减压回收至无醇味，过滤，滤液用盐酸调至pH2，加热30分钟，得沉淀物，放冷，过滤，水洗，干燥，得粗品。粗品用乙酸乙酯索氏回流，回流液浓缩至适量，放置，抽滤，得23-羟基白桦酸38.2g。
实施例2称取白头翁根干燥粗粉1.0kg，用3000ml的60％乙醇渗漉，合并乙醇渗漉液，减压回收至无醇味，过滤，滤液用盐酸调至pH2，加热30分钟，得沉淀物，放冷，过滤，水洗，干燥，得粗品。粗品用乙酸乙酯索氏回流，回流液浓缩至适量，放置，抽滤，得23-羟基白桦酸51.0g。
实施例3称取白头翁根干燥粗粉1.0kg，用3000ml的95％乙醇渗漉，合并提取液，减压回收至无醇味，过滤，滤液用盐酸调至pH2，加热30分钟，得沉淀物，放冷，过滤，水洗，干燥，得粗品。粗品用乙酸乙酯索氏回流，回流液浓缩至适量，放置，抽滤，得23-羟基白桦酸45.6g。
实施例4取本发明的23-羟基白桦酸20mg和微粉硅胶280mg，充分混合均匀，过筛，加入适量的硬脂酸镁，混匀，用干法造粒机制粒，过筛，筛取40～80目之间的颗粒，装入胶囊，每粒装0.3g。
实施例5按照实施例4所述方法制备胶囊，不同的是使用400mg本发明的23-羟基白桦酸、100mg微粉硅胶和适量的硬脂酸镁，每粒胶囊装0.5g。
实施例6按本技术领域技术人员公知的方法制备23-羟基白桦酸的片剂，其中所述片剂按实际需要制成含20～200mg的23-羟基白桦酸。取本发明的23-羟基白桦酸150g、微粉硅胶420g、无水乳糖380g、氧化硅30g，混合30分钟后，再筛入200g硬脂酸镁，继续混匀，最后用12/32英寸的标准凹冲压成片。
权利要求
1.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防脑神经胶质瘤药物中的应用。
2.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肠道肿瘤药物中的应用。
3.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
4.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
5.23-羟基白桦酸在制备治疗或预防爱滋病药物中的应用。
6.根据权利要求1～5中任一所述的以23-羟基白桦酸作为活性成分的药物组合物。
7.根据权利要求1～4，23-羟基白桦酸可用于制备治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌及肝癌的药物。
8.根据权利要求5，23-羟基白桦酸可用于制备治疗或预防爱滋病的药物。
全文摘要
本发明涉及23－羟基白桦酸在制药领域中的新用途。该物质可作为脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌细胞及HIV病毒的抑制剂；本发明还涉及含有该化合物用于治疗或预防脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌及爱滋病的药物组合物。
文档编号A61P31/00GK1491651SQ0315290
公开日2004年4月28日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者叶文才, 范春林, 赵守训 申请人:叶文才
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