羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜及其制备方法
专利名称：羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多价离子交联的羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜及其制备方法，属于医用材料科学领域。
背景技术：
几乎所有的手术都会发生粘连。手术粘连的比例率达60％～90％。腹腔手术粘连轻者可以造成腹痛，重者可以造成肠梗阻。妇科盆腔手术造成疼痛或不孕。心脏、脑部以及筋腱手术粘连同样会造成严重后遗症。粘连常需要二次手术来清除，但清除后新的粘连可以再次发生。粘连不仅是引起手术患者健康恶化甚至死亡的因素之一，还导致医疗效率的降低和医疗费用的升高。
粘连生成的主因是手术引起组织炎症，降低机体的纤维蛋白溶解功能，使机体内原有的纤维蛋白原凝固←→纤维蛋白溶解平衡向纤维蛋白原凝固方向倾斜，增加了相临机体组织被凝固了的纤维蛋白粘连在一起的可能性。同时，手术过程中渗出的细胞外基质(ECM)会玷污受伤的组织表面，基质中的粘着蛋白就会粘着于组织表面。而粘着蛋白是成纤维母细胞的配体。因此，成纤维母细胞就会通过粘着蛋白的配位而吸附到组织表面上，活化、增生。在相邻组织间发生的纤维母细胞的吸附、活化和增生，导致了粘连。
手术粘连早已引起医学界高度重视。医生们试图通过改进手术程序、施用各种药物，如抗炎药类，抗凝血药类和纤维蛋白消解剂等，来防止或减轻手术粘连。但收效甚微，或由于副作用限制了这些方法的应用。
近年来一种简便的物理屏障法，固体膜屏障或胶体屏障为这一手术中的医疗难题开辟了新的解决途径。在胶体屏障方面曾试用了羧甲基纤维素钠水溶液(Korean Thorac Cardiovasc Surg 2000；33541)，有一定效果。透明质酸钠水溶液(J Invest Surg 1989；2320)也被用于防手术粘连，但其效果不确定(Fertil Steril 1991；56563)，而且价格昂贵。羧甲基壳聚糖水溶胶也被兔模型实验证明具有防手术粘连作用(Surg 1996；120866 & J Invest surg 2001；1493)，但由于其液体状态在体内停留时间较短，易被体液稀释，也不能达到很理想的效果。最早用于防手术粘连的固体屏障是膨化聚四氟乙烯膜(Gore-Tex)。此膜在盆腔手术中具有确定的防粘连效果(Gynecol Oncol1993；48247 & Prog Clin Biol Res 1993；381253)，但其不具有生物可降解性，需二次手术取出。此外，Gore-Tex需被缝合到手术创面上，因而其应用受到限制。由氧化再生纤维素织物制成的防手术粘连膜可以用于盆腔手术的防粘连。该膜目前的问题是遇到血后会变黑变脆，失去作用，施用前必需充分止血。另一种固态膜由碳化二亚胺共价交联羧甲基纤维素和透明质酸钠复合物制成，多数临床研究证明了其有效性(Fertil Steril 1996；66904)。不过该膜还是使用了昂贵的透明质酸钠和采用了相对复杂的共价交连反应，提高了其生产成本和价格。聚乳酸、聚己内酯系列材料虽然具有生物相容性和生物降解性，但由于其缺乏柔软性，做防粘连膜使用有一定困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种可生物降解的多价离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物防手术粘连膜及其制备方法。
所述多价离子交联羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜的具体化学构成是钙、铁离子或钙/铁、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物，是一种新的医用材料。所说的起交联作用的多价离子是二价钙、三价铁离子或二价钙/三价铁、二价钙/三价铝混合离子。
所述防手术粘连膜的特点是生物相容，可生物降解，羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜具有良好的柔曲性，体内停留时间可调，材料来源广泛，制备工艺简单，防粘连效果显著，对手术创伤的恢复有一定促进作用。
本发明的多价离子交联的羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜的制备方法如下注以下各步骤及后面的实施例中涉及的乙醇水溶液(以市售分析纯级无水乙醇或95％乙醇加蒸馏水配制而成)百分浓度均为体积/体积比(v/v)浓度，即每100ml乙醇水溶液中所含乙醇毫升数；羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素以及CaCl2、FeCl3·6H2O和AlCl3·6H2O水溶液的百分浓度均为重量/体积比(w/v)浓度，即每100ml各物质水溶液中所含相应物质的克数；盐酸和氢氧化钠溶液则以克当量浓度N表示，即每1000ml(1L)水中所含有的HCl或NaOH的克当量数。
1、羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的精制目前，我国将医用材料划归医疗器械类管理，因此，防手术粘连膜的理化及生物学性质应参照医药行业标准，制膜所用羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的重金属含量应≤10mg/kg(10ppm)，而市场所售的部分羧甲基壳聚糖的重金属含量超标(按照《中华人民共和国药典》(2000版)规定比色法测定)，不合格的原料可以用下述方法加以精制，直到满足上述标准用纯化水，如蒸馏水、重蒸蒸馏水或医用纯水，和浓盐酸配制0.5～2N的盐酸溶液，向此盐酸溶液中加入无水乙醇或95％乙醇水溶液，配制成乙醇/盐酸溶液体积比为6∶4到8∶2的混合溶液，将待精制羧甲基壳聚糖在此混合溶液中浸泡15～180分钟，过滤，去掉滤液，用50％到75％的乙醇水溶液洗涤上述浸泡过的羧甲基壳聚糖，过滤，弃掉滤液；将羧甲基壳聚糖置于70％～80％的乙醇水溶液中，滴加1～2N NaOH水溶液调解乙醇水溶液的pH值，使其pH值稳定在7～8之间，过滤，弃掉滤液，用70％～80％的乙醇水溶液洗涤羧甲基壳聚糖，于室温、在真空或流动空气条件下干燥。
羧甲基纤维素可以用纯粘胶纤维为原料经羧甲基化制备(参照中国专利ZL 001 03506.1)或市场上购买，对于重金属含量超过10mg/kg(10ppm)的羧甲基纤维素用上述精制羧甲基壳聚糖相同的方法精制。
已满足重金属含量指标及其它制膜要求的羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素原料则不需精制。
2、在温热(25～50℃)和充分搅拌条件下，用纯化水，将取代度为0.6～1.2、重金属含量≤10mg/kg(10ppm)的羧甲基壳聚糖和取代度为0.4～1.2、重金属含量≤10mg/kg(10ppm)的羧甲基纤维素分别配制成1％～5％的羧甲基壳聚糖和2％～5％的羧甲基纤维素水溶液，放置直至充分溶解，过滤除去不溶物，收取滤液。
3、取一定量的上述羧甲基壳聚糖水溶液，或按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比从1∶0.05到1∶2配制羧甲基壳聚糖水溶液和羧甲基纤维素水溶液两种水溶液的混合液，在洁净的平面上刮膜，例如将上述水溶液或混合液涂布到洁净的金属(如不锈钢)、玻璃或树脂等材料表面上，通过调整羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素溶液的浓度(C)和控制刮膜时单位面积上所使用的羧甲基壳聚糖溶液或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合溶液的体积(V)，亦即控制刮膜时所用的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素的实际质量(M＝CV)(例如M＝2～4mg/cm2)，控制干膜的厚度在20～60μm之间，在25～50℃真空或流动空气下干燥成羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜。
4、用纯化水，分别配制1.5％～15％CaCl2，2％～15％FeCl3·6H2O和1％～15％AlCl3·6H2O水溶液，再用上述CaCl2和FeCl3水溶液按Ca++/Fe+++离子当量比从1∶10到10∶1配制CaCl2/FeCl3混合水溶液，用上述CaCl2和AlCl3水溶液按Ca++/Al+++离子当量比从1∶1到20∶1配制CaCl2/AlCl3混合水溶液。
5、将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜在所述CaCl2，FeCl3，CaCl2/FeCl3，或CaCl2/AlCl3中的任何一种水溶液中浸泡15～180分钟取出，用蒸馏水充分冲洗，室温阴干，制得厚度为20～60μm不溶于水的钙离子、铁离子、或钙/铁混合离子、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜。
6、将上述交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜用耐幅射材料，如铝塑膜、PETG聚酯膜或高密度聚乙烯膜，封装后用60Co进行γ射线灭菌。
用上述方法制成的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜可在手术缝合切口前贴在手术创面上，用于防手术粘连。
本发明多价离子交联的羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜的化学构成及作用原理膜的主体成分，羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素分别是甲壳质和纤维素的衍生物。甲壳质和纤维素是自然界中存在最广泛的两种天然多糖。
羧甲基壳聚糖的初始原料是虾蟹的甲壳。首先由这些甲壳提取出甲壳质。甲壳质的结构是多聚N-乙酰基氨基葡萄糖[β-(1，4)-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-葡萄糖]。甲壳质通过在碱性条件下脱去乙酰转化成多聚氨基葡萄糖-即壳聚糖。壳聚糖经碱化再同氯乙酸反应转化成羧甲基壳聚糖。在工业上羧甲基壳聚糖已经可以大量生产，但产品质量不够稳定。由于羧甲基-CH2-COO-带负电荷，羧甲基化的氨基和未被羧甲基化的氨基质子化后(-NH2+OCH2-和-NH3+)带正电荷，因此羧甲基壳聚糖本质上是带两性电荷的高分子电解质。羧甲基壳聚糖同其前体壳聚糖、甲壳质一样，具有很好的生物相容性。其降解产物氨基葡萄糖是生物可吸收的。
羧甲基纤维素的初始原料是天然纤维素。纤维素的结构是多聚葡萄糖[β-(1，4)-2-脱氧-D-葡萄糖]，其羟基经过羧甲基化即生成羧甲基纤维素。羧甲基纤维素也已大批量工业生产。由于羧甲基-CH2-COO-基带负电荷，羧甲基纤维素本质上是带负电荷的高分子电解质。因为它是一种改性多糖，其降解产物小分子葡萄糖是可生物代谢的，因此具有良好的生物相容性和生物降解性。
羧甲基壳聚糖水溶胶已被兔模型实验证明具有防手术粘连作用(Surg1996；120866 & J Invest surg 2001；1493)，但由于其液体状态在体内停留时间较短，易被体液稀释，不能达到很理想的效果。羧甲基壳聚糖分子中的羧甲基(-CH2-COO-)可以同多价金属阳离子发生离子化反应而使其交联成为不溶于水的高分子多糖。本发明用多价金属离子Ca++，Fe+++或Ca++/Fe+++、Ca++/Al+++混合离子将羧甲基壳聚糖进行交联，制成了不溶于水的薄膜，延长了多糖在体内的停留时间，从而达到在创伤恢复期内完全隔离损伤组织，防止粘连的作用。在创伤恢复过程中和恢复以后，通过离子交换作用，膜中的多价金属离子，逐渐被体液中的单价离子Na+和K+所置换，羧甲基壳聚糖重新变成水溶性的胶体和溶液，继续以粘稠的胶体形态起防止术后粘连作用。然后，由于体液稀释和生物降解作用，胶体形态羧甲基壳聚糖逐渐转变成低聚糖溶液，进一步生物降解成低糖，参加机体正常代谢。离子交联羧甲基壳聚糖膜的缺点是柔曲性差，易断裂。Ca++交联膜性能尚可，而用Fe+++离子或Ca++/Fe+++、Ca++/Al+++混合离子交联时，羧甲基壳聚糖膜的韧性较差，制膜过程中膜容易发生断裂，需注意交联膜的干燥速度及从底板上脱膜时膜的干燥程度。
离子交联羧甲基壳聚糖膜的缺点可以用加入羧甲基纤维素组分来克服，为此制备了交联的羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素复合膜。在羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的复合物中，两种多糖衍生物结构中的-CH2-COO-基团都和羧甲基壳聚糖结构中的氨基基团发生静电吸引，构成一复合两性高分子电解质。这一复合物仍然是水溶性的。同羧甲基壳聚糖一样，如果将其直接置入手术部位，它将被组织液和损伤部位的渗出液稀释并带走，因而不能在创伤恢复期间很好地隔离损伤组织，充分有效地起到防粘连的作用。本发明将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物用多价金属离子Ca++，Fe+++或Ca++/Fe+++、Ca++/Al+++混合离子进行离子交联，制成不溶于水的薄膜，延长了多糖复合物在体内的停留时间，从而达到在创伤恢复期内完全隔离损伤组织，防止粘连的作用。同样，在创伤恢复过程中和恢复以后，通过离子交换作用，膜中的多价金属离子，逐渐被体液中的单价离子Na+和K+所置换，多糖复合物重新变成水溶性的胶体和溶液，然后进一步被生物降解成低糖，参加机体正常代谢。羧甲基纤维素的加入增加了膜的韧性和柔曲性，调解羧甲基纤维素在复合物的比例可以调节膜的韧性，即膜中羧甲基纤维素的比例越高，膜的柔韧性越好；调解离子种类和混合离子中离子的配比可以调解膜在体内的离子交换速度，例如钙离子交联膜中钙离子与钠离子的离子交换速度远高于铁离子或钙/铁、钙/铝混合离子交联膜中相应离子或混合离子与钠离子的离子交换速度，因而通过调解离子种类和离子配比可以调解膜在体内的停留时间，从而可以制备适用于不同类型的手术的防粘连膜。
动物实验表明先用羧甲基壳聚糖水溶液或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素水溶液涂敷手术创面及周围可能受伤组织，再将上述复合膜贴在手术创面上，可使膜更容易粘附在创伤组织表面上，防粘连效果更佳。为此目的，所用的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合水溶液需另行灭菌，例如经0.2μm微孔膜过滤除菌，无菌封装。
具体实施例
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖，在40℃和电磁搅拌条件下，用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。静置脱气。
(3)、将上述溶液3×10ml涂到3张洁净的面积为7cm×9cm的PETG聚酯片上，置于生物实验用超净工作台台面上，室温下，通洁净风干燥成膜。
(4)、室温下，配制400ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，100ml浓度为8.1％的FeCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液和100ml浓度为7.25％的AlCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，三种溶液的克离子当量浓度均为0.9；再用上述溶液分别配制100ml CaCl2溶液+100ml FeCl3溶液和100ml CaCl2溶液+100ml AlCl3溶液的两种混合溶液，两种混合溶液中的离子当量比分别是钙/铁＝1∶1和钙/铝＝1∶1；将三张附有羧甲基壳聚糖干燥膜的PETG聚酯片分别放在CaCl2水溶液、CaCl2/FeCl3混合溶液和CaCl2/AlCl3混合溶液中浸泡150分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，为防止膜断裂，半干时起膜，制得3张厚度为38μm不溶于水的钙离子交联的羧甲基壳聚糖膜。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌，即制成了可用于手术的防粘连膜。钙离子交联膜在生理盐水中钙钠离子交换速度较快，适用于术后恢复期较短的手术。钙/铁和钙/铝混合离子交联膜中钙/铁混合离子和钙/铝混合离子同钠离子的离子交换速度较慢，适用于术后恢复期较长的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.59，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶2，1∶1，1∶0.3，1∶0.2，1∶0.15，1∶0.11，1∶0.07，和1∶0.05的比例将两种溶液充分混合，配成8种混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、分别将上述混合液各10ml涂到8张洁净的面积为7cm×9cm的不锈钢薄板上，置于真空干燥箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制500ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，置于搪瓷盘中，将附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的不锈钢薄板在CaCl2水溶液中浸泡120分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得8张厚度为38±1μm不溶于水的钙离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。随着羧甲基纤维素在膜中比例的增加，膜的韧性和柔曲性增加，透明度下降。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌，即制成了可用于手术的防粘连膜。钙离子交联膜在生理盐水中钙钠离子交换速度较快，适用于术后恢复期较短的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.61，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶0.2的比例将两种溶液充分混合，配成混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、将上述混合液10ml涂到洁净的面积为7cm×9cm的PETG聚酯片上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制200ml浓度为8.1％的FeCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，置于搪瓷盘中，将附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的PETG聚酯片在FeCl3水溶液中浸泡60分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得厚度为37μm不溶于水的三价铁离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。三价铁离子交联膜在生理盐水中铁/钠离子交换速度慢，适用于术后恢复期较长的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.48，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶1的比例将两种溶液充分混合，混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、将上述混合液3×10ml分别涂到三片洁净的面积为7cm×9cm的玻璃片上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制300ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液和300ml8.1％的FeCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，两种溶液的克离子当量浓度均为0.9。分别配制150ml CaCl2溶液+50ml FeCl3溶液、100ml CaCl2溶液+100ml FeCl3溶液和50ml CaCl2溶液+150ml FeCl3溶液的三种混和溶液，三种混合溶液的钙/铁离子当量比分别为1∶3、1∶1和3∶1。将三种溶液分别置于三个搪瓷盘中，将三张附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的玻璃片分别放在三种混合溶液中浸泡90分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得三张厚度为37μm不溶于水的钙/铁离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。随着铁离子在混合溶液中比例的增加，膜由浅黄色转变成棕黄色，透明度下降。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。钙/铁离子交联膜在生理盐水中钙、铁离子同钠离子的离子交换速度随混合溶液中铁离子比例的增加而变缓，钙/铁离子交联膜适用于术后恢复期较长的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.63，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶0.5的比例将两种溶液充分混合，混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、将上述混合液5×10ml分别涂到五片洁净的面积为7cm×9cm的玻璃板上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制800ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液和250ml浓度为7.25％的AlCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，两种溶液的克离子当量浓度均为0.9，分别配制200ml CaCl2溶液+10ml AlCl3溶液、200mlCaCl2溶液+20ml AlCl3溶液、150ml CaCl2溶液+30ml FeCl3溶液、150mlCaCl2溶液+50ml AlCl3溶液和100ml CaCl2溶液+100ml AlCl3溶液的五种混和溶液，五种溶液的钙/铝离子当量比分别为20∶1、10∶1、5∶1、3∶1和1∶1，将五种溶液分别置于五个搪瓷盘中，将5张附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的玻璃板分别放在5种混合溶液中浸泡90分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得5张厚度为38μm不溶于水的钙/铝离子交联的羧甲基甲壳胺/羧甲基纤维素多糖膜，铝离子在混合溶液中比例不影响膜的外观。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。钙/铝离子交联膜在生理盐水中钙、铝离子与钠离子的离子交换速度随混合溶液中铝离子比例的增加而急剧变缓，钙/铝离子交联膜适用于术后恢复期从较短到较长的手术。实施例6大鼠防粘连实例本实例动物实验部分在北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室完成。
(1)、取市售取代度为1.0的粉状羧甲基壳聚糖，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量高于10mg/kg(10ppm)，按如下过程精制先用重蒸蒸馏水和浓盐酸配制1N盐酸，然后用无水乙醇和所配制的1N盐酸按体积比7∶3配制乙醇/盐酸溶液150ml，室温下， 将25g待精制羧甲基壳聚糖放在上述乙醇/盐酸溶液中浸泡25min，转移到砂芯过滤器滤杯中，水循环泵抽滤，以5×150ml 50％乙醇水溶液洗涤滤杯中羧甲基壳聚糖五次，抽滤；将羧甲基壳聚糖转移到烧杯中，加入150ml 75％乙醇水溶液搅拌成悬浮液，边搅拌边向该悬浮液中逐滴滴加2N NaOH水溶液，同时用酸度计监测悬浮液的pH值，直到pH值稳定在7.5；再将悬浮液转移到砂芯过滤器滤杯中，抽滤，以3×150ml 75％乙醇水溶液洗涤滤杯中羧甲基壳聚糖三次，将羧甲基壳聚糖置于真空干燥箱中室温下抽真空干燥，得19g精制产品。按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，精制品的重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.60，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶0.05的比例将两种溶液充分混合，配成混合溶液，混合液静置脱气。将混合溶液分成两份，一份用于制膜，制膜过程见本实施例下述步骤(3)-(5)；一份用于制备除菌的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合溶液，过程见本实施例下述步骤(6)。
(3)、将上述混合液5×10ml分别涂到五片洁净的面积为7cm×9cm的PETG聚酯片上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制500ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，置于搪瓷盘中，将附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的五片PETG聚酯片在CaCl2水溶液中浸泡150分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得5张厚度为38μm，不溶于水的钙离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。
(6)、将一份步骤(2)所述的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合水溶液在砂芯过滤器中依次经1.2μ、1.0μ、0.8μ、0.6μ和0.45μ微孔膜，以循环水泵减压过滤，在无菌条件下，将过滤液装入10ml灭菌注射器中，装上Sartorius公司生产的孔径为0.2μ的Minisart微孔除菌膜，推压过滤，得除菌羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合溶液，封装于5ml无菌注射器中，再用已经过60Coγ射线灭菌的铝塑膜将注射器无菌封装。
(7)、取体重为180g-210g的SD大鼠27只，分成两组，对照组16只，实验组11只，以2％戊巴比妥钠按50mg/kg体重计量腹腔注射麻醉，腹部去毛，在腹部正中切口，在距回盲部5cm处，选5cm回肠用干纱布反复磨擦肠管表面成点状出血，对照组大鼠在肠模型做好后，即将回肠复位，逐层缝合，切口涂红酶素眼膏，12小时后给食；实验组大鼠则在肠管擦伤后，立即向受伤肠壁以及周围暴露和被触碰过的肠壁涂抹已除菌的比例为1∶0.05的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素溶液，然后将钙离子交联的组分比为1∶0.05的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防粘连膜剪成略长于肠擦伤处，宽可包绕肠管的长方形，在无菌生理盐水中浸软，包绕擦伤肠段，将肠复位，关腹，余后处理同对照组。14日后处死动物。打开腹腔肉眼观查腹腔粘连情况。粘连程度参照胡建敏(中华实验外科杂志，1989，6(3)，101)和Phillips(Br J Sug，1984，71(7)，537)粘连分级法，分成0-IV级0级无粘连I级与周围组织(网膜、腹膜、肠系膜)有少量疏松粘连(一条粘连带)，易分离，无渗血II级粘连较I级致密(有两条粘连带)，可分离，分离时稍有损伤并渗血III级粘连广泛致密，三条以上或索状粘连带，分离后局部损伤，渗血，无肠梗阻。
IV级广泛、致密、团块状粘连，不可钝性分离，有肠梗阻。
统计学分析粘连统计结果以对照组和实验组样本间X2检验进行比较，检验标准P＜0.05时有显著性差异。
组织病理学分析取回盲部肠管，以10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片5μm，H.E染色，光学显微镜观察创面修复，间皮细胞，成纤维细胞，胶原纤维数量及排列，组织炎症等。
实验结果肉眼观察实验组所使用的防粘连膜在两周内已全部被降解吸收，未发现任何膜的残留物；两组大鼠腹腔粘连分级情况见下表
对两组大鼠粘连情况统计X2检验，P＜0.001，同检验标准(P＜0.05为差异显著)比较，本实验结果显示，实验组同对照组粘连差异非常显著，即膜的防粘连效果非常显著。
组织病理分析，即显微镜观察结果对照组浆膜间皮消失，间质水肿，肉芽肿形成，成纤维细胞增生活跃，可见增生性血管炎。
实验组间质反应较轻，纤维化带较薄且为局部纤维化灶。
组织病理分析结果同样显示了本产品对粘连的抑制作用。
此外，从组织病理分析还可以看出，膜的使用促进了创伤的恢复，具体表现在实验组样品间质反应轻，无对照组所表现的肉芽肿和增生性血管炎，成纤维细胞不活跃。
权利要求
1.一种羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜制备方法，包括下述步骤(1)、在25～50℃和充分搅拌条件下，用纯化水分别将取代度为0.6～1.2、重金属含量≤10mg/kg的羧甲基壳聚糖和取代度为0.4～1.2、重金属含量≤10mg/kg的羧甲基纤维素配制成1％～5％(w/v)的羧甲基壳聚糖和2％～5％(w/v)的羧甲基纤维素水溶液，放置直至充分溶解，过滤除去不溶物，收取滤液；若所述羧甲基壳聚糖和/或羧甲基纤维素的重金属含量高于10mg/kg，可以用下述方法加以精制，直至重金属含量≤10mg/kg后，再配制成上述水溶液用纯化水和浓盐酸配制0.5～2N的盐酸溶液，用所述盐酸溶液和无水乙醇或95％(v/v)乙醇水溶液相混，配制成乙醇/盐酸溶液体积比为6∶4到8∶2的混合溶液，将待精制羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素在此混合溶液中浸泡15～180分钟，过滤，去掉滤液，以50％到75％(v/v)的乙醇水溶液洗涤上述浸泡过的羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素，过滤，弃掉滤液，将羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素置于70％～80％(v/v)的乙醇水溶液中，滴加1～2NNaOH水溶液，调解乙醇水溶液的pH值，使其pH值稳定在7～8之间，过滤，弃掉滤液，用70％～80％(v/v)的乙醇水溶液洗涤羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素，于室温、在真空或流动空气下干燥；(2)、取一定量的上述羧甲基壳聚糖水溶液，或按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比从1∶0.05到1∶2配制上述羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素两种水溶液的混合液，在洁净的平面上刮膜，通过控制刮膜时所用的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素的实际质量，控制干膜的厚度在20～60μm之间，然后于25～50℃，真空或流动空气下干燥成羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜；(3)、用纯化水，分别配制1.5％～15％(w/v)CaCl2，2％～15％(w/v)FeCl3·6H2O和1％～15％(w/v)AlCl3·6H2O水溶液，再用上述CaCl2和FeCl3水溶液按Ca++/Fe+++离子当量比从1∶10到10∶1配制CaCl2/FeCl3混合水溶液，用上述CaCl2和AlCl3水溶液按Ca++/Al+++离子当量比从1∶1到20∶1配制CaCl2/AlCl3混合水溶液；(4)、将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜在所述CaCl2，FeCl3，CaCl2/FeCl3，或CaCl2/AlCl3中的任何一种水溶液或混合水溶液中浸泡15～180分钟取出，用纯化水充分冲洗，室温阴干，获得羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜。
2.根据权利要求1所述的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜制备方法，其特征在于将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜以耐幅射材料封装后用60Co放射源进行γ射线灭菌。
3.根据权利要求1或2所述的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜制备方法，其特征在于所说的混合液刮膜是将上述混合液均匀涂布到洁净的金属、玻璃或树脂等材料表面上。
4.根据权利要求1或2的方法制备的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜，其特征在于所述防手术粘连膜的具体化学构成是钙、铁离子或钙/铁、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物，所说的起交联作用的多价离子是二价钙、三价铁离子或二价钙/三价铁、二价钙/三价铝混合离子。
5.根据权利要求1或2的方法制备的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜，其特征在于所说的防手术粘连膜是生物相容的、可生物吸收的生物医学材料，可以用来防止或减轻外科手术的术后粘连。
全文摘要
本发明涉及一种多价离子交联的羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合防手术粘连膜及其制备方法，属于医用材料科学领域。其制备过程为将羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素分别用纯化水配制成水溶液，过滤，用羧甲基壳聚糖溶液或按比例均匀混合的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素溶液刮膜，干燥后置于多价金属离子Ca
文档编号A61L31/04GK1481907SQ03153650
公开日2004年3月17日 申请日期2003年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者张连仲, 王淑琴, 冯博智 申请人:大连永兴医用材料有限公司
技术领域：
本发明涉及一种多价离子交联的羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜及其制备方法，属于医用材料科学领域。
背景技术：
几乎所有的手术都会发生粘连。手术粘连的比例率达60％～90％。腹腔手术粘连轻者可以造成腹痛，重者可以造成肠梗阻。妇科盆腔手术造成疼痛或不孕。心脏、脑部以及筋腱手术粘连同样会造成严重后遗症。粘连常需要二次手术来清除，但清除后新的粘连可以再次发生。粘连不仅是引起手术患者健康恶化甚至死亡的因素之一，还导致医疗效率的降低和医疗费用的升高。
粘连生成的主因是手术引起组织炎症，降低机体的纤维蛋白溶解功能，使机体内原有的纤维蛋白原凝固←→纤维蛋白溶解平衡向纤维蛋白原凝固方向倾斜，增加了相临机体组织被凝固了的纤维蛋白粘连在一起的可能性。同时，手术过程中渗出的细胞外基质(ECM)会玷污受伤的组织表面，基质中的粘着蛋白就会粘着于组织表面。而粘着蛋白是成纤维母细胞的配体。因此，成纤维母细胞就会通过粘着蛋白的配位而吸附到组织表面上，活化、增生。在相邻组织间发生的纤维母细胞的吸附、活化和增生，导致了粘连。
手术粘连早已引起医学界高度重视。医生们试图通过改进手术程序、施用各种药物，如抗炎药类，抗凝血药类和纤维蛋白消解剂等，来防止或减轻手术粘连。但收效甚微，或由于副作用限制了这些方法的应用。
近年来一种简便的物理屏障法，固体膜屏障或胶体屏障为这一手术中的医疗难题开辟了新的解决途径。在胶体屏障方面曾试用了羧甲基纤维素钠水溶液(Korean Thorac Cardiovasc Surg 2000；33541)，有一定效果。透明质酸钠水溶液(J Invest Surg 1989；2320)也被用于防手术粘连，但其效果不确定(Fertil Steril 1991；56563)，而且价格昂贵。羧甲基壳聚糖水溶胶也被兔模型实验证明具有防手术粘连作用(Surg 1996；120866 & J Invest surg 2001；1493)，但由于其液体状态在体内停留时间较短，易被体液稀释，也不能达到很理想的效果。最早用于防手术粘连的固体屏障是膨化聚四氟乙烯膜(Gore-Tex)。此膜在盆腔手术中具有确定的防粘连效果(Gynecol Oncol1993；48247 & Prog Clin Biol Res 1993；381253)，但其不具有生物可降解性，需二次手术取出。此外，Gore-Tex需被缝合到手术创面上，因而其应用受到限制。由氧化再生纤维素织物制成的防手术粘连膜可以用于盆腔手术的防粘连。该膜目前的问题是遇到血后会变黑变脆，失去作用，施用前必需充分止血。另一种固态膜由碳化二亚胺共价交联羧甲基纤维素和透明质酸钠复合物制成，多数临床研究证明了其有效性(Fertil Steril 1996；66904)。不过该膜还是使用了昂贵的透明质酸钠和采用了相对复杂的共价交连反应，提高了其生产成本和价格。聚乳酸、聚己内酯系列材料虽然具有生物相容性和生物降解性，但由于其缺乏柔软性，做防粘连膜使用有一定困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种可生物降解的多价离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物防手术粘连膜及其制备方法。
所述多价离子交联羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜的具体化学构成是钙、铁离子或钙/铁、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物，是一种新的医用材料。所说的起交联作用的多价离子是二价钙、三价铁离子或二价钙/三价铁、二价钙/三价铝混合离子。
所述防手术粘连膜的特点是生物相容，可生物降解，羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜具有良好的柔曲性，体内停留时间可调，材料来源广泛，制备工艺简单，防粘连效果显著，对手术创伤的恢复有一定促进作用。
本发明的多价离子交联的羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜的制备方法如下注以下各步骤及后面的实施例中涉及的乙醇水溶液(以市售分析纯级无水乙醇或95％乙醇加蒸馏水配制而成)百分浓度均为体积/体积比(v/v)浓度，即每100ml乙醇水溶液中所含乙醇毫升数；羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素以及CaCl2、FeCl3·6H2O和AlCl3·6H2O水溶液的百分浓度均为重量/体积比(w/v)浓度，即每100ml各物质水溶液中所含相应物质的克数；盐酸和氢氧化钠溶液则以克当量浓度N表示，即每1000ml(1L)水中所含有的HCl或NaOH的克当量数。
1、羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的精制目前，我国将医用材料划归医疗器械类管理，因此，防手术粘连膜的理化及生物学性质应参照医药行业标准，制膜所用羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的重金属含量应≤10mg/kg(10ppm)，而市场所售的部分羧甲基壳聚糖的重金属含量超标(按照《中华人民共和国药典》(2000版)规定比色法测定)，不合格的原料可以用下述方法加以精制，直到满足上述标准用纯化水，如蒸馏水、重蒸蒸馏水或医用纯水，和浓盐酸配制0.5～2N的盐酸溶液，向此盐酸溶液中加入无水乙醇或95％乙醇水溶液，配制成乙醇/盐酸溶液体积比为6∶4到8∶2的混合溶液，将待精制羧甲基壳聚糖在此混合溶液中浸泡15～180分钟，过滤，去掉滤液，用50％到75％的乙醇水溶液洗涤上述浸泡过的羧甲基壳聚糖，过滤，弃掉滤液；将羧甲基壳聚糖置于70％～80％的乙醇水溶液中，滴加1～2N NaOH水溶液调解乙醇水溶液的pH值，使其pH值稳定在7～8之间，过滤，弃掉滤液，用70％～80％的乙醇水溶液洗涤羧甲基壳聚糖，于室温、在真空或流动空气条件下干燥。
羧甲基纤维素可以用纯粘胶纤维为原料经羧甲基化制备(参照中国专利ZL 001 03506.1)或市场上购买，对于重金属含量超过10mg/kg(10ppm)的羧甲基纤维素用上述精制羧甲基壳聚糖相同的方法精制。
已满足重金属含量指标及其它制膜要求的羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素原料则不需精制。
2、在温热(25～50℃)和充分搅拌条件下，用纯化水，将取代度为0.6～1.2、重金属含量≤10mg/kg(10ppm)的羧甲基壳聚糖和取代度为0.4～1.2、重金属含量≤10mg/kg(10ppm)的羧甲基纤维素分别配制成1％～5％的羧甲基壳聚糖和2％～5％的羧甲基纤维素水溶液，放置直至充分溶解，过滤除去不溶物，收取滤液。
3、取一定量的上述羧甲基壳聚糖水溶液，或按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比从1∶0.05到1∶2配制羧甲基壳聚糖水溶液和羧甲基纤维素水溶液两种水溶液的混合液，在洁净的平面上刮膜，例如将上述水溶液或混合液涂布到洁净的金属(如不锈钢)、玻璃或树脂等材料表面上，通过调整羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素溶液的浓度(C)和控制刮膜时单位面积上所使用的羧甲基壳聚糖溶液或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合溶液的体积(V)，亦即控制刮膜时所用的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素的实际质量(M＝CV)(例如M＝2～4mg/cm2)，控制干膜的厚度在20～60μm之间，在25～50℃真空或流动空气下干燥成羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜。
4、用纯化水，分别配制1.5％～15％CaCl2，2％～15％FeCl3·6H2O和1％～15％AlCl3·6H2O水溶液，再用上述CaCl2和FeCl3水溶液按Ca++/Fe+++离子当量比从1∶10到10∶1配制CaCl2/FeCl3混合水溶液，用上述CaCl2和AlCl3水溶液按Ca++/Al+++离子当量比从1∶1到20∶1配制CaCl2/AlCl3混合水溶液。
5、将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜在所述CaCl2，FeCl3，CaCl2/FeCl3，或CaCl2/AlCl3中的任何一种水溶液中浸泡15～180分钟取出，用蒸馏水充分冲洗，室温阴干，制得厚度为20～60μm不溶于水的钙离子、铁离子、或钙/铁混合离子、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜。
6、将上述交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜用耐幅射材料，如铝塑膜、PETG聚酯膜或高密度聚乙烯膜，封装后用60Co进行γ射线灭菌。
用上述方法制成的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜可在手术缝合切口前贴在手术创面上，用于防手术粘连。
本发明多价离子交联的羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜的化学构成及作用原理膜的主体成分，羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素分别是甲壳质和纤维素的衍生物。甲壳质和纤维素是自然界中存在最广泛的两种天然多糖。
羧甲基壳聚糖的初始原料是虾蟹的甲壳。首先由这些甲壳提取出甲壳质。甲壳质的结构是多聚N-乙酰基氨基葡萄糖[β-(1，4)-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-葡萄糖]。甲壳质通过在碱性条件下脱去乙酰转化成多聚氨基葡萄糖-即壳聚糖。壳聚糖经碱化再同氯乙酸反应转化成羧甲基壳聚糖。在工业上羧甲基壳聚糖已经可以大量生产，但产品质量不够稳定。由于羧甲基-CH2-COO-带负电荷，羧甲基化的氨基和未被羧甲基化的氨基质子化后(-NH2+OCH2-和-NH3+)带正电荷，因此羧甲基壳聚糖本质上是带两性电荷的高分子电解质。羧甲基壳聚糖同其前体壳聚糖、甲壳质一样，具有很好的生物相容性。其降解产物氨基葡萄糖是生物可吸收的。
羧甲基纤维素的初始原料是天然纤维素。纤维素的结构是多聚葡萄糖[β-(1，4)-2-脱氧-D-葡萄糖]，其羟基经过羧甲基化即生成羧甲基纤维素。羧甲基纤维素也已大批量工业生产。由于羧甲基-CH2-COO-基带负电荷，羧甲基纤维素本质上是带负电荷的高分子电解质。因为它是一种改性多糖，其降解产物小分子葡萄糖是可生物代谢的，因此具有良好的生物相容性和生物降解性。
羧甲基壳聚糖水溶胶已被兔模型实验证明具有防手术粘连作用(Surg1996；120866 & J Invest surg 2001；1493)，但由于其液体状态在体内停留时间较短，易被体液稀释，不能达到很理想的效果。羧甲基壳聚糖分子中的羧甲基(-CH2-COO-)可以同多价金属阳离子发生离子化反应而使其交联成为不溶于水的高分子多糖。本发明用多价金属离子Ca++，Fe+++或Ca++/Fe+++、Ca++/Al+++混合离子将羧甲基壳聚糖进行交联，制成了不溶于水的薄膜，延长了多糖在体内的停留时间，从而达到在创伤恢复期内完全隔离损伤组织，防止粘连的作用。在创伤恢复过程中和恢复以后，通过离子交换作用，膜中的多价金属离子，逐渐被体液中的单价离子Na+和K+所置换，羧甲基壳聚糖重新变成水溶性的胶体和溶液，继续以粘稠的胶体形态起防止术后粘连作用。然后，由于体液稀释和生物降解作用，胶体形态羧甲基壳聚糖逐渐转变成低聚糖溶液，进一步生物降解成低糖，参加机体正常代谢。离子交联羧甲基壳聚糖膜的缺点是柔曲性差，易断裂。Ca++交联膜性能尚可，而用Fe+++离子或Ca++/Fe+++、Ca++/Al+++混合离子交联时，羧甲基壳聚糖膜的韧性较差，制膜过程中膜容易发生断裂，需注意交联膜的干燥速度及从底板上脱膜时膜的干燥程度。
离子交联羧甲基壳聚糖膜的缺点可以用加入羧甲基纤维素组分来克服，为此制备了交联的羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素复合膜。在羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的复合物中，两种多糖衍生物结构中的-CH2-COO-基团都和羧甲基壳聚糖结构中的氨基基团发生静电吸引，构成一复合两性高分子电解质。这一复合物仍然是水溶性的。同羧甲基壳聚糖一样，如果将其直接置入手术部位，它将被组织液和损伤部位的渗出液稀释并带走，因而不能在创伤恢复期间很好地隔离损伤组织，充分有效地起到防粘连的作用。本发明将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物用多价金属离子Ca++，Fe+++或Ca++/Fe+++、Ca++/Al+++混合离子进行离子交联，制成不溶于水的薄膜，延长了多糖复合物在体内的停留时间，从而达到在创伤恢复期内完全隔离损伤组织，防止粘连的作用。同样，在创伤恢复过程中和恢复以后，通过离子交换作用，膜中的多价金属离子，逐渐被体液中的单价离子Na+和K+所置换，多糖复合物重新变成水溶性的胶体和溶液，然后进一步被生物降解成低糖，参加机体正常代谢。羧甲基纤维素的加入增加了膜的韧性和柔曲性，调解羧甲基纤维素在复合物的比例可以调节膜的韧性，即膜中羧甲基纤维素的比例越高，膜的柔韧性越好；调解离子种类和混合离子中离子的配比可以调解膜在体内的离子交换速度，例如钙离子交联膜中钙离子与钠离子的离子交换速度远高于铁离子或钙/铁、钙/铝混合离子交联膜中相应离子或混合离子与钠离子的离子交换速度，因而通过调解离子种类和离子配比可以调解膜在体内的停留时间，从而可以制备适用于不同类型的手术的防粘连膜。
动物实验表明先用羧甲基壳聚糖水溶液或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素水溶液涂敷手术创面及周围可能受伤组织，再将上述复合膜贴在手术创面上，可使膜更容易粘附在创伤组织表面上，防粘连效果更佳。为此目的，所用的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合水溶液需另行灭菌，例如经0.2μm微孔膜过滤除菌，无菌封装。
具体实施例
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖，在40℃和电磁搅拌条件下，用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。静置脱气。
(3)、将上述溶液3×10ml涂到3张洁净的面积为7cm×9cm的PETG聚酯片上，置于生物实验用超净工作台台面上，室温下，通洁净风干燥成膜。
(4)、室温下，配制400ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，100ml浓度为8.1％的FeCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液和100ml浓度为7.25％的AlCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，三种溶液的克离子当量浓度均为0.9；再用上述溶液分别配制100ml CaCl2溶液+100ml FeCl3溶液和100ml CaCl2溶液+100ml AlCl3溶液的两种混合溶液，两种混合溶液中的离子当量比分别是钙/铁＝1∶1和钙/铝＝1∶1；将三张附有羧甲基壳聚糖干燥膜的PETG聚酯片分别放在CaCl2水溶液、CaCl2/FeCl3混合溶液和CaCl2/AlCl3混合溶液中浸泡150分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，为防止膜断裂，半干时起膜，制得3张厚度为38μm不溶于水的钙离子交联的羧甲基壳聚糖膜。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌，即制成了可用于手术的防粘连膜。钙离子交联膜在生理盐水中钙钠离子交换速度较快，适用于术后恢复期较短的手术。钙/铁和钙/铝混合离子交联膜中钙/铁混合离子和钙/铝混合离子同钠离子的离子交换速度较慢，适用于术后恢复期较长的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.59，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶2，1∶1，1∶0.3，1∶0.2，1∶0.15，1∶0.11，1∶0.07，和1∶0.05的比例将两种溶液充分混合，配成8种混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、分别将上述混合液各10ml涂到8张洁净的面积为7cm×9cm的不锈钢薄板上，置于真空干燥箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制500ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，置于搪瓷盘中，将附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的不锈钢薄板在CaCl2水溶液中浸泡120分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得8张厚度为38±1μm不溶于水的钙离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。随着羧甲基纤维素在膜中比例的增加，膜的韧性和柔曲性增加，透明度下降。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌，即制成了可用于手术的防粘连膜。钙离子交联膜在生理盐水中钙钠离子交换速度较快，适用于术后恢复期较短的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.61，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶0.2的比例将两种溶液充分混合，配成混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、将上述混合液10ml涂到洁净的面积为7cm×9cm的PETG聚酯片上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制200ml浓度为8.1％的FeCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，置于搪瓷盘中，将附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的PETG聚酯片在FeCl3水溶液中浸泡60分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得厚度为37μm不溶于水的三价铁离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。三价铁离子交联膜在生理盐水中铁/钠离子交换速度慢，适用于术后恢复期较长的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.48，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶1的比例将两种溶液充分混合，混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、将上述混合液3×10ml分别涂到三片洁净的面积为7cm×9cm的玻璃片上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制300ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液和300ml8.1％的FeCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，两种溶液的克离子当量浓度均为0.9。分别配制150ml CaCl2溶液+50ml FeCl3溶液、100ml CaCl2溶液+100ml FeCl3溶液和50ml CaCl2溶液+150ml FeCl3溶液的三种混和溶液，三种混合溶液的钙/铁离子当量比分别为1∶3、1∶1和3∶1。将三种溶液分别置于三个搪瓷盘中，将三张附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的玻璃片分别放在三种混合溶液中浸泡90分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得三张厚度为37μm不溶于水的钙/铁离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。随着铁离子在混合溶液中比例的增加，膜由浅黄色转变成棕黄色，透明度下降。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。钙/铁离子交联膜在生理盐水中钙、铁离子同钠离子的离子交换速度随混合溶液中铁离子比例的增加而变缓，钙/铁离子交联膜适用于术后恢复期较长的手术。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.63，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶0.5的比例将两种溶液充分混合，混合溶液，将该混合液静置脱气。
(3)、将上述混合液5×10ml分别涂到五片洁净的面积为7cm×9cm的玻璃板上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制800ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液和250ml浓度为7.25％的AlCl3.6H2O(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，两种溶液的克离子当量浓度均为0.9，分别配制200ml CaCl2溶液+10ml AlCl3溶液、200mlCaCl2溶液+20ml AlCl3溶液、150ml CaCl2溶液+30ml FeCl3溶液、150mlCaCl2溶液+50ml AlCl3溶液和100ml CaCl2溶液+100ml AlCl3溶液的五种混和溶液，五种溶液的钙/铝离子当量比分别为20∶1、10∶1、5∶1、3∶1和1∶1，将五种溶液分别置于五个搪瓷盘中，将5张附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的玻璃板分别放在5种混合溶液中浸泡90分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得5张厚度为38μm不溶于水的钙/铝离子交联的羧甲基甲壳胺/羧甲基纤维素多糖膜，铝离子在混合溶液中比例不影响膜的外观。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。钙/铝离子交联膜在生理盐水中钙、铝离子与钠离子的离子交换速度随混合溶液中铝离子比例的增加而急剧变缓，钙/铝离子交联膜适用于术后恢复期从较短到较长的手术。实施例6大鼠防粘连实例本实例动物实验部分在北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室完成。
(1)、取市售取代度为1.0的粉状羧甲基壳聚糖，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量高于10mg/kg(10ppm)，按如下过程精制先用重蒸蒸馏水和浓盐酸配制1N盐酸，然后用无水乙醇和所配制的1N盐酸按体积比7∶3配制乙醇/盐酸溶液150ml，室温下， 将25g待精制羧甲基壳聚糖放在上述乙醇/盐酸溶液中浸泡25min，转移到砂芯过滤器滤杯中，水循环泵抽滤，以5×150ml 50％乙醇水溶液洗涤滤杯中羧甲基壳聚糖五次，抽滤；将羧甲基壳聚糖转移到烧杯中，加入150ml 75％乙醇水溶液搅拌成悬浮液，边搅拌边向该悬浮液中逐滴滴加2N NaOH水溶液，同时用酸度计监测悬浮液的pH值，直到pH值稳定在7.5；再将悬浮液转移到砂芯过滤器滤杯中，抽滤，以3×150ml 75％乙醇水溶液洗涤滤杯中羧甲基壳聚糖三次，将羧甲基壳聚糖置于真空干燥箱中室温下抽真空干燥，得19g精制产品。按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，精制品的重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
羧甲基纤维素由本专利发明人以粘胶纤维无纺布为原料经羧甲基化制成，取代度为0.60，按《中华人民共和国药典》(2000版)规定的比色法测定，其重金属含量低于10mg/kg(10ppm)。
(2)、取上述精制羧甲基壳聚糖和上述羧甲基纤维素，在40℃和电磁搅拌条件下，分别用重蒸蒸馏水配制成2.5％的水溶液，放置过夜，用G2玻璃砂漏斗过滤，收取滤液。按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比为1∶0.05的比例将两种溶液充分混合，配成混合溶液，混合液静置脱气。将混合溶液分成两份，一份用于制膜，制膜过程见本实施例下述步骤(3)-(5)；一份用于制备除菌的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合溶液，过程见本实施例下述步骤(6)。
(3)、将上述混合液5×10ml分别涂到五片洁净的面积为7cm×9cm的PETG聚酯片上，置于真空烘箱中，45℃真空干燥成膜。
(4)、配制500ml浓度为5％的CaCl2(分析纯级)重蒸蒸馏水溶液，置于搪瓷盘中，将附有羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜的五片PETG聚酯片在CaCl2水溶液中浸泡150分钟取出，用蒸馏水冲洗3次，室温阴干，起膜，制得5张厚度为38μm，不溶于水的钙离子交联的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜。
(5)、将上述羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素多糖膜铝塑封装后，用60Co放射源进行γ射线灭菌。
(6)、将一份步骤(2)所述的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合水溶液在砂芯过滤器中依次经1.2μ、1.0μ、0.8μ、0.6μ和0.45μ微孔膜，以循环水泵减压过滤，在无菌条件下，将过滤液装入10ml灭菌注射器中，装上Sartorius公司生产的孔径为0.2μ的Minisart微孔除菌膜，推压过滤，得除菌羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素混合溶液，封装于5ml无菌注射器中，再用已经过60Coγ射线灭菌的铝塑膜将注射器无菌封装。
(7)、取体重为180g-210g的SD大鼠27只，分成两组，对照组16只，实验组11只，以2％戊巴比妥钠按50mg/kg体重计量腹腔注射麻醉，腹部去毛，在腹部正中切口，在距回盲部5cm处，选5cm回肠用干纱布反复磨擦肠管表面成点状出血，对照组大鼠在肠模型做好后，即将回肠复位，逐层缝合，切口涂红酶素眼膏，12小时后给食；实验组大鼠则在肠管擦伤后，立即向受伤肠壁以及周围暴露和被触碰过的肠壁涂抹已除菌的比例为1∶0.05的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素溶液，然后将钙离子交联的组分比为1∶0.05的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防粘连膜剪成略长于肠擦伤处，宽可包绕肠管的长方形，在无菌生理盐水中浸软，包绕擦伤肠段，将肠复位，关腹，余后处理同对照组。14日后处死动物。打开腹腔肉眼观查腹腔粘连情况。粘连程度参照胡建敏(中华实验外科杂志，1989，6(3)，101)和Phillips(Br J Sug，1984，71(7)，537)粘连分级法，分成0-IV级0级无粘连I级与周围组织(网膜、腹膜、肠系膜)有少量疏松粘连(一条粘连带)，易分离，无渗血II级粘连较I级致密(有两条粘连带)，可分离，分离时稍有损伤并渗血III级粘连广泛致密，三条以上或索状粘连带，分离后局部损伤，渗血，无肠梗阻。
IV级广泛、致密、团块状粘连，不可钝性分离，有肠梗阻。
统计学分析粘连统计结果以对照组和实验组样本间X2检验进行比较，检验标准P＜0.05时有显著性差异。
组织病理学分析取回盲部肠管，以10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片5μm，H.E染色，光学显微镜观察创面修复，间皮细胞，成纤维细胞，胶原纤维数量及排列，组织炎症等。
实验结果肉眼观察实验组所使用的防粘连膜在两周内已全部被降解吸收，未发现任何膜的残留物；两组大鼠腹腔粘连分级情况见下表
对两组大鼠粘连情况统计X2检验，P＜0.001，同检验标准(P＜0.05为差异显著)比较，本实验结果显示，实验组同对照组粘连差异非常显著，即膜的防粘连效果非常显著。
组织病理分析，即显微镜观察结果对照组浆膜间皮消失，间质水肿，肉芽肿形成，成纤维细胞增生活跃，可见增生性血管炎。
实验组间质反应较轻，纤维化带较薄且为局部纤维化灶。
组织病理分析结果同样显示了本产品对粘连的抑制作用。
此外，从组织病理分析还可以看出，膜的使用促进了创伤的恢复，具体表现在实验组样品间质反应轻，无对照组所表现的肉芽肿和增生性血管炎，成纤维细胞不活跃。
权利要求
1.一种羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜制备方法，包括下述步骤(1)、在25～50℃和充分搅拌条件下，用纯化水分别将取代度为0.6～1.2、重金属含量≤10mg/kg的羧甲基壳聚糖和取代度为0.4～1.2、重金属含量≤10mg/kg的羧甲基纤维素配制成1％～5％(w/v)的羧甲基壳聚糖和2％～5％(w/v)的羧甲基纤维素水溶液，放置直至充分溶解，过滤除去不溶物，收取滤液；若所述羧甲基壳聚糖和/或羧甲基纤维素的重金属含量高于10mg/kg，可以用下述方法加以精制，直至重金属含量≤10mg/kg后，再配制成上述水溶液用纯化水和浓盐酸配制0.5～2N的盐酸溶液，用所述盐酸溶液和无水乙醇或95％(v/v)乙醇水溶液相混，配制成乙醇/盐酸溶液体积比为6∶4到8∶2的混合溶液，将待精制羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素在此混合溶液中浸泡15～180分钟，过滤，去掉滤液，以50％到75％(v/v)的乙醇水溶液洗涤上述浸泡过的羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素，过滤，弃掉滤液，将羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素置于70％～80％(v/v)的乙醇水溶液中，滴加1～2NNaOH水溶液，调解乙醇水溶液的pH值，使其pH值稳定在7～8之间，过滤，弃掉滤液，用70％～80％(v/v)的乙醇水溶液洗涤羧甲基壳聚糖或羧甲基纤维素，于室温、在真空或流动空气下干燥；(2)、取一定量的上述羧甲基壳聚糖水溶液，或按羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素质量比从1∶0.05到1∶2配制上述羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素两种水溶液的混合液，在洁净的平面上刮膜，通过控制刮膜时所用的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素的实际质量，控制干膜的厚度在20～60μm之间，然后于25～50℃，真空或流动空气下干燥成羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜；(3)、用纯化水，分别配制1.5％～15％(w/v)CaCl2，2％～15％(w/v)FeCl3·6H2O和1％～15％(w/v)AlCl3·6H2O水溶液，再用上述CaCl2和FeCl3水溶液按Ca++/Fe+++离子当量比从1∶10到10∶1配制CaCl2/FeCl3混合水溶液，用上述CaCl2和AlCl3水溶液按Ca++/Al+++离子当量比从1∶1到20∶1配制CaCl2/AlCl3混合水溶液；(4)、将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜在所述CaCl2，FeCl3，CaCl2/FeCl3，或CaCl2/AlCl3中的任何一种水溶液或混合水溶液中浸泡15～180分钟取出，用纯化水充分冲洗，室温阴干，获得羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜。
2.根据权利要求1所述的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜制备方法，其特征在于将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜以耐幅射材料封装后用60Co放射源进行γ射线灭菌。
3.根据权利要求1或2所述的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜制备方法，其特征在于所说的混合液刮膜是将上述混合液均匀涂布到洁净的金属、玻璃或树脂等材料表面上。
4.根据权利要求1或2的方法制备的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜，其特征在于所述防手术粘连膜的具体化学构成是钙、铁离子或钙/铁、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合物，所说的起交联作用的多价离子是二价钙、三价铁离子或二价钙/三价铁、二价钙/三价铝混合离子。
5.根据权利要求1或2的方法制备的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜，其特征在于所说的防手术粘连膜是生物相容的、可生物吸收的生物医学材料，可以用来防止或减轻外科手术的术后粘连。
全文摘要
本发明涉及一种多价离子交联的羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素复合防手术粘连膜及其制备方法，属于医用材料科学领域。其制备过程为将羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素分别用纯化水配制成水溶液，过滤，用羧甲基壳聚糖溶液或按比例均匀混合的羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素溶液刮膜，干燥后置于多价金属离子Ca
文档编号A61L31/04GK1481907SQ03153650
公开日2004年3月17日 申请日期2003年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者张连仲, 王淑琴, 冯博智 申请人:大连永兴医用材料有限公司
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