柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂及其制备工艺的制作方法
专利名称：柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及柔红霉素或盐酸柔红霉素的制剂，具体说是涉及一种柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂，本发明还涉及该药物的制备工艺。
背景技术：
柔红霉素或盐酸柔红霉素为蒽环类广谱抗肿瘤抗生素，其作用机制主要是通过它嵌入DNA双螺旋中与DNA结合，使其模板发生改变，这种嵌合可导致DNA空间结构的障碍，从而抑制DNA和RNA聚合酶，阻止DNA和RNA的合成。盐酸柔红霉素具有广谱的抗实验性肿瘤的作用，主要用于对常用抗肿瘤药耐药的急性淋巴细胞或粒细胞白血病。对淋巴肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、骨骼肌肉瘤及绒癌等也有一定疗效。虽然盐酸柔红霉素抗瘤谱广，疗效好，但是由静脉注射后毒副作用较大，除有骨髓抑制、胃肠道反应外，并具有心脏毒性，表现为突发性心动过速，呼吸困难，心脏扩大，急性心力衰竭，肺水肿等，严重者可致心力衰竭。临床上还出现蛋白尿、皮疹、脱发等，漏出血管外时可致局部坏死。上述毒副作用严重限制了盐酸柔红霉素的临床应用。
脂质体(Liposome)最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子层小囊称为脂质体。脂质体可分为单室脂质体和多室脂质体。单室脂质体又分为小单室脂质体和大单室脂质体。Bangham和Standish最初发现的就是多室脂质体，它们较易制备，尺寸一般为佳0.5-5微米。小单室脂质体为球形，尺寸一般为佳20-50纳米；大单室脂质体的尺寸为微米数量级。1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体，主要作用机理是将药物粉末或溶液包裹在脂质体双层脂质膜所封闭的水相中或嵌入脂质体双层脂质膜中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。目前用作药物载体的脂质体多为大单室脂质体，粒径一般位于100-1000纳米之间。70年代中后期，人们开始研究将脂质体用作蒽环类抗癌药物，包括盐酸柔红霉素的有效载体，80年代末已有临床实验开始进行，到90年代中期欧美已有脂质体药物上市。这些药物被包裹在特定的脂质体再通过静脉注射进入人体后，临床实验结果表明其毒副作用明显减少，药物半衰期显著延长，但其药效却并不减弱反而得到加强。
目前世界上研制成功并上市的脂质体产品有美国Alza Pharmaceuticals医药公司研制的Doxil和Caelyx，主要用于治疗复发性卵巢癌和AIDS相关的Kaposi’s肉瘤；美国伊兰医药公司(Elan Pharmaceuticals，Inc.)主要用于治疗乳腺癌的MyocetTM。Doxil，Caelyx和MyocetTM的药学活性成分都为阿霉素或盐酸阿霉素，其中Doxil和Caelyx是运用“隐形”(stealth)技术将盐酸阿霉素包裹在脂质体微粒中，同时在每个脂质体微粒表面再包裹上聚乙二醇(PEG)以进一步延长其在体内循环半衰期，它们的半衰期可达55小时。另外美国的APHOIS公司已经成功的将紫杉醇(paclitaxel)和喜树碱(camptothecin)等难溶性药物制成了脂质体制剂并用于乳腺癌的治疗。到目前为止，世界上还只有一只柔红霉素脂质体产品在市场上销售，它就是美国Gilead生产的DaunoXome，主要用于白血病和淋巴瘤的治疗。我国目前尚无自行研制和生产的脂质体盐酸柔红霉素产品在市场上销售，患者只能使用进口产品。本发明不仅添补了我国自行研制和生产盐酸柔红霉素脂质体制剂的空白，而且将使我国在这个产品的研发和生产技术上处于国际先进地位。另外，本发明柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体制剂的制备采用了国产原料，大大降低了其生产成本，使我国癌症患者最终能使用这种药效高且毒副作用低的抗癌新药。
国内外已有的研究结果表明，有三个因素提高盐酸柔红霉素脂质体药效和降低毒副作用有重要的影响。一是脂质体的粒径和均匀度；二是形成脂质体的脂质和脂质体内所包裹药物的化学降解程度；三是脂质体药物中非包裹药物的存在量，也即药物在脂质体中包裹率的控制和非包裹药物的去除技术。到目前为止，解决上述三个因素的工艺条件均不理想。本发明提供的柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂的新配方和制备工艺很好地解决了这三个制备脂质体药物的关键因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好、包裹率高、成本低、毒副作用少的柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂。
本发明另一个目的是提供该注射剂的制备工艺。
本发明的技术方案是根据脂质体的特性，选用特殊比例的磷脂混合物制备包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素的空白脂质体，配方中还加入胆固醇和自由基捕捉剂维生素E来增加柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性，采用pH梯度法促进药物包裹，药物包裹率达97％以上，并通过特殊的加工工艺来控制该制剂注射入人体后柔红霉素从脂质体中释放到人体内的速度，降低了柔红霉素的毒副作用而使其药效增加。
脂质体主要由天然和/或合成磷脂组成，这些磷脂可分为三大类，即中性磷脂，带正电磷脂和带负电磷脂，本发明脂质体制备主要选用中性磷脂。但由于含有磷脂的脂质体的粒径在贮存期间会发生改变而影响其药效，本发明在配方中加入带负电荷的磷脂可使脂质体粒经在贮存期间的变化减小到最低程度。带负电荷磷脂和中性磷脂的比例为0.1∶1-0.4∶1。另外，配方中还加入胆固醇，它使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低了氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。胆固醇和中性磷脂的比例为0.1∶1-1∶1。同时为了进一步降低形成脂质体的磷脂和脂质体所包裹药物的化学降解，配方中还加入了维生素E。维生素E是一种有效的抗氧化剂，被认为是通过与磷脂过氧化自由基反应并猝灭单一态的氧分子和对磷脂的双分子层进行排序(如限制类脂层分子的流动性)等分子机制而发挥其抗氧化作用。维生素E和磷脂的摩尔比例为0.001∶1-0.1∶1。已有的研究结果表明，卵磷脂、饱和大豆磷脂和磷脂酰甘油酯等的水解都受pH值的影响，而且水解产物可以使脂质体混悬液的pH值下降，加速脂质体的进一步水解。这些磷脂成分均在pH6.5时最稳定，水解速度常数最小。因此，本发明在把柔红霉素或盐酸柔红霉素有效地包裹在空白脂质体中后，又将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体置于加入缓冲剂的脂质体分散液中，进一步增强了柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性。
柔红霉素或柔红霉素可采用“离子梯度法”来包裹到空白脂质体中，它通过脂质体双分子脂质层内外离子浓度的差异来使药物更容易被包裹到脂质体中，这些离子包括Na+，K+，Li+，NH4+，H+等，使用H+时的方法被称作“pH梯度法”。本发明将采用“离子梯度法”中效果较好的“pH梯度法”来包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素。该方法通过调节脂质体内外环境的pH差异来使脂质体外的柔红霉素或盐酸柔红霉素较易进入脂质体内，而脂质体内的柔红霉素或盐酸柔红霉素不易释放到脂质体外，从而使药物包裹率很高，一般可达97％以上。具体措施通过将柔红霉素或盐酸柔红霉素在被包裹到空白脂质体时用碱粉沫或碱水溶液来调节空白脂质体脂质双层膜外液相环境中的pH值来增加药物包裹率，药物处于脂质体双层脂质膜所包裹的酸性水溶液中，酸性水溶液由0.01M-0.5M的有机酸制备。脂质体的粒度及均匀度可通过高压均粒机制备，也可通过挤压设备把空白脂质体悬浮液在压力下挤过相应孔径的微孔膜来达到。在包裹药物后通过渗析过滤法然后将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体置于与人体生理环境类似的脂质体分散液中。
空白脂质体的制备可采用薄膜分散法(TFV)，也可用逆相蒸发法(REV)、乙醇注入法来制备。制备过程中确切温度随脂质体组份不同而不同。成品盐酸柔红霉素脂质体的分散液中为增加其在储存期间的稳定性加入了缓冲剂。
本发明的目的可以通过以下措施来为实现一种柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，每1000ml制剂的原料配方为柔红霉素或盐酸柔红霉素500mg～5.0g中性磷脂 500mg～50g负电荷磷脂50mg～20g胆固醇25mg～15.4g抗氧化剂 0.3mg～4.6g有机酸33mg～84g碱28mg～118g糖28g～200g缓冲剂1g～100g注射用水 定容至1000ml同时满足柔红霉素或盐酸柔红霉素和磷脂的摩尔比例为0.05∶1-0.5∶1，带负电荷磷脂和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-0.4∶1，胆固醇和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-1∶1。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中中性磷脂可以是蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)、双硬脂酸卵磷脂(DSPC)、大豆卵磷脂(soy PC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、双软脂酸卵磷脂(DPPC)或双肉豆寇酸卵磷脂(DMPC)。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中带负电荷磷脂可以是双肉豆寇酸磷脂酰甘油(DMPG)、双月桂酸磷脂酰甘油(DLPG)、双软脂酸磷脂酰甘油(DPPG)、双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG)、双肉豆寇酸磷脂酸(DMPA)、双硬脂酸磷脂酸(DSPA)、双月桂酸磷脂酸(DLPA)、双软脂酸磷脂酸(DPPA)、双油酸磷脂酰丝氨酸(DOPS)或双亚油酸磷脂酰肌醇(DLPI)。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中抗氧化剂可以是维生素E，维生素E和磷脂的摩尔比例为0.001∶1-0.1∶1。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中有机酸可以是柠檬酸、琥珀酸、乙酸、草酸、葡萄酸、乳糖酸、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中碱可以是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢钠或氢氧化钠。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中糖为乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或棉白糖。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中缓冲剂可以是左氨酸、组氨酸或缓血酸胺。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其剂型可以是注射液、冻干粉。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂的制备方法，包含下列步骤1)制备空白脂质体根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿或氯仿-甲醇混合溶剂中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中溶剂减压除去，形成脂质薄膜；配制0.01M-0.5M的有机酸溶液，用酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在40℃-70℃之间，得空白脂质体悬浮液；2)均化空白脂质体水化完全后用高压均粒机制备脂质体至所需粒径和均匀度，也可通过挤压设备把空白脂质体悬浮液在压力下挤过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的粒径控制在40-200nm，脂质体粒径和均匀度可用多角度纳米粒子分析器来检测；3)包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素配制碱水溶液或准备碱粉末；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶于无菌水或浓度为3％-15％的糖水溶液，加热到40℃-70℃；用碱水溶液或碱粉末调节空白脂质体悬浮液至碱性；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液混合均匀并在40℃-70℃下保温一段时间；4)纯化和固化脂质体按重量百分比配制浓度为3％-15％的糖水溶液并加入缓冲剂，调节至pH5-pH7，得脂质体的分散液，缓冲剂的含量为0.2％-10％；然后采用脂质体分散液洗涤含柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH5-pH7的脂质体分散液，使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体分散在与人体生理环境类似的糖水溶液中，得柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体；5)定容、除菌、分装、保存用注射用水定容；将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
本发明的优点本发明的脂质体的粒径位于40nm-200nm之间，药物包裹率达97％以上，非包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素含量少，一般小于3％。同时，配方加入胆固醇和抗氧化剂维生素E，使得柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性大大提高。另外，由于柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的生产过程中关键的均粒步骤可由高效的高压均粒机来完成，而且该制剂也可通过冻干制成冻干剂型来保存，这不仅使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性进一步提高，并且使该制剂的工业化生产成为可能。本发明冻干粉在2℃-8℃下的一年稳定性实验结果表明其平均粒径变化率小于8％，药物包裹率的变化率小于5％，显示了本发明柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体制剂优异的稳定性。
本发明的药效学实验结果脂质体盐酸柔红霉素对小鼠P1798淋巴肉瘤的药效实验脂质体盐酸柔红霉素(L-DNR)制剂按实例2制备，浓度为2.0mg/ml的，传统盐酸柔红霉素(F-DNR)制剂由盐酸柔红霉素溶于无菌生理盐水配制，浓度为2.0mg/ml。P1798淋巴肉瘤注入小鼠体内四天后由小鼠尾静脉注入脂质体盐酸柔红霉素(L-DNR)，对照组的小鼠在同样条件下注射传统盐酸柔红霉素(F-DNR)，实验期为90天。传统盐酸柔红霉素(F-DNR)在95％置信限时的LD50为10.36mg/Kg±1.12mg/Kg，脂质体盐酸柔红霉素(L-DNR)在95％置信限时的LD50为19.41mg/Kg±1.34mg/Kg。实验结果表明脂质体盐酸柔红霉素抗小鼠P1798淋巴肉瘤的LD50是传统盐酸柔红霉素的1.87倍。
上述药效实验结果表明脂质体盐酸柔红霉素对P1798淋巴肉瘤的疗效显著优于传统盐酸柔红霉素。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐明，实施例不是对本发明的限制。
实施例1制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素500mg双硬脂酸卵磷脂(DSPC)5.3g
双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG) 1.7g胆固醇1.0g维生素E 7.5mg柠檬酸1150mg无水碳酸钠800mg蔗糖 90g甘氨酸5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.05M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度在60℃-65℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为80nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的蔗糖水溶液，加热到60℃-65℃；用0.5M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温1 0-30分钟；配制9％的蔗糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为0.5mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例2制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 2000mg双硬脂酸卵磷脂(DSPC) 21g双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG) 7g胆固醇 3.8g维生素E30mg柠檬酸 4600mg无水碳酸钠 3200mg
蔗糖 90g甘氨酸 5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.3M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度在60℃-65℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为80nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的蔗糖水溶液，加热到60℃-65℃；用0.5M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的蔗糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为2.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例3制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 1000mg氢化大豆卵磷脂(HSPC) 9g双肉豆寇酸磷脂酰甘油(DMPG)5g胆固醇1.6g维生素E 15mg柠檬酸2300mg无水碳酸钠1600mg乳糖 90g甘氨酸5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于2∶1氯仿-甲醇中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿和甲醇减压除去，形成脂质薄膜；配制0.30M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在65℃±3℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为60nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测，将盐酸柔红霉素溶于9％的乳糖水溶液，加热到60℃-70℃；用0.5M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.3±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的乳糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体的分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为1.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例4制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 2000mg双肉豆寇酸卵磷脂(DMPC)17g双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG) 11g胆固醇3.0mg维生素E 30mg柠檬酸4600mg无水碳酸钠3200mg蔗糖 90g甘氨酸5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.3M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在60℃-65℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为80nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的蔗糖水溶液，加热到60℃-65℃；用2.0M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的蔗糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为2.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例5制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 2000mg双软脂酸卵磷脂(DPPC) 16g蛋黄磷脂酰甘油(EPG)12g胆固醇 2.8g维生素E30mg柠檬酸 4600mg无水碳酸钠 3200mg乳糖 90g甘氨酸 5g注射用水 定容至所需容量制备工艺根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.25M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在50℃-55℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为100nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的乳糖水溶液，加热到50℃-55℃；加入配方量的无水碳酸钠粉末调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在50℃-60℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的乳糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为2.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例6制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素5000mg双软脂酸卵磷脂(DPPC)40g蛋黄磷脂酰甘油(EPG) 30g胆固醇 7.0g维生素E 75mg柠檬酸 11.5mg无水碳酸钠 8.0mg乳糖90g甘氨酸 5g注射用水定容至所需容量制备工艺根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.25M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在50℃-55℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为100nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的乳糖水溶液，加热到50℃-55℃；加入配方量的无水碳酸钠粉末调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在50℃-60℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的乳糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为5.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
权利要求
1.一种柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于每1000ml制剂的原料配方为柔红霉素或盐酸柔红霉素 500mg～5.0g中性磷脂 500mg～50g负电荷磷脂 50mg～20g胆固醇 25mg～15.4g抗氧化剂 0.3mg～4.6g有机酸 33mg～84g碱 28mg～118g糖 28g～200g缓冲剂 1g～100g注射用水 定容至1000ml同时满足柔红霉素或盐酸柔红霉素和磷脂的摩尔比例为0.05∶1-0.5∶1，带负电荷磷脂和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-0.4∶1，胆固醇和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-1∶1。
2.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于制备脂质体的中性磷脂可以是蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双硬脂酸卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、双软脂酸卵磷脂或双肉豆寇酸卵磷脂。
3.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于制备脂质体的带负电荷磷脂可以是双肉豆寇酸磷脂酰甘油、双月桂酸磷脂酰甘油、双软脂酸磷脂酰甘油、双硬脂酸磷脂酰甘油、双肉豆寇酸磷脂酸、双硬脂酸磷脂酸、双月桂酸磷脂酸、双软脂酸磷脂酸、双油酸磷脂酰丝氨酸或双亚油酸磷脂酰肌醇。
4.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于抗氧化剂可以是维生素E，维生素E和磷脂的摩尔比例为0.001∶1-0.1∶1。
5.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于有机酸可以是柠檬酸、琥珀酸、乙酸、草酸、葡萄酸、乳糖酸、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸。
6.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于碱可以是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢钠或氢氧化钠。
7.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于糖为乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或棉白糖。
8.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于缓冲剂可以是甘氨酸、组氨酸或缓血酸胺。
9.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于其剂型可以是注射液、冻干粉。
10.权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂的制备方法，其特征在于包含下列步骤1)制备空白脂质体根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿或氯仿-甲醇混合溶剂中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中溶剂减压除去，形成脂质薄膜；配制0.01M-0.5M的有机酸溶液，用酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在40℃-70℃之间，得空白脂质体悬浮液；2)均化空白脂质体水化完全后用高压均粒机制备脂质体至所需粒径和均匀度，也可通过挤压设备把空白脂质体悬浮液在压力下挤过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的粒径控制在40-200nm，脂质体粒径和均匀度可用多角度纳米粒子分析器来检测；3)包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素配制碱水溶液或准备碱粉末；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶于无菌水或浓度为3％-1 5％的糖水溶液，加热到40℃-70℃；用碱水溶液或碱粉末调节空白脂质体悬浮液至碱性；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液混合均匀并在40℃-70℃下保温一段时间；4)纯化和固化脂质体按重量百分比配制浓度为3％-15％的糖水溶液并加入缓冲剂，调节至pH5-pH7，得脂质体的分散液，缓冲剂的含量为0.2％-10％；然后采用脂质体分散液洗涤含柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH5-pH7的脂质体分散液，使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体分散在与人体生理环境类似的糖水溶液中，得柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体；5)定容、除菌、分装、保存用注射用水定容；将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
全文摘要
本发明公开了一种柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂及其制备工艺。该注射剂由柔红霉素或盐酸柔红霉素、中性磷脂、负电荷磷脂、胆固醇、抗氧化剂、有机酸、碱、糖、缓冲剂、注射用水制备而成，该制备工艺包括制备空白脂质体、均化脂质体、包裹药物、纯化和固化脂质体、定容、除菌、分装、保存等步骤。该注射剂稳定性好、包裹率高、成本低、毒副作用少，该制备工艺简单易行。
文档编号A61K31/7028GK1626100SQ20041004167
公开日2005年6月15日 申请日期2004年8月12日 优先权日2004年8月12日
发明者贺明, 贺欣, 周金鸿 申请人:常州太平洋药物研究所有限公司
技术领域：
本发明涉及柔红霉素或盐酸柔红霉素的制剂，具体说是涉及一种柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂，本发明还涉及该药物的制备工艺。
背景技术：
柔红霉素或盐酸柔红霉素为蒽环类广谱抗肿瘤抗生素，其作用机制主要是通过它嵌入DNA双螺旋中与DNA结合，使其模板发生改变，这种嵌合可导致DNA空间结构的障碍，从而抑制DNA和RNA聚合酶，阻止DNA和RNA的合成。盐酸柔红霉素具有广谱的抗实验性肿瘤的作用，主要用于对常用抗肿瘤药耐药的急性淋巴细胞或粒细胞白血病。对淋巴肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、骨骼肌肉瘤及绒癌等也有一定疗效。虽然盐酸柔红霉素抗瘤谱广，疗效好，但是由静脉注射后毒副作用较大，除有骨髓抑制、胃肠道反应外，并具有心脏毒性，表现为突发性心动过速，呼吸困难，心脏扩大，急性心力衰竭，肺水肿等，严重者可致心力衰竭。临床上还出现蛋白尿、皮疹、脱发等，漏出血管外时可致局部坏死。上述毒副作用严重限制了盐酸柔红霉素的临床应用。
脂质体(Liposome)最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子层小囊称为脂质体。脂质体可分为单室脂质体和多室脂质体。单室脂质体又分为小单室脂质体和大单室脂质体。Bangham和Standish最初发现的就是多室脂质体，它们较易制备，尺寸一般为佳0.5-5微米。小单室脂质体为球形，尺寸一般为佳20-50纳米；大单室脂质体的尺寸为微米数量级。1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体，主要作用机理是将药物粉末或溶液包裹在脂质体双层脂质膜所封闭的水相中或嵌入脂质体双层脂质膜中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。目前用作药物载体的脂质体多为大单室脂质体，粒径一般位于100-1000纳米之间。70年代中后期，人们开始研究将脂质体用作蒽环类抗癌药物，包括盐酸柔红霉素的有效载体，80年代末已有临床实验开始进行，到90年代中期欧美已有脂质体药物上市。这些药物被包裹在特定的脂质体再通过静脉注射进入人体后，临床实验结果表明其毒副作用明显减少，药物半衰期显著延长，但其药效却并不减弱反而得到加强。
目前世界上研制成功并上市的脂质体产品有美国Alza Pharmaceuticals医药公司研制的Doxil和Caelyx，主要用于治疗复发性卵巢癌和AIDS相关的Kaposi’s肉瘤；美国伊兰医药公司(Elan Pharmaceuticals，Inc.)主要用于治疗乳腺癌的MyocetTM。Doxil，Caelyx和MyocetTM的药学活性成分都为阿霉素或盐酸阿霉素，其中Doxil和Caelyx是运用“隐形”(stealth)技术将盐酸阿霉素包裹在脂质体微粒中，同时在每个脂质体微粒表面再包裹上聚乙二醇(PEG)以进一步延长其在体内循环半衰期，它们的半衰期可达55小时。另外美国的APHOIS公司已经成功的将紫杉醇(paclitaxel)和喜树碱(camptothecin)等难溶性药物制成了脂质体制剂并用于乳腺癌的治疗。到目前为止，世界上还只有一只柔红霉素脂质体产品在市场上销售，它就是美国Gilead生产的DaunoXome，主要用于白血病和淋巴瘤的治疗。我国目前尚无自行研制和生产的脂质体盐酸柔红霉素产品在市场上销售，患者只能使用进口产品。本发明不仅添补了我国自行研制和生产盐酸柔红霉素脂质体制剂的空白，而且将使我国在这个产品的研发和生产技术上处于国际先进地位。另外，本发明柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体制剂的制备采用了国产原料，大大降低了其生产成本，使我国癌症患者最终能使用这种药效高且毒副作用低的抗癌新药。
国内外已有的研究结果表明，有三个因素提高盐酸柔红霉素脂质体药效和降低毒副作用有重要的影响。一是脂质体的粒径和均匀度；二是形成脂质体的脂质和脂质体内所包裹药物的化学降解程度；三是脂质体药物中非包裹药物的存在量，也即药物在脂质体中包裹率的控制和非包裹药物的去除技术。到目前为止，解决上述三个因素的工艺条件均不理想。本发明提供的柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂的新配方和制备工艺很好地解决了这三个制备脂质体药物的关键因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好、包裹率高、成本低、毒副作用少的柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂。
本发明另一个目的是提供该注射剂的制备工艺。
本发明的技术方案是根据脂质体的特性，选用特殊比例的磷脂混合物制备包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素的空白脂质体，配方中还加入胆固醇和自由基捕捉剂维生素E来增加柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性，采用pH梯度法促进药物包裹，药物包裹率达97％以上，并通过特殊的加工工艺来控制该制剂注射入人体后柔红霉素从脂质体中释放到人体内的速度，降低了柔红霉素的毒副作用而使其药效增加。
脂质体主要由天然和/或合成磷脂组成，这些磷脂可分为三大类，即中性磷脂，带正电磷脂和带负电磷脂，本发明脂质体制备主要选用中性磷脂。但由于含有磷脂的脂质体的粒径在贮存期间会发生改变而影响其药效，本发明在配方中加入带负电荷的磷脂可使脂质体粒经在贮存期间的变化减小到最低程度。带负电荷磷脂和中性磷脂的比例为0.1∶1-0.4∶1。另外，配方中还加入胆固醇，它使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低了氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。胆固醇和中性磷脂的比例为0.1∶1-1∶1。同时为了进一步降低形成脂质体的磷脂和脂质体所包裹药物的化学降解，配方中还加入了维生素E。维生素E是一种有效的抗氧化剂，被认为是通过与磷脂过氧化自由基反应并猝灭单一态的氧分子和对磷脂的双分子层进行排序(如限制类脂层分子的流动性)等分子机制而发挥其抗氧化作用。维生素E和磷脂的摩尔比例为0.001∶1-0.1∶1。已有的研究结果表明，卵磷脂、饱和大豆磷脂和磷脂酰甘油酯等的水解都受pH值的影响，而且水解产物可以使脂质体混悬液的pH值下降，加速脂质体的进一步水解。这些磷脂成分均在pH6.5时最稳定，水解速度常数最小。因此，本发明在把柔红霉素或盐酸柔红霉素有效地包裹在空白脂质体中后，又将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体置于加入缓冲剂的脂质体分散液中，进一步增强了柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性。
柔红霉素或柔红霉素可采用“离子梯度法”来包裹到空白脂质体中，它通过脂质体双分子脂质层内外离子浓度的差异来使药物更容易被包裹到脂质体中，这些离子包括Na+，K+，Li+，NH4+，H+等，使用H+时的方法被称作“pH梯度法”。本发明将采用“离子梯度法”中效果较好的“pH梯度法”来包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素。该方法通过调节脂质体内外环境的pH差异来使脂质体外的柔红霉素或盐酸柔红霉素较易进入脂质体内，而脂质体内的柔红霉素或盐酸柔红霉素不易释放到脂质体外，从而使药物包裹率很高，一般可达97％以上。具体措施通过将柔红霉素或盐酸柔红霉素在被包裹到空白脂质体时用碱粉沫或碱水溶液来调节空白脂质体脂质双层膜外液相环境中的pH值来增加药物包裹率，药物处于脂质体双层脂质膜所包裹的酸性水溶液中，酸性水溶液由0.01M-0.5M的有机酸制备。脂质体的粒度及均匀度可通过高压均粒机制备，也可通过挤压设备把空白脂质体悬浮液在压力下挤过相应孔径的微孔膜来达到。在包裹药物后通过渗析过滤法然后将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体置于与人体生理环境类似的脂质体分散液中。
空白脂质体的制备可采用薄膜分散法(TFV)，也可用逆相蒸发法(REV)、乙醇注入法来制备。制备过程中确切温度随脂质体组份不同而不同。成品盐酸柔红霉素脂质体的分散液中为增加其在储存期间的稳定性加入了缓冲剂。
本发明的目的可以通过以下措施来为实现一种柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，每1000ml制剂的原料配方为柔红霉素或盐酸柔红霉素500mg～5.0g中性磷脂 500mg～50g负电荷磷脂50mg～20g胆固醇25mg～15.4g抗氧化剂 0.3mg～4.6g有机酸33mg～84g碱28mg～118g糖28g～200g缓冲剂1g～100g注射用水 定容至1000ml同时满足柔红霉素或盐酸柔红霉素和磷脂的摩尔比例为0.05∶1-0.5∶1，带负电荷磷脂和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-0.4∶1，胆固醇和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-1∶1。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中中性磷脂可以是蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)、双硬脂酸卵磷脂(DSPC)、大豆卵磷脂(soy PC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、双软脂酸卵磷脂(DPPC)或双肉豆寇酸卵磷脂(DMPC)。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中带负电荷磷脂可以是双肉豆寇酸磷脂酰甘油(DMPG)、双月桂酸磷脂酰甘油(DLPG)、双软脂酸磷脂酰甘油(DPPG)、双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG)、双肉豆寇酸磷脂酸(DMPA)、双硬脂酸磷脂酸(DSPA)、双月桂酸磷脂酸(DLPA)、双软脂酸磷脂酸(DPPA)、双油酸磷脂酰丝氨酸(DOPS)或双亚油酸磷脂酰肌醇(DLPI)。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中抗氧化剂可以是维生素E，维生素E和磷脂的摩尔比例为0.001∶1-0.1∶1。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中有机酸可以是柠檬酸、琥珀酸、乙酸、草酸、葡萄酸、乳糖酸、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中碱可以是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢钠或氢氧化钠。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中糖为乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或棉白糖。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其中缓冲剂可以是左氨酸、组氨酸或缓血酸胺。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其剂型可以是注射液、冻干粉。
所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂的制备方法，包含下列步骤1)制备空白脂质体根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿或氯仿-甲醇混合溶剂中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中溶剂减压除去，形成脂质薄膜；配制0.01M-0.5M的有机酸溶液，用酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在40℃-70℃之间，得空白脂质体悬浮液；2)均化空白脂质体水化完全后用高压均粒机制备脂质体至所需粒径和均匀度，也可通过挤压设备把空白脂质体悬浮液在压力下挤过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的粒径控制在40-200nm，脂质体粒径和均匀度可用多角度纳米粒子分析器来检测；3)包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素配制碱水溶液或准备碱粉末；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶于无菌水或浓度为3％-15％的糖水溶液，加热到40℃-70℃；用碱水溶液或碱粉末调节空白脂质体悬浮液至碱性；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液混合均匀并在40℃-70℃下保温一段时间；4)纯化和固化脂质体按重量百分比配制浓度为3％-15％的糖水溶液并加入缓冲剂，调节至pH5-pH7，得脂质体的分散液，缓冲剂的含量为0.2％-10％；然后采用脂质体分散液洗涤含柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH5-pH7的脂质体分散液，使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体分散在与人体生理环境类似的糖水溶液中，得柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体；5)定容、除菌、分装、保存用注射用水定容；将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
本发明的优点本发明的脂质体的粒径位于40nm-200nm之间，药物包裹率达97％以上，非包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素含量少，一般小于3％。同时，配方加入胆固醇和抗氧化剂维生素E，使得柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性大大提高。另外，由于柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的生产过程中关键的均粒步骤可由高效的高压均粒机来完成，而且该制剂也可通过冻干制成冻干剂型来保存，这不仅使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体的稳定性进一步提高，并且使该制剂的工业化生产成为可能。本发明冻干粉在2℃-8℃下的一年稳定性实验结果表明其平均粒径变化率小于8％，药物包裹率的变化率小于5％，显示了本发明柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体制剂优异的稳定性。
本发明的药效学实验结果脂质体盐酸柔红霉素对小鼠P1798淋巴肉瘤的药效实验脂质体盐酸柔红霉素(L-DNR)制剂按实例2制备，浓度为2.0mg/ml的，传统盐酸柔红霉素(F-DNR)制剂由盐酸柔红霉素溶于无菌生理盐水配制，浓度为2.0mg/ml。P1798淋巴肉瘤注入小鼠体内四天后由小鼠尾静脉注入脂质体盐酸柔红霉素(L-DNR)，对照组的小鼠在同样条件下注射传统盐酸柔红霉素(F-DNR)，实验期为90天。传统盐酸柔红霉素(F-DNR)在95％置信限时的LD50为10.36mg/Kg±1.12mg/Kg，脂质体盐酸柔红霉素(L-DNR)在95％置信限时的LD50为19.41mg/Kg±1.34mg/Kg。实验结果表明脂质体盐酸柔红霉素抗小鼠P1798淋巴肉瘤的LD50是传统盐酸柔红霉素的1.87倍。
上述药效实验结果表明脂质体盐酸柔红霉素对P1798淋巴肉瘤的疗效显著优于传统盐酸柔红霉素。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐明，实施例不是对本发明的限制。
实施例1制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素500mg双硬脂酸卵磷脂(DSPC)5.3g
双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG) 1.7g胆固醇1.0g维生素E 7.5mg柠檬酸1150mg无水碳酸钠800mg蔗糖 90g甘氨酸5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.05M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度在60℃-65℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为80nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的蔗糖水溶液，加热到60℃-65℃；用0.5M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温1 0-30分钟；配制9％的蔗糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为0.5mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例2制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 2000mg双硬脂酸卵磷脂(DSPC) 21g双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG) 7g胆固醇 3.8g维生素E30mg柠檬酸 4600mg无水碳酸钠 3200mg
蔗糖 90g甘氨酸 5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.3M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度在60℃-65℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为80nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的蔗糖水溶液，加热到60℃-65℃；用0.5M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的蔗糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为2.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例3制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 1000mg氢化大豆卵磷脂(HSPC) 9g双肉豆寇酸磷脂酰甘油(DMPG)5g胆固醇1.6g维生素E 15mg柠檬酸2300mg无水碳酸钠1600mg乳糖 90g甘氨酸5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于2∶1氯仿-甲醇中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿和甲醇减压除去，形成脂质薄膜；配制0.30M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在65℃±3℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为60nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测，将盐酸柔红霉素溶于9％的乳糖水溶液，加热到60℃-70℃；用0.5M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.3±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的乳糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体的分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为1.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例4制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 2000mg双肉豆寇酸卵磷脂(DMPC)17g双硬脂酸磷脂酰甘油(DSPG) 11g胆固醇3.0mg维生素E 30mg柠檬酸4600mg无水碳酸钠3200mg蔗糖 90g甘氨酸5g注射用水 定容至所需容量制剂工艺如下根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.3M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在60℃-65℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为80nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的蔗糖水溶液，加热到60℃-65℃；用2.0M的无水碳酸钠水溶液调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在60℃-70℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的蔗糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为2.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例5制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素 2000mg双软脂酸卵磷脂(DPPC) 16g蛋黄磷脂酰甘油(EPG)12g胆固醇 2.8g维生素E30mg柠檬酸 4600mg无水碳酸钠 3200mg乳糖 90g甘氨酸 5g注射用水 定容至所需容量制备工艺根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.25M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在50℃-55℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为100nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的乳糖水溶液，加热到50℃-55℃；加入配方量的无水碳酸钠粉末调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在50℃-60℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的乳糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为2.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
实施例6制剂处方(1000ml容量)盐酸柔红霉素5000mg双软脂酸卵磷脂(DPPC)40g蛋黄磷脂酰甘油(EPG) 30g胆固醇 7.0g维生素E 75mg柠檬酸 11.5mg无水碳酸钠 8.0mg乳糖90g甘氨酸 5g注射用水定容至所需容量制备工艺根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压除去，形成脂质薄膜；配制0.25M的柠檬酸溶液，用柠檬酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在50℃-55℃之间，得空白脂质体悬浮液；水化完全后用高压均粒机制备脂质体至平均粒径为100nm，脂质体粒径和均匀度用多角度纳米粒子分析器来检测；将盐酸柔红霉素溶于9％的乳糖水溶液，加热到50℃-55℃；加入配方量的无水碳酸钠粉末调节空白脂质体悬浮液pH为7.5±0.3；将盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液在50℃-60℃混合均匀并保温10-30分钟；配制9％的乳糖水溶液并加入0.5％的甘氨酸，得脂质体分散液；采用脂质体分散液洗涤含盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH为5.0-6.0的脂质体分散液，用注射用水定容并调节至盐酸柔红霉素的浓度为5.0mg/ml溶液，将盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
权利要求
1.一种柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于每1000ml制剂的原料配方为柔红霉素或盐酸柔红霉素 500mg～5.0g中性磷脂 500mg～50g负电荷磷脂 50mg～20g胆固醇 25mg～15.4g抗氧化剂 0.3mg～4.6g有机酸 33mg～84g碱 28mg～118g糖 28g～200g缓冲剂 1g～100g注射用水 定容至1000ml同时满足柔红霉素或盐酸柔红霉素和磷脂的摩尔比例为0.05∶1-0.5∶1，带负电荷磷脂和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-0.4∶1，胆固醇和中性磷脂的摩尔比例为0.1∶1-1∶1。
2.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于制备脂质体的中性磷脂可以是蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双硬脂酸卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、双软脂酸卵磷脂或双肉豆寇酸卵磷脂。
3.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于制备脂质体的带负电荷磷脂可以是双肉豆寇酸磷脂酰甘油、双月桂酸磷脂酰甘油、双软脂酸磷脂酰甘油、双硬脂酸磷脂酰甘油、双肉豆寇酸磷脂酸、双硬脂酸磷脂酸、双月桂酸磷脂酸、双软脂酸磷脂酸、双油酸磷脂酰丝氨酸或双亚油酸磷脂酰肌醇。
4.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于抗氧化剂可以是维生素E，维生素E和磷脂的摩尔比例为0.001∶1-0.1∶1。
5.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于有机酸可以是柠檬酸、琥珀酸、乙酸、草酸、葡萄酸、乳糖酸、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸。
6.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于碱可以是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢钠或氢氧化钠。
7.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于糖为乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或棉白糖。
8.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于缓冲剂可以是甘氨酸、组氨酸或缓血酸胺。
9.根据权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂，其特征在于其剂型可以是注射液、冻干粉。
10.权利要求1所述的柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体注射剂的制备方法，其特征在于包含下列步骤1)制备空白脂质体根据配方选用磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿或氯仿-甲醇混合溶剂中混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中溶剂减压除去，形成脂质薄膜；配制0.01M-0.5M的有机酸溶液，用酸溶液来水化脂质薄膜，水化温度一般在40℃-70℃之间，得空白脂质体悬浮液；2)均化空白脂质体水化完全后用高压均粒机制备脂质体至所需粒径和均匀度，也可通过挤压设备把空白脂质体悬浮液在压力下挤过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的粒径控制在40-200nm，脂质体粒径和均匀度可用多角度纳米粒子分析器来检测；3)包裹柔红霉素或盐酸柔红霉素配制碱水溶液或准备碱粉末；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶于无菌水或浓度为3％-1 5％的糖水溶液，加热到40℃-70℃；用碱水溶液或碱粉末调节空白脂质体悬浮液至碱性；将柔红霉素或盐酸柔红霉素溶液和碱性空白脂质体悬浮液混合均匀并在40℃-70℃下保温一段时间；4)纯化和固化脂质体按重量百分比配制浓度为3％-15％的糖水溶液并加入缓冲剂，调节至pH5-pH7，得脂质体的分散液，缓冲剂的含量为0.2％-10％；然后采用脂质体分散液洗涤含柔红霉素或盐酸柔红霉素的脂质体，利用渗析过滤法使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体外溶液置换为pH5-pH7的脂质体分散液，使柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体分散在与人体生理环境类似的糖水溶液中，得柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体；5)定容、除菌、分装、保存用注射用水定容；将柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体悬浮液用微孔膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2℃-8℃下保存或冻干保存至使用。
全文摘要
本发明公开了一种柔红霉素或盐酸柔红霉素脂质体注射剂及其制备工艺。该注射剂由柔红霉素或盐酸柔红霉素、中性磷脂、负电荷磷脂、胆固醇、抗氧化剂、有机酸、碱、糖、缓冲剂、注射用水制备而成，该制备工艺包括制备空白脂质体、均化脂质体、包裹药物、纯化和固化脂质体、定容、除菌、分装、保存等步骤。该注射剂稳定性好、包裹率高、成本低、毒副作用少，该制备工艺简单易行。
文档编号A61K31/7028GK1626100SQ20041004167
公开日2005年6月15日 申请日期2004年8月12日 优先权日2004年8月12日
发明者贺明, 贺欣, 周金鸿 申请人:常州太平洋药物研究所有限公司
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