复合粒子和包覆复合粒子的制作方法
专利名称：复合粒子和包覆复合粒子的制作方法
技术领域：
本发明涉及复合粒子和包覆复合粒子以及它们的制备方法。
背景技术：
迄今，在药品、食品、农药、动物用药等中，关于包覆粒子的制备方法已公开了很多技术。粒子(被包覆的粒子)用包覆层包覆，是由于例如抑制了所受来自外部因素的影响，因此，为了使其选择性地接受外部因素的影响，以此作为引发器(扳机)引起粒子的变化等，而向粒子赋予功能为目的而进行的。
然而，在例如将小型粒子用包覆层包覆的场合，粒子彼此由于粒子间的范得华力或静电力、来自包覆层成分或液滴的交联的力等而凝聚，往往得到不是理想大小的包覆粒子。作为不是理想大小的包覆粒子，例如可列举出在例如经肺给药用微粒或静脉注射用微粒中，具有或是容易使气管或血管阻塞的大小、或是容易因机体的异物排除作用而被排泄的大小的包覆粒子等。
另一方面，作为核酸向细胞内的送达手段，已知有使用阳离子脂质体或阳离子聚合物的方法。但是，该方法中，在将含有核酸的阳离子脂质体或阳离子聚合物注射到静脉内之后，核酸被从血液中快速去除，在靶组织为肝脏和肺以外的场合，例如在肿瘤部位等的场合，不能把核酸送达至靶组织，从而不能充分发挥其应有的作用。因此，曾报导了一种可以解决核酸在血中被快速去除的问题的核酸封入脂质体(将核酸封入在脂质体内的脂质体)(参见特表2002-508765号公报、特表2002-501511号公报、Biochimica et Biophysica Acta，2001年，第1510卷，p.152-166和专利文献1)。在特表2002-508765号公报中，报导了用于制备含有核酸等粒子的方法，作为这种方法，例如将阳离子型脂质预先溶解于氯仿中，接着加入寡脱氧核苷酸(ODN)的水溶液和甲醇并混合后，经过离心分离，使阳离子型脂质/ODN的复合体转移至氯仿层，进而取出该氯仿层，向其中加入聚乙二醇衍生化磷脂、中性的脂质和水，形成油包水型(W/O)乳液，采用逆相蒸发法进行处理，从而制备ODN内包脂质体的方法；在特表2002-501511号公报和Biochimica et Biophysica Act中曾报告将ODN溶解于pH3.8的柠檬酸水溶液中，加入脂质(乙醇中)，将乙醇浓度降低至20vol％，从而配制成包封ODN的脂质体，进行粒度分级过滤，采用透析法除去过剩的乙醇后，将试样进一步在pH7.5下进行透析，除去附着在脂质体表面上的ODN，从而制备包封ODN的脂质体的方法，分别制成了封入各种核酸等有效成分的脂质体。
与此相对，在专利文献1中，曾报导采用在液体中用脂质膜包覆微粒的方法来制备封入了核酸等有效成分的脂质体。在该方法中，通过使微粒分散、并且使极性有机溶剂在溶解有脂质的含极性有机溶剂的水溶液中的比例减少，使微粒被脂质膜包覆，在液体中进行包覆，可以非常高效率地制备例如适于静脉注射用的微粒等那样大小的包覆微粒，另外，该专利文献1中还举出作为微粒例子的药物复合体。该药物复合体是导引(リ一ド)粒子(与下述的介导粒子的含义相同)与药物的复合粒子。包覆了该复合粒子的包覆复合粒子的粒径，根据所包覆的复合粒子而不同，据报告，包覆使ODN附着在作为介导粒子的阳离子脂质体上而制得的复合粒子而得到的包覆复合粒子，其粒径小，可以作为注射剂使用，该包覆复合粒子在静脉内给药的场合，显示出高的血中滞留性，较多地聚集在肿瘤组织中。
另一方面，近年来，siRNA作为药效比反义药物更好的药剂而引人注目[参见Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，2002年，第296卷，p.1000-1004]。迄今为止，关于siRNA在血中的动态虽还没有充分的报导，但可以预料，siRNA与反义药物相同，从血中快速消失而不转移至靶组织，因此，为了提高药物向靶组织的转移性，人们希望开发出某种载体[参见Biochimica et Biophysica Acta，1996年，第1281卷，p.139-149；J.Controlled Release，1996年，第41卷，p.121-130]。
专利文献1国际公开第02/28367号小册子发明内容发明要解决的课题本发明的目的在于提供一种药物附着在介导粒子上的复合粒子的凝聚抑制方法及其制备方法等。另外，本发明的目的还在于提供凝聚被抑制的复合粒子由包覆层包覆的包覆复合粒子的制备方法、能够采用该制备方法制备的包覆复合粒子等。
解决课题的手段本发明涉及以下的(1)～(47)。
(1)复合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子中，使该介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(2)上述(1)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。
(3)上述(1)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(4)上述(1)～(3)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物分散或者溶解而被含有，使药物附着在该介导粒子上而得到的。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物借助静电附着在介导粒子上而形成的。
(6)上述(1)～(5)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
(7)上述(1)～(6)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
(8)上述(1)～(7)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，药物为核酸。
(9)上述(8)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
(10)上述(1)～(9)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子为由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子。
(11)上述(10)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使药物和附着竞争剂附着在该介导粒子上而得到的。
(12)上述(10)或者(11)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物和附着竞争剂借助静电附着在介导粒子上而形成的。
(13)上述(10)～(12)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
(14)上述(10)～(12)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素(ケタラン硫酸)以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
(15)复合粒子的凝聚抑制剂，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(16)上述(15)所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
(17)上述(15)所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(18)复合粒子的制备方法，该复合粒子是由作为药物的核酸附着在介导粒子上而形成的，其中包括在含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂的介导粒子的分散液中，使作为药物的该核酸分散或者溶解而被含有，使作为药物的该核酸附着在该介导粒子上的步骤。
(19)复合粒子的制备方法，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中包括在含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂的介导粒子的分散液中，通过使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤。
(20)上述(19)所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
(21)上述(19)所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
(22)上述(19)～(21)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，药物是核酸。
(23)上述(18)或者(22)所述的复合粒子的制备方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
(24)上述(18)～(23)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
(25)上述(18)～(23)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(26)上述(18)～(25)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
(27)上述(18)～(25)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
(28)按照上述(18)～(27)中任一项所述的复合粒子的制备方法制备的复合粒子。
(29)复合粒子，其中含有介导粒子以及附着在该介导粒子上的作为药物的核酸；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(30)复合粒子，其中含有介导粒子、附着在该介导粒子上的药物、以及附着在该介导粒子上的附着竞争剂；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(31)上述(30)所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
(32)上述(30)所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
(33)上述(30)～(32)中任一项所述的复合粒子，其中，药物为核酸。
(34)上述(29)或者(33)所述的复合粒子，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
(35)上述(29)～(34)中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
(36)上述(29)～(34)中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(37)上述(29)～(36)中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
(38)上述(29)～(36)中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
(39)包覆复合粒子的制备方法，包括配制含有极性有机溶剂的液体(A液)的步骤，其中分散有上述(28)～(38)中任一项所述的复合粒子并且溶解有包覆层成分；然后，通过使A液中的极性有机溶剂的比例减少，使复合粒子被由包覆层成分构成的包覆层包覆的步骤。
(40)上述(39)所述的包覆复合粒子的制备方法，配制A液的步骤包括配制含有极性有机溶剂的液体(B液)的步骤，其中分散有上述(28)～(38)中任一项所述的复合粒子；配制将包覆层成分溶解于溶剂中而形成的液体(C液)的步骤，该溶剂中含有与B液中的极性有机溶剂相同或者不同的极性有机溶剂；以及，将B液与C液混合的步骤。
(41)上述(39)或者(40)所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层为脂质膜。
(42)上述(41)所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层含有水溶性高分子衍生物。
(43)按照上述(39)～(42)中任一项所述的包覆复合粒子的制备方法制备的包覆复合粒子。
(44)包覆复合粒子，由上述(28)～(38)中任一项所述的复合粒子以及包覆该复合粒子的包覆层构成，其中，构成该包覆层的包覆层成分是这样一种成分，即，在含有极性溶剂的溶剂中，当极性溶剂的浓度相对提高时溶解、而相对降低时析出或者聚集，其中极性溶剂在溶剂中的浓度范围是该复合粒子不溶解但能够分散的浓度范围。
(45)上述(44)所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为脂质膜。
(46)上述(45)所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为含有水溶性高分子衍生物的包覆层。
(47)上述(44)～(46)中任一项所述的包覆复合粒子，其中，包覆复合粒子的平均粒径在300nm以下。
发明的效果本发明提供一种药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法、其制备方法等，还提供凝聚被抑制的、由包覆层将复合粒子包覆了的包覆复合粒子的制备方法、可以采用该制备方法制备的包覆复合粒子等。
具体实施例方式
本发明中所述复合粒子是指至少含有介导粒子和药物并且药物附着在介导粒子上的粒子。
上述药物(以下称为药物A)是在本发明的复合粒子中附着在介导粒子上的药物，优选是静电附着在介导粒子上的药物，其中包含由于药物分子内的电荷或者由于分子内的极化等原因而导致产生朝向阳离子或者阴离子的静电引力的物质。可列举出例如蛋白质、肽、核酸、低分子化合物、糖类、高分子化合物等具有药理学活性的物质等，优选可列举出核酸，更优选可列举出基因、DNA、RNA、寡核苷酸(ODN)、质粒和siRNA，进一步优选可列举出质粒和siRNA。
作为蛋白质或者肽，可列举出例如缓激肽、血管紧张肽、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、缩胆囊素、β-内啡肽、促黑素细胞抑制因子、促黑素、胃泌素拮抗剂、神经降压素、生长抑素、二甲氧基马钱子碱、环孢霉素、脑啡肽、铁传递蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽、甲状腺素、生长素、促性腺激素、促黄体生成素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸酶、羧肽酶、谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活剂、链激酶、白细胞介素、干扰素、胞壁酰二肽、胸腺生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生长素、血小板生成素、胰蛋白酶抑制剂、溶菌酶、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子、神经生长因子、来自血小板的生长因子、转化生长因子、内皮细胞生长因子、成纤维细胞(纤维母细胞)生长因子、胶质细胞生长因子、胸腺素、特异抗体(可列举出例如，抗EGF受体抗体等)等。
作为核酸，可列举出例如反义寡核苷酸、有义寡核苷酸等的ODN、基因、DNA、RNA、质粒、siRNA等，该核酸也包含在核酸结构中的磷酸部分、酯部分等中所含的氧原子等被替代成例如硫原子等其他的原子而形成的衍生物。应予说明，siRNA是指短的双链RNA。
作为低分子化合物，可列举出例如ε-氨基己酸、盐酸精氨酸、L-天冬氨酸钾、氨甲环酸、硫酸博莱霉素、硫酸长春新碱、头孢唑啉钠、头孢噻吩钠、胞磷胆碱、阿糖胞苷、硫酸庆大霉素、盐酸万古霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星等。
作为糖类，可列举出例如硫酸软骨素钠、肝素钠、葡聚糖荧光素等。
作为高分子化合物，可列举出例如聚乙烯磺酸钠、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物(DIVEMA)、苯乙烯马来酸酐共聚物-新制癌菌素结合体(SMANCS)等。
本发明中所述介导粒子是指以例如药物、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等作为构成成分的微粒，优选以脂质体为构成成分的微粒。本发明中的介导粒子也可以由药物、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等之中的2种以上组合而成的复合体作为构成成分，也可以由药物、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等与其他的化合物(例如糖、脂质、无机化合物等)组合而成的复合体作为构成成分。
作为介导粒子的构成成分的药物(以下称为药物B)，包括在分散有下述的介导粒子的溶剂中呈粒子形态的药物；与上述其他的化合物一起形成复合体进而在分散有下述的介导粒子的溶剂中呈粒子形态的药物等。可列举出例如脂质性药物、高分子药物、金属药物等，具体地可列举出顺铂、维生素D、维生素E、香菇多糖等。
脂质聚集体或者脂质体由例如脂质和/或表面活性剂等构成，作为脂质，为单纯脂质、复合脂质或者衍生脂质均可，可列举出例如磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘脂类(sphingoid)、固醇类等，优选可列举出磷脂。另外，作为脂质，还可列举出例如表面活性剂(与下述的表面活性剂的含义相同)、高分子(与下述的高分子的含义相同，具体为葡聚糖等)、聚氧乙烯衍生物(具体为聚乙二醇等)等的脂质衍生物，优选可列举出聚乙二醇衍生化磷脂。作为表面活性剂，可列举出例如非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂等。
作为磷脂，可列举出例如磷脂酰胆碱(具体为大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱等)、磷脂酰乙醇胺(具体为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺等)、甘油磷脂(具体为磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱等)、鞘类磷脂(具体为(神经)鞘磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油、神经酰胺磷酸甘油酸(セラミドホスホグリセロリン酸)等)、甘油磷酸脂(glycerophosphono)、鞘类磷酸脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具体为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)、氢化磷脂(具体为氢化磷脂酰胆碱等)等的天然或者合成的磷脂。
作为甘油糖脂，可列举出例如亚硫酸核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基甘油二酯、二半乳糖甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、糖基二甘油酯等。
作为鞘糖脂，可列举出例如半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂等。
作为鞘脂类，可列举出例如sphingan、icosasphingan、鞘氨醇、它们的衍生物等。作为衍生物，可列举出例如由sphingan、icosasphingan、鞘氨醇等中的-NH2转变成-NHCO(CH2)xCH3(式中，x表示0～18的整数，其中优选6、12或18)而成的衍生物等。
作为固醇类，可列举出例如胆固醇、二氢胆固醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角固醇、岩藻甾醇、3β-[N-(N′N′-二甲氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)等。
作为其他的脂质，还可列举出例如N-[1-(2，3-二油酰基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油酰基丙基)]-N，N-二甲胺(DODAP)、N-[1-(2，3-二油酰氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、N-[1-(2，3-二(十四烷氧基)丙基)]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油酰氧基丙基)]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)等。
作为非离子型表面活性剂，可列举出例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(具体为聚山梨酯80等)、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇(具体为Pluronic F68等)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(具体为山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具体为聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂基醇等)、脂肪酸甘油酯等。
作为阴离子型表面活性剂，可列举出例如酰基肌氨酸、烷基硫酸钠、烷基苯磺酸盐、碳数7～22的脂肪酸钠等。具体地可列举出十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠等。
作为阳离子型表面活性剂，可列举出例如烷基胺盐、酰基胺盐、季铵盐、胺衍生物等。具体地可列举出苯扎氯铵、酰氨基乙基二乙胺盐、N-烷基多烷基多胺盐、脂肪酸多亚乙基多酰胺、鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、烷基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙胺、脂肪酸三乙醇胺酯等。
作为两性表面活性剂，可列举出例如3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸等。
在脂质体中，这些脂质和表面活性剂可以单独地或者组合使用，优选组合使用。作为组合使用场合的组合，可列举出例如从氢化大豆磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇中选出的2种成分以上的组合；从二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇中选出的2种成分以上的组合；EPC与DOTAP的组合；EPC、DOTAP和聚乙二醇衍生化磷脂的组合；EPC、DOTAP、胆固醇和聚乙二醇衍生化磷脂的组合等。
另外，在脂质体中，根据需要，还可以含有例如胆固醇等固醇类等的膜稳定化剂，例如生育酚等抗氧化剂等。
作为脂质聚集体，可列举出例如球状胶束、球状反胶束、香肠状胶束、香肠状反胶束、板状胶束、板状反胶束、六角形I、六角形II和脂质2分子以上组成的聚集体等。
作为乳液粒子，可列举出例如由脂肪乳剂、非离子型表面活性剂与大豆油形成的乳液、脂质乳剂、脂质纳米球等水包油型(O/W)乳液和水包油包水型(W/O/W)乳液粒子等。
作为高分子，可列举出例如白蛋白、葡聚糖、壳聚糖、硫酸葡聚糖、DNA等天然高分子；例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰树枝状聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚羟基乙酸、聚乙二醇化聚乳酸等合成高分子、以及它们的盐等。
在此，高分子的盐包括例如金属盐、铵盐、酸加成盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，可列举出例如锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐、镁盐、钙盐等碱土类金属盐、铝盐、锌盐等；作为铵盐，可列举出例如铵、四甲基铵等的盐；作为酸加成盐，可列举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐、以及乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐；作为有机胺加成盐，可列举出例如吗啉、哌啶等的加成盐；作为氨基酸加成盐，可列举出例如甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸等的加成盐。
作为金属胶体，可列举出例如含有金、银、铂、铜、铑、氧化硅、钙、铝、铁、铟、镉、钡、铅等的金属胶体。
作为微粒制剂，可列举出例如微球、微胶囊、纳米晶体、脂类纳米粒子、高分子胶束等。
另外，优选地，介导粒子具有与药物A静电相反的电荷。此处所述与药物A静电相反的电荷，包括相对于药物分子内的电荷、分子内的极化等产生静电引力的电荷、表面极化等。为了使介导粒子具有与药物A静电相反的电荷，优选地，介导粒子含有具有与药物A静电相反的电荷的带电物质，更优选地，介导粒子含有具有与药物A静电相反的电荷的脂质(下述的阳离子型脂质或者阴离子型脂质)。
介导粒子中所含有的带电物质，可分为呈阳离子性的阳离子型物质和呈阴离子性的阴离子型物质两类，不过即使是具有阳离子性基团和阴离子性基团二者的两性物质，由于pH值的影响或者由于与其他物质的结合等而使相对阴性度发生变化，相应于各种情况，可以将其归类为阳离子型物质或者阴离子型物质。这些带电物质作为上述介导粒子的构成成分使用，或者加入到该介导粒子的构成成分中使用均可。
作为阳离子型物质，可列举出例如上述的介导粒子的定义中所示例的那些中的阳离子型物质[具体为阳离子型脂质、阳离子型表面活性剂(与上述同义)、阳离子型高分子等]、在等电点以下的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽等。
作为阳离子型脂质，可列举出例如DOTAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIE、DC-Chol等。
作为阳离子型高分子，可列举出例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、polyfect、壳聚糖等。
作为在等电点以下的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽，只要是在该物质的等电点以下的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽就没有特别限定。可列举出例如白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、胃蛋白酶、核糖核酸酶T1等。
作为阴离子型物质，可列举出例如在上述的介导粒子的定义中所示例的那些物质中的阴离子型物质[具体为阴离子型脂质、阴离子型表面活性剂(与上述同义)、阴离子型高分子等]、在等电点以上的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽、核酸等。
作为阴离子型脂质，可列举出例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
作为阴离子型高分子，可列举出例如聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰树枝状聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚羟基乙酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、阴离子性葡聚糖荧光素等。
作为在等电点以上的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽，只要是在该物质的等电点以上的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽就没有特别限定。可列举出例如白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、组蛋白、鱼精蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等。
作为阴离子型物质的核酸，可列举出例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等，只要是不显示生理活性的，不管其长度和序列如何，均可使用。
在本发明中，作为介导粒子中所含有的选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，优选可列举出糖脂、或者水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，具体地可列举出例如聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。另外，更优选可列举出水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。本发明中选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物以及表面活性剂，其分子的一部分由于例如疏水性亲合力、静电力等而具有与介导粒子的构成成分结合的性质，而分子的其他部分则由于例如亲水性亲合力、静电力等而具有与制备介导粒子时的溶剂结合的性质，优选是具有这两方面性能的物质。以下，将选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂表示为凝聚抑制物质。
作为从糖、肽和核酸中选出的1种以上物质的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出由例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等的糖，例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽、谷胱甘肽等的肽，例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等的核酸等，与例如在上述介导粒子的定义中所列举的脂质等或者例如硬脂酸、棕榈酸、月桂酸等的脂肪酸结合而形成的衍生物等。
作为糖的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出例如在上述介导粒子的定义中所列举的甘油糖脂、鞘类糖脂等。
作为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出由例如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、低聚糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬氨酰胺(polyaspartate amide)、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、低聚甘油等或者它们的衍生物，与例如在上述介导粒子的定义中所列举的脂质结合，或者与例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸结合而形成的衍生物等，更优选可列举出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，进一步优选可列举出聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
作为聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出例如聚乙二醇化脂质[具体为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具体为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)等)、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、Cremophor EL等]、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类(具体为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯等)、聚乙二醇脂肪酸酯类等，更优选可列举出聚乙二醇化脂质。
作为聚甘油衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出例如聚甘油化脂质(具体为聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)、聚甘油脂肪酸酯等，更优选可列举出聚甘油化脂质。
作为表面活性剂，可列举出例如在上述介导粒子的定义中所列举的表面活性剂、聚乙二醇烷基醚等，优选可列举出聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。
作为本发明中的附着竞争剂，可列举出例如具有与药物A静电相同的电荷的物质等，包含因分子内的电荷、分子内的极化等产生的朝向阳离子或者阴离子的静电引力而静电附着在介导粒子上的物质，可列举出例如脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽、高分子等。作为脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子，可列举出例如在上述荷电物质的定义中所列举的阳离子型脂质、阴离子型脂质、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、核酸、蛋白质、肽、阳离子型高分子、阴离子型高分子等，优选可列举出在上述荷电物质的定义中所列举的阳离子型高分子、阴离子型高分子等，更优选可列举出硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、阴离子性葡聚糖荧光素、聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、polyfect、壳聚糖等中选出的1种以上的物质。附着竞争剂优选静电附着在介导粒子上，优选为即使附着在介导粒子上也不会使象介导粒子凝聚那样的交联形成的那样大小的物质，或者优选为在分子内具有能够排斥介导粒子附着的部分从而抑制该介导粒子凝聚的物质。另外，特别是在上述药物A为分子量5000以上的大分子药物(例如基因、DNA、RNA、质粒、siRNA等)的场合，进一步使附着竞争剂附着在介导粒子上，这是本发明的最优选的方案之一。
本发明的凝聚抑制剂可以含有本发明中的凝聚抑制物质，而且，在不妨碍该凝聚抑制物质的凝聚抑制作用的前提下，也可以含有其他的任何物质。
在本发明中，药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制，可以通过使该介导粒子含有凝聚抑制物质来实现，具体地说，例如，在已分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中，使药物分散或者溶解而被含有，使药物附着在该介导粒子上而得到的，这样就可以在该复合粒子的制备过程中抑制该复合粒子的凝聚和/或在制备后抑制该复合粒子的凝聚。另外，优选地，当将药物A分散或者溶解而使其被含有时，可以使其进一步含有附着竞争剂，从而使附着竞争剂与药物一起附着在该介导粒子上，由此可以进一步抑制复合粒子的凝聚。
更具体地说，本发明的凝聚抑制方法可以采用使药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的制备方法来实施，该方法包括例如以下几个步骤制备一种分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体的步骤，以及在分散有介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物A的步骤(例如向分散有介导粒子的液体中加入药物A并使其分散或者溶解的步骤、向分散有介导粒子的液体中加入分散或者溶解了药物A的液体的步骤等)。此处，作为按照在分散有介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物A的步骤而得到的复合粒子，具体地可列举出例如在分散有以含有阳离子型脂质的脂质体为构成成分的微粒的液体中，通过分散或者溶解来使该液体含有作为药物的核酸，在以含有阳离子型脂质的脂质体作为构成成分的微粒上附着作为药物的核酸而形成的复合粒子，同样地，在以含有阳离子型脂质的脂质聚集体作为构成成分的微粒上附着作为药物的核酸而形成的复合粒子，在以含有聚-L-赖氨酸等阳离子型高分子的高分子作为构成成分的微粒上附着作为药物的核酸的复合粒子，在以含有磷脂酸等阴离子型脂质的脂质体或者脂质聚集体作为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子，在以含有苯乙烯马来酸等阴离子型高分子的高分子为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子，在以含有聚-L-赖氨酸等阳离子型高分子的高分子作为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子，在以含有阳离子型脂质的脂质体或者脂质聚集体作为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子等。另外，在分散有介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物A的步骤，优选是在分散或者溶解有药物A的液体中还含有附着竞争剂，然后将该液体加入到分散有介导粒子的液体中的步骤，在该场合，使药物A与附着竞争剂一起附着到介导粒子上来制备复合粒子，这样就可以在复合粒子的制备中抑制该复合粒子的凝聚以及在制备后抑制该复合粒子的凝聚。
含有凝聚抑制物质的介导粒子可以按照公知的制备方法或者按照类似的方法来制备，只要是能使介导粒子中含有凝聚抑制物质，任何的制备方法均可用来制备。例如，为了制备一种作为介导粒子之一的以含有凝聚抑制物质的脂质体为构成成分的微粒，可以采用公知的脂质体的制备方法。作为公知的脂质体的制备方法，可列举出例如Bangham等人的脂质体制备法[参见“J.Mol.Biol.”，1965年，第13卷，p.238-252]、乙醇注入法[参见“J.Cell Biol.”，1975年，第66卷，p.621-634]、French Press法[参见“FEBS Lett.”，1979年，第99卷，p.210-214]、冷冻熔融法[参见“Arch.Biochem.Biophys.”，1981年，第212卷，p.186-194]、逆相蒸发法[参见“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，1978年，第75卷，p.4194-4198]、pH梯度法(参见例如专利第2572554号公报、专利第2659136号公报等)等。作为制备脂质体时使脂质体混悬的溶液，可以使用例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等。另外，在制备脂质体时，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等的抗氧化剂；例如甘油、葡萄糖、氯化钠等的等渗剂等。另外，也可以通过将脂质等溶解于例如乙醇等有机溶剂中，蒸馏除去溶剂后，添加生理盐水等，振荡搅拌，使其形成脂质体来制备脂质体。
另外，也可以利用例如非离子型表面活性剂(与上述同义)、阳离子型表面活性剂(与上述同义)、阴离子型表面活性剂(与上述同义)、高分子、聚氧乙烯衍生物等任意地进行脂质体的表面改性，这些表面改性的脂质体也可以作为本发明中的介导粒子的构成成分使用[参见D.D.Lasic，F.Martin编，“Stealth Liposomes”，(美国)，CRC Press Inc，1995年，p.93-102]。作为高分子，可列举出例如葡聚糖、普鲁兰多糖、甘露聚糖、支链淀粉、羟乙基淀粉等。作为聚氧乙烯衍生物，可列举出例如聚山梨酯80、Pluronic F68、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇、PEG-DSPE等。脂质体的表面改性，可以采用使介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂的方法之一。
脂质体的平均粒径可以根据希望自由选择。作为调节平均粒径的方法，可列举出例如挤压法、将大的多室脂质体(MLV)机械粉碎(具体使用Manton-gaulin、微流体化仪(microfluidizer)等)的方法[参见R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm编著，“Emulsion andNanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs”，德国，Scientific Publishers Stuttgart，1998年，p.267-294]等。
另外，将构成介导粒子的例如从药物B、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等中选出的2种以上组合而成的复合体的制备方法，可以是例如仅仅在水中将药物B与脂质或高分子等混合的制备方法，此时，如果需要，还可以增加整粒步骤或无菌化步骤等。另外，复合体的形成也可以在例如丙酮、醚等各种溶剂中进行。
在本发明的药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法中，凝聚抑制物质相对于介导粒子全体的比例，按重量比计，优选1∶0.9～1∶0.01，更优选1∶0.7～1∶0.1，进一步优选1∶0.6～1∶0.2，最优选1∶0.5～1∶0.3。
作为介导粒子的大小，平均粒径优选为10nm～300nm，更优选为50nm～150nm，进一步优选为50nm～100nm。
用于使介导粒子分散的溶剂，是那些不溶解介导粒子的溶剂，在复合粒子的制备步骤中，优选是不妨碍药物A附着在介导粒子上的溶剂。作为用于使介导粒子分散的溶剂，可列举出例如含有水等的溶剂，优选可列举出水。另一方面，作为介导粒子，优选在例如水等中分散的介导粒子。在制备介导粒子时使用的溶剂为水的场合，可以在相同液体中，在制备介导粒子之后，接着制备复合粒子。
在向分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中，通过分散或者溶解来使该液体含有药物A或者药物A与附着竞争剂的步骤中，在该分散有介导粒子的液体中加入分散或者溶解有药物A或者药物A与附着竞争剂的液体的场合，作为可使药物A或者药物A与附着竞争剂分散或者溶解的液体使用的溶剂，只要是在该分散有介导粒子的液体与分散或者溶解有药物A或者药物A和附着竞争剂的液体混合后的混合液中，不会妨碍药物A附着在该介导粒子上的溶剂，任何一种溶剂均可以使用。作为使药物A或者药物A和附着竞争剂分散或者溶解的溶剂，可列举出例如含有水等的溶剂，优选可列举出水。另一方面，作为药物A和附着竞争剂，分别优选能够溶解或者分散在例如水等中的药物A和附着竞争剂，进一步分别优选能够溶解在水中的药物A和附着竞争剂。
介导粒子在分散有介导粒子的液体中所占的比例，只要能够使药物A或者药物A和附着竞争剂附着在介导粒子上就没有特殊限定，优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～500mg/mL。另外，在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中，通过分散或者溶解来使该液体含有药物A或者药物A和附着竞争剂的步骤中，在向该分散有介导粒子的液体中加入分散或者溶解有药物A或者药物A和附着竞争剂的液体的场合，药物A和附着竞争剂的总量相对于分散或者溶解有药物A或者药物A和附着竞争剂的液体的比例，只要能够使药物A或者药物A和附着竞争剂附着在介导粒子上就没有特殊限定，优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～400mg/mL。药物A和附着竞争剂的总量相对于介导粒子的比例，按重量比计，优选为1∶1～1000∶1，更优选为2∶1～200∶1。
本发明的复合粒子，是含有一种含有凝聚抑制物质的介导粒子、以及作为附着在该介导粒子上的药物的核酸、或者附着在该介导粒子上的药物和附着在该介导粒子上的附着竞争剂的复合粒子，本发明的复合粒子中的各构成成分的定义与上述各定义相同。
本发明的复合粒子的制备方法是包括在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有作为药物的核酸或者药物和附着竞争剂，从而使该核酸或者该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤的制备方法。包括在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有作为药物的核酸，从而使该核酸附着在该介导粒子上的步骤的制备方法，在上述本发明的药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法的说明中，可以把药物作为核酸，采用同样的方法来实施。包括在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物和附着竞争剂，从而使该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤的制备方法，可以采用与上述本发明的药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法的说明中使用附着竞争剂的场合的说明中所记载的同样的方法来实施。
本发明中的复合粒子和本发明的复合粒子的大小，其平均粒径优选为50nm～300nm，更优选为50nm～200nm，进一步优选为50nm～150nm。
另外，在本发明中的复合粒子和本发明的复合粒子的制备步骤之后，通过加入荷电物质或者分散或者溶解有荷电物质的液体，也可以使荷电物质附着在该复合粒子上，从而得到多重复合粒子。例如，利用阳离子型物质和凝聚抑制物质在水中配制以作为介导粒子的脂质体为构成成分的微粒，然后，添加作为药物A的例如核酸(优选同时添加附着竞争剂)，进而添加例如阴离子型物质，也可以制成多重复合粒子。另外，本发明中的复合粒子和本发明的复合粒子，也可以制成包覆复合粒子。
本发明的包覆复合粒子是一类至少由本发明的复合粒子和包覆该复合粒子的包覆层构成的包覆复合粒子，例如是这样一类包覆复合粒子等，其中，构成该包覆层的包覆层成分，在含有极性溶剂的溶剂中，当极性溶剂的浓度相对提高时溶解、而相对降低时析出或者聚集，所述极性溶剂在溶剂中的浓度范围是该复合粒子不溶解但能够分散的浓度范围。
作为本发明的包覆复合粒子中构成包覆层的包覆层成分，可列举出例如在上述介导粒子的定义中所列举的脂质、表面活性剂、高分子等，优选可列举出上述介导粒子的定义中所列举的从脂质和表面活性剂中选出的1种以上的物质，更优选可列举出当包覆层为脂质膜时，是从脂质和表面活性剂中选出的1种以上的物质，进一步优选可列举出磷脂。
另外，作为在包覆层为脂质膜的场合使用的脂质，还可列举出例如合成脂质等。作为合成脂质，可列举出例如含氟磷脂酰胆碱、含氟表面活性剂、二烷基溴化铵等，它们可以单独使用或者与其他脂质等组合使用。另外，在包覆层为脂质膜的场合，包覆层优选含有水溶性高分子衍生物。作为水溶性高分子衍生物，可列举出例如在上述凝聚抑制物质的定义中所示例的水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物等，优选可列举出在上述凝聚抑制物质的定义中所示例的聚乙二醇衍生化磷脂等。另外，作为水溶性高分子衍生物，更优选具有以下两方面性质的物质，即，其分子的一部分具有通过例如亲水性亲合力、静电力等与本发明中的凝聚抑制物质或者附着竞争剂相结合的性质、而其他部分具有通过例如疏水性亲合力、静电力等与其他的包覆层成分相结合的性质；通过使用上述物质，可以提高本发明的复合粒子的包覆效率。水溶性高分子衍生物相对于包覆层成分全体的比例，按重量比计，优选为1∶0.5～1∶0.01，更优选为1∶0.25～1∶0.01，进一步优选为1∶0.15～1∶0.02。
本发明的包覆复合粒子可以采用这样一种制备方法来制备，该制备方法包括，例如配制含有一种能使本发明的复合粒子分散且能使包覆层成分溶解的极性有机溶剂的液体(A液)的步骤；接着，通过减少A液中的极性有机溶剂的比例来使复合粒子被包覆层包覆的步骤；在该场合，该包覆复合粒子以混悬液(D液)的形态获得。A液中的溶剂是使复合粒子不溶解、但可使包覆层成分溶解的溶剂，在减少了A液中的极性有机溶剂的比例的D液中，复合粒子不溶解，而包覆层成分或者不溶解，或者凝聚。在A液中的溶剂为单独的极性有机溶剂的场合，优选缓慢地加入一种溶剂(E液)，该E液含有例如可与该极性有机溶剂混合的该极性有机溶剂以外的溶剂，由此可以使该极性有机溶剂的比例相对减少。此处，E液是含有该极性有机溶剂以外的溶剂的溶剂，但是也可以含有极性有机溶剂。另外，在A液中的溶剂为由极性有机溶剂与该极性有机溶剂以外的溶剂形成的混合液的场合，可以通过加入溶剂(F液)，该F液含有例如可与极性有机溶剂混合的该极性有机溶剂以外的溶剂，和/或，通过蒸馏、半透膜分离、分馏等，选择性地除去极性有机溶剂，从而可以使该极性有机溶剂的比例减少。此处，F液是含有该极性有机溶剂以外的溶剂的溶剂，F液也可以含有极性有机溶剂，只要其比例低于A液中的极性有机溶剂的比例即可。作为极性有机溶剂，可列举出例如甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇等醇类；甘油、乙二醇、丙二醇等二醇类；聚乙二醇等的聚亚烷基二醇类等，优选可列举出乙醇。作为极性有机溶剂以外的溶剂，可列举出例如水、液体二氧化碳、液体烃、卤化碳、卤代烃等，优选可列举出水。另外，A液、E液和F液也可以含有离子、缓冲成分等。
极性有机溶剂与该极性有机溶剂以外的溶剂的组合，优选是可相互混合的组合，可以根据上述复合粒子和上述包覆层成分在A液和D液的溶剂中以及在E液和F液中的溶解度等来选择。另一方面，对于上述复合粒子，优选在A液和D液的溶剂中以及在E液和F液的任一种溶剂中的溶解度低，而且优选在极性有机溶剂和该极性有机溶剂以外的溶剂的任一种溶剂中的溶解度也低，而包覆层成分优选在D液的溶剂中和在F液中的溶解度低并优选在A液的溶剂中和在E液中的溶解度高，而且优选在极性有机溶剂中的溶解度高并优选在该极性有机溶剂以外的溶剂中的溶解度低。此处，复合粒子的溶解度低是指复合粒子中所含有的介导粒子、药物A和附着竞争剂等各成分在该溶剂中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，但只要通过各成分间的结合等，各成分的溶出性也能变小即可。例如，即使在介导粒子中所含有的成分中的任一种在A液的溶剂中的溶解度高的场合，只要附着竞争剂在A液的溶剂中的溶解度低，就可以抑制复合粒子中的其他成分的溶出，从而可以降低复合粒子在A液的溶剂中的溶解度。即，在选择性地使用与复合粒子中的其他成分在A液的溶剂中的溶解度相比，在A液的溶剂中的溶解度低的附着竞争剂的场合，附着竞争剂在制备包覆复合粒子的过程中具有抑制复合粒子的其他成分的溶出，从而提高生产率和合格率的效果。
A液中的极性有机溶剂的比例，只要满足不使本发明的复合粒子溶解地存在、而只是使包覆该复合粒子的包覆层成分溶解的条件，就没有特殊限定，根据所使用的溶剂、复合粒子和包覆层成分的种类等的不同而异，但优选为30vol％以上，更优选为60～90vol％。另外，D液中的极性有机溶剂的比例，只要是能使包覆层成分在本发明的复合粒子表面上形成包覆层的比例，就没有特殊限定，但优选为50vol％以下。
作为配制A液的步骤，只要上述复合粒子不溶解，则按照任何顺序添加上述极性有机溶剂、上述复合粒子和上述包覆层成分、或者上述极性有机溶剂、上述复合粒子、上述包覆层成分和上述极性有机溶剂以外的溶剂来配制A液的步骤均是可以的，优选可列举出，首先配制含有其中分散有本发明复合粒子的极性有机溶剂的液体(B液)，另外配制使包覆层成分溶解在含有与B液中的极性有机溶剂相同或者不同的极性有机溶剂的溶剂中而形成的液体(C液)，然后将B液与C液混合来配制A液的步骤。在将B液与C液混合来配制A液时，优选缓慢地混合。
作为例如包覆层为脂质膜的本发明的包覆复合粒子的优选制备方法，可列举出以下的方法。
(步骤1)使本发明的复合粒子分散(混悬)于含有极性有机溶剂的水溶液、优选含有乙醇等醇类的水溶液中。
(步骤2)将构成脂质膜的脂质和/或表面活性剂(构成脂质膜的成分)溶解于一种含有与上述含有极性有机溶剂的水溶液相同或者不同的含有极性有机溶剂的水溶液中、优选溶解于相同的含有极性有机溶剂的水溶液或者极性有机溶剂中。此时，也可以进一步添加水溶性高分子衍生物(例如聚乙二醇修饰脂质衍生物等)，此处，对添加的水溶性高分子衍生物的量没有特殊限定。
(步骤3)将步骤1中得到的液体与步骤2中得到的液体混合。
(步骤4)向步骤3中得到的混合液中逐次少量添加水、或者将该混合液透析、或者从该混合液中蒸馏除去极性有机溶剂，来使该混合液中的极性有机溶剂的相对比例减少，以混悬液的形态获得被脂质膜包覆的包覆复合粒子。
不管所使用的复合粒子的种类和所使用的包覆层成分的种类是什么，都可以采用基本上与上述同样的方法来制备本发明的包覆复合粒子。对于介导粒子是以脂质体为构成成分的微粒、包覆层成分为脂质和/或表面活性剂、包覆层为脂质膜的包覆复合粒子，从其构成考虑，可分类为狭义的脂质体；而对于介导粒子是以脂质体为构成成分的微粒以外的粒子，包覆层成分为脂质和/或表面活性剂、包覆层为脂质膜的包覆复合粒子，可分类为广义的脂质体。在本发明中，更优选介导粒子的构成成分和包覆复合粒子均为脂质体。
在本发明的包覆复合粒子的制备方法中所使用的本发明的复合粒子在A液和B液中的比例，只要该复合粒子能够被包覆层成分包覆，就没有特殊限定，但优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～500mg/mL。另外，所使用的包覆层成分(例如脂质等)在A液和C液中的比例，只要能够包覆本发明的复合粒子，就没有特殊限定，但优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～400mg/mL。包覆层成分相对于本发明的复合粒子的比例，按重量比计，优选为1∶0.1～1∶1000，更优选为1∶1～1∶10。
另外，本发明的包覆复合粒子和采用本发明的包覆复合粒子的制备方法得到的包覆复合粒子的大小，其平均粒径优选为350nm以下，更优选为300nm以下，进一步优选为200nm以下。具体地优选为例如可注射的大小。
进而，也可以用抗体等蛋白质、糖类、糖脂、氨基酸、核酸、各种低分子化合物、高分子化合物等物质对上述得到的包覆复合粒子进行修饰，这样得到的包覆复合粒子也包括在本发明的包覆复合粒子中。例如，为了应用于靶向制剂，也可以进一步用抗体等蛋白质、肽、脂肪酸类等对上述得到的包覆复合粒子进行脂质膜表面修饰[参见D.D.Lasic、F.Martin编，Stea1th Liposomes，(美国)，CRC Press Inc.，1995年，p.93-102]，另外，与对作为介导粒子的构成成分的脂质体的处理相同地，也可以用例如非离子型表面活性剂(与上述同义)、阳离子型表面活性剂(与上述同义)、阴离子型表面活性剂(与上述同义)、高分子(与上述同义)、聚氧乙烯衍生物(与上述同义)等任意地进行表面改性，这些经过脂质膜表面修饰或者表面改性的粒子也包括在本发明的包覆复合粒子中。
本发明的包覆复合粒子，为了达到例如药剂对血液成分等机体成分、胃肠道消化液等的稳定化、副作用的降低、药剂在肿瘤等的靶脏器中的集聚性增大、经口或经粘膜的药剂的吸收的改善等目的而制成制剂使用。
在将本发明的包覆复合粒子制成制剂使用的场合，可以将采用上述方法配制的包覆复合粒子的混悬液直接以例如注射剂等形式使用，也可以采用例如过滤、离心分离等方法从该混悬液中除去溶剂来使用，也可以将该混悬液、或者将加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘氨酸等赋形剂的该混悬液冷冻干燥后使用。
在注射剂的场合，优选向上述的包覆复合粒子的混悬液或者将上述的溶剂除去或者冷冻干燥的包覆复合粒子中混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等来配制注射剂。另外，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA等抗氧化剂，甘油、葡萄糖、氯化钠等的等渗剂等来制备注射剂。另外，也可以加入例如甘油等的冷冻保存剂进行冷冻保存。
另外，本发明的包覆复合粒子也可以与适当的赋形剂等一起进行制粒、干燥等，加工成例如胶囊剂、片剂、颗粒剂等口服用制剂。
下面，用实施例具体地说明本发明。但本发明不受这些实施例的限定。
应予说明，本实施例中所使用的ODN是硫代磷酸酯(ホスホロチオエ一ト)型、20mer、5’端为FITC标记、5’ACTAGTGGCTAGCGAATCTC3’、宝生物公司制。
另外，本实施例中所使用的质粒，为含有连结到CAG启动子上的β-半乳糖苷酶基因的8.5kb的质粒(以下记做pCAG-LacZ)、或者含有连结到CAG启动子的RLuc基因的6.1kb的质粒(以下记做pCAG-RLuc)。
pCAG-Rluc质粒按照以下的方法制备。
将质粒pRL-nu11载体[Promega公司制]1μg溶解于30μL的缓冲液(pH7.5)[Universal Buffer H；50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、6.6mmol/L氯化镁、10mmol/L二硫苏糖醇以及100mmol/L氯化钠、宝酒造公司制，以下相同]中，加入10单位的限制酶SalI和EcoRI，在37℃下进行2小时消化反应。将得到的反应溶液用琼脂糖凝胶电泳处理后，将3.3kbp的DNA片段用精制试剂盒[QIAEX II Gel Extraction Kit、QIAGEN公司制，以下相同]回收。
接着，将国际公开第01/33957号小册子中所述的质粒pBSKS(+)CAG启动子1μg溶解于30μL的缓冲液(pH7.5)中，加入限制酶SalI和EcoRI，在37℃下进行2小时消化反应，将这样得到的反应溶液用琼脂糖凝胶电泳处理后，将含有1.7kbp的CAG启动子的DNA片段用精制试剂盒回收。
将上述得到的、来自质粒pRL-nu11载体的Sal I-EcoRI片段(3.3Kbp)0.1μg和来自质粒pBSKS(+)CAG启动子的SalI-EcoRI片段(1.7kbp)0.1μg溶解于T4连接酶缓冲液[66mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、10mmol/L氯化镁、1mmol/L二硫苏糖醇以及0.1mmol腺苷三磷酸、宝酒造公司制]30μL中，加入T4DNA连接酶100单位(宝酒造公司制)，在16℃下进行16小时连结反应。
使用得到的反应液，将大肠杆菌DH5α(东洋纺社制)采用Cohen等人的方法[参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1972年，第69卷，p.2110-2114]进行转化，得到氨苄青霉素耐药性株。按照公知的方法从该转化株分离pCAG-Rluc质粒。
另外，本实施例中所使用的siRNA，是由5’端为FITC标记的有义序列5’CUGGAUCGUAAGAAGGCAGdT.dT3’和反义序列5’CUGCCUUCUUACGAUCCAG dTdT3’构成的siRNA。
实施例1将DOTAP[Avanti公司制，以下相同]/PEG-DSPE(日本油脂制，以下相同)/蒸馏水按照30mg/6mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜(Whatman制，以下相同)4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜(Whatman制，以下相同)10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜(Whatman制，以下相同)24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例2将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/9mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例3将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/12mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例4将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/18mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例5将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/24mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例6将DOTAP/聚氧乙烯氢化蓖麻油[HCO-60、日本油脂制]/蒸馏水按照30mg/24mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
比较例1将DOTAP/蒸馏水按照30mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例7与实施例1同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例8与实施例2同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例9与实施例3同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例10与实施例4同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例11与实施例5同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
比较例2与比较例1同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
试验例1对于实施例1～11和比较例1～2中得到的各复合粒子，用动态光散射(DLS)检测仪(NanoZS、Malvern社制)测定复合粒子的平均粒径。
结果示于表1中。
表1
由于实施例1～11中制备的复合粒子的平均粒径为300nm以下，因此可以认为凝聚已受到抑制，与此相反，比较例1和2中制备的复合粒子的平均粒径大于300nm。
实施例12将DOTAP/PEG-DSPE[Avanti公司制，以下相同]/蒸馏水按照30mg/12mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.04mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.01mL，制备复合粒子。
比较例3将DOTAP/蒸馏水按照30mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.04mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.01mL，制备复合粒子。
试验例2目视观察实施例12和比较例3中配制的各复合粒子的凝聚物的生成。结果示于表2中。
表2
从表2看出，实施例12中制备的复合粒子中即使添加质粒也观察不到凝聚物的生成，与此相反，对于比较例3中制备的复合粒子就观察到凝聚物的生成。
实施例13与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入0.5mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.25mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中，加入将包覆层成分的EPC[日本油脂制；以下相同]/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.25mL，接着缓慢加入蒸馏水23mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例14与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入3mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.25mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例15与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及6mg/mL的硫酸葡聚糖(Merk社制，以下相同)水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例16与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及12mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例17与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及3mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例18与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及3mg/mL的阴离子性葡聚糖荧光素(Molecular Probes社制)水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
试验例3对于实施例13～18中得到的各制剂，用动态光散射(DLS)检测仪(A model ELS-800、大塚电子制)测定包覆微粒的平均粒径。结果示于表3中。
表3
实施例13～18中得到的任一个制剂，其平均粒径均为350nm以下，因此可以认为，在包覆复合粒子的制备步骤中，复合粒子的凝聚受到抑制。
试验例4对于实施例13和实施例15～17中得到的各制剂，质粒和EPC相对于加入量的回收率如下述那样求出。
将各制剂用水稀释10倍，向该稀释液200μL中加入10w/v％的TritonX-100(和光纯药制，以下相同)水溶液200μL，加入2μg/mL溴化乙锭(和光纯药社制)水溶液200μL以及生理盐水1400μL。使用荧光光度计(日立、F-4500)，测定激发波长580nm和荧光波长615nm处的荧光，由此定量测定各制剂中的质粒。另外，将制剂中的EPC通过使用磷脂C-test Wako(和光纯药制，以下相同)的酶法进行定量测定。质粒和EPC的回收率分别按照下述式(1)和(2)算出。
结果示于表4中。
质粒的回收率(％)＝A/C×100…………(1)EPC的回收率(％)＝B/D×100…………(2)A制剂中的质粒量(mg)B制剂中的EPC量(mg)C实施例中的质粒加入量(mg)D实施例中的EPC加入量(mg)表4
从表4看出，对于实施例13和15～17中得到的制剂，质粒的回收率均为高达50％以上，由此表明，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆是良好的。另外，对于含有附着竞争剂的实施例15～17中得到的制剂，EPC的回收率也基本在高达50％以上，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆的效率更好，更优选的。
实施例19与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入2mg/mL的siRNA水溶液0.125mL和6mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中，加入由包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.25mL，接着缓慢加入蒸馏水23mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水，接着，将相对于120重量份的EPC为50重量份的PEG-DSPE(复合粒子混悬液的4vol％)溶解于少量的乙醇中并进行混合，在70℃下加温2分钟，得到制剂。
试验例5用DLS检测仪(A model ELS-800、大塚电子制)测定实施例19得到的制剂中的包覆微粒的平均粒径。结果示于表5中。
表5
应予说明，实施例19中得到的制剂，其平均粒径为350nm以下，因此可以认为，在包覆复合粒子的制备步骤中，复合粒子的凝聚受到抑制。
试验例6对于实施例19中得到的制剂，如下述那样求出siRNA和EPC相对于加入量的回收率。
将制剂用水稀释20倍，向该稀释液50μL中加入10w/v％TritonX-100水溶液50μL，进而加入生理盐水400μL。使用荧光酶标仪(WALLAC、ARVOTMSX1420 Multilabel counter)，测定激发波长485nm和荧光波长530nm处的荧光，由此定量测定制剂中的siRNA。另外，将制剂中的EPC通过使用磷脂C-test Wako(和光纯药制)的酶法进行定量测定。siRNA和EPC的回收率分别按照下述式(3)和(4)算出。结果示于表6中。
siRNA的回收率(％)＝A/C×100……………(3)EPC的回收率(％)＝B/D×100………………(4)A制剂中的siRNA量(mg)B制剂中的EPC量(mg)C实施例19中的siRNA加入量(mg)D实施例19中的EPC加入量(mg)
表6
从表6看出，对于实施例19中得到的制剂，siRNA的回收率为高达50％以上，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆是良好的，EPC的回收率也为高达50％以上，由此可以认为，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆是很有效的。
实施例20与实施例3同样地制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.25mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.125mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中，加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC按照最终成为120mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行再混悬，得到制剂。
实施例21与实施例20同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE(日本油脂制，以下相同)按照最终成为120mg/10mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入PBS进行再混悬，得到制剂。
实施例22
与实施例20同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入PBS进行再混悬，得到制剂。
实施例23与实施例20同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/50mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入PBS进行再混悬，得到制剂。
实施例24与实施例3同样地制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.25mL中，加入2mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.0625mL、以及20mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.0625mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC按照最终成为120mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，制备包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例25与实施例24同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/10mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例26与实施例24同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例27与实施例24同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/50mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
试验例7对于实施例20～27中得到的各制剂，用DLS检测仪(NanoZS、Malvern社制)测定包覆微粒的平均粒径。结果示于表7中。
表7
实施例20～27中得到的制剂，其平均粒径为350nm以下，因此可以认为，在包覆复合粒子的制备步骤中，复合粒子的凝聚受到抑制。
试验例8对于实施例20～27中得到的各制剂，与试验例4同样地求出EPC相对于加入量的回收率。结果示于表8中。
表8
从表8看出，对于实施例20～27中得到的制剂，EPC的回收率均很高，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆可以很有效地进行。另外，水溶性高分子衍生物相对于包覆层成分全体的比例，按重量比计为1∶0.25～1∶0.01的实施例21、22、25和26中得到的制剂，包覆微粒的平均粒径更小，而且EPC的回收率更高，因此更优选。
工业实用性本发明提供一种由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法及该复合粒子的制备方法等，另外还提供将凝聚受到抑制的复合粒子用包覆层包覆而成的包覆复合粒子的制备方法以及可以按照该制备方法制备的包覆复合粒子等。
权利要求
1.复合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子中，使该介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
2.权利要求1所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
3.权利要求1所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
4.权利要求1～3中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物分散或者溶解而被含有，使药物附着在该介导粒子上而得到的。
5.权利要求1～4中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物借助静电附着在介导粒子上而形成的。
6.权利要求1～5中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
7.权利要求1～6中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
8.权利要求1～7中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，药物为核酸。
9.权利要求8所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
10.权利要求1～9中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子为由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子。
11.权利要求10所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使药物和附着竞争剂附着在该介导粒子上而得到的。
12.权利要求10或者11所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物和附着竞争剂借助静电附着在介导粒子上而形成的。
13.权利要求10～12中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
14.权利要求10～12中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
15.复合粒子的凝聚抑制剂，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
16.权利要求15所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
17.权利要求15所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
18.复合粒子的制备方法，该复合粒子是由作为药物的核酸附着在介导粒子上而形成的，其中包括在已分散有介导粒子的液体中，通过使作为药物的该核酸分散或者溶解而被含有，使作为药物的该核酸附着在该介导粒子上的步骤；所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
19.复合粒子的制备方法，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中包括在已分散有介导粒子的液体中，通过使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤，所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
20.权利要求19所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
21.权利要求19所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
22.权利要求19～21中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，药物是核酸。
23.权利要求18或者22所述的复合粒子的制备方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
24.权利要求18～23中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
25.权利要求18～23中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
26.权利要求18～25中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
27.权利要求18～25中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
28.按照权利要求18～27中任一项所述的复合粒子的制备方法制备的复合粒子。
29.复合粒子，其中含有介导粒子以及附着在该介导粒子上的作为药物的核酸；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
30.复合粒子，其中含有介导粒子、附着在该介导粒子上的药物、以及附着在该介导粒子上的附着竞争剂；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
31.权利要求30所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
32.权利要求30所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
33.权利要求30～32中任一项所述的复合粒子，其中，药物为核酸。
34.权利要求29或者33所述的复合粒子，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
35.权利要求29～34中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
36.权利要求29～34中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
37.权利要求29～36中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
38.权利要求29～36中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
39.包覆复合粒子的制备方法，包括配制含有极性有机溶剂的液体A液的步骤，其中分散有权利要求28～38中任一项所述的复合粒子并且溶解有包覆层成分；然后，通过使A液中的极性有机溶剂的比例减少，使复合粒子被由包覆层成分构成的包覆层包覆的步骤。
40.权利要求39所述的包覆复合粒子的制备方法，配制A液的步骤包括配制含有极性有机溶剂的液体B液的步骤，其中分散有权利要求28～38中任一项所述的复合粒子；配制将包覆层成分溶解于溶剂中而形成的液体C液的步骤，该溶剂中含有与B液中的极性有机溶剂相同或者不同的极性有机溶剂；以及，将B液与C液混合的步骤。
41.权利要求39或者40所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层为脂质膜。
42.权利要求41所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层含有水溶性高分子衍生物。
43.按照权利要求39～42中任一项所述的包覆复合粒子的制备方法制备的包覆复合粒子。
44.包覆复合粒子，由权利要求28～38中任一项所述的复合粒子以及包覆该复合粒子的包覆层构成，其中，构成该包覆层的包覆层成分为如下成分，该成分在含有极性溶剂的溶剂中，当极性溶剂的浓度相对提高时溶解、而相对降低时析出或者聚集，其中极性溶剂在溶剂中的浓度范围是该复合粒子不溶解但能够分散的浓度范围。
45.权利要求44所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为脂质膜。
46.权利要求45所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为含有水溶性高分子衍生物的包覆层。
47.权利要求44～46中任一项所述的包覆复合粒子，其中，包覆复合粒子的平均粒径在300nm以下。
全文摘要
本发明提供一种复合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子中，使该介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。另外还提供复合粒子的制备方法，该复合粒子由作为药物的核酸或者药物与附着竞争剂附着在介导粒子上而形成，其中包括在分散有介导粒子的液体中，使作为药物的该核酸或者药物和附着竞争剂分散或溶解，使作为药物的该核酸或者药物和附着竞争剂附着在该介导粒子上，其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
文档编号A61K9/10GK1929864SQ20058000758
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者山内雅博, 加藤泰己 申请人:协和发酵工业株式会社
技术领域：
本发明涉及复合粒子和包覆复合粒子以及它们的制备方法。
背景技术：
迄今，在药品、食品、农药、动物用药等中，关于包覆粒子的制备方法已公开了很多技术。粒子(被包覆的粒子)用包覆层包覆，是由于例如抑制了所受来自外部因素的影响，因此，为了使其选择性地接受外部因素的影响，以此作为引发器(扳机)引起粒子的变化等，而向粒子赋予功能为目的而进行的。
然而，在例如将小型粒子用包覆层包覆的场合，粒子彼此由于粒子间的范得华力或静电力、来自包覆层成分或液滴的交联的力等而凝聚，往往得到不是理想大小的包覆粒子。作为不是理想大小的包覆粒子，例如可列举出在例如经肺给药用微粒或静脉注射用微粒中，具有或是容易使气管或血管阻塞的大小、或是容易因机体的异物排除作用而被排泄的大小的包覆粒子等。
另一方面，作为核酸向细胞内的送达手段，已知有使用阳离子脂质体或阳离子聚合物的方法。但是，该方法中，在将含有核酸的阳离子脂质体或阳离子聚合物注射到静脉内之后，核酸被从血液中快速去除，在靶组织为肝脏和肺以外的场合，例如在肿瘤部位等的场合，不能把核酸送达至靶组织，从而不能充分发挥其应有的作用。因此，曾报导了一种可以解决核酸在血中被快速去除的问题的核酸封入脂质体(将核酸封入在脂质体内的脂质体)(参见特表2002-508765号公报、特表2002-501511号公报、Biochimica et Biophysica Acta，2001年，第1510卷，p.152-166和专利文献1)。在特表2002-508765号公报中，报导了用于制备含有核酸等粒子的方法，作为这种方法，例如将阳离子型脂质预先溶解于氯仿中，接着加入寡脱氧核苷酸(ODN)的水溶液和甲醇并混合后，经过离心分离，使阳离子型脂质/ODN的复合体转移至氯仿层，进而取出该氯仿层，向其中加入聚乙二醇衍生化磷脂、中性的脂质和水，形成油包水型(W/O)乳液，采用逆相蒸发法进行处理，从而制备ODN内包脂质体的方法；在特表2002-501511号公报和Biochimica et Biophysica Act中曾报告将ODN溶解于pH3.8的柠檬酸水溶液中，加入脂质(乙醇中)，将乙醇浓度降低至20vol％，从而配制成包封ODN的脂质体，进行粒度分级过滤，采用透析法除去过剩的乙醇后，将试样进一步在pH7.5下进行透析，除去附着在脂质体表面上的ODN，从而制备包封ODN的脂质体的方法，分别制成了封入各种核酸等有效成分的脂质体。
与此相对，在专利文献1中，曾报导采用在液体中用脂质膜包覆微粒的方法来制备封入了核酸等有效成分的脂质体。在该方法中，通过使微粒分散、并且使极性有机溶剂在溶解有脂质的含极性有机溶剂的水溶液中的比例减少，使微粒被脂质膜包覆，在液体中进行包覆，可以非常高效率地制备例如适于静脉注射用的微粒等那样大小的包覆微粒，另外，该专利文献1中还举出作为微粒例子的药物复合体。该药物复合体是导引(リ一ド)粒子(与下述的介导粒子的含义相同)与药物的复合粒子。包覆了该复合粒子的包覆复合粒子的粒径，根据所包覆的复合粒子而不同，据报告，包覆使ODN附着在作为介导粒子的阳离子脂质体上而制得的复合粒子而得到的包覆复合粒子，其粒径小，可以作为注射剂使用，该包覆复合粒子在静脉内给药的场合，显示出高的血中滞留性，较多地聚集在肿瘤组织中。
另一方面，近年来，siRNA作为药效比反义药物更好的药剂而引人注目[参见Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，2002年，第296卷，p.1000-1004]。迄今为止，关于siRNA在血中的动态虽还没有充分的报导，但可以预料，siRNA与反义药物相同，从血中快速消失而不转移至靶组织，因此，为了提高药物向靶组织的转移性，人们希望开发出某种载体[参见Biochimica et Biophysica Acta，1996年，第1281卷，p.139-149；J.Controlled Release，1996年，第41卷，p.121-130]。
专利文献1国际公开第02/28367号小册子发明内容发明要解决的课题本发明的目的在于提供一种药物附着在介导粒子上的复合粒子的凝聚抑制方法及其制备方法等。另外，本发明的目的还在于提供凝聚被抑制的复合粒子由包覆层包覆的包覆复合粒子的制备方法、能够采用该制备方法制备的包覆复合粒子等。
解决课题的手段本发明涉及以下的(1)～(47)。
(1)复合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子中，使该介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(2)上述(1)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。
(3)上述(1)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(4)上述(1)～(3)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物分散或者溶解而被含有，使药物附着在该介导粒子上而得到的。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物借助静电附着在介导粒子上而形成的。
(6)上述(1)～(5)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
(7)上述(1)～(6)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
(8)上述(1)～(7)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，药物为核酸。
(9)上述(8)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
(10)上述(1)～(9)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子为由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子。
(11)上述(10)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使药物和附着竞争剂附着在该介导粒子上而得到的。
(12)上述(10)或者(11)所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物和附着竞争剂借助静电附着在介导粒子上而形成的。
(13)上述(10)～(12)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
(14)上述(10)～(12)中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素(ケタラン硫酸)以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
(15)复合粒子的凝聚抑制剂，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(16)上述(15)所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
(17)上述(15)所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(18)复合粒子的制备方法，该复合粒子是由作为药物的核酸附着在介导粒子上而形成的，其中包括在含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂的介导粒子的分散液中，使作为药物的该核酸分散或者溶解而被含有，使作为药物的该核酸附着在该介导粒子上的步骤。
(19)复合粒子的制备方法，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中包括在含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂的介导粒子的分散液中，通过使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤。
(20)上述(19)所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
(21)上述(19)所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
(22)上述(19)～(21)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，药物是核酸。
(23)上述(18)或者(22)所述的复合粒子的制备方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
(24)上述(18)～(23)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
(25)上述(18)～(23)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(26)上述(18)～(25)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
(27)上述(18)～(25)中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
(28)按照上述(18)～(27)中任一项所述的复合粒子的制备方法制备的复合粒子。
(29)复合粒子，其中含有介导粒子以及附着在该介导粒子上的作为药物的核酸；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(30)复合粒子，其中含有介导粒子、附着在该介导粒子上的药物、以及附着在该介导粒子上的附着竞争剂；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
(31)上述(30)所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
(32)上述(30)所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
(33)上述(30)～(32)中任一项所述的复合粒子，其中，药物为核酸。
(34)上述(29)或者(33)所述的复合粒子，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
(35)上述(29)～(34)中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
(36)上述(29)～(34)中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
(37)上述(29)～(36)中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
(38)上述(29)～(36)中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
(39)包覆复合粒子的制备方法，包括配制含有极性有机溶剂的液体(A液)的步骤，其中分散有上述(28)～(38)中任一项所述的复合粒子并且溶解有包覆层成分；然后，通过使A液中的极性有机溶剂的比例减少，使复合粒子被由包覆层成分构成的包覆层包覆的步骤。
(40)上述(39)所述的包覆复合粒子的制备方法，配制A液的步骤包括配制含有极性有机溶剂的液体(B液)的步骤，其中分散有上述(28)～(38)中任一项所述的复合粒子；配制将包覆层成分溶解于溶剂中而形成的液体(C液)的步骤，该溶剂中含有与B液中的极性有机溶剂相同或者不同的极性有机溶剂；以及，将B液与C液混合的步骤。
(41)上述(39)或者(40)所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层为脂质膜。
(42)上述(41)所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层含有水溶性高分子衍生物。
(43)按照上述(39)～(42)中任一项所述的包覆复合粒子的制备方法制备的包覆复合粒子。
(44)包覆复合粒子，由上述(28)～(38)中任一项所述的复合粒子以及包覆该复合粒子的包覆层构成，其中，构成该包覆层的包覆层成分是这样一种成分，即，在含有极性溶剂的溶剂中，当极性溶剂的浓度相对提高时溶解、而相对降低时析出或者聚集，其中极性溶剂在溶剂中的浓度范围是该复合粒子不溶解但能够分散的浓度范围。
(45)上述(44)所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为脂质膜。
(46)上述(45)所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为含有水溶性高分子衍生物的包覆层。
(47)上述(44)～(46)中任一项所述的包覆复合粒子，其中，包覆复合粒子的平均粒径在300nm以下。
发明的效果本发明提供一种药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法、其制备方法等，还提供凝聚被抑制的、由包覆层将复合粒子包覆了的包覆复合粒子的制备方法、可以采用该制备方法制备的包覆复合粒子等。
具体实施例方式
本发明中所述复合粒子是指至少含有介导粒子和药物并且药物附着在介导粒子上的粒子。
上述药物(以下称为药物A)是在本发明的复合粒子中附着在介导粒子上的药物，优选是静电附着在介导粒子上的药物，其中包含由于药物分子内的电荷或者由于分子内的极化等原因而导致产生朝向阳离子或者阴离子的静电引力的物质。可列举出例如蛋白质、肽、核酸、低分子化合物、糖类、高分子化合物等具有药理学活性的物质等，优选可列举出核酸，更优选可列举出基因、DNA、RNA、寡核苷酸(ODN)、质粒和siRNA，进一步优选可列举出质粒和siRNA。
作为蛋白质或者肽，可列举出例如缓激肽、血管紧张肽、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、缩胆囊素、β-内啡肽、促黑素细胞抑制因子、促黑素、胃泌素拮抗剂、神经降压素、生长抑素、二甲氧基马钱子碱、环孢霉素、脑啡肽、铁传递蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽、甲状腺素、生长素、促性腺激素、促黄体生成素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸酶、羧肽酶、谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活剂、链激酶、白细胞介素、干扰素、胞壁酰二肽、胸腺生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生长素、血小板生成素、胰蛋白酶抑制剂、溶菌酶、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子、神经生长因子、来自血小板的生长因子、转化生长因子、内皮细胞生长因子、成纤维细胞(纤维母细胞)生长因子、胶质细胞生长因子、胸腺素、特异抗体(可列举出例如，抗EGF受体抗体等)等。
作为核酸，可列举出例如反义寡核苷酸、有义寡核苷酸等的ODN、基因、DNA、RNA、质粒、siRNA等，该核酸也包含在核酸结构中的磷酸部分、酯部分等中所含的氧原子等被替代成例如硫原子等其他的原子而形成的衍生物。应予说明，siRNA是指短的双链RNA。
作为低分子化合物，可列举出例如ε-氨基己酸、盐酸精氨酸、L-天冬氨酸钾、氨甲环酸、硫酸博莱霉素、硫酸长春新碱、头孢唑啉钠、头孢噻吩钠、胞磷胆碱、阿糖胞苷、硫酸庆大霉素、盐酸万古霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星等。
作为糖类，可列举出例如硫酸软骨素钠、肝素钠、葡聚糖荧光素等。
作为高分子化合物，可列举出例如聚乙烯磺酸钠、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物(DIVEMA)、苯乙烯马来酸酐共聚物-新制癌菌素结合体(SMANCS)等。
本发明中所述介导粒子是指以例如药物、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等作为构成成分的微粒，优选以脂质体为构成成分的微粒。本发明中的介导粒子也可以由药物、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等之中的2种以上组合而成的复合体作为构成成分，也可以由药物、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等与其他的化合物(例如糖、脂质、无机化合物等)组合而成的复合体作为构成成分。
作为介导粒子的构成成分的药物(以下称为药物B)，包括在分散有下述的介导粒子的溶剂中呈粒子形态的药物；与上述其他的化合物一起形成复合体进而在分散有下述的介导粒子的溶剂中呈粒子形态的药物等。可列举出例如脂质性药物、高分子药物、金属药物等，具体地可列举出顺铂、维生素D、维生素E、香菇多糖等。
脂质聚集体或者脂质体由例如脂质和/或表面活性剂等构成，作为脂质，为单纯脂质、复合脂质或者衍生脂质均可，可列举出例如磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘脂类(sphingoid)、固醇类等，优选可列举出磷脂。另外，作为脂质，还可列举出例如表面活性剂(与下述的表面活性剂的含义相同)、高分子(与下述的高分子的含义相同，具体为葡聚糖等)、聚氧乙烯衍生物(具体为聚乙二醇等)等的脂质衍生物，优选可列举出聚乙二醇衍生化磷脂。作为表面活性剂，可列举出例如非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂等。
作为磷脂，可列举出例如磷脂酰胆碱(具体为大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱等)、磷脂酰乙醇胺(具体为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺等)、甘油磷脂(具体为磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱等)、鞘类磷脂(具体为(神经)鞘磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油、神经酰胺磷酸甘油酸(セラミドホスホグリセロリン酸)等)、甘油磷酸脂(glycerophosphono)、鞘类磷酸脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具体为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)、氢化磷脂(具体为氢化磷脂酰胆碱等)等的天然或者合成的磷脂。
作为甘油糖脂，可列举出例如亚硫酸核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基甘油二酯、二半乳糖甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、糖基二甘油酯等。
作为鞘糖脂，可列举出例如半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂等。
作为鞘脂类，可列举出例如sphingan、icosasphingan、鞘氨醇、它们的衍生物等。作为衍生物，可列举出例如由sphingan、icosasphingan、鞘氨醇等中的-NH2转变成-NHCO(CH2)xCH3(式中，x表示0～18的整数，其中优选6、12或18)而成的衍生物等。
作为固醇类，可列举出例如胆固醇、二氢胆固醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角固醇、岩藻甾醇、3β-[N-(N′N′-二甲氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)等。
作为其他的脂质，还可列举出例如N-[1-(2，3-二油酰基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油酰基丙基)]-N，N-二甲胺(DODAP)、N-[1-(2，3-二油酰氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、N-[1-(2，3-二(十四烷氧基)丙基)]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油酰氧基丙基)]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)等。
作为非离子型表面活性剂，可列举出例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(具体为聚山梨酯80等)、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇(具体为Pluronic F68等)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(具体为山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具体为聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂基醇等)、脂肪酸甘油酯等。
作为阴离子型表面活性剂，可列举出例如酰基肌氨酸、烷基硫酸钠、烷基苯磺酸盐、碳数7～22的脂肪酸钠等。具体地可列举出十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠等。
作为阳离子型表面活性剂，可列举出例如烷基胺盐、酰基胺盐、季铵盐、胺衍生物等。具体地可列举出苯扎氯铵、酰氨基乙基二乙胺盐、N-烷基多烷基多胺盐、脂肪酸多亚乙基多酰胺、鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、烷基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙胺、脂肪酸三乙醇胺酯等。
作为两性表面活性剂，可列举出例如3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸等。
在脂质体中，这些脂质和表面活性剂可以单独地或者组合使用，优选组合使用。作为组合使用场合的组合，可列举出例如从氢化大豆磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇中选出的2种成分以上的组合；从二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇中选出的2种成分以上的组合；EPC与DOTAP的组合；EPC、DOTAP和聚乙二醇衍生化磷脂的组合；EPC、DOTAP、胆固醇和聚乙二醇衍生化磷脂的组合等。
另外，在脂质体中，根据需要，还可以含有例如胆固醇等固醇类等的膜稳定化剂，例如生育酚等抗氧化剂等。
作为脂质聚集体，可列举出例如球状胶束、球状反胶束、香肠状胶束、香肠状反胶束、板状胶束、板状反胶束、六角形I、六角形II和脂质2分子以上组成的聚集体等。
作为乳液粒子，可列举出例如由脂肪乳剂、非离子型表面活性剂与大豆油形成的乳液、脂质乳剂、脂质纳米球等水包油型(O/W)乳液和水包油包水型(W/O/W)乳液粒子等。
作为高分子，可列举出例如白蛋白、葡聚糖、壳聚糖、硫酸葡聚糖、DNA等天然高分子；例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰树枝状聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚羟基乙酸、聚乙二醇化聚乳酸等合成高分子、以及它们的盐等。
在此，高分子的盐包括例如金属盐、铵盐、酸加成盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，可列举出例如锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐、镁盐、钙盐等碱土类金属盐、铝盐、锌盐等；作为铵盐，可列举出例如铵、四甲基铵等的盐；作为酸加成盐，可列举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐、以及乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐；作为有机胺加成盐，可列举出例如吗啉、哌啶等的加成盐；作为氨基酸加成盐，可列举出例如甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸等的加成盐。
作为金属胶体，可列举出例如含有金、银、铂、铜、铑、氧化硅、钙、铝、铁、铟、镉、钡、铅等的金属胶体。
作为微粒制剂，可列举出例如微球、微胶囊、纳米晶体、脂类纳米粒子、高分子胶束等。
另外，优选地，介导粒子具有与药物A静电相反的电荷。此处所述与药物A静电相反的电荷，包括相对于药物分子内的电荷、分子内的极化等产生静电引力的电荷、表面极化等。为了使介导粒子具有与药物A静电相反的电荷，优选地，介导粒子含有具有与药物A静电相反的电荷的带电物质，更优选地，介导粒子含有具有与药物A静电相反的电荷的脂质(下述的阳离子型脂质或者阴离子型脂质)。
介导粒子中所含有的带电物质，可分为呈阳离子性的阳离子型物质和呈阴离子性的阴离子型物质两类，不过即使是具有阳离子性基团和阴离子性基团二者的两性物质，由于pH值的影响或者由于与其他物质的结合等而使相对阴性度发生变化，相应于各种情况，可以将其归类为阳离子型物质或者阴离子型物质。这些带电物质作为上述介导粒子的构成成分使用，或者加入到该介导粒子的构成成分中使用均可。
作为阳离子型物质，可列举出例如上述的介导粒子的定义中所示例的那些中的阳离子型物质[具体为阳离子型脂质、阳离子型表面活性剂(与上述同义)、阳离子型高分子等]、在等电点以下的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽等。
作为阳离子型脂质，可列举出例如DOTAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIE、DC-Chol等。
作为阳离子型高分子，可列举出例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、polyfect、壳聚糖等。
作为在等电点以下的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽，只要是在该物质的等电点以下的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽就没有特别限定。可列举出例如白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、胃蛋白酶、核糖核酸酶T1等。
作为阴离子型物质，可列举出例如在上述的介导粒子的定义中所示例的那些物质中的阴离子型物质[具体为阴离子型脂质、阴离子型表面活性剂(与上述同义)、阴离子型高分子等]、在等电点以上的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽、核酸等。
作为阴离子型脂质，可列举出例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
作为阴离子型高分子，可列举出例如聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰树枝状聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚羟基乙酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、阴离子性葡聚糖荧光素等。
作为在等电点以上的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽，只要是在该物质的等电点以上的值的pH下能够形成复合体的蛋白质或者肽就没有特别限定。可列举出例如白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、组蛋白、鱼精蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等。
作为阴离子型物质的核酸，可列举出例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等，只要是不显示生理活性的，不管其长度和序列如何，均可使用。
在本发明中，作为介导粒子中所含有的选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，优选可列举出糖脂、或者水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，具体地可列举出例如聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。另外，更优选可列举出水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。本发明中选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物以及表面活性剂，其分子的一部分由于例如疏水性亲合力、静电力等而具有与介导粒子的构成成分结合的性质，而分子的其他部分则由于例如亲水性亲合力、静电力等而具有与制备介导粒子时的溶剂结合的性质，优选是具有这两方面性能的物质。以下，将选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂表示为凝聚抑制物质。
作为从糖、肽和核酸中选出的1种以上物质的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出由例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等的糖，例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽、谷胱甘肽等的肽，例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等的核酸等，与例如在上述介导粒子的定义中所列举的脂质等或者例如硬脂酸、棕榈酸、月桂酸等的脂肪酸结合而形成的衍生物等。
作为糖的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出例如在上述介导粒子的定义中所列举的甘油糖脂、鞘类糖脂等。
作为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出由例如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、低聚糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬氨酰胺(polyaspartate amide)、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、低聚甘油等或者它们的衍生物，与例如在上述介导粒子的定义中所列举的脂质结合，或者与例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸结合而形成的衍生物等，更优选可列举出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，进一步优选可列举出聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
作为聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出例如聚乙二醇化脂质[具体为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具体为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)等)、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、Cremophor EL等]、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类(具体为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯等)、聚乙二醇脂肪酸酯类等，更优选可列举出聚乙二醇化脂质。
作为聚甘油衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可列举出例如聚甘油化脂质(具体为聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)、聚甘油脂肪酸酯等，更优选可列举出聚甘油化脂质。
作为表面活性剂，可列举出例如在上述介导粒子的定义中所列举的表面活性剂、聚乙二醇烷基醚等，优选可列举出聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。
作为本发明中的附着竞争剂，可列举出例如具有与药物A静电相同的电荷的物质等，包含因分子内的电荷、分子内的极化等产生的朝向阳离子或者阴离子的静电引力而静电附着在介导粒子上的物质，可列举出例如脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽、高分子等。作为脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子，可列举出例如在上述荷电物质的定义中所列举的阳离子型脂质、阴离子型脂质、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、核酸、蛋白质、肽、阳离子型高分子、阴离子型高分子等，优选可列举出在上述荷电物质的定义中所列举的阳离子型高分子、阴离子型高分子等，更优选可列举出硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、阴离子性葡聚糖荧光素、聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、polyfect、壳聚糖等中选出的1种以上的物质。附着竞争剂优选静电附着在介导粒子上，优选为即使附着在介导粒子上也不会使象介导粒子凝聚那样的交联形成的那样大小的物质，或者优选为在分子内具有能够排斥介导粒子附着的部分从而抑制该介导粒子凝聚的物质。另外，特别是在上述药物A为分子量5000以上的大分子药物(例如基因、DNA、RNA、质粒、siRNA等)的场合，进一步使附着竞争剂附着在介导粒子上，这是本发明的最优选的方案之一。
本发明的凝聚抑制剂可以含有本发明中的凝聚抑制物质，而且，在不妨碍该凝聚抑制物质的凝聚抑制作用的前提下，也可以含有其他的任何物质。
在本发明中，药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制，可以通过使该介导粒子含有凝聚抑制物质来实现，具体地说，例如，在已分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中，使药物分散或者溶解而被含有，使药物附着在该介导粒子上而得到的，这样就可以在该复合粒子的制备过程中抑制该复合粒子的凝聚和/或在制备后抑制该复合粒子的凝聚。另外，优选地，当将药物A分散或者溶解而使其被含有时，可以使其进一步含有附着竞争剂，从而使附着竞争剂与药物一起附着在该介导粒子上，由此可以进一步抑制复合粒子的凝聚。
更具体地说，本发明的凝聚抑制方法可以采用使药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的制备方法来实施，该方法包括例如以下几个步骤制备一种分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体的步骤，以及在分散有介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物A的步骤(例如向分散有介导粒子的液体中加入药物A并使其分散或者溶解的步骤、向分散有介导粒子的液体中加入分散或者溶解了药物A的液体的步骤等)。此处，作为按照在分散有介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物A的步骤而得到的复合粒子，具体地可列举出例如在分散有以含有阳离子型脂质的脂质体为构成成分的微粒的液体中，通过分散或者溶解来使该液体含有作为药物的核酸，在以含有阳离子型脂质的脂质体作为构成成分的微粒上附着作为药物的核酸而形成的复合粒子，同样地，在以含有阳离子型脂质的脂质聚集体作为构成成分的微粒上附着作为药物的核酸而形成的复合粒子，在以含有聚-L-赖氨酸等阳离子型高分子的高分子作为构成成分的微粒上附着作为药物的核酸的复合粒子，在以含有磷脂酸等阴离子型脂质的脂质体或者脂质聚集体作为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子，在以含有苯乙烯马来酸等阴离子型高分子的高分子为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子，在以含有聚-L-赖氨酸等阳离子型高分子的高分子作为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子，在以含有阳离子型脂质的脂质体或者脂质聚集体作为构成成分的微粒上附着蛋白质的复合粒子等。另外，在分散有介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物A的步骤，优选是在分散或者溶解有药物A的液体中还含有附着竞争剂，然后将该液体加入到分散有介导粒子的液体中的步骤，在该场合，使药物A与附着竞争剂一起附着到介导粒子上来制备复合粒子，这样就可以在复合粒子的制备中抑制该复合粒子的凝聚以及在制备后抑制该复合粒子的凝聚。
含有凝聚抑制物质的介导粒子可以按照公知的制备方法或者按照类似的方法来制备，只要是能使介导粒子中含有凝聚抑制物质，任何的制备方法均可用来制备。例如，为了制备一种作为介导粒子之一的以含有凝聚抑制物质的脂质体为构成成分的微粒，可以采用公知的脂质体的制备方法。作为公知的脂质体的制备方法，可列举出例如Bangham等人的脂质体制备法[参见“J.Mol.Biol.”，1965年，第13卷，p.238-252]、乙醇注入法[参见“J.Cell Biol.”，1975年，第66卷，p.621-634]、French Press法[参见“FEBS Lett.”，1979年，第99卷，p.210-214]、冷冻熔融法[参见“Arch.Biochem.Biophys.”，1981年，第212卷，p.186-194]、逆相蒸发法[参见“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，1978年，第75卷，p.4194-4198]、pH梯度法(参见例如专利第2572554号公报、专利第2659136号公报等)等。作为制备脂质体时使脂质体混悬的溶液，可以使用例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等。另外，在制备脂质体时，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等的抗氧化剂；例如甘油、葡萄糖、氯化钠等的等渗剂等。另外，也可以通过将脂质等溶解于例如乙醇等有机溶剂中，蒸馏除去溶剂后，添加生理盐水等，振荡搅拌，使其形成脂质体来制备脂质体。
另外，也可以利用例如非离子型表面活性剂(与上述同义)、阳离子型表面活性剂(与上述同义)、阴离子型表面活性剂(与上述同义)、高分子、聚氧乙烯衍生物等任意地进行脂质体的表面改性，这些表面改性的脂质体也可以作为本发明中的介导粒子的构成成分使用[参见D.D.Lasic，F.Martin编，“Stealth Liposomes”，(美国)，CRC Press Inc，1995年，p.93-102]。作为高分子，可列举出例如葡聚糖、普鲁兰多糖、甘露聚糖、支链淀粉、羟乙基淀粉等。作为聚氧乙烯衍生物，可列举出例如聚山梨酯80、Pluronic F68、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇、PEG-DSPE等。脂质体的表面改性，可以采用使介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂的方法之一。
脂质体的平均粒径可以根据希望自由选择。作为调节平均粒径的方法，可列举出例如挤压法、将大的多室脂质体(MLV)机械粉碎(具体使用Manton-gaulin、微流体化仪(microfluidizer)等)的方法[参见R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm编著，“Emulsion andNanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs”，德国，Scientific Publishers Stuttgart，1998年，p.267-294]等。
另外，将构成介导粒子的例如从药物B、脂质聚集体、脂质体、乳液粒子、高分子、金属胶体、微粒制剂等中选出的2种以上组合而成的复合体的制备方法，可以是例如仅仅在水中将药物B与脂质或高分子等混合的制备方法，此时，如果需要，还可以增加整粒步骤或无菌化步骤等。另外，复合体的形成也可以在例如丙酮、醚等各种溶剂中进行。
在本发明的药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法中，凝聚抑制物质相对于介导粒子全体的比例，按重量比计，优选1∶0.9～1∶0.01，更优选1∶0.7～1∶0.1，进一步优选1∶0.6～1∶0.2，最优选1∶0.5～1∶0.3。
作为介导粒子的大小，平均粒径优选为10nm～300nm，更优选为50nm～150nm，进一步优选为50nm～100nm。
用于使介导粒子分散的溶剂，是那些不溶解介导粒子的溶剂，在复合粒子的制备步骤中，优选是不妨碍药物A附着在介导粒子上的溶剂。作为用于使介导粒子分散的溶剂，可列举出例如含有水等的溶剂，优选可列举出水。另一方面，作为介导粒子，优选在例如水等中分散的介导粒子。在制备介导粒子时使用的溶剂为水的场合，可以在相同液体中，在制备介导粒子之后，接着制备复合粒子。
在向分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中，通过分散或者溶解来使该液体含有药物A或者药物A与附着竞争剂的步骤中，在该分散有介导粒子的液体中加入分散或者溶解有药物A或者药物A与附着竞争剂的液体的场合，作为可使药物A或者药物A与附着竞争剂分散或者溶解的液体使用的溶剂，只要是在该分散有介导粒子的液体与分散或者溶解有药物A或者药物A和附着竞争剂的液体混合后的混合液中，不会妨碍药物A附着在该介导粒子上的溶剂，任何一种溶剂均可以使用。作为使药物A或者药物A和附着竞争剂分散或者溶解的溶剂，可列举出例如含有水等的溶剂，优选可列举出水。另一方面，作为药物A和附着竞争剂，分别优选能够溶解或者分散在例如水等中的药物A和附着竞争剂，进一步分别优选能够溶解在水中的药物A和附着竞争剂。
介导粒子在分散有介导粒子的液体中所占的比例，只要能够使药物A或者药物A和附着竞争剂附着在介导粒子上就没有特殊限定，优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～500mg/mL。另外，在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中，通过分散或者溶解来使该液体含有药物A或者药物A和附着竞争剂的步骤中，在向该分散有介导粒子的液体中加入分散或者溶解有药物A或者药物A和附着竞争剂的液体的场合，药物A和附着竞争剂的总量相对于分散或者溶解有药物A或者药物A和附着竞争剂的液体的比例，只要能够使药物A或者药物A和附着竞争剂附着在介导粒子上就没有特殊限定，优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～400mg/mL。药物A和附着竞争剂的总量相对于介导粒子的比例，按重量比计，优选为1∶1～1000∶1，更优选为2∶1～200∶1。
本发明的复合粒子，是含有一种含有凝聚抑制物质的介导粒子、以及作为附着在该介导粒子上的药物的核酸、或者附着在该介导粒子上的药物和附着在该介导粒子上的附着竞争剂的复合粒子，本发明的复合粒子中的各构成成分的定义与上述各定义相同。
本发明的复合粒子的制备方法是包括在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有作为药物的核酸或者药物和附着竞争剂，从而使该核酸或者该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤的制备方法。包括在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有作为药物的核酸，从而使该核酸附着在该介导粒子上的步骤的制备方法，在上述本发明的药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法的说明中，可以把药物作为核酸，采用同样的方法来实施。包括在分散有含有凝聚抑制物质的介导粒子的液体中通过分散或者溶解来使该液体含有药物和附着竞争剂，从而使该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤的制备方法，可以采用与上述本发明的药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法的说明中使用附着竞争剂的场合的说明中所记载的同样的方法来实施。
本发明中的复合粒子和本发明的复合粒子的大小，其平均粒径优选为50nm～300nm，更优选为50nm～200nm，进一步优选为50nm～150nm。
另外，在本发明中的复合粒子和本发明的复合粒子的制备步骤之后，通过加入荷电物质或者分散或者溶解有荷电物质的液体，也可以使荷电物质附着在该复合粒子上，从而得到多重复合粒子。例如，利用阳离子型物质和凝聚抑制物质在水中配制以作为介导粒子的脂质体为构成成分的微粒，然后，添加作为药物A的例如核酸(优选同时添加附着竞争剂)，进而添加例如阴离子型物质，也可以制成多重复合粒子。另外，本发明中的复合粒子和本发明的复合粒子，也可以制成包覆复合粒子。
本发明的包覆复合粒子是一类至少由本发明的复合粒子和包覆该复合粒子的包覆层构成的包覆复合粒子，例如是这样一类包覆复合粒子等，其中，构成该包覆层的包覆层成分，在含有极性溶剂的溶剂中，当极性溶剂的浓度相对提高时溶解、而相对降低时析出或者聚集，所述极性溶剂在溶剂中的浓度范围是该复合粒子不溶解但能够分散的浓度范围。
作为本发明的包覆复合粒子中构成包覆层的包覆层成分，可列举出例如在上述介导粒子的定义中所列举的脂质、表面活性剂、高分子等，优选可列举出上述介导粒子的定义中所列举的从脂质和表面活性剂中选出的1种以上的物质，更优选可列举出当包覆层为脂质膜时，是从脂质和表面活性剂中选出的1种以上的物质，进一步优选可列举出磷脂。
另外，作为在包覆层为脂质膜的场合使用的脂质，还可列举出例如合成脂质等。作为合成脂质，可列举出例如含氟磷脂酰胆碱、含氟表面活性剂、二烷基溴化铵等，它们可以单独使用或者与其他脂质等组合使用。另外，在包覆层为脂质膜的场合，包覆层优选含有水溶性高分子衍生物。作为水溶性高分子衍生物，可列举出例如在上述凝聚抑制物质的定义中所示例的水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物等，优选可列举出在上述凝聚抑制物质的定义中所示例的聚乙二醇衍生化磷脂等。另外，作为水溶性高分子衍生物，更优选具有以下两方面性质的物质，即，其分子的一部分具有通过例如亲水性亲合力、静电力等与本发明中的凝聚抑制物质或者附着竞争剂相结合的性质、而其他部分具有通过例如疏水性亲合力、静电力等与其他的包覆层成分相结合的性质；通过使用上述物质，可以提高本发明的复合粒子的包覆效率。水溶性高分子衍生物相对于包覆层成分全体的比例，按重量比计，优选为1∶0.5～1∶0.01，更优选为1∶0.25～1∶0.01，进一步优选为1∶0.15～1∶0.02。
本发明的包覆复合粒子可以采用这样一种制备方法来制备，该制备方法包括，例如配制含有一种能使本发明的复合粒子分散且能使包覆层成分溶解的极性有机溶剂的液体(A液)的步骤；接着，通过减少A液中的极性有机溶剂的比例来使复合粒子被包覆层包覆的步骤；在该场合，该包覆复合粒子以混悬液(D液)的形态获得。A液中的溶剂是使复合粒子不溶解、但可使包覆层成分溶解的溶剂，在减少了A液中的极性有机溶剂的比例的D液中，复合粒子不溶解，而包覆层成分或者不溶解，或者凝聚。在A液中的溶剂为单独的极性有机溶剂的场合，优选缓慢地加入一种溶剂(E液)，该E液含有例如可与该极性有机溶剂混合的该极性有机溶剂以外的溶剂，由此可以使该极性有机溶剂的比例相对减少。此处，E液是含有该极性有机溶剂以外的溶剂的溶剂，但是也可以含有极性有机溶剂。另外，在A液中的溶剂为由极性有机溶剂与该极性有机溶剂以外的溶剂形成的混合液的场合，可以通过加入溶剂(F液)，该F液含有例如可与极性有机溶剂混合的该极性有机溶剂以外的溶剂，和/或，通过蒸馏、半透膜分离、分馏等，选择性地除去极性有机溶剂，从而可以使该极性有机溶剂的比例减少。此处，F液是含有该极性有机溶剂以外的溶剂的溶剂，F液也可以含有极性有机溶剂，只要其比例低于A液中的极性有机溶剂的比例即可。作为极性有机溶剂，可列举出例如甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇等醇类；甘油、乙二醇、丙二醇等二醇类；聚乙二醇等的聚亚烷基二醇类等，优选可列举出乙醇。作为极性有机溶剂以外的溶剂，可列举出例如水、液体二氧化碳、液体烃、卤化碳、卤代烃等，优选可列举出水。另外，A液、E液和F液也可以含有离子、缓冲成分等。
极性有机溶剂与该极性有机溶剂以外的溶剂的组合，优选是可相互混合的组合，可以根据上述复合粒子和上述包覆层成分在A液和D液的溶剂中以及在E液和F液中的溶解度等来选择。另一方面，对于上述复合粒子，优选在A液和D液的溶剂中以及在E液和F液的任一种溶剂中的溶解度低，而且优选在极性有机溶剂和该极性有机溶剂以外的溶剂的任一种溶剂中的溶解度也低，而包覆层成分优选在D液的溶剂中和在F液中的溶解度低并优选在A液的溶剂中和在E液中的溶解度高，而且优选在极性有机溶剂中的溶解度高并优选在该极性有机溶剂以外的溶剂中的溶解度低。此处，复合粒子的溶解度低是指复合粒子中所含有的介导粒子、药物A和附着竞争剂等各成分在该溶剂中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，但只要通过各成分间的结合等，各成分的溶出性也能变小即可。例如，即使在介导粒子中所含有的成分中的任一种在A液的溶剂中的溶解度高的场合，只要附着竞争剂在A液的溶剂中的溶解度低，就可以抑制复合粒子中的其他成分的溶出，从而可以降低复合粒子在A液的溶剂中的溶解度。即，在选择性地使用与复合粒子中的其他成分在A液的溶剂中的溶解度相比，在A液的溶剂中的溶解度低的附着竞争剂的场合，附着竞争剂在制备包覆复合粒子的过程中具有抑制复合粒子的其他成分的溶出，从而提高生产率和合格率的效果。
A液中的极性有机溶剂的比例，只要满足不使本发明的复合粒子溶解地存在、而只是使包覆该复合粒子的包覆层成分溶解的条件，就没有特殊限定，根据所使用的溶剂、复合粒子和包覆层成分的种类等的不同而异，但优选为30vol％以上，更优选为60～90vol％。另外，D液中的极性有机溶剂的比例，只要是能使包覆层成分在本发明的复合粒子表面上形成包覆层的比例，就没有特殊限定，但优选为50vol％以下。
作为配制A液的步骤，只要上述复合粒子不溶解，则按照任何顺序添加上述极性有机溶剂、上述复合粒子和上述包覆层成分、或者上述极性有机溶剂、上述复合粒子、上述包覆层成分和上述极性有机溶剂以外的溶剂来配制A液的步骤均是可以的，优选可列举出，首先配制含有其中分散有本发明复合粒子的极性有机溶剂的液体(B液)，另外配制使包覆层成分溶解在含有与B液中的极性有机溶剂相同或者不同的极性有机溶剂的溶剂中而形成的液体(C液)，然后将B液与C液混合来配制A液的步骤。在将B液与C液混合来配制A液时，优选缓慢地混合。
作为例如包覆层为脂质膜的本发明的包覆复合粒子的优选制备方法，可列举出以下的方法。
(步骤1)使本发明的复合粒子分散(混悬)于含有极性有机溶剂的水溶液、优选含有乙醇等醇类的水溶液中。
(步骤2)将构成脂质膜的脂质和/或表面活性剂(构成脂质膜的成分)溶解于一种含有与上述含有极性有机溶剂的水溶液相同或者不同的含有极性有机溶剂的水溶液中、优选溶解于相同的含有极性有机溶剂的水溶液或者极性有机溶剂中。此时，也可以进一步添加水溶性高分子衍生物(例如聚乙二醇修饰脂质衍生物等)，此处，对添加的水溶性高分子衍生物的量没有特殊限定。
(步骤3)将步骤1中得到的液体与步骤2中得到的液体混合。
(步骤4)向步骤3中得到的混合液中逐次少量添加水、或者将该混合液透析、或者从该混合液中蒸馏除去极性有机溶剂，来使该混合液中的极性有机溶剂的相对比例减少，以混悬液的形态获得被脂质膜包覆的包覆复合粒子。
不管所使用的复合粒子的种类和所使用的包覆层成分的种类是什么，都可以采用基本上与上述同样的方法来制备本发明的包覆复合粒子。对于介导粒子是以脂质体为构成成分的微粒、包覆层成分为脂质和/或表面活性剂、包覆层为脂质膜的包覆复合粒子，从其构成考虑，可分类为狭义的脂质体；而对于介导粒子是以脂质体为构成成分的微粒以外的粒子，包覆层成分为脂质和/或表面活性剂、包覆层为脂质膜的包覆复合粒子，可分类为广义的脂质体。在本发明中，更优选介导粒子的构成成分和包覆复合粒子均为脂质体。
在本发明的包覆复合粒子的制备方法中所使用的本发明的复合粒子在A液和B液中的比例，只要该复合粒子能够被包覆层成分包覆，就没有特殊限定，但优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～500mg/mL。另外，所使用的包覆层成分(例如脂质等)在A液和C液中的比例，只要能够包覆本发明的复合粒子，就没有特殊限定，但优选为1μg/mL～1g/mL，更优选为0.1～400mg/mL。包覆层成分相对于本发明的复合粒子的比例，按重量比计，优选为1∶0.1～1∶1000，更优选为1∶1～1∶10。
另外，本发明的包覆复合粒子和采用本发明的包覆复合粒子的制备方法得到的包覆复合粒子的大小，其平均粒径优选为350nm以下，更优选为300nm以下，进一步优选为200nm以下。具体地优选为例如可注射的大小。
进而，也可以用抗体等蛋白质、糖类、糖脂、氨基酸、核酸、各种低分子化合物、高分子化合物等物质对上述得到的包覆复合粒子进行修饰，这样得到的包覆复合粒子也包括在本发明的包覆复合粒子中。例如，为了应用于靶向制剂，也可以进一步用抗体等蛋白质、肽、脂肪酸类等对上述得到的包覆复合粒子进行脂质膜表面修饰[参见D.D.Lasic、F.Martin编，Stea1th Liposomes，(美国)，CRC Press Inc.，1995年，p.93-102]，另外，与对作为介导粒子的构成成分的脂质体的处理相同地，也可以用例如非离子型表面活性剂(与上述同义)、阳离子型表面活性剂(与上述同义)、阴离子型表面活性剂(与上述同义)、高分子(与上述同义)、聚氧乙烯衍生物(与上述同义)等任意地进行表面改性，这些经过脂质膜表面修饰或者表面改性的粒子也包括在本发明的包覆复合粒子中。
本发明的包覆复合粒子，为了达到例如药剂对血液成分等机体成分、胃肠道消化液等的稳定化、副作用的降低、药剂在肿瘤等的靶脏器中的集聚性增大、经口或经粘膜的药剂的吸收的改善等目的而制成制剂使用。
在将本发明的包覆复合粒子制成制剂使用的场合，可以将采用上述方法配制的包覆复合粒子的混悬液直接以例如注射剂等形式使用，也可以采用例如过滤、离心分离等方法从该混悬液中除去溶剂来使用，也可以将该混悬液、或者将加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘氨酸等赋形剂的该混悬液冷冻干燥后使用。
在注射剂的场合，优选向上述的包覆复合粒子的混悬液或者将上述的溶剂除去或者冷冻干燥的包覆复合粒子中混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等来配制注射剂。另外，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA等抗氧化剂，甘油、葡萄糖、氯化钠等的等渗剂等来制备注射剂。另外，也可以加入例如甘油等的冷冻保存剂进行冷冻保存。
另外，本发明的包覆复合粒子也可以与适当的赋形剂等一起进行制粒、干燥等，加工成例如胶囊剂、片剂、颗粒剂等口服用制剂。
下面，用实施例具体地说明本发明。但本发明不受这些实施例的限定。
应予说明，本实施例中所使用的ODN是硫代磷酸酯(ホスホロチオエ一ト)型、20mer、5’端为FITC标记、5’ACTAGTGGCTAGCGAATCTC3’、宝生物公司制。
另外，本实施例中所使用的质粒，为含有连结到CAG启动子上的β-半乳糖苷酶基因的8.5kb的质粒(以下记做pCAG-LacZ)、或者含有连结到CAG启动子的RLuc基因的6.1kb的质粒(以下记做pCAG-RLuc)。
pCAG-Rluc质粒按照以下的方法制备。
将质粒pRL-nu11载体[Promega公司制]1μg溶解于30μL的缓冲液(pH7.5)[Universal Buffer H；50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、6.6mmol/L氯化镁、10mmol/L二硫苏糖醇以及100mmol/L氯化钠、宝酒造公司制，以下相同]中，加入10单位的限制酶SalI和EcoRI，在37℃下进行2小时消化反应。将得到的反应溶液用琼脂糖凝胶电泳处理后，将3.3kbp的DNA片段用精制试剂盒[QIAEX II Gel Extraction Kit、QIAGEN公司制，以下相同]回收。
接着，将国际公开第01/33957号小册子中所述的质粒pBSKS(+)CAG启动子1μg溶解于30μL的缓冲液(pH7.5)中，加入限制酶SalI和EcoRI，在37℃下进行2小时消化反应，将这样得到的反应溶液用琼脂糖凝胶电泳处理后，将含有1.7kbp的CAG启动子的DNA片段用精制试剂盒回收。
将上述得到的、来自质粒pRL-nu11载体的Sal I-EcoRI片段(3.3Kbp)0.1μg和来自质粒pBSKS(+)CAG启动子的SalI-EcoRI片段(1.7kbp)0.1μg溶解于T4连接酶缓冲液[66mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、10mmol/L氯化镁、1mmol/L二硫苏糖醇以及0.1mmol腺苷三磷酸、宝酒造公司制]30μL中，加入T4DNA连接酶100单位(宝酒造公司制)，在16℃下进行16小时连结反应。
使用得到的反应液，将大肠杆菌DH5α(东洋纺社制)采用Cohen等人的方法[参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1972年，第69卷，p.2110-2114]进行转化，得到氨苄青霉素耐药性株。按照公知的方法从该转化株分离pCAG-Rluc质粒。
另外，本实施例中所使用的siRNA，是由5’端为FITC标记的有义序列5’CUGGAUCGUAAGAAGGCAGdT.dT3’和反义序列5’CUGCCUUCUUACGAUCCAG dTdT3’构成的siRNA。
实施例1将DOTAP[Avanti公司制，以下相同]/PEG-DSPE(日本油脂制，以下相同)/蒸馏水按照30mg/6mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜(Whatman制，以下相同)4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜(Whatman制，以下相同)10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜(Whatman制，以下相同)24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例2将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/9mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例3将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/12mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例4将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/18mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例5将DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水按照30mg/24mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例6将DOTAP/聚氧乙烯氢化蓖麻油[HCO-60、日本油脂制]/蒸馏水按照30mg/24mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
比较例1将DOTAP/蒸馏水按照30mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制备复合粒子。
实施例7与实施例1同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例8与实施例2同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例9与实施例3同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例10与实施例4同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
实施例11与实施例5同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
比较例2与比较例1同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.005mL，制备复合粒子。
试验例1对于实施例1～11和比较例1～2中得到的各复合粒子，用动态光散射(DLS)检测仪(NanoZS、Malvern社制)测定复合粒子的平均粒径。
结果示于表1中。
表1
由于实施例1～11中制备的复合粒子的平均粒径为300nm以下，因此可以认为凝聚已受到抑制，与此相反，比较例1和2中制备的复合粒子的平均粒径大于300nm。
实施例12将DOTAP/PEG-DSPE[Avanti公司制，以下相同]/蒸馏水按照30mg/12mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.04mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.01mL，制备复合粒子。
比较例3将DOTAP/蒸馏水按照30mg/mL混合，用涡旋混合器振荡搅拌。将得到的混悬液在室温下通过0.4μm的聚碳酸酯滤膜4次，通过0.1μm的聚碳酸酯滤膜10次，进而通过0.05μm的聚碳酸酯滤膜24次，制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.04mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.01mL，制备复合粒子。
试验例2目视观察实施例12和比较例3中配制的各复合粒子的凝聚物的生成。结果示于表2中。
表2
从表2看出，实施例12中制备的复合粒子中即使添加质粒也观察不到凝聚物的生成，与此相反，对于比较例3中制备的复合粒子就观察到凝聚物的生成。
实施例13与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入0.5mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.25mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中，加入将包覆层成分的EPC[日本油脂制；以下相同]/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.25mL，接着缓慢加入蒸馏水23mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例14与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入3mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.25mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例15与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及6mg/mL的硫酸葡聚糖(Merk社制，以下相同)水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例16与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及12mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例17与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及3mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
实施例18与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ质粒水溶液0.125mL以及3mg/mL的阴离子性葡聚糖荧光素(Molecular Probes社制)水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
用得到的复合粒子的混悬液，经过与实施例13同样的包覆复合粒子的配制，得到制剂。
试验例3对于实施例13～18中得到的各制剂，用动态光散射(DLS)检测仪(A model ELS-800、大塚电子制)测定包覆微粒的平均粒径。结果示于表3中。
表3
实施例13～18中得到的任一个制剂，其平均粒径均为350nm以下，因此可以认为，在包覆复合粒子的制备步骤中，复合粒子的凝聚受到抑制。
试验例4对于实施例13和实施例15～17中得到的各制剂，质粒和EPC相对于加入量的回收率如下述那样求出。
将各制剂用水稀释10倍，向该稀释液200μL中加入10w/v％的TritonX-100(和光纯药制，以下相同)水溶液200μL，加入2μg/mL溴化乙锭(和光纯药社制)水溶液200μL以及生理盐水1400μL。使用荧光光度计(日立、F-4500)，测定激发波长580nm和荧光波长615nm处的荧光，由此定量测定各制剂中的质粒。另外，将制剂中的EPC通过使用磷脂C-test Wako(和光纯药制，以下相同)的酶法进行定量测定。质粒和EPC的回收率分别按照下述式(1)和(2)算出。
结果示于表4中。
质粒的回收率(％)＝A/C×100…………(1)EPC的回收率(％)＝B/D×100…………(2)A制剂中的质粒量(mg)B制剂中的EPC量(mg)C实施例中的质粒加入量(mg)D实施例中的EPC加入量(mg)表4
从表4看出，对于实施例13和15～17中得到的制剂，质粒的回收率均为高达50％以上，由此表明，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆是良好的。另外，对于含有附着竞争剂的实施例15～17中得到的制剂，EPC的回收率也基本在高达50％以上，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆的效率更好，更优选的。
实施例19与实施例12同样地制备介导粒子。向得到的介导粒子的混悬液0.5mL中，加入2mg/mL的siRNA水溶液0.125mL和6mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中，加入由包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.25mL，接着缓慢加入蒸馏水23mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水，接着，将相对于120重量份的EPC为50重量份的PEG-DSPE(复合粒子混悬液的4vol％)溶解于少量的乙醇中并进行混合，在70℃下加温2分钟，得到制剂。
试验例5用DLS检测仪(A model ELS-800、大塚电子制)测定实施例19得到的制剂中的包覆微粒的平均粒径。结果示于表5中。
表5
应予说明，实施例19中得到的制剂，其平均粒径为350nm以下，因此可以认为，在包覆复合粒子的制备步骤中，复合粒子的凝聚受到抑制。
试验例6对于实施例19中得到的制剂，如下述那样求出siRNA和EPC相对于加入量的回收率。
将制剂用水稀释20倍，向该稀释液50μL中加入10w/v％TritonX-100水溶液50μL，进而加入生理盐水400μL。使用荧光酶标仪(WALLAC、ARVOTMSX1420 Multilabel counter)，测定激发波长485nm和荧光波长530nm处的荧光，由此定量测定制剂中的siRNA。另外，将制剂中的EPC通过使用磷脂C-test Wako(和光纯药制)的酶法进行定量测定。siRNA和EPC的回收率分别按照下述式(3)和(4)算出。结果示于表6中。
siRNA的回收率(％)＝A/C×100……………(3)EPC的回收率(％)＝B/D×100………………(4)A制剂中的siRNA量(mg)B制剂中的EPC量(mg)C实施例19中的siRNA加入量(mg)D实施例19中的EPC加入量(mg)
表6
从表6看出，对于实施例19中得到的制剂，siRNA的回收率为高达50％以上，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆是良好的，EPC的回收率也为高达50％以上，由此可以认为，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆是很有效的。
实施例20与实施例3同样地制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.25mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.125mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中，加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC按照最终成为120mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行再混悬，得到制剂。
实施例21与实施例20同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE(日本油脂制，以下相同)按照最终成为120mg/10mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入PBS进行再混悬，得到制剂。
实施例22
与实施例20同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入PBS进行再混悬，得到制剂。
实施例23与实施例20同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/50mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入PBS进行再混悬，得到制剂。
实施例24与实施例3同样地制备介导粒子。
向得到的介导粒子的混悬液0.25mL中，加入2mg/mL的pCAG-RLuc质粒水溶液0.0625mL、以及20mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.0625mL，制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC按照最终成为120mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，制备包覆复合粒子。将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例25与实施例24同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/10mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例26与实施例24同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
实施例27与实施例24同样地制备复合粒子。
向得到的复合粒子的混悬液中加入乙醇0.5mL，进而加入将包覆层成分的EPC/PEG-DSPE按照最终成为120mg/50mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接着缓慢加入蒸馏水11.5mL，以将乙醇的浓度调整至5vol％以下，配制包覆复合粒子。
将得到的包覆复合粒子的混悬液超速离心(1小时、110000×g、25℃)分离，除去上清液，加入生理盐水进行再混悬，得到制剂。
试验例7对于实施例20～27中得到的各制剂，用DLS检测仪(NanoZS、Malvern社制)测定包覆微粒的平均粒径。结果示于表7中。
表7
实施例20～27中得到的制剂，其平均粒径为350nm以下，因此可以认为，在包覆复合粒子的制备步骤中，复合粒子的凝聚受到抑制。
试验例8对于实施例20～27中得到的各制剂，与试验例4同样地求出EPC相对于加入量的回收率。结果示于表8中。
表8
从表8看出，对于实施例20～27中得到的制剂，EPC的回收率均很高，使用包覆用脂质对复合粒子的包覆可以很有效地进行。另外，水溶性高分子衍生物相对于包覆层成分全体的比例，按重量比计为1∶0.25～1∶0.01的实施例21、22、25和26中得到的制剂，包覆微粒的平均粒径更小，而且EPC的回收率更高，因此更优选。
工业实用性本发明提供一种由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子的凝聚抑制方法及该复合粒子的制备方法等，另外还提供将凝聚受到抑制的复合粒子用包覆层包覆而成的包覆复合粒子的制备方法以及可以按照该制备方法制备的包覆复合粒子等。
权利要求
1.复合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子中，使该介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
2.权利要求1所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
3.权利要求1所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂，是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
4.权利要求1～3中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物分散或者溶解而被含有，使药物附着在该介导粒子上而得到的。
5.权利要求1～4中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物借助静电附着在介导粒子上而形成的。
6.权利要求1～5中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
7.权利要求1～6中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
8.权利要求1～7中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，药物为核酸。
9.权利要求8所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
10.权利要求1～9中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子为由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子。
11.权利要求10所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是在已分散有介导粒子的液体中，使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使药物和附着竞争剂附着在该介导粒子上而得到的。
12.权利要求10或者11所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，由药物和附着竞争剂附着在介导粒子上而形成的复合粒子，是药物和附着竞争剂借助静电附着在介导粒子上而形成的。
13.权利要求10～12中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
14.权利要求10～12中任一项所述的复合粒子的凝聚抑制方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
15.复合粒子的凝聚抑制剂，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
16.权利要求15所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
17.权利要求15所述的复合粒子的凝聚抑制剂，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
18.复合粒子的制备方法，该复合粒子是由作为药物的核酸附着在介导粒子上而形成的，其中包括在已分散有介导粒子的液体中，通过使作为药物的该核酸分散或者溶解而被含有，使作为药物的该核酸附着在该介导粒子上的步骤；所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
19.复合粒子的制备方法，该复合粒子是由药物附着在介导粒子上而形成的，其中包括在已分散有介导粒子的液体中，通过使药物和附着竞争剂分散或者溶解而被含有，使该药物和该附着竞争剂附着在该介导粒子上的步骤，所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
20.权利要求19所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
21.权利要求19所述的复合粒子的制备方法，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
22.权利要求19～21中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，药物是核酸。
23.权利要求18或者22所述的复合粒子的制备方法，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、寡核苷酸、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
24.权利要求18～23中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
25.权利要求18～23中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
26.权利要求18～25中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
27.权利要求18～25中任一项所述的复合粒子的制备方法，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
28.按照权利要求18～27中任一项所述的复合粒子的制备方法制备的复合粒子。
29.复合粒子，其中含有介导粒子以及附着在该介导粒子上的作为药物的核酸；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
30.复合粒子，其中含有介导粒子、附着在该介导粒子上的药物、以及附着在该介导粒子上的附着竞争剂；其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
31.权利要求30所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从脂质、表面活性剂、核酸、蛋白质、肽和高分子中选出的1种以上的物质。
32.权利要求30所述的复合粒子，其中，附着竞争剂是从硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖钠、硫酸软骨素、硫酸软骨素钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素以及阴离子性葡聚糖荧光素中选出的1种以上的物质。
33.权利要求30～32中任一项所述的复合粒子，其中，药物为核酸。
34.权利要求29或者33所述的复合粒子，其中，作为药物的核酸是从基因、DNA、RNA、质粒和siRNA中选出的1种以上的物质。
35.权利要求29～34中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物。
36.权利要求29～34中任一项所述的复合粒子，其中，选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂是从聚乙二醇化脂质、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂质、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中选出的1种以上的物质。
37.权利要求29～36中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为具有与药物静电相反的电荷的介导粒子。
38.权利要求29～36中任一项所述的复合粒子，其中，介导粒子为以脂质体为构成成分的微粒，该脂质体含有具有与药物静电相反的电荷的脂质。
39.包覆复合粒子的制备方法，包括配制含有极性有机溶剂的液体A液的步骤，其中分散有权利要求28～38中任一项所述的复合粒子并且溶解有包覆层成分；然后，通过使A液中的极性有机溶剂的比例减少，使复合粒子被由包覆层成分构成的包覆层包覆的步骤。
40.权利要求39所述的包覆复合粒子的制备方法，配制A液的步骤包括配制含有极性有机溶剂的液体B液的步骤，其中分散有权利要求28～38中任一项所述的复合粒子；配制将包覆层成分溶解于溶剂中而形成的液体C液的步骤，该溶剂中含有与B液中的极性有机溶剂相同或者不同的极性有机溶剂；以及，将B液与C液混合的步骤。
41.权利要求39或者40所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层为脂质膜。
42.权利要求41所述的包覆复合粒子的制备方法，其中，包覆层含有水溶性高分子衍生物。
43.按照权利要求39～42中任一项所述的包覆复合粒子的制备方法制备的包覆复合粒子。
44.包覆复合粒子，由权利要求28～38中任一项所述的复合粒子以及包覆该复合粒子的包覆层构成，其中，构成该包覆层的包覆层成分为如下成分，该成分在含有极性溶剂的溶剂中，当极性溶剂的浓度相对提高时溶解、而相对降低时析出或者聚集，其中极性溶剂在溶剂中的浓度范围是该复合粒子不溶解但能够分散的浓度范围。
45.权利要求44所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为脂质膜。
46.权利要求45所述的包覆复合粒子，其中，包覆层为含有水溶性高分子衍生物的包覆层。
47.权利要求44～46中任一项所述的包覆复合粒子，其中，包覆复合粒子的平均粒径在300nm以下。
全文摘要
本发明提供一种复合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由药物附着在介导粒子上而形成的复合粒子中，使该介导粒子中含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。另外还提供复合粒子的制备方法，该复合粒子由作为药物的核酸或者药物与附着竞争剂附着在介导粒子上而形成，其中包括在分散有介导粒子的液体中，使作为药物的该核酸或者药物和附着竞争剂分散或溶解，使作为药物的该核酸或者药物和附着竞争剂附着在该介导粒子上，其中所述介导粒子含有选自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性剂。
文档编号A61K9/10GK1929864SQ20058000758
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者山内雅博, 加藤泰己 申请人:协和发酵工业株式会社
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