人干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的应用的制作方法
专利名称：人干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人干扰素α2a的一种新的医药用途，具体地说涉及干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的应用。
背景技术：
干扰素(IFN)是一种对病毒感染和某些肿瘤性疾病有治疗作用的天然蛋白质，治疗病毒性感染中，干扰素是目前公认的首选药物。根据其来源不同，干扰素可分为IFNα，IFNβ，IFNγ及IFNω等多种型别，其中α型干扰素又存在α1b，α2a，α2b等多个亚型。
人α2a型干扰素(IFN-α2a)是由165个氨基酸组成的单链多肽，分子质量为19.219kD，是国际上已经大量生产和广泛应用的抗病毒及抗肿瘤多肽药物。它对不同人体肿瘤有抗增生作用，能抑制病毒核酸密码的转录和分解病毒的RNA核酸，抑制病毒蛋白的合成，可用于治疗乙型、丙型肝炎，艾滋病、白血病，卡波氏肉瘤等多种疾病。具有免疫调节功能，既可促进淋巴细胞CD抗原的表达和某些细胞因子的分泌，还可促进NK、LAK、TIL等免疫细胞发挥杀肿瘤活性，是一种具有多功能细胞因子。
重组人干扰素α2a是采用重组DNA技术生产的一种高稳定性、高纯度、高生物效价的基因工程干扰素，具有广泛抗病毒和免疫调节作用，可通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制受感染细胞内病毒的复制，同时还可以增强NK细胞活性及其它免疫功能的调节作用，有效地遏制病毒的侵袭和控制感染，从而使病情逐步恢复。目前，国内外已有多个厂家生产该产品，可通过市购获得。
本发明中的非典型肺炎是去冬今春在亚洲、北美和欧洲出现的一种急性呼吸道传染病，WHO将其定义为严重急性呼吸系统综合征(Severe acuterespiratory syndrome，SARS)，其病原体为一种新发现的病毒，它为冠状病毒的一个变种，与已知的冠状病毒基因序列的同源性约为60％，但在抗原性上二者没有交叉。所以虽然正常人群存在一定的冠状病毒的抗体阳性率，但对此种病毒却没有保护作用，导致人群的普遍易感。该病主要通过人与人的密切接触和短距离接触传染性飞沫感染，由于该病起病急、传播快、致死率较高，给人民的健康带来很大的威胁。到目前为止，在世界数十个国家已经发现了此病，曾经感染人数达数千人。虽然目前此病已经得到了有效控制，但寻找该病的防治药物，仍是非常必要和重要。
到目前为此，尚无人干扰素α2a用于防治SARS的报道。
发明内容
本发明公开了人干扰素α2a在制备防治非典型肺炎药物中的应用。
本发明中的人干扰素α2a可以为基因工程产品，也可以是从天然生物材料中经分离纯化得到，或经过其它方法获得的产品。
本发明所说的非典型肺炎是指SARS病毒引起的肺炎。
本发明通过实验在细胞水平证明了人干扰素α2a对SARS病毒感染细胞具有明显的保护作用。在实验中首先进行病毒的毒力测定，然后进行干扰素α2a对细胞毒性的测定，最后进行干扰素α2a抗病毒药效测定。实验结果表明，干扰素α2a具有保护宿主细胞，抵抗SARS病毒感染的作用。
到目前为止还没有其它通过实验证实人干扰素α2a对SARS病毒防治有效的药物的报道。
人干扰素α2a制备的防治非典型肺炎的药物的用药途径可以通过注射或粘膜给药，剂型可以为注射剂、喷雾剂或滴鼻剂。
具体实施例方式
人干扰素α2a的抗SARS病毒试验一、试验材料1、细胞非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供。
2、病毒SARS病毒，BJ-01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供，该病毒株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为SARS病毒BJ01 CGMCC NO.0936。
3、培养基DMEM培养基加10％小牛血清。
4、药品及来源人干扰素α2a，沈阳三生制药生产，批号GR020901，9.58×107IU/ml；二、实验的基本条件病毒测定在生物安全三级实验室。
三、病毒毒力测定Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒培养液，37℃，5％CO2温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)，每浓度4孔，用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID50)。经重复试验确定该病毒的TCID50是10-8。
四、人干扰素α2a对细胞毒性的测定Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。人干扰素α2a每个设5个浓度即106、105、104、103、102IU/ml(终浓度)，每浓度4孔。设正常细胞对照。每天观察给药组细胞病变，观察到5天。确定药物的无毒浓度为106IU/ml。
五、人干扰素α2a抗病毒药效测定不同浓度的人干扰素α2a对不同浓度的病毒药效测定。VeroE6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。将最大无毒浓度以下的人干扰素α2a按表1稀释5个浓度，分别加入细胞板中，每孔100μl，37℃ 5％CO2温箱培养24h后，再分别加入不同稀释度的病毒(103、4、5TCID50)，共同培养48～72h，观察细胞病变CPE(细胞病变在25％以下为+，26～50％为++，51～75％为+++，76～100％为++++，正常细胞为-)每个稀释度设4个孔，并设正常细胞对照、最高浓度药物对照和不同稀释度(103、4、5TCID50)的病毒对照，每天观察，待病毒对照出现细胞明显病变时，判定人干扰素α2a抗病毒的效应，试验重复2次，结果见表1。
表1 干扰素α2a对SARS病毒的作用药物浓度CPE组别(IU/ml) 105104103(TCID50)细胞对照 / - - -药物对照 106- - -病毒对照 / ++++ +++++++α2a干扰素106- - -105- - -104+++ -103+++ ++ +102++++ +++ ++TCID50＝10-8用Reed Muench法计算当病毒为1000 TCID50时人干扰素α2a的半数有效浓度IC50为100IU/ml。
以上结果表明，预先以干扰素α2a处理Vero E6细胞，然后再以SARS病毒进行攻击，细胞病变受到明显抑制，其IC50为100IU/ml，表明所测定的人干扰素α2a具有保护宿主细胞，抵抗SARS病毒感染的作用，提示临床可用于SARS病毒感染的防治。
权利要求
1.人干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中的非典型肺炎是指严重急性呼吸系统综合征，即SARS，它由变异的冠状病毒引起。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征是人干扰素α2a通过注射或粘膜给药。
4.根据权利要求3所述的用途，其中人干扰素α2a为粉针剂或喷雾剂或滴鼻剂形式。
全文摘要
本发明公开了人干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的应用。人干扰素α2a具有较强的抗病毒能力，对SARS病毒感染细胞具有明显保护作用。用人干扰素α2a制备的药物具有广阔的市场前景和良好的社会效益。
文档编号A61P11/00GK1589898SQ0315583
公开日2005年3月9日 申请日期2003年8月25日 优先权日2003年8月25日
发明者王京燕, 赵艳红, 纪晓光, 李晓萸, 张敏, 赵京花, 张永祥 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
技术领域：
本发明涉及人干扰素α2a的一种新的医药用途，具体地说涉及干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的应用。
背景技术：
干扰素(IFN)是一种对病毒感染和某些肿瘤性疾病有治疗作用的天然蛋白质，治疗病毒性感染中，干扰素是目前公认的首选药物。根据其来源不同，干扰素可分为IFNα，IFNβ，IFNγ及IFNω等多种型别，其中α型干扰素又存在α1b，α2a，α2b等多个亚型。
人α2a型干扰素(IFN-α2a)是由165个氨基酸组成的单链多肽，分子质量为19.219kD，是国际上已经大量生产和广泛应用的抗病毒及抗肿瘤多肽药物。它对不同人体肿瘤有抗增生作用，能抑制病毒核酸密码的转录和分解病毒的RNA核酸，抑制病毒蛋白的合成，可用于治疗乙型、丙型肝炎，艾滋病、白血病，卡波氏肉瘤等多种疾病。具有免疫调节功能，既可促进淋巴细胞CD抗原的表达和某些细胞因子的分泌，还可促进NK、LAK、TIL等免疫细胞发挥杀肿瘤活性，是一种具有多功能细胞因子。
重组人干扰素α2a是采用重组DNA技术生产的一种高稳定性、高纯度、高生物效价的基因工程干扰素，具有广泛抗病毒和免疫调节作用，可通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制受感染细胞内病毒的复制，同时还可以增强NK细胞活性及其它免疫功能的调节作用，有效地遏制病毒的侵袭和控制感染，从而使病情逐步恢复。目前，国内外已有多个厂家生产该产品，可通过市购获得。
本发明中的非典型肺炎是去冬今春在亚洲、北美和欧洲出现的一种急性呼吸道传染病，WHO将其定义为严重急性呼吸系统综合征(Severe acuterespiratory syndrome，SARS)，其病原体为一种新发现的病毒，它为冠状病毒的一个变种，与已知的冠状病毒基因序列的同源性约为60％，但在抗原性上二者没有交叉。所以虽然正常人群存在一定的冠状病毒的抗体阳性率，但对此种病毒却没有保护作用，导致人群的普遍易感。该病主要通过人与人的密切接触和短距离接触传染性飞沫感染，由于该病起病急、传播快、致死率较高，给人民的健康带来很大的威胁。到目前为止，在世界数十个国家已经发现了此病，曾经感染人数达数千人。虽然目前此病已经得到了有效控制，但寻找该病的防治药物，仍是非常必要和重要。
到目前为此，尚无人干扰素α2a用于防治SARS的报道。
发明内容
本发明公开了人干扰素α2a在制备防治非典型肺炎药物中的应用。
本发明中的人干扰素α2a可以为基因工程产品，也可以是从天然生物材料中经分离纯化得到，或经过其它方法获得的产品。
本发明所说的非典型肺炎是指SARS病毒引起的肺炎。
本发明通过实验在细胞水平证明了人干扰素α2a对SARS病毒感染细胞具有明显的保护作用。在实验中首先进行病毒的毒力测定，然后进行干扰素α2a对细胞毒性的测定，最后进行干扰素α2a抗病毒药效测定。实验结果表明，干扰素α2a具有保护宿主细胞，抵抗SARS病毒感染的作用。
到目前为止还没有其它通过实验证实人干扰素α2a对SARS病毒防治有效的药物的报道。
人干扰素α2a制备的防治非典型肺炎的药物的用药途径可以通过注射或粘膜给药，剂型可以为注射剂、喷雾剂或滴鼻剂。
具体实施例方式
人干扰素α2a的抗SARS病毒试验一、试验材料1、细胞非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供。
2、病毒SARS病毒，BJ-01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供，该病毒株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为SARS病毒BJ01 CGMCC NO.0936。
3、培养基DMEM培养基加10％小牛血清。
4、药品及来源人干扰素α2a，沈阳三生制药生产，批号GR020901，9.58×107IU/ml；二、实验的基本条件病毒测定在生物安全三级实验室。
三、病毒毒力测定Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒培养液，37℃，5％CO2温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)，每浓度4孔，用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID50)。经重复试验确定该病毒的TCID50是10-8。
四、人干扰素α2a对细胞毒性的测定Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。人干扰素α2a每个设5个浓度即106、105、104、103、102IU/ml(终浓度)，每浓度4孔。设正常细胞对照。每天观察给药组细胞病变，观察到5天。确定药物的无毒浓度为106IU/ml。
五、人干扰素α2a抗病毒药效测定不同浓度的人干扰素α2a对不同浓度的病毒药效测定。VeroE6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。将最大无毒浓度以下的人干扰素α2a按表1稀释5个浓度，分别加入细胞板中，每孔100μl，37℃ 5％CO2温箱培养24h后，再分别加入不同稀释度的病毒(103、4、5TCID50)，共同培养48～72h，观察细胞病变CPE(细胞病变在25％以下为+，26～50％为++，51～75％为+++，76～100％为++++，正常细胞为-)每个稀释度设4个孔，并设正常细胞对照、最高浓度药物对照和不同稀释度(103、4、5TCID50)的病毒对照，每天观察，待病毒对照出现细胞明显病变时，判定人干扰素α2a抗病毒的效应，试验重复2次，结果见表1。
表1 干扰素α2a对SARS病毒的作用药物浓度CPE组别(IU/ml) 105104103(TCID50)细胞对照 / - - -药物对照 106- - -病毒对照 / ++++ +++++++α2a干扰素106- - -105- - -104+++ -103+++ ++ +102++++ +++ ++TCID50＝10-8用Reed Muench法计算当病毒为1000 TCID50时人干扰素α2a的半数有效浓度IC50为100IU/ml。
以上结果表明，预先以干扰素α2a处理Vero E6细胞，然后再以SARS病毒进行攻击，细胞病变受到明显抑制，其IC50为100IU/ml，表明所测定的人干扰素α2a具有保护宿主细胞，抵抗SARS病毒感染的作用，提示临床可用于SARS病毒感染的防治。
权利要求
1.人干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中的非典型肺炎是指严重急性呼吸系统综合征，即SARS，它由变异的冠状病毒引起。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征是人干扰素α2a通过注射或粘膜给药。
4.根据权利要求3所述的用途，其中人干扰素α2a为粉针剂或喷雾剂或滴鼻剂形式。
全文摘要
本发明公开了人干扰素α2a在制备非典型肺炎防治药物中的应用。人干扰素α2a具有较强的抗病毒能力，对SARS病毒感染细胞具有明显保护作用。用人干扰素α2a制备的药物具有广阔的市场前景和良好的社会效益。
文档编号A61P11/00GK1589898SQ0315583
公开日2005年3月9日 申请日期2003年8月25日 优先权日2003年8月25日
发明者王京燕, 赵艳红, 纪晓光, 李晓萸, 张敏, 赵京花, 张永祥 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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