用于抵抗艾利希体病的犬疫苗的制作方法
专利名称：用于抵抗艾利希体病的犬疫苗的制作方法
技术领域：
本发明提供一种安全且有效的疫苗组合物，其包含一有效免疫量的灭活犬艾利希体(Ehrlichia canis)菌苗；一药理学上可接受的载剂；及一免疫原性刺激量的基本上由一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法。
背景技术：
犬艾利希体病是一种由一经血液介导的细胞内病原菌犬艾利希体(E.canis)引起的致死性疾病，并可感染处于任何生长阶段的任何品种的犬。犬艾利希体病主要由棕色犬壁虱血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineous)传播，其被认为是该疾病的主要传播源头。犬艾利希体病是美国的地方性潜在致死性疾病并出现于世界各地。症状通常由急性疾病态进展至慢性疾病态，此取决于生物体菌株及宿主的免疫状态而定。在急性病例中，症状包括液脓性的眼排泄物及鼻涕、脱水、网状内皮组织增生、发烧、一般性淋巴结病、脾肿大及血小板减少症。在慢性病例中，可出现厌食、抑郁、精力不振、僵硬及不愿走路、四肢或阴囊水肿及咳嗽或呼吸困难等可变症状。
目前还没有用于有效治疗或预防犬艾利希体病的疫苗。对各种形式艾利希体病的通常治疗是投予抗生素(例如四环素)至少2周(急性病例)或1至2个月(慢性病例)。在慢性病例中，血液异常可持续3至6个月，或持续终生。可能需要支持治疗来对抗消瘦及特定器官功能障碍。疾病的有效预防显然优于感染后抗生素治疗。
因此，本发明的一目的是提供一种用于在犬中诱发抗犬艾利希体病的保护性免疫的安全且有效的疫苗组合物。
本发明的另一目的是提供一种用于预防或改善犬中的犬艾利希体病的方法。
本发明的又一目的是提供一种用于在测试动物中诱发临床犬艾利希体病的方法。该方法可用于宿主防御及致病机制的评价及研究，并用于抗艾利希体病疫苗的改进研制。
本发明的一特征是该疫苗组合物可保护犬免受多种起源于多个地理区域的E.canis菌株的侵袭。
本发明的另一特征是可将抗犬艾利希体病的有效保护性免疫赋予任何年龄的犬。
自下文详细说明将易知本发明的其他目的及特征。
发明内容
本发明提供一种安全且有效的疫苗组合物，其包含一有效免疫量的灭活犬艾利希体菌苗、一药理学上可接受的载剂及一免疫原性刺激量的包含以下各物或基本上由以下各物组成的佐剂系统一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫(CMI)反应诱导剂。
本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法。
本发明进一步提供一种用于诱发测试动物临床E.canis感染的方法，该方法可用于宿主防御及致病机制的研究及评价，并可用于犬艾利希体病治疗及预防的改进研制。
具体实施例方式
犬艾利希体病病原为犬艾利希体(E.canis)，一种立克次氏体(Rickettsiales)目革兰氏阴性细菌，其单独出现或在循环哺乳动物白细胞的致密包体中出现并由壁虱传播。犬艾利希体病是美国许多地区的地方病，且已知在世界各地出现。自然发生的急性犬艾利希体病酷似落矶山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)。多数急性病例出现于更温暖的月份，这与壁虱传播媒介的最大活性一致。犬艾利希体病可是一种致死性疾病。通常它是一种慢性疾病，可影响任何年龄犬并导致各种可变症状，例如厌食、抑郁、精力不振、僵硬及不愿走路、四肢或阴囊水肿、咳嗽或呼吸困难等。迄今为止，尚没有已知有效的对抗犬艾利希体病的接种疫苗或免疫治疗。
令人吃惊地，目前已发现向处于任何生长阶段(较佳犬龄为16周或更大)的犬投予一疫苗组合物可预防或缓解犬艾利希体病，该疫苗组合物包含有效免疫量的灭活E.canis菌苗、一药理学上可接受的载剂及一免疫原性刺激量的基本上由一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫(CMI)反应诱导剂组成的佐剂系统。
适用于本发明免疫组合物中的E.canis菌苗可为一或多株菌株。适用于本发明免疫组合物中的E.canis菌苗可为一或多株菌株，例如那些命名为Ebony、Broadfoot、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venezuela、北卡罗莱纳州立大学(the North Carolina State University)(NCSU)菌株Jake、NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy的菌珠、具有任一该些指定菌株的感染E.canis的细胞系、具有任一该些指定菌株的感染E.canis的DH82细胞系或由美国种质保藏中心(the American TypeCulture Collection)(ATCC，Rockville，MD)储存并给予存取编号CRL 10390的感染E.canis的DH82细胞系(如美国专利第5,192,679号中所揭示)，或诸如此类。适用于本发明疫苗组合物中的E.canis菌苗较佳可为两株E.canis，例如Ebony及Broadfoot。
例如，基于16S重组DNA(rDNA)序列，Ebony菌株与Oklahoma菌株具99.9％同源性(即，1个核苷酸差异)[Mathew JS等人，Attempted transmission of Ehrlichia canisby Rhipicephalus sanguineus after passage in cell culture，Am J Vet Res 1996 Nov；57(11)1594-8]，且Ebony菌株已显示为可由棕色犬壁虱(血红扇头蜱)幼虫及成虫传播给犬(Mathew 1996)。
已揭示Florida菌株含有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)及一属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)。而且，美国专利第6,043,085号揭示Florida菌株具有一120-kDa免疫显性抗原蛋白，包含14个重复片段，每一重复片段具有36个氨基酸，预测这些重复片段表面暴露。重复单元具有亲水性，形成蛋白表面暴露区的核心，并富含丝氨酸及谷氨酸。丝氨酸及谷胺酸各占重复单元氨基酸的19％。Florida菌株被认为毒性比E.canis菌株NCSU Jake弱[Breitschwerdt等人.Doxycycline hyclate treatment of experimental E.canis followed bychallenge inoculation with two Ehrlichia canis strains，Antimicrobial Agents andChemotherapy，1998 Feb；42(2)362-68}，而与Oklahoma菌株的血清学比较揭示100％的特异性及87.5％的灵敏性[Dawson JE等人.Serological comparison of humanEhrlichia canis using two Ehrlichia canis isolates.J Infect Dis.1991 Mar；163(3)564-7}。
除在连续的犬细胞系(例如，DH82)中生长(KeysaryA等人.The first isolation，invitro propagation，and genetic characterization of Ehrlichia canis in Israel，Vet.Parasitol.1996 Apr；62(3-4)331-40.)外，Israel 611菌株亦已在连续的小鼠巨噬细胞系(例如，J774.A1)中生长(Keysary A等人.Cultivation of Ehrlichia canis in a continuous BALB/Cmouse macrophage cell culture line，J Vet Diag.Invest.2001 Nov；13(6)521-3)。Israel 611具有两种形式的桑椹胚(1)致密桑椹胚和(2)松散桑椹胚，且其16S rRNA基因序列与Oklahoma菌株有三个核苷酸不同，与Florida菌株有四个核苷酸不同，各有一个核苷酸缺口(Keysary，1996)。与Oklahoma菌株的同源性差异程度为0.54％，而与Florida菌株的同源性差异程度为0.61％(Keysary，1996)。
与Florida菌株一样，Louisiana菌株具有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)、一属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)及如美国专利第6,043,085号中所揭示的一120-kDa免疫显性抗原蛋白，该抗原蛋白含有14个重复片段，每一重复片段具有36个氨基酸，预测这些重复片段表面暴露。重复单元具有亲水性，可形成蛋白表面暴露区的核心，并富含丝氨酸及谷氨酸。丝氨酸及谷氨酸各占重复单元氨基酸的19％。
亦类似地，Oklahoma菌株具有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)、一属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)及如美国专利第6,043,085号中所揭示的一120-kDa免疫显性抗原蛋白，该抗原蛋白含有14个重复片段，每一重复片段具有36个氨基酸，预测这些重复片段表面暴露。这些重复单元具有亲水性，可形成蛋白表面暴露区的核心，并富含丝氨酸及谷氨酸。丝氨酸及谷氨酸各占重复单元氨基酸的19％。此外，McBride JW等人发现Oklahoma具有一可编码548至688个氨基酸的糖蛋白基因(2,064bp)，其预测分子量分别仅为61及73kDa，但电泳迁移率为140kDa(P140)。140-kDa蛋白基因具有十四(14)个几乎完全相同的衔接布置的108-bp重复单元。P140基因(1,620bp)的14个重复区(78％)在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。该重组蛋白显示在那些由氨基酸序列预测的分子量的1.6至2倍间的分子量。抗这些重组蛋白的抗体与E.canis P140作应。于E.canis重组蛋白上检测到碳水化合物。碳水化合物组分分析于该重组蛋白上鉴别到葡萄糖、半乳糖及木糖。仅存在一个N-连接的(Asn-Xaa-Ser/Thr)糖基化位点，缺少N-糖苷酶F的作用，在P120及P140重复区分别存在70及126 Ser/Thr糖基化位点以及碳水化合物与蛋白的莫耳比率高，这一切表明这些聚糖可为O连接型(McBride JW等人.Glycosylation of Homologous Immunodominant Proteins of Ehrlichia chaffeensis andEhrlichia canis.Infection and Immunity，January 2000，68(1)13-18)。Oklahoma可于包含12.5％胎牛血清及200mM L-谷胺醯胺的最低必需培养基中的犬巨噬细胞系DH82中生长(Bowie，M.V.等人Potential value of major antigenic protein 2 for serological diagnosisof heartwater and related Ehrlichia！infections，Clin.Diagnostic Lab.Immun.，1999 Mar；6(2)209-15)。与FL菌株的血清学比较揭示100％的特异性及87.5％的灵敏性(Dawson1991，见上文)。基于16S rDNA序列，已在菌株Ebony(Mathew 1996)、Kagoshima 1(Unver A等人.Analysis of 16S rRNA gene sequences of Ehrlichia canis，Anaplasma platys，and Wolbachia species from canine blood in Japan，Ann NY Acad.Sci.2003 Jun；990692-8}及Venezuela(Unver A等人.Molecular and antigenic comparison of Ehrlichia canis isolatesfrom dogs，ticks，and a human in Venezuela.J Clin Microbiol.2001 Aug；39(8)2788-93}中发现99.9％的相似性。
NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy及菌株Jake皆具有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)。已揭示DJ、Fuzzy及Jake亦具有属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)。Jake被认为比Florida菌株毒性更强(Breitschwerdt 1998，见上文)。
已发现Kagoshima 1的几乎整个16S rRNA序列与来自Oklahoma及Venezuela E.canis菌株的序列最相似(1,387个碱基对中有1个碱基对差异)，序列同一性为99.9％(Unver 2003，supra)。除与Kagoshima 1菌株的高序列同一性外及与之类似，基于16SrDNA序列，Venezuela菌株与Oklahoma菌株有99.9％的相似(Uhver 2001)。
在较佳实践中，E.canis菌苗在一含有RPMI1640并补充胎牛血清、葡萄糖及谷胺醯胺的培养基支持的犬单核细胞巨噬细胞系(有时称其为连续的犬巨噬细胞或犬巨噬细胞系)中生长。该些细胞较佳可在一支持培养基上培养，该支持培养基可为RPMI1640、OptiMEM或AIM V(较佳RPMI1640)，并补充至多10％的胎牛血清、0.5％的乳蛋白水解产物、30微克/毫升的多粘菌素B(Polymyxin B)、110微克/毫升的丙酮酸钠、2.5毫克/毫升的碳酸氢钠、4毫克/毫升的葡萄糖、6毫克/毫升的L-谷胺醯胺、0.55毫克/毫升的硫酸镁，并培养至多95天，较佳至多35天，最佳约5至10天，以达成≥1×104TCID50的滴度(组织培养感染剂量(Tissue Culture Infectious Dose))，然后收获该培养物，并加以处理以便于灭活。
然后，可由传统灭活方法灭活如此获得的E.canis菌苗。例如，使用化学灭活剂(例如二元次乙亚胺、β-丙内酯、福尔马林、硫柳汞、戊二醛、十二烷基硫酸钠或诸如此类或其混合物)进行化学灭活，较佳的灭活剂为福尔马林。菌苗亦可在紫外光存在下由热或补骨脂素灭活。
有效免疫量的灭活E.canis菌苗可随所选菌株而改变，且其可为任何足以引起一保护性免疫反应的量。其中剂量单位包含至少约1×104TCID50灭活E.canis菌苗的量较为合适。
本文所用术语“抗体反应诱导剂”指任何能增强体液免疫反应的化合物或化合物组合。典型实例为乙烯马来酸酐(EMA)共聚物、苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸混合物的共聚物的乳胶乳液例如NEOCRYLA-640(Avecia Neo Resius，Frankfort，IN)、氢氧化铝或诸如此类或其混合物。本发明的抗体反应诱导剂较佳为EMA和NEOCRYL.的混合物。NEOCRYL为Avecia BV，Sluisweg 12 P.O.Box 123 NL-5140 AC WaalwijkNetherlands对水性丙烯酸聚合物及共聚物的注册商标。数字A640表示其级别。NEOCRYLA640为一未聚结的水性苯乙烯化丙烯酸共聚物，其pH为约7.5，黏度为约100cps(Brookfield 25℃)，当提供为含有40重量％固体时重量/加仑为8.6磅，比重为1.30毫克/升，玻璃态转变温度(Tg)为44℃、最低薄膜形成温度(MFFT)为40℃且酸值(不挥发物)为50。特定而言，NEOCRYLA640为一未聚结的水性丙烯酸苯乙烯共聚物。更特定而言，NEOCRYLA640为苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸混合物的共聚物的乳胶乳液。
本发明所用合适级别的EMA共聚物为线性乙烯-马来酸酐共聚物，例如EMA-31(Monsanto公司，St.Louis，MO)，其为一含酸性官能基的共聚物。这些共聚物是水溶性的微细可自由流动的白色粉末，具有以下典型性质软化点为约170℃，分解温度为约247℃，pH(1％溶液)为2.3，比粘度(二甲基甲醯胺中1％溶液)为0.9至1.2克/100毫升。
本文所用术语“细胞介导的免疫(CMI)反应诱导剂”指任何能增强细胞免疫反应的试剂或试剂组合。典型实例为生物制剂，例如一减毒的牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)菌株、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)(BCG)(Calbiochem，La Jolla，CA)或诸如此类，及Th1相关细胞因子，例如白介素-12(IL-12)、白介素-18(IL-18)、γ干扰素或诸如此类(较佳地IL-12)；或係水包油乳液的物质，例如水包石蜡油乳液，如EMULSIGENSA(MVP Laboratories，Ralston，NE)、SP油(角鲨烷、PluronicL 121及Tween80的组合物(角鲨烷购自VWR/Kodak，Rochester，NY且PluronicL121购自BASF，Mt.Olive，NJ))、SAF-1(兴泰克佐剂调配物-1(Syntex Adjuvant Formulation-1)，一胞壁醯二肽苏氨酰基类似物、吐温80、PluronicL121及角鲨烷的组合物，其由Byars，N.E.及Allison，A.C.，Vaccine，5(3)223-28阐述)或诸如此类，较佳为EMULSIGENSA且更佳为水包油乳液。EMULSIGEN为Modern Veterinary Products，5404 Miller Ave.Omaha，Nebraska 68127，U.S.A对于一乳化的水包油性质的兽医抗原佐剂的注册商标。字母SA表示其级别。一石蜡乳化油佐剂基质EMULSIGENSA当与胰酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth)(TSB)混合时是乳白色的(20％终浓度)，黏度为25至50cps(布鲁克菲尔(Brookfield)LV粘度计，心轴#18，于30rpm下)，且其包含至少80％小于或等于八(8)微米的油相小滴。Pluronic为BASF公司环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物的注册商标，数字L121表示其级别。
佐剂系统的免疫原性刺激量可根据抗体反应诱导剂、CMI诱导剂、E.canis菌苗组分、潜在传染性暴露程度、疫苗组合物投予方法、犬的生长阶段及大小或诸如此类而改变。而且，佐剂系统的免疫原性刺激量为一足以增强对免疫因子E.canis菌苗的免疫反应的量。一般而言，约1％至6％体积/体积(较佳约4％体积/体积)的抗体反应诱导剂的量及约3％至7％体积/体积(较佳约5％体积/体积)的CMI诱导剂的量较为合适。
适用于本发明疫苗组合物中的药理学上可接受的载剂为任何习知用于兽医医药组合物的液体载剂，且其较佳为平衡盐溶液，以便适于组织培养基。
除作为活性成份的灭活E.canis菌苗外，本发明亦涵盖，本发明疫苗组合物亦可含有其他活性组分，例如针对狂犬病病毒、白垩病(伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi))、犬瘟病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、贾第虫(Giardia)、诸如犬(canicola)血清型、黄疸出血(icterohaemorrhagiae)血清型、波摩那(pomona)血清型、流感伤寒(grippotyphosa)血清型或布拉提斯拉瓦(bratislava)血清型等的钩端螺旋体的抗病原组分或其组合。
在本发明的一实施例中，本发明的灭活E.canis菌苗组分可使用已知技术(例如阐述于Nature，1974，252，252-254或Journal of Immunology，1978，120，1109-13中者)并入脂质体中。在本发明的另一实施例中，本发明的灭活E.canis菌苗组分可结合至合适的生物化合物，例如多糖、肽、蛋白质或诸如此类或其组合。
在本发明的一较佳实施例中，本发明疫苗组合物可调配成一剂量单位形式，以便于投予并确保剂量一致。在此，剂量单位在与疫苗组合物相关时是指适合作为用于动物的单位剂量的物理离散单元，每一单元含有一经计算可与所需佐剂系统及载剂或媒剂一起产生期望免疫原性效应的规定量的E.canis菌苗。
本发明疫苗组合物可以非经肠方式投予，例如经肌内、经皮下、经腹膜内、经皮内或诸如此类投予，较佳地经皮下或经皮内投予，且更佳地经皮下投予；或所述组合物可经口或经鼻内投予。
因此，本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法，其包含向所述犬投予一安全且有效的上文所述疫苗组合物。
在较佳实践中，本发明疫苗组合物根据由潜在暴露于E.canis菌苗载剂中的时间所确定的时间表以有效量非经肠、经口或经鼻内投予，较佳非经肠投予，更佳经皮下投予。这样，接受治疗的动物在自然暴露之前可有时间产生免疫性。例如，典型的治疗方案可包括潜在暴露前至少5周非经肠投予，较佳经皮下注射。至少2次投予较佳，例如，第一次在经治疗动物潜在暴露前约5周时，且第二次在经治疗动物潜在暴露前约2周时。
为有效地研究及评价E.canis菌苗的致病机制及宿主犬的防御机制并以此提高疫苗工艺及改良疫苗产品，必须创造出一个有效的激发模型。尽管已知不同的犬艾利希体病激发模型，但尚没有一个模型能够使高百分比率的测试动物表现出通常与犬艾利希体病相关的持久而严重的临床症症，例如，粘液脓性的眼排泄物、脱水或诸如此类。因此，评价疫苗和药物以及研究E.canis菌苗和由其所致的疾病需要更佳和更持续有效的激发模型。
令人吃惊地，目前已发现特别有效的E.canis激发可于一验动物中通过向所述测试动物投予含有活E.canis细菌的强毒培养物的外周血单核细胞(PBMC)激发储备液而获得。强毒的E.canis培养物通过以下制备使E.canis微生物(例如E.canis Ebony、E.canis Broadfoot或诸如此类，较佳地E.canis Ebony)在一宿主中反复继代；自宿主血样中分离PBMC；并混合经分离的PBMC与20％的胎牛血清及10％的二甲亚砜。因此，本发明亦提供一种用于在测试动物中诱导临床犬艾利希体病的方法，其包含向所述动物投予一有效量的基本上由强毒E.canis微生物在外周血单核细胞中组成的E.canis激发储备液。E.canis Broadfoot(有时称做E.canis BF或Broadfoot)及E.canisEbony(有时称做Ebony)各自的活培养物皆已由ATCC(根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)与用于专利操作目的微生物储存有关的条款和要求)储存(2004年2月11日)，且已分别给予ATCC存取编号PTA-5811(Broadfoot菌株)及PTA-5812(Ebony菌株)。
在实际实践中，E.canis微生物的毒性可通过在宿主动物中反复继代增强。将来自宿主的全血样品置于一梯度培养基(例如Histopaque1077)上，离心并分离PBMC层。使如此获得的PBMC与20％胎牛血清及10％二甲亚砜混合，并于液氮中冷冻储存以提供一致且持续的激发储备液供应。该激发储备液可在投予测试动物前用生理盐水缓冲液稀释。投予可通过任何习知接种途径，例如皮下、肌内、皮内或诸如此类，且最佳可经由皮下投予。
为了更清楚的理解本发明，下文中列出以下实例。这些实例仅用于阐明目的而绝不能其理解成限制本发明的范围或基本原理。事实上，除了那些本文中已显示及阐述者外，所属领域的技术人员自下文提出的实例及前述说明明了本发明的各种修改方案。此等修改方案亦意欲在随附的权利要求书的范围内。
除非另有说明，否则所有份数均指重量份数。
实例1强毒E.canis激发模型的评价A.激发储备液的制备使活的E.canis Ebony菌株细菌在犬中反复继代。于2500xg下离心受感染犬的全血样品15分钟。收集血沉棕黄层并用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，然后于Histopaque1077上分层并于400xg下离心分层材料45分钟。收集PBMC，并用PBS洗涤。使经洗涤PBMC与20％胎牛血清及10％二甲亚砜混合，并于液氮中冷冻。使用前，将激发储备液用缓冲盐水溶液稀释至激发储备液∶缓冲盐水溶液为1∶3或1∶4的最终稀释液。
B.激发方法在该评价中，将20只8至12个月龄的犬随机分成2组。通过皮下途径使用1毫升经稀释的激发储备液来激发犬。一组使用激发储备液的1∶3稀释液来激发，而另一组使用激发储备液的1∶4稀释液来激发。激发后，观察犬并每周采集血液样品3次来监测疾病的临床症候(包括血小板减少症)，总共56天。
C.观察结果经观测的临床症候包括粘液脓性的鼻涕及眼排泄物、抑郁、脱水、淋巴结病和角膜水肿。粘液脓性的眼排泄物及脱水是最常观察到的症候。粘液脓性的眼排泄物及脱水是疾病发展所特有的并间接反映疾病的严重程度。对于各临床症候，每一观测时间点记录一次发病并比较两组间的总发病率。在观测时间点上，53％(1∶3稀释)及35％(1∶4稀释)存在粘液脓性的眼排泄物且44％(1∶3稀释)及30％(1∶4稀释)存在脱水。
在该评价中亦观察到明显较高的死亡率。死亡率的诱发是激发储备液中所用E.canis菌苗强发病机理的最显著指征。对于1∶3稀释处理，100％的犬符合艾利希体病的病例界定，而对于1∶4稀释处理，80％的犬符合艾利希体病的病例界定。资料显示于表I中。
记录直肠温度，作为艾利希体病感染指示。多数受感染犬出现一定的直肠温度升高。资料显示于表II中。
于激发后约12天(DPC)开始并在整个剩余的观测期内，可观测到血小板减少症(血小板计数低于200,000/微升)。资料显示于表III中。
D.结论上文所述激发模型可在犬中产生严重的犬艾利希体病的临床症候，并提供艾利希体病的病例界定以用于艾利希体病的进一步研究及治疗评价。犬艾利希体病的临床病例界定将由死亡、至少连续3个观察日有粘液脓性的眼排泄物及/或至少连续3个观察日有脱水来界定。
表I
*症候包括于艾利希体病的病例界定中。
表II直肠温度—激发后
表III血小板计数，103/微升—激发后
实例2由BCG辅助的E.canis菌苗诱导的效力的评价一减毒牛分枝杆菌的高压灭菌制备物BCG被公认为是细胞介导的免疫(CMI)的有效诱导剂。为测定协同CMI效应，用不同浓度水平的BCG辅助E.canis菌苗。早先研究表明仅用习知(抗体反应诱导)犬佐剂(例如EMA及Neocryl)辅助的E.canis菌苗仅能诱导效力减弱的保护性免疫。
A.材料及方法使用三个接种疫苗组(每组7条犬)及1个对照组(6条犬)。疫苗含有5log TCID50(预灭活滴度)用下列佐剂组合辅助的E.canis Ebony菌株菌苗。疫苗A含有伯氏疏螺旋体菌菌苗(borrelia burgdoferi bacterin)(BBB)及EMA/Neocryl。疫苗B含有伯氏疏螺旋体菌菌苗(BBB)、EMA/Neocryl及100微克/剂量BCG。疫苗C含有伯氏疏螺旋体菌菌苗(BBB)、EMA/Neocryl及1.0毫克/剂量BCG。三种疫苗的其他组分相同。对照组犬未接种疫苗。
27条犬被随机分成4组前3组(每组7条犬)通过皮下途径间隔21天用疫苗A、B或C接种两次。第4组6条犬用作对照，不接种疫苗。第二次疫苗接种后16天，所有的犬皆用强毒的E.canis激发并观测临床症候、直肠温度及血小板计数改变，共观测56天。
B.结果及讨论结果概示于表IV中。用强毒的E.canis激发后56天，接种疫苗A组中7条犬中有4只(57％)患有血小板减少症并具有高直肠温度。接种疫苗B组中观测到相同结果。在疫苗C组的犬中，研究期间7条犬中仅有2条(28.5％)的接种疫苗的犬患有血小板减少症并具有高直肠温度。6条对照犬中有5条(83％)患有血小板减少症并具有高直肠温度。混合各组的临床症候，各组间无差异。体温及血小板计数改变是E.canis感染及艾利希体病的典型症候。
表IV
1BBB＝源自福特道齐动物健康(Fort Dodge Animal Health)产品系列的伯氏疏螺旋体菌菌苗2由Monsanto公司，St.Louis，MO制造。
3由AVECIA Neo Resius，Frankfort，IN制造4BCG＝卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)，其为减毒牛分枝杆菌，源自Calbiochem，La Jolla，CA。
该研究的结果清楚地表明仅用习知(抗体反应诱导)佐剂(EMA+Neocryl)辅助的疫苗不具有保护性。当疫苗用较低剂量BCG(例如100微克/剂量)辅助时，结果同样如此。然而，当疫苗用1毫克/剂量BCG辅助时，其变得具有保护性。因此，CMI诱导剂(BCG)在足以增强免疫反应的浓度时所诱导的保护性免疫可使E.canis菌苗疫苗具有效力。
C.结论保护犬不受E.canis感染需要CMI。仅用习知犬佐剂辅助的E.canis菌苗不能在活体内诱导保护性免疫。
实例3灭活E.canis疫苗组合物的制备两株E.canis菌苗Ebony及Broadfoot各自在一含有RPMI1640并补充有5％至7％胎牛血清、2％葡萄糖及2毫莫耳谷胺醯胺的培养基所支持的DH82细胞中培养5至14天。所得培养物于≥1×104TCID50的滴度收获。收获物经滴定、裂解且随后通过添加0.1％的福尔马林溶液，于36°±2C下培养24至48小时，添加另一份0.1％的福尔马林并于36°±C下再次培养24至48小时来灭活。两株E.canis灭活菌株以1×104.5TCID50的相同剂量与下述佐剂系统掺合在一起以获得疫苗组合物A。
疫苗组合物A
1由Monsanto公司，St.Louis，MO制造2由AVECIA Neo Resius，Frankfort，IN制造3由MVP Laboratories公司，Ralston，NE制造4由LTI，Grand Island，NY制造的最低必需培养基(MEM)
实例4对由E.canis疫苗组合物A诱导的十二个月免疫持续时间的评价在该评价中，将15周至16周龄的小猎犬分成2组，1个对照(不接种疫苗)组(15条犬)及1个接种疫苗组(27条犬)。接种疫苗组间隔21天接受两次1毫升剂量的如实例3所述疫苗组合物A。如实例1所述，接种疫苗后十二个月，所有测试动物皆经由皮下途径用一感染E.canis的外周血单核细胞(pmbc)的1∶3稀释液的已确立的低温激发池来激发。于激发后12天(DPC)开始每周观察测试动物3次。依照动物健康及台湾大学实验动物管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))导则，任何垂死的或身体状况不佳的测试动物均由国家认可的兽医详细检查。
使用K-ELISA评价血清样品中的E.canis抗体，以定量接种疫苗后的免疫反应。向涂覆有E.canis全细胞提取蛋白的孔中一式两份地添加血清样品。然后，向各孔中添加结合过氧化物酶的山羊抗犬免疫球蛋白(IgG)，并于36°±2℃下培养平板30分钟。移除未结合的交联物后，使用ATBS替代系统培养平板。使用一动力学模式，于405至490微米下以35秒的间隔读取平板20分钟。血清学结果显示于表V中，其中DPV1指第一次疫苗剂量后的天数；DPV2指第二次疫苗剂量后的天数；MPV2指第二次疫苗剂量后的月数；而DPC指激发的天数。
观测结果由表V的血清学数据可见，与对照(未接种疫苗)组相比，接种疫苗组的抗体有明显增加。接种疫苗组及对照组间抗体的明显差异亦可在激发后观测到。除血清学数据外，亦记录红细胞比容值、血小板计数、直肠温度及每周体重。与对照组相比，接种疫苗组红细胞比容百分率明显更低。与对照组相比，激发后44天接种疫苗组血小板计数明显更低。与对照组相比，接种疫苗组重量损失显著更低。在对照组中，87％符合犬艾利希体病的病例界定(包括死亡率)。在接种疫苗组中，在56天临床观测期内，44％符合犬艾利希体病的病例界定。
结论实例3的E.canis疫苗组合物明显降低犬中的临床犬艾利希体病。投予两次1毫升剂量的所述疫苗可在至少12个月的时间内诱发免疫。投予实例3的疫苗组合物可显著增加犬中抗E.canis的抗体。
表V对灭活E.canis疫苗的抗体反应
表V(接续)
实例5对响应于灭活E.canis疫苗的细胞介导的免疫的评价使用犬IL-12及IFN-γ酶联斑点分析来评价接种犬型艾利希体(E.canis)菌苗的犬中IL-12及IFN-γ的水平。与对照犬相比，由接种疫苗的犬中分离的外周血单核细胞可产生更高数量的IL-12及IFN-γ斑点，这显示CMI反应可在保护犬不受E.canis感染中起作用。
A.材料及方法在本研究中使用两组犬接受E.canis菌苗的接种疫苗组及不接受菌苗的对照组。在用E.canis菌苗第一次接种后，自接种疫苗的犬及对照犬中抽取全血。经由无菌静脉穿刺将对照及接种疫苗的犬的全血样品收集至10毫升EDTA管中。于一Percoll梯度上通过离心分离外周血单核细胞(PBMC)。分离后，对于每一样品，计数PBMC并测定细胞浓度。然后，将分离的PBMC立即用于酶联斑点分析中。
用于培养犬PBMC的完全培养基由等体积Aim V(Invitrogen，Carlsbad，CA；Cat.#12055-083}及Ex-Cell(JRH Biosciences，Lenexa，KS；Cat.# 141610-500M}、10％热灭活的马血清(Hyclone，Logan，UT；Cat.# SH30074.03}及10微克/毫升庆大霉素组成。
酶联斑点分析酶联斑点平板的制备IL-12平板将Immobilon P平板(Millipore，Burlington，MA)用70％的甲醇预润湿，用Dulbecco-Vogt磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤，用100微升/孔小鼠抗人IL-12抗体(10微克/毫升；Mabtech，Sweden)涂覆，在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释，并于37℃5+2％CO2中培养2小时。然后用DPBS+0.1％吐温20洗涤平板并于36℃5+2％CO2中用完全Aim V/ExCell培养基封阻至少2小时。
IFN-γ平板用于犬IFN-γ检测的酶联斑点平板以一类似于犬IL-12平板的方式制备，使用一对犬IFN-γ具特异性的抗体。本研究中所用平板可自R&D Systems(Minneapolis，MN；Cat.# EL781)购买，并可根据操作说明书制备。这些平板用抗犬IFN-γ多克隆抗体预涂覆。
抗原的制备最初使用6种不同的细胞制备物作为抗原来刺激IL-12及IFN-γ的产生。这些细胞制备物包括1.活的感染E.canis的DH82细胞2.感染E.canis的DH82细胞裂解物(通过匀浆化裂解细胞)3.通过福尔马林处理来灭活的感染E.canis的DH82细胞裂解物4.仅活的未受到感染的DH82细胞5.未受到感染的DH82细胞裂解物6.通过福尔马林处理来灭活的未受到感染的DH82细胞裂解物。
使用前3种制备物来刺激刺激IL-12及IFN-γ的产生。试验中使用另外3种制备物作为阴性对照。分析当天，收获、计数活的感染E canis及未感染E.canis的DH82细胞，并测定细胞浓度。将期望数量的活细胞及同等细胞数的细胞裂解物(用或不用福尔马林处理)重新悬浮于完全Aim V/Excell培养基中并加以分析。在完全培养基中制备分裂素刀豆体球蛋白(Concanavalin)A(Con A)(Sigma Cat# C0412)及菜豆(Phaseolus vulgaris)(PHA)凝集素(Sigma Cat.# L-4144)，并将其用作分析的阳性对照。
E.canis及PBMC的培养涂覆抗体的平板在2小时介质封阻后，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)+0.1％吐温20洗涤。向涂覆抗体的孔中添加合适稀释度的活的感染E.canis及未感染E.canis的DH82细胞、细胞裂解物、培养基及阳性对照，添加量为每孔150微升。向适合的孔中添加已在完全培养基中稀释至期望细胞浓度的经稀释PBMC与50微升/孔的细胞培养物。然后于36℃±2℃、5+2％CO2下培养平板20至50小时，此取决于拟进行的分析。
平板培养IL-12平板培养后，通过用DPBS+0.1％吐温20洗涤来去除细胞。在DPBS+0.5％牛血清白蛋白(BSA)中将生物素化检测抗体(Mabtech，Sweden；Cat.#3450-6)稀释至1.0微克/毫升并在使用前使其通过0.2微米唧筒过滤器过滤。向适合的孔中添加100微升检测抗体。于36℃±2℃，5+2％CO2下将平板培养3小时。去除检测抗体并用DPBS+0.1％吐温洗涤平板。于36℃、5±2％CO2下用100微升/孔的于DPBS+0.1％吐温20中稀释至1∶1000的StreptAvidin-HRP(KPL，Gaithersburg，MD；Cat.#14-30-00)将平板培养1小时。
培养期间，制备底物溶液。于一Erylenmeyer玻璃烧瓶中，将一片20毫克的AEC(3-氨基-9-乙基-咔唑，Sigma，St.Louis，MO；Cat.#D4254)溶于2毫升N，N-二甲基甲醯胺(DNF)中。一旦溶解，向底物溶液中添加58毫升0.1M醋酸钠(pH 5.0)及30微升过氧化氢(H2O2)，然后在使用前使其通过一0.45微米过滤器过滤。
用DPBS+0.1％吐温20洗涤平板，随后单独用DPBS洗涤平板以去除残余的清洁剂。向各孔中添加100微升底物溶液并于室温下培养至多20分钟。通过去除底物溶液并用蒸馏水洗涤来终止反应。于室温下干燥平板，并使用一Zeiss Elispot计数器(CarlZeiss Vision，Oberkochen，德国)及KS ELISPOT 4.4软件来评价斑点生成单元(SPC)的数量、面积及强度。
IFN-γ平板培养后，通过用洗涤缓冲液(R&D Systems，Minneapolis，MN)洗涤来去除细胞。根据操作说明书于稀释缓冲液1(R&D System，Minneapolis，MN)中稀释生物素化检测抗体并在使用前使其通过0.2微米唧筒过滤器过滤。向适合的孔中添加100微升检测抗体。然后于36℃±2℃、5+2％CO2下培养平板3小时。去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤平板。于36℃±2℃、5±2％CO2下用100微升/孔根据操作说明书稀释的StreptAvidin-AP(R&D System，Minneapolis，MN)将平板培养1小时。
在用StreptAvidin-AP培养后，用洗涤缓冲液洗涤平板，并于室温下用100微升/孔BCIP/NBT(R&D System，Minneapolis，MN)培养20分钟。去除底物溶液并用蒸馏水洗涤平板来终止反应。于室温下干燥平板，并使用一Zeiss Elispot计数器(Carl ZeissVision，Oberkochen，德国)及KS ELISPOT 4.4软件来评价斑点生成单元(SPC)的数量、面积及强度。
数据分析结果读取为斑点形成细胞(SFC)并根据实验性质而以不同方式表达。有三种可能的方式呈现数据各孔中最初的斑点数、每一样品每次处理的平均斑点数及刺激指数(Stimulus Index)。通过用未经刺激孔(仅有细胞+培养基)中的平均斑点数除以经刺激孔中的平均斑点数来计算刺激指数。
B.结果及解释实施该评价来估计在由接种E.canis的犬中分离的PBMC中IL-12及IFN-γ分泌细胞的数目。
在本实验中，使用1组对照及3组接种疫苗的犬。实验结果示于表VI及VII中。由表VI可见，数据表明在3组接种疫苗的犬仅活的感染E.canis的DH82细胞刺激PBMC中产生IL-12，而相比之下对照犬的PBMC中没有产生IL-12。刺激亦与感染E.canis的DH82细胞呈剂量相关性，最大斑点数在E.canis储备液的1∶10稀释度(相当于1×104细胞/孔)下而非在1∶1000稀释度下出现。用或未用福尔马林处理的感染E.canis的DH82细胞裂解物、活的未受到感染的DH82细胞、未受到感染的DH82细胞裂解物及经福尔马林处理裂解物的DH82细胞均不产生任何可检测的IL-12反应。两组接种疫苗的犬较第三组接种疫苗的犬反应程度更高。对照犬除了对阳性分裂素(PHA)有较低反应外，对任何刺激均无反应。
表VII显示同样的四组犬的IFN-γ酶联斑点分析结果。类似于IL-12，在所有三组接种疫苗的犬中，活的E.canis DH82细胞皆显示最高的IFN-γ斑点诱导。该诱导亦依赖于E.canis细胞数，在1∶10稀释度下呈现最高水平，在1∶1000稀释度下呈现最低水平。对于接种疫苗的犬，感染E.canis的DH82细胞裂解物产生更低的斑点数。经福尔马林处理的裂解物在1∶1000稀释度下可产生一背景，而在1∶10或1∶100稀释度时无斑点。这可能是由于残余福尔马林对单核细胞活性有抑制效应。与活的感染E.canis的DH82细胞相比，所有三种制剂的未受到感染的DH82细胞仅产生背景斑。单条犬的反应类似于在IL-12酶联斑点分析中所见者。同样的两组接种疫苗的犬比第三组对单独的分裂素(ConA)刺激显示的反应更强，而对照犬的反应弱。
本实验的结果表明，仅有活的感染E.canis的DH82细胞可通过PBMC同时诱导产生IL-12及IFN-γ。感染E.canis的DH82细胞裂解物或经福尔马林处理的裂解物均不能使用，因为它们对T细胞或单核细胞的细胞活性的刺激效应较低。
C.总结下文的表VI及VII中所示数据表明CMI可在保护经E.canis菌苗接种免疫的犬方面起作用。接种疫苗犬的IL-12及IFN-γ斑点数增加表明激活了T细胞及单核细胞。
表VI由E.canis菌苗诱导的犬中IL-12酶联斑点反应抗原稀释度
表VII由E.canis菌苗诱导的犬中IFN-g酶联斑点反应抗原稀释度
权利要求
1.一种疫苗组合物，其包含有效免疫量的灭活犬艾利希体(Ehrlichia canis)菌苗；药理学上可接受的载剂；及免疫原性刺激量的基本上由抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述灭活菌苗选自由下列各物组成的群组一或多种命名为Ebony、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venezuela、北卡罗莱纳州立大学(the North Carolina State University)(NCSU)菌株Jake、NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy的E.canis菌株、具有任一所述指定菌株的感染E.canis的细胞系及具有任一所述指定菌株的感染E.canis的DH82细胞系。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述灭活菌苗选自由犬艾利希体Ebony、犬艾利希体Broadfoot及其混合物组成的群组。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体反应诱导剂选自由乙烯马来酸酐、苯乙烯化丙烯酸共聚物及其混合物组成的群组。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞介导的免疫反应诱导剂选自由水包油乳液、Th1相关细胞因子、减毒牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及其混合物组成的群组。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述灭活菌苗以足以提供至少1×104TCID50/单位剂量的量存在。
7.如权利要求4所述的组合物，其中所述抗体反应诱导剂为乙烯马来酸酐与苯乙烯化丙烯酸共聚物的混合物，且其以约1％体积/体积乙烯马来酸酐及约3％体积/体积苯乙烯化丙烯酸共聚物的量存在。
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述水包油乳液选自由水包石蜡油乳液、角鲨烷与环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物的组合物、兴泰克佐剂调配物-1(SyntexAdiuvant Formulation-1)及其混合物组成的群组。
9.如权利要求5所述的组合物，其中所述Th1相关细胞因子选自由白介素-12、白介素-18、γ干扰素及其混合物组成的群组。
10.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞介导的免疫反应剂为水包油乳液并以介于约3％至7％体积/体积之间的量存在。
11.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞介导的免疫反应剂为水包油乳液并以约5％体积/体积的量存在。
12.一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法，其包含向所述犬投予疫苗组合物，所述疫苗组合物包含有效免疫量的灭活犬艾利希体菌苗、药理学上可接受的载剂及免疫原性刺激量的基本上由抗体反应诱导剂及细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。
13.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述灭活菌苗选自由下列各物组成的群组一或多种命名为Ebony、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venezuela、北卡罗莱纳州立大学(NCSU)菌株Jake、NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy的E.canis菌株、具有任一所述指定菌株的感染E.canis的细胞系及具有任一所述指定菌株的感染E.canis的DH82细胞系。
14.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述灭活菌苗为犬艾利希体Ebony或犬艾利希体Broadfoot或其混合物。
15.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述抗体反应诱导剂为乙烯马来酸酐与苯乙烯化丙烯酸共聚物的混合物。
16.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述细胞介导的免疫反应诱导剂选自由水包石蜡油乳液、角鲨烷与环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物的组合物、兴泰克佐剂调配物-1、一减毒牛分枝杆菌、白介素-12、白介素-18、γ干扰素及其混合物组成的群组。
17.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述灭活菌苗以足以提供至少1×104TCID50/单位剂量的量存在。
18.一种用于在测试动物中诱导临床犬艾利希体病的方法，其包含向所述测试动物投予有效量的基本上由感染有强毒的犬艾利希体微生物的外周血单核细胞组成的激发储备液。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述储备溶液经皮下投予。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述强毒的微生物通过其在测试动物中之反复继代而产生。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述微生物为犬艾利希体Ebony。
22.一种包含感染有强毒的犬艾利希体微生物的外周血单核细胞的激发储备组合物。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述强毒的微生物为已在测试动物中反复继代的犬艾利希体Ebony。
全文摘要
本发明提供一种安全且有效的疫苗组合物，其包含一有效免疫量的灭活犬艾利希体(Ehrlichia canis)菌苗；一药理学上可接受的载剂；及一免疫原性刺激量的基本上由一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法。
文档编号A61K39/02GK1930185SQ200580007652
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月11日
发明者胡良标(乔治), 托马斯·杰伊·赫斯, 江玉维, 朱信觉(史蒂夫) 申请人:惠氏公司
技术领域：
本发明提供一种安全且有效的疫苗组合物，其包含一有效免疫量的灭活犬艾利希体(Ehrlichia canis)菌苗；一药理学上可接受的载剂；及一免疫原性刺激量的基本上由一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法。
背景技术：
犬艾利希体病是一种由一经血液介导的细胞内病原菌犬艾利希体(E.canis)引起的致死性疾病，并可感染处于任何生长阶段的任何品种的犬。犬艾利希体病主要由棕色犬壁虱血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineous)传播，其被认为是该疾病的主要传播源头。犬艾利希体病是美国的地方性潜在致死性疾病并出现于世界各地。症状通常由急性疾病态进展至慢性疾病态，此取决于生物体菌株及宿主的免疫状态而定。在急性病例中，症状包括液脓性的眼排泄物及鼻涕、脱水、网状内皮组织增生、发烧、一般性淋巴结病、脾肿大及血小板减少症。在慢性病例中，可出现厌食、抑郁、精力不振、僵硬及不愿走路、四肢或阴囊水肿及咳嗽或呼吸困难等可变症状。
目前还没有用于有效治疗或预防犬艾利希体病的疫苗。对各种形式艾利希体病的通常治疗是投予抗生素(例如四环素)至少2周(急性病例)或1至2个月(慢性病例)。在慢性病例中，血液异常可持续3至6个月，或持续终生。可能需要支持治疗来对抗消瘦及特定器官功能障碍。疾病的有效预防显然优于感染后抗生素治疗。
因此，本发明的一目的是提供一种用于在犬中诱发抗犬艾利希体病的保护性免疫的安全且有效的疫苗组合物。
本发明的另一目的是提供一种用于预防或改善犬中的犬艾利希体病的方法。
本发明的又一目的是提供一种用于在测试动物中诱发临床犬艾利希体病的方法。该方法可用于宿主防御及致病机制的评价及研究，并用于抗艾利希体病疫苗的改进研制。
本发明的一特征是该疫苗组合物可保护犬免受多种起源于多个地理区域的E.canis菌株的侵袭。
本发明的另一特征是可将抗犬艾利希体病的有效保护性免疫赋予任何年龄的犬。
自下文详细说明将易知本发明的其他目的及特征。
发明内容
本发明提供一种安全且有效的疫苗组合物，其包含一有效免疫量的灭活犬艾利希体菌苗、一药理学上可接受的载剂及一免疫原性刺激量的包含以下各物或基本上由以下各物组成的佐剂系统一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫(CMI)反应诱导剂。
本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法。
本发明进一步提供一种用于诱发测试动物临床E.canis感染的方法，该方法可用于宿主防御及致病机制的研究及评价，并可用于犬艾利希体病治疗及预防的改进研制。
具体实施例方式
犬艾利希体病病原为犬艾利希体(E.canis)，一种立克次氏体(Rickettsiales)目革兰氏阴性细菌，其单独出现或在循环哺乳动物白细胞的致密包体中出现并由壁虱传播。犬艾利希体病是美国许多地区的地方病，且已知在世界各地出现。自然发生的急性犬艾利希体病酷似落矶山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)。多数急性病例出现于更温暖的月份，这与壁虱传播媒介的最大活性一致。犬艾利希体病可是一种致死性疾病。通常它是一种慢性疾病，可影响任何年龄犬并导致各种可变症状，例如厌食、抑郁、精力不振、僵硬及不愿走路、四肢或阴囊水肿、咳嗽或呼吸困难等。迄今为止，尚没有已知有效的对抗犬艾利希体病的接种疫苗或免疫治疗。
令人吃惊地，目前已发现向处于任何生长阶段(较佳犬龄为16周或更大)的犬投予一疫苗组合物可预防或缓解犬艾利希体病，该疫苗组合物包含有效免疫量的灭活E.canis菌苗、一药理学上可接受的载剂及一免疫原性刺激量的基本上由一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫(CMI)反应诱导剂组成的佐剂系统。
适用于本发明免疫组合物中的E.canis菌苗可为一或多株菌株。适用于本发明免疫组合物中的E.canis菌苗可为一或多株菌株，例如那些命名为Ebony、Broadfoot、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venezuela、北卡罗莱纳州立大学(the North Carolina State University)(NCSU)菌株Jake、NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy的菌珠、具有任一该些指定菌株的感染E.canis的细胞系、具有任一该些指定菌株的感染E.canis的DH82细胞系或由美国种质保藏中心(the American TypeCulture Collection)(ATCC，Rockville，MD)储存并给予存取编号CRL 10390的感染E.canis的DH82细胞系(如美国专利第5,192,679号中所揭示)，或诸如此类。适用于本发明疫苗组合物中的E.canis菌苗较佳可为两株E.canis，例如Ebony及Broadfoot。
例如，基于16S重组DNA(rDNA)序列，Ebony菌株与Oklahoma菌株具99.9％同源性(即，1个核苷酸差异)[Mathew JS等人，Attempted transmission of Ehrlichia canisby Rhipicephalus sanguineus after passage in cell culture，Am J Vet Res 1996 Nov；57(11)1594-8]，且Ebony菌株已显示为可由棕色犬壁虱(血红扇头蜱)幼虫及成虫传播给犬(Mathew 1996)。
已揭示Florida菌株含有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)及一属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)。而且，美国专利第6,043,085号揭示Florida菌株具有一120-kDa免疫显性抗原蛋白，包含14个重复片段，每一重复片段具有36个氨基酸，预测这些重复片段表面暴露。重复单元具有亲水性，形成蛋白表面暴露区的核心，并富含丝氨酸及谷氨酸。丝氨酸及谷胺酸各占重复单元氨基酸的19％。Florida菌株被认为毒性比E.canis菌株NCSU Jake弱[Breitschwerdt等人.Doxycycline hyclate treatment of experimental E.canis followed bychallenge inoculation with two Ehrlichia canis strains，Antimicrobial Agents andChemotherapy，1998 Feb；42(2)362-68}，而与Oklahoma菌株的血清学比较揭示100％的特异性及87.5％的灵敏性[Dawson JE等人.Serological comparison of humanEhrlichia canis using two Ehrlichia canis isolates.J Infect Dis.1991 Mar；163(3)564-7}。
除在连续的犬细胞系(例如，DH82)中生长(KeysaryA等人.The first isolation，invitro propagation，and genetic characterization of Ehrlichia canis in Israel，Vet.Parasitol.1996 Apr；62(3-4)331-40.)外，Israel 611菌株亦已在连续的小鼠巨噬细胞系(例如，J774.A1)中生长(Keysary A等人.Cultivation of Ehrlichia canis in a continuous BALB/Cmouse macrophage cell culture line，J Vet Diag.Invest.2001 Nov；13(6)521-3)。Israel 611具有两种形式的桑椹胚(1)致密桑椹胚和(2)松散桑椹胚，且其16S rRNA基因序列与Oklahoma菌株有三个核苷酸不同，与Florida菌株有四个核苷酸不同，各有一个核苷酸缺口(Keysary，1996)。与Oklahoma菌株的同源性差异程度为0.54％，而与Florida菌株的同源性差异程度为0.61％(Keysary，1996)。
与Florida菌株一样，Louisiana菌株具有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)、一属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)及如美国专利第6,043,085号中所揭示的一120-kDa免疫显性抗原蛋白，该抗原蛋白含有14个重复片段，每一重复片段具有36个氨基酸，预测这些重复片段表面暴露。重复单元具有亲水性，可形成蛋白表面暴露区的核心，并富含丝氨酸及谷氨酸。丝氨酸及谷氨酸各占重复单元氨基酸的19％。
亦类似地，Oklahoma菌株具有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)、一属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)及如美国专利第6,043,085号中所揭示的一120-kDa免疫显性抗原蛋白，该抗原蛋白含有14个重复片段，每一重复片段具有36个氨基酸，预测这些重复片段表面暴露。这些重复单元具有亲水性，可形成蛋白表面暴露区的核心，并富含丝氨酸及谷氨酸。丝氨酸及谷氨酸各占重复单元氨基酸的19％。此外，McBride JW等人发现Oklahoma具有一可编码548至688个氨基酸的糖蛋白基因(2,064bp)，其预测分子量分别仅为61及73kDa，但电泳迁移率为140kDa(P140)。140-kDa蛋白基因具有十四(14)个几乎完全相同的衔接布置的108-bp重复单元。P140基因(1,620bp)的14个重复区(78％)在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。该重组蛋白显示在那些由氨基酸序列预测的分子量的1.6至2倍间的分子量。抗这些重组蛋白的抗体与E.canis P140作应。于E.canis重组蛋白上检测到碳水化合物。碳水化合物组分分析于该重组蛋白上鉴别到葡萄糖、半乳糖及木糖。仅存在一个N-连接的(Asn-Xaa-Ser/Thr)糖基化位点，缺少N-糖苷酶F的作用，在P120及P140重复区分别存在70及126 Ser/Thr糖基化位点以及碳水化合物与蛋白的莫耳比率高，这一切表明这些聚糖可为O连接型(McBride JW等人.Glycosylation of Homologous Immunodominant Proteins of Ehrlichia chaffeensis andEhrlichia canis.Infection and Immunity，January 2000，68(1)13-18)。Oklahoma可于包含12.5％胎牛血清及200mM L-谷胺醯胺的最低必需培养基中的犬巨噬细胞系DH82中生长(Bowie，M.V.等人Potential value of major antigenic protein 2 for serological diagnosisof heartwater and related Ehrlichia！infections，Clin.Diagnostic Lab.Immun.，1999 Mar；6(2)209-15)。与FL菌株的血清学比较揭示100％的特异性及87.5％的灵敏性(Dawson1991，见上文)。基于16S rDNA序列，已在菌株Ebony(Mathew 1996)、Kagoshima 1(Unver A等人.Analysis of 16S rRNA gene sequences of Ehrlichia canis，Anaplasma platys，and Wolbachia species from canine blood in Japan，Ann NY Acad.Sci.2003 Jun；990692-8}及Venezuela(Unver A等人.Molecular and antigenic comparison of Ehrlichia canis isolatesfrom dogs，ticks，and a human in Venezuela.J Clin Microbiol.2001 Aug；39(8)2788-93}中发现99.9％的相似性。
NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy及菌株Jake皆具有一保守的主要免疫反应性28-kDa蛋白基因(美国专利第6,458,942号)。已揭示DJ、Fuzzy及Jake亦具有属于omp-1多基因家族的p 30基因(美国专利第6,432,649号)。Jake被认为比Florida菌株毒性更强(Breitschwerdt 1998，见上文)。
已发现Kagoshima 1的几乎整个16S rRNA序列与来自Oklahoma及Venezuela E.canis菌株的序列最相似(1,387个碱基对中有1个碱基对差异)，序列同一性为99.9％(Unver 2003，supra)。除与Kagoshima 1菌株的高序列同一性外及与之类似，基于16SrDNA序列，Venezuela菌株与Oklahoma菌株有99.9％的相似(Uhver 2001)。
在较佳实践中，E.canis菌苗在一含有RPMI1640并补充胎牛血清、葡萄糖及谷胺醯胺的培养基支持的犬单核细胞巨噬细胞系(有时称其为连续的犬巨噬细胞或犬巨噬细胞系)中生长。该些细胞较佳可在一支持培养基上培养，该支持培养基可为RPMI1640、OptiMEM或AIM V(较佳RPMI1640)，并补充至多10％的胎牛血清、0.5％的乳蛋白水解产物、30微克/毫升的多粘菌素B(Polymyxin B)、110微克/毫升的丙酮酸钠、2.5毫克/毫升的碳酸氢钠、4毫克/毫升的葡萄糖、6毫克/毫升的L-谷胺醯胺、0.55毫克/毫升的硫酸镁，并培养至多95天，较佳至多35天，最佳约5至10天，以达成≥1×104TCID50的滴度(组织培养感染剂量(Tissue Culture Infectious Dose))，然后收获该培养物，并加以处理以便于灭活。
然后，可由传统灭活方法灭活如此获得的E.canis菌苗。例如，使用化学灭活剂(例如二元次乙亚胺、β-丙内酯、福尔马林、硫柳汞、戊二醛、十二烷基硫酸钠或诸如此类或其混合物)进行化学灭活，较佳的灭活剂为福尔马林。菌苗亦可在紫外光存在下由热或补骨脂素灭活。
有效免疫量的灭活E.canis菌苗可随所选菌株而改变，且其可为任何足以引起一保护性免疫反应的量。其中剂量单位包含至少约1×104TCID50灭活E.canis菌苗的量较为合适。
本文所用术语“抗体反应诱导剂”指任何能增强体液免疫反应的化合物或化合物组合。典型实例为乙烯马来酸酐(EMA)共聚物、苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸混合物的共聚物的乳胶乳液例如NEOCRYLA-640(Avecia Neo Resius，Frankfort，IN)、氢氧化铝或诸如此类或其混合物。本发明的抗体反应诱导剂较佳为EMA和NEOCRYL.的混合物。NEOCRYL为Avecia BV，Sluisweg 12 P.O.Box 123 NL-5140 AC WaalwijkNetherlands对水性丙烯酸聚合物及共聚物的注册商标。数字A640表示其级别。NEOCRYLA640为一未聚结的水性苯乙烯化丙烯酸共聚物，其pH为约7.5，黏度为约100cps(Brookfield 25℃)，当提供为含有40重量％固体时重量/加仑为8.6磅，比重为1.30毫克/升，玻璃态转变温度(Tg)为44℃、最低薄膜形成温度(MFFT)为40℃且酸值(不挥发物)为50。特定而言，NEOCRYLA640为一未聚结的水性丙烯酸苯乙烯共聚物。更特定而言，NEOCRYLA640为苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸混合物的共聚物的乳胶乳液。
本发明所用合适级别的EMA共聚物为线性乙烯-马来酸酐共聚物，例如EMA-31(Monsanto公司，St.Louis，MO)，其为一含酸性官能基的共聚物。这些共聚物是水溶性的微细可自由流动的白色粉末，具有以下典型性质软化点为约170℃，分解温度为约247℃，pH(1％溶液)为2.3，比粘度(二甲基甲醯胺中1％溶液)为0.9至1.2克/100毫升。
本文所用术语“细胞介导的免疫(CMI)反应诱导剂”指任何能增强细胞免疫反应的试剂或试剂组合。典型实例为生物制剂，例如一减毒的牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)菌株、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)(BCG)(Calbiochem，La Jolla，CA)或诸如此类，及Th1相关细胞因子，例如白介素-12(IL-12)、白介素-18(IL-18)、γ干扰素或诸如此类(较佳地IL-12)；或係水包油乳液的物质，例如水包石蜡油乳液，如EMULSIGENSA(MVP Laboratories，Ralston，NE)、SP油(角鲨烷、PluronicL 121及Tween80的组合物(角鲨烷购自VWR/Kodak，Rochester，NY且PluronicL121购自BASF，Mt.Olive，NJ))、SAF-1(兴泰克佐剂调配物-1(Syntex Adjuvant Formulation-1)，一胞壁醯二肽苏氨酰基类似物、吐温80、PluronicL121及角鲨烷的组合物，其由Byars，N.E.及Allison，A.C.，Vaccine，5(3)223-28阐述)或诸如此类，较佳为EMULSIGENSA且更佳为水包油乳液。EMULSIGEN为Modern Veterinary Products，5404 Miller Ave.Omaha，Nebraska 68127，U.S.A对于一乳化的水包油性质的兽医抗原佐剂的注册商标。字母SA表示其级别。一石蜡乳化油佐剂基质EMULSIGENSA当与胰酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth)(TSB)混合时是乳白色的(20％终浓度)，黏度为25至50cps(布鲁克菲尔(Brookfield)LV粘度计，心轴#18，于30rpm下)，且其包含至少80％小于或等于八(8)微米的油相小滴。Pluronic为BASF公司环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物的注册商标，数字L121表示其级别。
佐剂系统的免疫原性刺激量可根据抗体反应诱导剂、CMI诱导剂、E.canis菌苗组分、潜在传染性暴露程度、疫苗组合物投予方法、犬的生长阶段及大小或诸如此类而改变。而且，佐剂系统的免疫原性刺激量为一足以增强对免疫因子E.canis菌苗的免疫反应的量。一般而言，约1％至6％体积/体积(较佳约4％体积/体积)的抗体反应诱导剂的量及约3％至7％体积/体积(较佳约5％体积/体积)的CMI诱导剂的量较为合适。
适用于本发明疫苗组合物中的药理学上可接受的载剂为任何习知用于兽医医药组合物的液体载剂，且其较佳为平衡盐溶液，以便适于组织培养基。
除作为活性成份的灭活E.canis菌苗外，本发明亦涵盖，本发明疫苗组合物亦可含有其他活性组分，例如针对狂犬病病毒、白垩病(伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi))、犬瘟病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、贾第虫(Giardia)、诸如犬(canicola)血清型、黄疸出血(icterohaemorrhagiae)血清型、波摩那(pomona)血清型、流感伤寒(grippotyphosa)血清型或布拉提斯拉瓦(bratislava)血清型等的钩端螺旋体的抗病原组分或其组合。
在本发明的一实施例中，本发明的灭活E.canis菌苗组分可使用已知技术(例如阐述于Nature，1974，252，252-254或Journal of Immunology，1978，120，1109-13中者)并入脂质体中。在本发明的另一实施例中，本发明的灭活E.canis菌苗组分可结合至合适的生物化合物，例如多糖、肽、蛋白质或诸如此类或其组合。
在本发明的一较佳实施例中，本发明疫苗组合物可调配成一剂量单位形式，以便于投予并确保剂量一致。在此，剂量单位在与疫苗组合物相关时是指适合作为用于动物的单位剂量的物理离散单元，每一单元含有一经计算可与所需佐剂系统及载剂或媒剂一起产生期望免疫原性效应的规定量的E.canis菌苗。
本发明疫苗组合物可以非经肠方式投予，例如经肌内、经皮下、经腹膜内、经皮内或诸如此类投予，较佳地经皮下或经皮内投予，且更佳地经皮下投予；或所述组合物可经口或经鼻内投予。
因此，本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法，其包含向所述犬投予一安全且有效的上文所述疫苗组合物。
在较佳实践中，本发明疫苗组合物根据由潜在暴露于E.canis菌苗载剂中的时间所确定的时间表以有效量非经肠、经口或经鼻内投予，较佳非经肠投予，更佳经皮下投予。这样，接受治疗的动物在自然暴露之前可有时间产生免疫性。例如，典型的治疗方案可包括潜在暴露前至少5周非经肠投予，较佳经皮下注射。至少2次投予较佳，例如，第一次在经治疗动物潜在暴露前约5周时，且第二次在经治疗动物潜在暴露前约2周时。
为有效地研究及评价E.canis菌苗的致病机制及宿主犬的防御机制并以此提高疫苗工艺及改良疫苗产品，必须创造出一个有效的激发模型。尽管已知不同的犬艾利希体病激发模型，但尚没有一个模型能够使高百分比率的测试动物表现出通常与犬艾利希体病相关的持久而严重的临床症症，例如，粘液脓性的眼排泄物、脱水或诸如此类。因此，评价疫苗和药物以及研究E.canis菌苗和由其所致的疾病需要更佳和更持续有效的激发模型。
令人吃惊地，目前已发现特别有效的E.canis激发可于一验动物中通过向所述测试动物投予含有活E.canis细菌的强毒培养物的外周血单核细胞(PBMC)激发储备液而获得。强毒的E.canis培养物通过以下制备使E.canis微生物(例如E.canis Ebony、E.canis Broadfoot或诸如此类，较佳地E.canis Ebony)在一宿主中反复继代；自宿主血样中分离PBMC；并混合经分离的PBMC与20％的胎牛血清及10％的二甲亚砜。因此，本发明亦提供一种用于在测试动物中诱导临床犬艾利希体病的方法，其包含向所述动物投予一有效量的基本上由强毒E.canis微生物在外周血单核细胞中组成的E.canis激发储备液。E.canis Broadfoot(有时称做E.canis BF或Broadfoot)及E.canisEbony(有时称做Ebony)各自的活培养物皆已由ATCC(根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)与用于专利操作目的微生物储存有关的条款和要求)储存(2004年2月11日)，且已分别给予ATCC存取编号PTA-5811(Broadfoot菌株)及PTA-5812(Ebony菌株)。
在实际实践中，E.canis微生物的毒性可通过在宿主动物中反复继代增强。将来自宿主的全血样品置于一梯度培养基(例如Histopaque1077)上，离心并分离PBMC层。使如此获得的PBMC与20％胎牛血清及10％二甲亚砜混合，并于液氮中冷冻储存以提供一致且持续的激发储备液供应。该激发储备液可在投予测试动物前用生理盐水缓冲液稀释。投予可通过任何习知接种途径，例如皮下、肌内、皮内或诸如此类，且最佳可经由皮下投予。
为了更清楚的理解本发明，下文中列出以下实例。这些实例仅用于阐明目的而绝不能其理解成限制本发明的范围或基本原理。事实上，除了那些本文中已显示及阐述者外，所属领域的技术人员自下文提出的实例及前述说明明了本发明的各种修改方案。此等修改方案亦意欲在随附的权利要求书的范围内。
除非另有说明，否则所有份数均指重量份数。
实例1强毒E.canis激发模型的评价A.激发储备液的制备使活的E.canis Ebony菌株细菌在犬中反复继代。于2500xg下离心受感染犬的全血样品15分钟。收集血沉棕黄层并用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，然后于Histopaque1077上分层并于400xg下离心分层材料45分钟。收集PBMC，并用PBS洗涤。使经洗涤PBMC与20％胎牛血清及10％二甲亚砜混合，并于液氮中冷冻。使用前，将激发储备液用缓冲盐水溶液稀释至激发储备液∶缓冲盐水溶液为1∶3或1∶4的最终稀释液。
B.激发方法在该评价中，将20只8至12个月龄的犬随机分成2组。通过皮下途径使用1毫升经稀释的激发储备液来激发犬。一组使用激发储备液的1∶3稀释液来激发，而另一组使用激发储备液的1∶4稀释液来激发。激发后，观察犬并每周采集血液样品3次来监测疾病的临床症候(包括血小板减少症)，总共56天。
C.观察结果经观测的临床症候包括粘液脓性的鼻涕及眼排泄物、抑郁、脱水、淋巴结病和角膜水肿。粘液脓性的眼排泄物及脱水是最常观察到的症候。粘液脓性的眼排泄物及脱水是疾病发展所特有的并间接反映疾病的严重程度。对于各临床症候，每一观测时间点记录一次发病并比较两组间的总发病率。在观测时间点上，53％(1∶3稀释)及35％(1∶4稀释)存在粘液脓性的眼排泄物且44％(1∶3稀释)及30％(1∶4稀释)存在脱水。
在该评价中亦观察到明显较高的死亡率。死亡率的诱发是激发储备液中所用E.canis菌苗强发病机理的最显著指征。对于1∶3稀释处理，100％的犬符合艾利希体病的病例界定，而对于1∶4稀释处理，80％的犬符合艾利希体病的病例界定。资料显示于表I中。
记录直肠温度，作为艾利希体病感染指示。多数受感染犬出现一定的直肠温度升高。资料显示于表II中。
于激发后约12天(DPC)开始并在整个剩余的观测期内，可观测到血小板减少症(血小板计数低于200,000/微升)。资料显示于表III中。
D.结论上文所述激发模型可在犬中产生严重的犬艾利希体病的临床症候，并提供艾利希体病的病例界定以用于艾利希体病的进一步研究及治疗评价。犬艾利希体病的临床病例界定将由死亡、至少连续3个观察日有粘液脓性的眼排泄物及/或至少连续3个观察日有脱水来界定。
表I
*症候包括于艾利希体病的病例界定中。
表II直肠温度—激发后
表III血小板计数，103/微升—激发后
实例2由BCG辅助的E.canis菌苗诱导的效力的评价一减毒牛分枝杆菌的高压灭菌制备物BCG被公认为是细胞介导的免疫(CMI)的有效诱导剂。为测定协同CMI效应，用不同浓度水平的BCG辅助E.canis菌苗。早先研究表明仅用习知(抗体反应诱导)犬佐剂(例如EMA及Neocryl)辅助的E.canis菌苗仅能诱导效力减弱的保护性免疫。
A.材料及方法使用三个接种疫苗组(每组7条犬)及1个对照组(6条犬)。疫苗含有5log TCID50(预灭活滴度)用下列佐剂组合辅助的E.canis Ebony菌株菌苗。疫苗A含有伯氏疏螺旋体菌菌苗(borrelia burgdoferi bacterin)(BBB)及EMA/Neocryl。疫苗B含有伯氏疏螺旋体菌菌苗(BBB)、EMA/Neocryl及100微克/剂量BCG。疫苗C含有伯氏疏螺旋体菌菌苗(BBB)、EMA/Neocryl及1.0毫克/剂量BCG。三种疫苗的其他组分相同。对照组犬未接种疫苗。
27条犬被随机分成4组前3组(每组7条犬)通过皮下途径间隔21天用疫苗A、B或C接种两次。第4组6条犬用作对照，不接种疫苗。第二次疫苗接种后16天，所有的犬皆用强毒的E.canis激发并观测临床症候、直肠温度及血小板计数改变，共观测56天。
B.结果及讨论结果概示于表IV中。用强毒的E.canis激发后56天，接种疫苗A组中7条犬中有4只(57％)患有血小板减少症并具有高直肠温度。接种疫苗B组中观测到相同结果。在疫苗C组的犬中，研究期间7条犬中仅有2条(28.5％)的接种疫苗的犬患有血小板减少症并具有高直肠温度。6条对照犬中有5条(83％)患有血小板减少症并具有高直肠温度。混合各组的临床症候，各组间无差异。体温及血小板计数改变是E.canis感染及艾利希体病的典型症候。
表IV
1BBB＝源自福特道齐动物健康(Fort Dodge Animal Health)产品系列的伯氏疏螺旋体菌菌苗2由Monsanto公司，St.Louis，MO制造。
3由AVECIA Neo Resius，Frankfort，IN制造4BCG＝卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)，其为减毒牛分枝杆菌，源自Calbiochem，La Jolla，CA。
该研究的结果清楚地表明仅用习知(抗体反应诱导)佐剂(EMA+Neocryl)辅助的疫苗不具有保护性。当疫苗用较低剂量BCG(例如100微克/剂量)辅助时，结果同样如此。然而，当疫苗用1毫克/剂量BCG辅助时，其变得具有保护性。因此，CMI诱导剂(BCG)在足以增强免疫反应的浓度时所诱导的保护性免疫可使E.canis菌苗疫苗具有效力。
C.结论保护犬不受E.canis感染需要CMI。仅用习知犬佐剂辅助的E.canis菌苗不能在活体内诱导保护性免疫。
实例3灭活E.canis疫苗组合物的制备两株E.canis菌苗Ebony及Broadfoot各自在一含有RPMI1640并补充有5％至7％胎牛血清、2％葡萄糖及2毫莫耳谷胺醯胺的培养基所支持的DH82细胞中培养5至14天。所得培养物于≥1×104TCID50的滴度收获。收获物经滴定、裂解且随后通过添加0.1％的福尔马林溶液，于36°±2C下培养24至48小时，添加另一份0.1％的福尔马林并于36°±C下再次培养24至48小时来灭活。两株E.canis灭活菌株以1×104.5TCID50的相同剂量与下述佐剂系统掺合在一起以获得疫苗组合物A。
疫苗组合物A
1由Monsanto公司，St.Louis，MO制造2由AVECIA Neo Resius，Frankfort，IN制造3由MVP Laboratories公司，Ralston，NE制造4由LTI，Grand Island，NY制造的最低必需培养基(MEM)
实例4对由E.canis疫苗组合物A诱导的十二个月免疫持续时间的评价在该评价中，将15周至16周龄的小猎犬分成2组，1个对照(不接种疫苗)组(15条犬)及1个接种疫苗组(27条犬)。接种疫苗组间隔21天接受两次1毫升剂量的如实例3所述疫苗组合物A。如实例1所述，接种疫苗后十二个月，所有测试动物皆经由皮下途径用一感染E.canis的外周血单核细胞(pmbc)的1∶3稀释液的已确立的低温激发池来激发。于激发后12天(DPC)开始每周观察测试动物3次。依照动物健康及台湾大学实验动物管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))导则，任何垂死的或身体状况不佳的测试动物均由国家认可的兽医详细检查。
使用K-ELISA评价血清样品中的E.canis抗体，以定量接种疫苗后的免疫反应。向涂覆有E.canis全细胞提取蛋白的孔中一式两份地添加血清样品。然后，向各孔中添加结合过氧化物酶的山羊抗犬免疫球蛋白(IgG)，并于36°±2℃下培养平板30分钟。移除未结合的交联物后，使用ATBS替代系统培养平板。使用一动力学模式，于405至490微米下以35秒的间隔读取平板20分钟。血清学结果显示于表V中，其中DPV1指第一次疫苗剂量后的天数；DPV2指第二次疫苗剂量后的天数；MPV2指第二次疫苗剂量后的月数；而DPC指激发的天数。
观测结果由表V的血清学数据可见，与对照(未接种疫苗)组相比，接种疫苗组的抗体有明显增加。接种疫苗组及对照组间抗体的明显差异亦可在激发后观测到。除血清学数据外，亦记录红细胞比容值、血小板计数、直肠温度及每周体重。与对照组相比，接种疫苗组红细胞比容百分率明显更低。与对照组相比，激发后44天接种疫苗组血小板计数明显更低。与对照组相比，接种疫苗组重量损失显著更低。在对照组中，87％符合犬艾利希体病的病例界定(包括死亡率)。在接种疫苗组中，在56天临床观测期内，44％符合犬艾利希体病的病例界定。
结论实例3的E.canis疫苗组合物明显降低犬中的临床犬艾利希体病。投予两次1毫升剂量的所述疫苗可在至少12个月的时间内诱发免疫。投予实例3的疫苗组合物可显著增加犬中抗E.canis的抗体。
表V对灭活E.canis疫苗的抗体反应
表V(接续)
实例5对响应于灭活E.canis疫苗的细胞介导的免疫的评价使用犬IL-12及IFN-γ酶联斑点分析来评价接种犬型艾利希体(E.canis)菌苗的犬中IL-12及IFN-γ的水平。与对照犬相比，由接种疫苗的犬中分离的外周血单核细胞可产生更高数量的IL-12及IFN-γ斑点，这显示CMI反应可在保护犬不受E.canis感染中起作用。
A.材料及方法在本研究中使用两组犬接受E.canis菌苗的接种疫苗组及不接受菌苗的对照组。在用E.canis菌苗第一次接种后，自接种疫苗的犬及对照犬中抽取全血。经由无菌静脉穿刺将对照及接种疫苗的犬的全血样品收集至10毫升EDTA管中。于一Percoll梯度上通过离心分离外周血单核细胞(PBMC)。分离后，对于每一样品，计数PBMC并测定细胞浓度。然后，将分离的PBMC立即用于酶联斑点分析中。
用于培养犬PBMC的完全培养基由等体积Aim V(Invitrogen，Carlsbad，CA；Cat.#12055-083}及Ex-Cell(JRH Biosciences，Lenexa，KS；Cat.# 141610-500M}、10％热灭活的马血清(Hyclone，Logan，UT；Cat.# SH30074.03}及10微克/毫升庆大霉素组成。
酶联斑点分析酶联斑点平板的制备IL-12平板将Immobilon P平板(Millipore，Burlington，MA)用70％的甲醇预润湿，用Dulbecco-Vogt磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤，用100微升/孔小鼠抗人IL-12抗体(10微克/毫升；Mabtech，Sweden)涂覆，在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释，并于37℃5+2％CO2中培养2小时。然后用DPBS+0.1％吐温20洗涤平板并于36℃5+2％CO2中用完全Aim V/ExCell培养基封阻至少2小时。
IFN-γ平板用于犬IFN-γ检测的酶联斑点平板以一类似于犬IL-12平板的方式制备，使用一对犬IFN-γ具特异性的抗体。本研究中所用平板可自R&D Systems(Minneapolis，MN；Cat.# EL781)购买，并可根据操作说明书制备。这些平板用抗犬IFN-γ多克隆抗体预涂覆。
抗原的制备最初使用6种不同的细胞制备物作为抗原来刺激IL-12及IFN-γ的产生。这些细胞制备物包括1.活的感染E.canis的DH82细胞2.感染E.canis的DH82细胞裂解物(通过匀浆化裂解细胞)3.通过福尔马林处理来灭活的感染E.canis的DH82细胞裂解物4.仅活的未受到感染的DH82细胞5.未受到感染的DH82细胞裂解物6.通过福尔马林处理来灭活的未受到感染的DH82细胞裂解物。
使用前3种制备物来刺激刺激IL-12及IFN-γ的产生。试验中使用另外3种制备物作为阴性对照。分析当天，收获、计数活的感染E canis及未感染E.canis的DH82细胞，并测定细胞浓度。将期望数量的活细胞及同等细胞数的细胞裂解物(用或不用福尔马林处理)重新悬浮于完全Aim V/Excell培养基中并加以分析。在完全培养基中制备分裂素刀豆体球蛋白(Concanavalin)A(Con A)(Sigma Cat# C0412)及菜豆(Phaseolus vulgaris)(PHA)凝集素(Sigma Cat.# L-4144)，并将其用作分析的阳性对照。
E.canis及PBMC的培养涂覆抗体的平板在2小时介质封阻后，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)+0.1％吐温20洗涤。向涂覆抗体的孔中添加合适稀释度的活的感染E.canis及未感染E.canis的DH82细胞、细胞裂解物、培养基及阳性对照，添加量为每孔150微升。向适合的孔中添加已在完全培养基中稀释至期望细胞浓度的经稀释PBMC与50微升/孔的细胞培养物。然后于36℃±2℃、5+2％CO2下培养平板20至50小时，此取决于拟进行的分析。
平板培养IL-12平板培养后，通过用DPBS+0.1％吐温20洗涤来去除细胞。在DPBS+0.5％牛血清白蛋白(BSA)中将生物素化检测抗体(Mabtech，Sweden；Cat.#3450-6)稀释至1.0微克/毫升并在使用前使其通过0.2微米唧筒过滤器过滤。向适合的孔中添加100微升检测抗体。于36℃±2℃，5+2％CO2下将平板培养3小时。去除检测抗体并用DPBS+0.1％吐温洗涤平板。于36℃、5±2％CO2下用100微升/孔的于DPBS+0.1％吐温20中稀释至1∶1000的StreptAvidin-HRP(KPL，Gaithersburg，MD；Cat.#14-30-00)将平板培养1小时。
培养期间，制备底物溶液。于一Erylenmeyer玻璃烧瓶中，将一片20毫克的AEC(3-氨基-9-乙基-咔唑，Sigma，St.Louis，MO；Cat.#D4254)溶于2毫升N，N-二甲基甲醯胺(DNF)中。一旦溶解，向底物溶液中添加58毫升0.1M醋酸钠(pH 5.0)及30微升过氧化氢(H2O2)，然后在使用前使其通过一0.45微米过滤器过滤。
用DPBS+0.1％吐温20洗涤平板，随后单独用DPBS洗涤平板以去除残余的清洁剂。向各孔中添加100微升底物溶液并于室温下培养至多20分钟。通过去除底物溶液并用蒸馏水洗涤来终止反应。于室温下干燥平板，并使用一Zeiss Elispot计数器(CarlZeiss Vision，Oberkochen，德国)及KS ELISPOT 4.4软件来评价斑点生成单元(SPC)的数量、面积及强度。
IFN-γ平板培养后，通过用洗涤缓冲液(R&D Systems，Minneapolis，MN)洗涤来去除细胞。根据操作说明书于稀释缓冲液1(R&D System，Minneapolis，MN)中稀释生物素化检测抗体并在使用前使其通过0.2微米唧筒过滤器过滤。向适合的孔中添加100微升检测抗体。然后于36℃±2℃、5+2％CO2下培养平板3小时。去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤平板。于36℃±2℃、5±2％CO2下用100微升/孔根据操作说明书稀释的StreptAvidin-AP(R&D System，Minneapolis，MN)将平板培养1小时。
在用StreptAvidin-AP培养后，用洗涤缓冲液洗涤平板，并于室温下用100微升/孔BCIP/NBT(R&D System，Minneapolis，MN)培养20分钟。去除底物溶液并用蒸馏水洗涤平板来终止反应。于室温下干燥平板，并使用一Zeiss Elispot计数器(Carl ZeissVision，Oberkochen，德国)及KS ELISPOT 4.4软件来评价斑点生成单元(SPC)的数量、面积及强度。
数据分析结果读取为斑点形成细胞(SFC)并根据实验性质而以不同方式表达。有三种可能的方式呈现数据各孔中最初的斑点数、每一样品每次处理的平均斑点数及刺激指数(Stimulus Index)。通过用未经刺激孔(仅有细胞+培养基)中的平均斑点数除以经刺激孔中的平均斑点数来计算刺激指数。
B.结果及解释实施该评价来估计在由接种E.canis的犬中分离的PBMC中IL-12及IFN-γ分泌细胞的数目。
在本实验中，使用1组对照及3组接种疫苗的犬。实验结果示于表VI及VII中。由表VI可见，数据表明在3组接种疫苗的犬仅活的感染E.canis的DH82细胞刺激PBMC中产生IL-12，而相比之下对照犬的PBMC中没有产生IL-12。刺激亦与感染E.canis的DH82细胞呈剂量相关性，最大斑点数在E.canis储备液的1∶10稀释度(相当于1×104细胞/孔)下而非在1∶1000稀释度下出现。用或未用福尔马林处理的感染E.canis的DH82细胞裂解物、活的未受到感染的DH82细胞、未受到感染的DH82细胞裂解物及经福尔马林处理裂解物的DH82细胞均不产生任何可检测的IL-12反应。两组接种疫苗的犬较第三组接种疫苗的犬反应程度更高。对照犬除了对阳性分裂素(PHA)有较低反应外，对任何刺激均无反应。
表VII显示同样的四组犬的IFN-γ酶联斑点分析结果。类似于IL-12，在所有三组接种疫苗的犬中，活的E.canis DH82细胞皆显示最高的IFN-γ斑点诱导。该诱导亦依赖于E.canis细胞数，在1∶10稀释度下呈现最高水平，在1∶1000稀释度下呈现最低水平。对于接种疫苗的犬，感染E.canis的DH82细胞裂解物产生更低的斑点数。经福尔马林处理的裂解物在1∶1000稀释度下可产生一背景，而在1∶10或1∶100稀释度时无斑点。这可能是由于残余福尔马林对单核细胞活性有抑制效应。与活的感染E.canis的DH82细胞相比，所有三种制剂的未受到感染的DH82细胞仅产生背景斑。单条犬的反应类似于在IL-12酶联斑点分析中所见者。同样的两组接种疫苗的犬比第三组对单独的分裂素(ConA)刺激显示的反应更强，而对照犬的反应弱。
本实验的结果表明，仅有活的感染E.canis的DH82细胞可通过PBMC同时诱导产生IL-12及IFN-γ。感染E.canis的DH82细胞裂解物或经福尔马林处理的裂解物均不能使用，因为它们对T细胞或单核细胞的细胞活性的刺激效应较低。
C.总结下文的表VI及VII中所示数据表明CMI可在保护经E.canis菌苗接种免疫的犬方面起作用。接种疫苗犬的IL-12及IFN-γ斑点数增加表明激活了T细胞及单核细胞。
表VI由E.canis菌苗诱导的犬中IL-12酶联斑点反应抗原稀释度
表VII由E.canis菌苗诱导的犬中IFN-g酶联斑点反应抗原稀释度
权利要求
1.一种疫苗组合物，其包含有效免疫量的灭活犬艾利希体(Ehrlichia canis)菌苗；药理学上可接受的载剂；及免疫原性刺激量的基本上由抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述灭活菌苗选自由下列各物组成的群组一或多种命名为Ebony、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venezuela、北卡罗莱纳州立大学(the North Carolina State University)(NCSU)菌株Jake、NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy的E.canis菌株、具有任一所述指定菌株的感染E.canis的细胞系及具有任一所述指定菌株的感染E.canis的DH82细胞系。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述灭活菌苗选自由犬艾利希体Ebony、犬艾利希体Broadfoot及其混合物组成的群组。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体反应诱导剂选自由乙烯马来酸酐、苯乙烯化丙烯酸共聚物及其混合物组成的群组。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞介导的免疫反应诱导剂选自由水包油乳液、Th1相关细胞因子、减毒牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及其混合物组成的群组。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述灭活菌苗以足以提供至少1×104TCID50/单位剂量的量存在。
7.如权利要求4所述的组合物，其中所述抗体反应诱导剂为乙烯马来酸酐与苯乙烯化丙烯酸共聚物的混合物，且其以约1％体积/体积乙烯马来酸酐及约3％体积/体积苯乙烯化丙烯酸共聚物的量存在。
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述水包油乳液选自由水包石蜡油乳液、角鲨烷与环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物的组合物、兴泰克佐剂调配物-1(SyntexAdiuvant Formulation-1)及其混合物组成的群组。
9.如权利要求5所述的组合物，其中所述Th1相关细胞因子选自由白介素-12、白介素-18、γ干扰素及其混合物组成的群组。
10.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞介导的免疫反应剂为水包油乳液并以介于约3％至7％体积/体积之间的量存在。
11.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞介导的免疫反应剂为水包油乳液并以约5％体积/体积的量存在。
12.一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法，其包含向所述犬投予疫苗组合物，所述疫苗组合物包含有效免疫量的灭活犬艾利希体菌苗、药理学上可接受的载剂及免疫原性刺激量的基本上由抗体反应诱导剂及细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。
13.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述灭活菌苗选自由下列各物组成的群组一或多种命名为Ebony、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venezuela、北卡罗莱纳州立大学(NCSU)菌株Jake、NCSU分离株Demon、DJ及Fuzzy的E.canis菌株、具有任一所述指定菌株的感染E.canis的细胞系及具有任一所述指定菌株的感染E.canis的DH82细胞系。
14.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述灭活菌苗为犬艾利希体Ebony或犬艾利希体Broadfoot或其混合物。
15.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述抗体反应诱导剂为乙烯马来酸酐与苯乙烯化丙烯酸共聚物的混合物。
16.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述细胞介导的免疫反应诱导剂选自由水包石蜡油乳液、角鲨烷与环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物的组合物、兴泰克佐剂调配物-1、一减毒牛分枝杆菌、白介素-12、白介素-18、γ干扰素及其混合物组成的群组。
17.如权利要求12所述的方法，其具有疫苗组合物，其中所述灭活菌苗以足以提供至少1×104TCID50/单位剂量的量存在。
18.一种用于在测试动物中诱导临床犬艾利希体病的方法，其包含向所述测试动物投予有效量的基本上由感染有强毒的犬艾利希体微生物的外周血单核细胞组成的激发储备液。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述储备溶液经皮下投予。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述强毒的微生物通过其在测试动物中之反复继代而产生。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述微生物为犬艾利希体Ebony。
22.一种包含感染有强毒的犬艾利希体微生物的外周血单核细胞的激发储备组合物。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述强毒的微生物为已在测试动物中反复继代的犬艾利希体Ebony。
全文摘要
本发明提供一种安全且有效的疫苗组合物，其包含一有效免疫量的灭活犬艾利希体(Ehrlichia canis)菌苗；一药理学上可接受的载剂；及一免疫原性刺激量的基本上由一抗体反应诱导剂及一细胞介导的免疫反应诱导剂组成的佐剂系统。本发明亦提供一种用于预防或缓解犬中的犬艾利希体病的方法。
文档编号A61K39/02GK1930185SQ200580007652
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月11日
发明者胡良标(乔治), 托马斯·杰伊·赫斯, 江玉维, 朱信觉(史蒂夫) 申请人:惠氏公司
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