新型tat复合物，及包含其的疫苗的制作方法
专利名称：新型tat复合物，及包含其的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含gp120 V3环的蛋白质物质在制备抗表达gp120的病毒的疫苗中的应用。
靶细胞的细胞膜对HIV的吸收发生在HIV gp120与细胞受体CD4相互作用时。这种相互作用诱导gp120中的构象变换，导致gp120 V3环的暴露。按照一种提议的模型，所述gp120 V3环又与作为HIV共同受体的其它细胞表面分子相互作用。最重要的HIV共同受体是趋化因子受体CCR5和CXCR4。现在普遍接受的是，嗜巨噬细胞(M-tropic)HIV分离物通过CCR5感染巨噬细胞，而嗜T细胞系(TCL-tropic)HIV毒株通过CXCR4感染TCL，以及双嗜性(dual-tropic)毒株通过任一共同受体感染。
所述gp120V3环与HIV共同受体的相互作用允许共同受体，CD4和gp120之间三元复合物的形成，又导致gp41中的构象变化。gp41与gp120一起形成病毒包膜糖蛋白复合物(Env)。据信，为了暴露在gp41的N端的融合序列，其与细胞表面相互作用并导致病毒包膜和细胞膜之间的融合，要求这些构象变化。在这种分步机制的过程中，由于gp120与CD4之间的相互作用，暴露出gp41和gp120上的隐蔽表位。否则，这些表位是隐藏的，并且，在gp120的情形下，是被针对抗gp120与共同受体相互作用的部分的抗体所识别的。
这些隐蔽表位已经成为对于接种和被动免疫目的的热点研究对象，并且有相当多的证据表明，gp120 V3环参与共同受体识别和应用。特别地，已经表明V3中的点突变或缺失可消除或置换共同受体的作用；已经证明V3肽与CXCR4相互作用；并且抗V3抗体削弱或阻滞gp120-CCR5结合。因此，这一模型被普遍接受，尽管各种观测已经导致认识到有另外的事件参与共同受体的应用，特别地在巨噬细胞中。
Tat是与1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)相关的在感染后很早产生的调节蛋白，并且其对于病毒基因的表达、复制和感染性是必需的(Arya 1985；Fisher 1986；Chang 1995)。在T细胞被HIV急性感染过程中，Tat还被释放到细胞外环境中，并被相邻的细胞吸收(Frankel 1988；Ensoli 1990；Ensoli1993；Chang 1997)，在其中，取决于浓度，构象状态，和细胞类型，其可以增加病毒感染性。具体地，Tat的吸收可以在感染的细胞中增加病毒基因的表达和复制(Frankel 1988；Ensoli 1993；Chang 1997)，然而，在未感染的细胞中，它增强共同受体CCR5和CXCR4两者的表达，这有助于嗜巨噬细胞和嗜T淋巴细胞的两种HIV-1毒株的传递(Huang 1998；Secchiero1999)。
与这些发现相一致，已经表明，对Tat的免疫应答在控制AIDS和AIDS相关疾病的进展中起关键作用，并且保护接种Tat的猴子免受SHIV感染(Cafaro et al.，Nat Med 1999)。然而，基于现有的研究，还没有认识到或假定在调控HIV吸收或膜融合的分子事件中Tat的特别作用。
WO 01/54719公开以功能性的、灭活的、突变的形式，作为抗原，或作为抗原肽，与野生型Env一同的Tat和/或Nef的用途，其基于这些抗原的结合在保护接种的猴子抵抗SHIV攻击方面是有效的观察结果。对所述抗原形式的抗原的衍生化作用使它们更安全和/或更稳定。没有迹象表明在Tat，或Nef，与Evn之间形成了复合物。
令人吃惊地，我们已经发现Tat可以与gp120 V3环相互作用，由此在分子的(结构的)和功能的水平上模拟所述CCR5共同受体，从而赋予嗜CCR5HIV毒株感染表达仅很少量CCR5的细胞靶点的能力，并且在固定的Tat不存在时，其不会受到输入的同种病毒的感染。
因此，在第一方面，提供一种用于在治疗中应用的复合物，其包含第一种和第二种肽，第一种肽包含gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，结合区衍生于Tat并且可被单克隆抗体所识别，所述单克隆抗体针对CCR5第二个细胞外环，如Lee，B.，等.，J.Biol.Chem.，1999，Vol.274，9617-9626中所述。所述鉴别的单克隆抗体可从Pharmingen获得，目录号是36460D。
在备选的方面，本发明提供一种包含第一种和第二种肽的复合物，第一种肽包含gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，结合区至少包含SEQ ID NO 1的残基21-40和46-60，或21-60，或其片段，突变体或变体，其能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。
优选地，结合区至少由SEQ ID NO 1的残基21-58组成。优选地，通过合适的接头结合SEQ ID NO 1的残基21-48和46-60，或46-58，并且将其适当排列，以便它们能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。备选地，一段包含SEQ ID NO 1的21-58的单个连续序列也是优选的，条件仍是保留结合SEQ ID NO.2的残基301-419的能力。
优选地，结合区至少包括SEQ ID NO 1的残基21-58。备选地，还优选结合区至少包括SEQ ID NO 1的残基21-40和46-58。
本发明还提供一种用于在治疗中使用的，特别地用作疫苗中的免疫原性成分的复合物，其包含第一种肽和第二种肽，所述第一种肽包含gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，结合区衍生于Tat并且可被抗-CCR5抗体所识别。
应该理解，本文使用术语“肽”来表示一种其中具有肽或拟肽结合的物质，并且其可能是包含其它类型的化合物，诸如糖残基，的更大的分子的一部分。通常优选肽包含大部分天然存在的氨基酸，并且特别优选地，天然存在的氨基酸形成超过90％的肽。在一个优选实施方案中，肽由天然存在的肽组成，任选地，其在任一端或两端和/或糖苷残基处用封闭基团取代。
特别令人惊讶地，Tat能够结合gp120的V3环，并且结合所述V3环的Tat的区域被抗-CCR5抗体识别。假定单克隆抗体的非常高的特异性，非常可能，Tat对gp120的V3环的作用与CCR5的作用类似，或相同。实际上，至少在涉及HIV感染性的范围内，我们已经确定细胞外Tat能够有效地为表达很少量这种共同受体的T细胞提供CCR5的功能性。
关于WO 01/54719，例如，尽管Tat和Env可以一同施用，但由于CD4尚未激活Env，并且由于为了避免只是在形成复合物之后的诸如复合交联的Tat V3环相互作用的干扰或添加佐剂而未采取特别的预防，Tat不能结合制剂中Env的V3环。在WO 01/54719情形下，直到Env被CD4激活时，其才不再接近Tat，以致从联合施用所获得唯一优势就是已知的Tat作为佐剂的优势。在本发明中，Tat不仅能够，尤其在其存在时，像这样作为佐剂，而且其与所述V3环的缔合产生新的抗原表位或有效用于防止HIV感染，或防止感染扩散的表位。
所以，M-tropic毒株起初只靶向巨噬细胞，但是，一旦释放出Tat，即使表达很少量CCR5的T细胞也可以被迅速感染，其可以导致建立持续感染所必需的病毒的大量集结。
通过认识到这一点，现在可能提供一种用于预防或治疗的至少Tat和Env相关部分的抗原复合物，从而在个体中刺激免疫原性应答。
这样的复合物也可以用来产生用于被动免疫的抗体，例如在怀疑个体可能已经暴露于HIV的情况下。这样的抗体可以在动物中产生以用于人类，并且还可以通过本领域公知的方法测序并人源化。
虽然复合物，和针对其的抗体，是专用于抗嗜CCR5病毒毒株，它们也可以用于抗嗜TCL毒株，以阻碍，或者甚至阻滞Tat-介导的从一个T细胞到另一个的病毒扩散。同样地，也可以靶向双嗜性毒株。
由于通过Tat的CCR5的分子拟态，复合物和抗这些复合物产生的抗体还将部分地模仿或针对抗CCR5中或CCR5/V3环复合物中存在的表位，其进一步对用于被动免疫的疫苗或抗体的功效作出贡献。
本发明的复合物一般可以适合提供为在适于注射的赋形剂中两种肽种类的组合。含有所述复合物的赋形剂可以这样储存，或者可以提供为在使用前组合的单个肽和/或赋形剂的分离制剂。
本发明的复合物典型地包含相互接触的两种肽种类。同时优选地，不是必需地，两个种类以化学计量的量存在，甚至任一种类的大部分是被复合的或结合于另一种类。所有必需的是，为了能够刺激与之相对的免疫应答，应该存在足量的两个种类的抗原性组合。
本发明的复合物可以仅依赖于Tat和gp120的V3环之间的天然的相互作用。还可以应用较弱的复合物，但是一般优选增强所述复合物。在这一方面，例如，可能应用能够与Tat蛋白的半胱氨酸-富集(reach)区发生缔合的二硫键，或使用本领域已知的其它蛋白交联技术，诸如，例如，BS3交联剂。
所述复合物可以只包含Tat和gp120的相关区域。在gp120的情形下，V3环区的全部或基本部分(substantial part)是足够的，尽管，如分子对接(docking)数据所指示的那样，也可以在体内包括接近V3环的残基。在Tat的情形下，尽管氨基酸1-61，和可能地，直到氨基酸70并超过70，参与同V3环的结合，但是应用残基21-58似乎特别有利。Tat序列的这一片段特别强地与单克隆抗CCR5抗体结合。
本发明中，一般看起来重要的那一部分Tat分子包括涉及到SEQ IDNO 1的残基1，2，4，16，19-22，25，26，29，34，35，45-47，51，55，57，59和61。然而，抗-CCR5很强地识别Tat(21-58)肽，并且，强度稍弱地识别Tat(46-60)肽，其包含Tat的碱性区域(basic region)。已知残基21-58的Tat片段包含2个重要的蛋白功能结构域半胱氨酸富集区(21-40)和碱性区域(46-58)。Tat(21-58)肽，而不是21-40，即半胱氨酸富集区，还是Tat-介导的HIV向性向低量CCR5表达TCLs扩增所需的最小的肽。这些数据强烈地预示所述Tat半胱氨酸富集区是用于CCR5模拟的Tat碱性区的最好的构象结构所需的。因此，在本发明应用短于全长的Tat的情形中，那时优选应用至少残基21-58或21-60，具有中等长度的剪截的肽，或者在单个的重组肽中至少残基21-40和46-58都存在，连接在一起或者通过接头区，并且还优选形成本发明的一部分。在应用上述序列的突变体或变体的情形，那时这可以通过删除、插入或倒置一个或多个残基而变化，条件是由此获得的肽能够如按照附属实施例中描述的测定法所确定的那样结合天然存在的gp120的V3环。优选保留的残基为，适当地1，2，4，16，19-22，25，26，29，34，35，45-47，51，55，57，59和61。
SEQ ID NO 1显示Tat的完整氨基酸序列。
应该理解所述载体肽或框架分子可以包括Tat的相关部分，但是这样可能产生其它表位，因而在多余表位的产生不被需要的情形中一般不优选。
包括V3环的肽可以包括或者由gp120组成，其任选地剪截和/或删除，或者可以包括更大或更小的分子。在一个优选实施方案中，包括V3环的肽可以包括一些或全部的Env。在这点上，认为处于其天然形式的Env是由病毒产生的未被加工的蛋白，其为gp120-gp41之间的融合蛋白，并且还已知为gp160。所述肽还可以包括Env的片段，并且应该理解，如此处所用，Env不仅仅是指Env及其片段，还指表达或能够表达V3环的任何肽。为了参考，本文提供完整的gp120序列，为SEQ ID NO 2。在本文中，应该理解所述肽可以只由V3环区域组成，并且还可以由任何中间体分子组成，诸如表达或暴露一个或多个V3环的载体分子，如本文在其它部分所讨论的那样。
所述Env分子或复合物可以是天然存在的那个分子，或者可以在其上进行任何删除或变化，条件是其仍保留V3环。优选删除突变体，诸如ΔV2Env突变体，其缺少V2环，但是其保留部分gp41。已发现这种突变体在与Tat组合时提供特别好的结果，产生高的抗-Env效价。
ΔV2Env与Tat形成复合物，并且增加抗Env的体液应答，而没有抑制抗Tat的体液应答。通过比较，野生型Env形成复合物，但是没有增加抗Env的体液应答，并且抑制抗Tat的体液应答，因而这证明ΔV2Env的应用比野生型Env刺激更多的B细胞全部组成部分。
因此，在优选实施方案中，本发明的复合物具有ΔV2Env作为其成分。
含有Env区域的V3环优选地包括至少SEQ ID NO.2的残基301-412，并且可以包括在这一序列上的任何变异或突变，诸如通过删除、插入或倒置一个或多个氨基酸，条件是由此获得的环能够结合如SEQ ID NO.1所示的Tat，正如通过附属实施例中的测定法所确定的那样。更加优选地，任何含有V3环的序列包括至少如在SEQ ID NO.2中所示的残基301，316，317，318，321，322，324，325，327，328，329，331，332，405，407，412，416-419。然而，包括SEQ ID NO.2.中的核苷酸299-333的V3环本身也是本发明的目标。
已知Tat可以用作为佐剂，增加细胞介导的抵抗抗原的免疫应答，并且将所述免疫应答向Th1表型极化(Fanales Belasio等.，J Immunol 2002；Ensoli B.，WO03/009867)。另外，Tat通过改变其经由蛋白酶体的加工而扩大抵抗抗原的Th1应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。这导致诱导抵抗通常为次优势的抗原性细胞毒性T细胞(CTL)表位的应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。
我们已经发现的是，这些性质不受影响，以致Tat与Env一起应用激发了更广泛的抵抗次优势表位，甚至Env，还有可以一起施用的其它抗原的应答。
更加优选的，例如，为了刺激抗体生产，能够与Env相互作用以暴露功能V3环的任何分子或物质可以有效用于本发明。在这种情形下，功能V3环能够结合如SEQ ID NO.1所示的Tat，正如通过附属实施例中的测定法所确定的那样。
一个适宜的实例是CD4或其片段，其能够在与Env相互作用时引起V3环的暴露。还包括病毒颗粒的包膜成分，以及其片段，所述病毒颗粒在Tat结合于病毒表面时，将通过诱导Env中存在的V3环的暴露而起作用。
已知V3环是对于Env与存在于胞外基质和细胞膜的硫酸乙酰肝素结合的主要决定簇。还已知Tat通过其碱性区域结合于硫酸乙酰肝素。因此，由于已经证明了Tat和Env形成复合物，本发明进一步延伸到还包括硫酸乙酰肝素，任选地以及其它已知结合硫酸乙酰肝素的分子的复合物，并且其与感染/炎症位点相关。例如，所述其它分子可以包括碱性成纤维细胞生长因子，并且所述复合物特别用作接种的免疫原。
由于本领域内已知Tat结合整联蛋白，其为细胞黏着受体，包括αvβ3、α5β1、αvβ3，并且其调控Tat进入细胞，所以本发明还延伸到本发明的复合物，其具有整联蛋白作为其它成分，特别用作接种的免疫原。例如，用于形成本发明中应用的复合物的其它分子包括结合Tat或Env或者两者的分子和物质，并且可以包括CD26、VEGF受体和趋化因子受体。
重要的是所述复合物应该足以刺激免疫应答，以便由此产生的抗体将在体内识别Tat/Env复合物。因此，尽管一般可能应用Tat序列的变体来结合gp120 V3环，但是可能的是，抗由此获得的复合物产生的抗体将不能在体内识别Tat或Tat21-58和Env的复合物，其中在体内，Tat肽和环的复合物的三级构型与在Tat或Tat21-58和Env之间形成的复合物的三级构型不同。
因此，一般优选地，对于产生抗体或作为疫苗制剂的免疫原而应用的复合物基本上包括免疫学的天然构象中的Tat的全部序列，或者优选地至少Tat21-58。在这一点上，可能实行某些氨基酸取代，而不影响Tat的免疫原性，尽管这样的取代可以影响由此获得的Tat在其它方面中的生物功效。例如，由于诸如确保Tat和V3环之间的更大的结合或者这样的取代可以通过优选的遗传工程方法获得的原因，进行这样的取代是可取的。
对于复合物形成，不那么重要的是，V3环是全部Env分子的部分，并且这种环可以由载体分子中适当的前后序列提供，条件是其可以以这样能够与Tat肽形成复合物的形式加以利用。特别地，应该理解这样的载体分子可以表达多于1个的V3环，以与不同的Tat蛋白形成多聚体复合物。
一般地，优选应用天然存在的Env、或者相似或相关蛋白，诸如其变体或工程突变体，条件是在构象上其暴露V3环。例如，这种暴露可以通过向其它两种肽种类的制剂中添加CD4、或CD4的gp120结合表位而获得，并且可以任选地包括硫酸乙酰肝素，例如，优选地以这样的方式-即成分可以连接成为融合蛋白，或者通过化学交联的方式，由此使得gp120能在这样的系统中暴露V3环。
在优选的方面，本发明提供如上文所述的复合物在制备用于治疗或预防病毒感染的药物中的应用，由此所述感染的病毒表达能够在其本身、CD4和CCR5之间形成三级复合物的分子。
用于复合物的肽可以通过任何常规方法衍生或取代，条件是它们仍然能够完成它们需要的用途，如上文所述。特别地，例如，尤其在所述肽是短的时，N-和/或C-端可以进行化学封闭，以抑制肽酶的作用。当所述肽是化学合成的或半合成的时，用更不易受攻击的部分取代易受影响的键也是可取的。在一些情形中，可以适当地用拟肽基团取代肽的大部分。
在本发明优选的复合物中，第二种肽包括HIV Tat半胱氨酸和碱性区，以及第一种肽包括HIV Env的V3环。第二种肽可以包括HIV Tat片段或其衍生物，以及第一种肽可以包括HIV Env片段或其衍生物。第二种肽可以包括HIV Tat肽或表位，以及第一种肽可以包括HIV Env肽或表位。
在优选的实施方案中，本发明的复合物包括至少1个肽间共价键。例如，所述复合物可以是HIV1 Tat、其片段或衍生物，和HIV Env、其片段或衍生物之间的共价连接的嵌合体。
在一个优选的复合物中，在第二种肽的结合区包括Tat的氨基酸残基1-61，或者其免疫原性等价物。所述Tat成分可以是反式激活突变体。
应该理解优选的复合物基本上没有细胞和细胞碎片。
本发明还提供用于预防或抑制母婴或在暴露于HIV的个体之间的HIV传播的方法，其包括给母亲或个体施用本文所定义的被动疫苗。
例如，一般地，用于这种治疗或预防的靶病毒是HIV或HTLV的毒株，而且可以是动物毒株，诸如SHIV。
抗本发明的复合物的抗体可以通过标准方法产生，并且产生适宜的单克隆或多克隆抗体，优选单克隆抗体。优选地，这样的抗体不能单独地结合CCR5、Tat、Env或gp120的V3环区的任何一个，但是能够结合Tat和Env或共同受体和Env的复合物。因此，由此获得的抗体可以在体内结合并且封闭Tat或共同受体和Env的复合物，因此预防或抑制感染。应该理解所述抗体不必需通过与在复合物形成时产生的新表位相互作用而结合所述复合物的两个或全部成分，并且可以只结合在Tat与Env结合时暴露的隐蔽表位。这样的表位可以发生在Tat、Env或者甚至CCR5上，并且这代表了本发明的优点。
在抗本发明的复合物的适宜的抗体制剂中，可以通过个别地消除抗体或结合Tat、Env或gp120的V3环的品系的简单方法将结合通常在Tat或Env上存在的表位的抗体从所选择的多克隆制剂或那些单克隆品系上移除，由此只留下多克隆制剂，或者表达结合只在复合物中存在的表位的抗体的品系。
应该理解通过这种方法产生的单克隆抗体，如果在动物中产生，可以通过本领域公知的方法适当地人源化。本发明延伸到对本文所描述的复合物特异的多克隆、单克隆以及人源化抗体。
提供了包括本发明的复合物的活性疫苗，对于包括本发明的抗体的用于被动免疫的抗体制剂也一样，适合这样的疫苗的赋形剂在本领域内是公知的，并且可以包括适宜的物质，诸如稳定剂、等渗剂和抗菌剂。
携带所述复合物或抗体的赋形剂可以以浓缩的或无活性形式贮存，需要时用于稀释和/或活化。适宜的赋形剂可以是含盐的或含盐的衍生物，或者对于本领域的技术人员显而易见的其它物质，并且优选地以可注射的形式，或者可以制成可注射的形式。
复合物或抗体的量应该足以作为免疫原或刺激物，或者适当地具有或强化生物效应。
本发明还延伸到复合物本身。这样的复合物的一种应用是在层析技术中确定来自患者的样品是否含有抗所述复合物的抗体。例如，可以以任何方式将所述复合物用在这样的技术中，诸如固定在载体上用于柱子中，适宜的检测试剂是标记的抗-抗体。
例如，本发明的复合物还可以用于靶细胞，并且用于鉴别妨碍HIV细胞进入的药物。例如，可以评估包括所述细胞和复合物并且经受感染剂量的病毒的培养物，以确定感染是否发生或者发生了多少。
因此，Tat-V3环复合物提供一种新型抗原，其可以用于预防性或治疗性接种，其通过诱导能够阻滞或结合体内Tat-V3环相互作用的保护抗体而实现，由此中断后续感染。抗体还可以阻滞CCR5-V3环相互作用，并且所述复合物可以用来产生用于阻滞母婴传播或在暴露的个体之间的水平HIV传播的被动免疫的保护抗体。
在优选的实施方案中，本发明提供在HIV Tat蛋白和HIV包膜蛋白Env之间形成的分子复合物，其在Tat的半胱氨酸富集区和碱性区与gp120V3环相互作用时产生。优选使用完整Tat蛋白、其突变体、片段或衍生物，以及HIV包膜蛋白gp120、其片段或衍生物而获得的分子复合物，对于它们作为用于抗HIV/AIDS预防性或治疗性接种的抗原的应用也一样。
优选的复合物包括HIV Tat半胱氨酸和碱性区以及HIV Env的V3环。由于暴露于Tat的细胞的蛋白酶体对蛋白进行不同处理(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)，另一种优选的复合物包括由暴露于Tat的细胞的蛋白酶体产生的Tat片段，其包括含有Tat的半胱氨酸区、碱性区和RGD区，Tat的半胱氨酸区和碱性区，Tat的碱性区和RGD区，或者只有碱性区的片段。另一种包括HIV Tat片段或其衍生物以及HIV Env片段或其衍生物，而另一种包括HIV Tat肽或表位以及HIV Env肽或表位。
在HIV 1Tat、其片段或衍生物，和HIV Env、其片段或衍生物之间共价连接的嵌合体也是优选的。
在一个实施方案中，Tat成分可以是反式激活的沉默突变体，例如Tat-cys22突变体。
这些实施方案的HIV优选地为HIV-1。优选的分化体是HIV-1分化体A，B，C，D，E，F，G和O。应该理解本发明延伸到嗜CCR5、嗜CXCR4和双嗜性毒株，并且涉及的任何具体病毒、或者其类型或种类同样适用于本发明的所有病毒主体。
本发明的疫苗特别用于预防或抑制母婴或在暴露于HIV个体之间的HIV传播。
通过下述非限制性的实施例进一步举例说明本发明。
实施例1HIV-1 Tat与gp120 V3环的分子相互作用应用分子对接模型(molecular docking model)研究HIV-1 Tat与HIV-1gp120 V3环的结合，其中允许Tat(BH10 HIV毒株)与Env蛋白的V3环(Ba-L HIV毒株)相互作用。使用到2003年7月为止保存在Protein DataBank中所有可利用的Tat蛋白和Env蛋白的结构作为模板，计算所有结构模型(Berman，H.M等.，Nucl.Acids Res.28，235-242，2000)。应用ClustalW比对各种蛋白的序列(Thompson，J.D等.，Nucl.Acids Res.22，4673-4680，1994)，并且使用Modeller6v2产生结构模型(Sali，A.和Blundell，T.L.J.Mol.Biol.234，779-815，1993)。使用AMBER-5通过能量最小化对所有计算的结构模型进行最优化(Pearlman，D.A.等.，in AMBER 5.0，University of California，San Francisco，1997)。然后，应用这些结构模型通过BIGGER程序来计算蛋白-蛋白加合物(Palma，P.N.等.，Proteins Struct.Funct.Genet.39，372-384，2000)。后一程序基于形状互补性和非键合(静电的和Van der Waals)相互作用产生蛋白-蛋白复合物并将其排列。
使用分离的V3环(a.a.297-336)进行初始分子对接(docking)计算，并且产生3种类型的低能加合物，其特征在于3种独特的相互作用区域。这些加合物特征在于与V3环相互作用的不同的Tat残基，尽管，通过比较，所述V3环只表现出单一的相互作用区，其包含残基Thr300，Arg301，Ala331，His332，Asn334以及V3环306-328片段的一些氨基酸。
接着计算Tat和暴露V3环的HIV-1Bal gp120的相对大的结构域(291a.a)的相互作用。由于没有关于V3环的构象以及其关于剩余的gp120结构域的相对定向的结构信息，将对于V3环可及的构象和柔性的范围定为样本。事实上，所述环构象的可变性可以对复合物几何学具有相当大的作用。通过在明确(explicit)溶剂中的长期分子动力学模拟进行构象取样。进行了对接计算，其允许Tat与Env蛋白的gp120的5个不同构象相互作用，所述构象包括2个最不相同的V3环构象加上3个中间体构象。
这些计算鉴定一种与Tat在包括V3环的区域相互作用的加合物，其与只用V3环进行计算发现的一种加合物中发现的基本相同。因此，预计这种加合物是最稳定的，并且当完整力场(由2个分子的原子产生)生效时，进行分子动力学(MD)计算，以最优化其构象并估计其稳定性。进行关于Env蛋白的氧化(即，在V3环上带有二硫键)和还原两种状态的计算，并且表明所述加合物在2种氧化状态下同样稳定。为了验证用所述方法发现的相互作用模型，并且为了分析蛋白-蛋白界面，还进行了使用Haddock程序的对接计算。发现5种最低能态的加合物具有与使用BIGGER计算发现的模型相同的几何学。
因此，所有这些计算都指向一种独特的相互作用模式。发现所述加合物的最终结构模型非常稳定，其具有2260±1122的平均相互作用表面，和-412±14kcal mol-1的平均蛋白-蛋白分子间能量。对相互作用能的最大贡献归因于具有-325±14kcal mol-1的平均能量的静电贡献所述相互作用表面包括Tat上的残基1，2，4，16，19-22，25，26，29，34，35，45-47，51，55，57，59，61和Env上的残基301，316，317，318，321，322，324，325，327，328，329，331，332，405，407，412，416-419。
Tat和gp120残基之间的3个分子间盐桥键(Asp5-Arg316，Lys50-Glu407和Lysl9-Asp327)分别发现在所有的各种模型以及在分子动力学模拟过程中是完全保守的。发现所述加合物通过额外的分子间氢键而更加稳定，在模拟过程中，所述氢键的数目在6-11之间变化，但是总是包括共同相互作用区的至少1个残基。还确定对所述加合物的稳定性的相当大的贡献是由30-40个疏水相互作用引起。这些相互作用中的20-30个由属于V3环的残基贡献，而大约其中的20个由属于Tat的20-59片段的残基引起。
实施例2在ELISA检测中Tat结合gp120 V3环。
进行酶联免疫吸附测定(ELISA)检测来确定Tat实际上是否在体外结合gp120 V3环。为了这一目的，将ELISA培养板用包含完整V3环的肽包被，接着使用载体牛血清白蛋白(BSA)广泛封闭，多重洗涤步骤，和与生物活性Tat蛋白或者，作为对照，其缓冲液(PBS-BSA 0.1％)一起额外温育(Cafaro等.，Nat Med 1999；Fanales-Belasio等.，Immunology 2001)。单克隆抗-V3和多克隆抗-Tat抗体用作检测结合的蛋白的初级抗体。
当未包被的(即BSA-封闭的)孔与抗-Tat或抗-V3抗体一起用于ELISA检测时，检测到微弱的背景信号，其范围为约0.1-0.4OD。结果显示在下文的表1中。然而，当用V3肽包被的孔与Tat一起温育时，信号增加到约1光学密度(OD)。相反，只与缓冲液一起温育的孔产生与背景水平(未包被的孔)相当的信号。正如期望的那样，V3包被的孔与抗-V3抗体一起产生高的ELISA信号。这些实验表明生物活性的Tat在体外结合于gp120V3环，这确定了使用分子对接计算获得的数据。通过用Tat包被孔以及将包被的孔与增加量的V3环肽一起温育，获得了相似的结果，如期望的那样，其表明V3环肽与固定的Tat的剂量-依赖型结合(表1bis)。
表1bis将孔用Tat(100ng)包被并用牛血清白蛋白(BSA)(100μg)封闭V3环肽量(ng)0 50 100 200 500抗V3抗体 0,119OD 0,181OD 0,285OD 0,435OD 0,787OD抗TAT抗体1,438OD 1,545OD 1,51OD 1,515OD 1,567OD
将孔用BSA(BSA)(100μg)包被抗V3抗体0,103OD 0,124OD 0,148OD 0,142OD 0,179OD实施例3Tat由针对CCR5 HIV共同受体的抗体所识别由于gp120V3环似乎是HIV毒株的共同受体选择和应用的主要决定簇，进行实验来确定Tat结合V3肽的能力是否归因于共同受体分子的Tat的拟态。为了这一目的，在ELISA检测中使用针对主要HIV-1共同受体(CCR5和CXCR4)的单克隆抗体(Pharmingen)，来确定它们是否能识别Tat，或者由具体的Tat序列和/或结构与功能结构域组成的Tat肽。已知这些单克隆抗体识别在HIV-1共同受体上存在的构象表位(Lee B等.，J Biol.Chem.，1999；Baribaud F等.，J Virol.2001)。因此，通过这些抗体的任何Tat识别将表明Tat与相关的共同受体共享结构相似性。
将ELISA培养板用天然Tat或下述Tat肽的一种(这些肽本质上对应的一个或多个区域在圆括号中给出)包被Tat(1-20)(N-端结构域)；Tat(21-40)(半胱氨酸-富集区-反式激活结构域)；Tat(36-50)(核心区)；Tat(46-60)(碱性区-核定位信号)；Tat(56-70)(谷氨酰胺-富集区)；Tat(65-80)(RGD序列)；Tat(73-86)(RGD序列)；Tat(83-102)(C-端结构域)；以及Tat(21-58)(半胱氨酸，核心，和碱性区)。
将单克隆抗-CCR5或抗CXCR4抗体用于检测步骤。抗-CCR5特异地识别重组天然Tat蛋白、Tat(21-58)肽以及，尽管具有更低的功效，Tat(46-60)肽。结果显示在下述表2中。相反，使用针对CXCR4的抗体没有观察到识别。
已知在这些实验中所用的抗-CCR5抗体识别在CCR5第二个细胞外环(ECL2)中存在的构象表位，并且中和HIV(Lee B等.，J Biol.Chem.，1999)。另外，已知RCL2参与导致膜融合的Env构象变化(Lee B等.，J Biol.Chem.，1999)。因此，这些数据表明包含Tat反式激活结构域和碱性富集区的Tat序列在结构水平上模拟CCR5的一个区域，其在gp120识别CCR5时参与细胞融合。
实施例4天然的、生物活性的Tat是抗-CCR5抗体识别CCR5所必需的在上述实施例3中描述的数据表明在肽21-58中存在的Tat序列能够折叠，以模拟CCR5共同受体的构象表位。为了确定Tat的具体构象是否是抗-CCR5抗体识别所必需的，将被抗-CCR5抗体识别的天然的、生物活性的Tat的能力与氧化的Tat制剂比较，所述氧化的Tat制剂通过将蛋白暴露于空气和直射光，按照已知的消除其大部分生物活性的方法获得(Fanales-Belasio，Immunology，2001)。这种方法导致-SH基团的氧化以及分子内和分子间二硫键的形成，其由在Tat反式激活结构域存在的半胱氨酸残基介导。已知Tat的反式激活特性又激活包括HIV共同受体的宿主基因的表达(Huang 1998；Secchiero 1999)。然而，Tat反式激活特性在反式激活突变体中被消除，在该突变体中半胱氨酸22被甘氨酸取代(Tat-cys22)(Caputo A等.，Gene Ther.1996)。然而，这种Tat突变体保持其免疫原特性、完整性(Caselli E等.，J Immunol.1999)。因此，Tat-cys22也包含在这一系列的实验中。
将ELISA孔用天然Tat、氧化的Tat(Tat OX)或Tat-cys22包被，并且在检测步骤中应用抗-CCR5、抗-CXCR4抗体。这些实验表明所述抗体特异性识别重组的天然Tat蛋白和Tat-cys22突变体，但是不识别氧化的Tat蛋白。结果显示在下述表3中。相反，并且作为对照，多克隆(兔)抗-Tat抗体识别，如预期的，具有相似功效的蛋白，这证明所有的孔都是均一地包被的。
因此，这些实验表明，包含Tat反式激活结构域、核心区和碱性区的Tat序列折叠，以模拟CCR5上存在的主要表位，并且消除Tat的反式激活特性的点突变不妨碍表位形成。
实施例5细胞外Tat增加CD4+易感细胞的HIV感染性并且在CCR5低表达细胞系中扩展HIV-1向性。
为了确定Tat是否可以通过模拟CCR5调节HIV-1进入，有必要确定在CCR5-依赖型系统中Tat对HIV进入的作用。为了这一目的，以单循环测定进行感染实验，所述单循环测定其使用编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的复制-缺陷重组HIV-1，所述感染实验将嗜CXCR4HXBc2HIV分离物、或者嗜CCR5ADA或YU2HIV分离物的包膜糖蛋白假定为假模标本。这些复制-缺失病毒(此处称为嗜R4HXBc2/HIV-CAT或嗜R5ADA/或YU2/HIV-CAT病毒)通过CD4/CXCR4或CD4/CCR5进入易感细胞，将它们的cDNA′s整合到细胞基因组中，并且表达报告基因CAT，但是它们不能产生后代(即，它们不能通过后续循环的病毒生产支持进一步的细胞感染(Helseth E.J Virol 1990))。因此，HIV-CAT病毒产生单轮的靶细胞感染循环，CAT乙酰化水平的定量允许定量评估HIV感染的功效。
基于上述在实施例1-4中获得的数据，进行实验来确定是否由于Tat对CCR5共同受体的分子模拟，Tat能够帮助HIV感染，扩展HIV向性，并且使得TCLs易受嗜R5(即，嗜-单核/巨噬细胞)HIV毒株的感染。为了这一目的，将CEMss和Jurkat细胞，2种表达CD4和CXCR4的TCLs，但是其缺乏蛋白水平上通过标准流式细胞术或蛋白质印迹可检测的量的CCR5表达的细胞，或者CD4-293细胞系接种在Tat-包被的孔中，所述孔先前与HIV-CAT病毒温育，所述HIV-CAT病毒用嗜X4HXBc2毒株、或者嗜CCR5ADA或YU2毒株的包膜假定为假模标本。如预计的，CEMss和Jurkat细胞系被HXBc2/HIV-CAT有效地感染，而由于缺乏初级HIV-1受体，使用CD4-293细胞系没有检测到感染。并且引人注目地，ADA或YU2假型的HIV-CAT还高效率地感染了CEMss和Jurkat细胞，尽管上述细胞已知抗嗜R5HIV-1毒株的感染。因此，这些数据确定了出乎意料的预测固定的Tat能够通过特别CCR5细胞外结构结构域的分子模拟，增加HIV-1细胞向性，即，使得嗜CCR5毒株能够感染TCLs，所述TCLs表达少量的CCR5以至于在不存在Tat时不会被连续地感染。
进一步的实验表明Tat21-58，而不是Tat21-40，足以帮助嗜R5 ADA Cat病毒感染CEMss细胞，这表明调节与gp120V3环的结合的Tat区域与HIV扩展向性必需的区域相同。
实施例6抗-CCR5抗体，而不是抗-CXCR4抗体，阻滞低CCR5表达细胞系的Tat-辅助的感染为了进一步证明固定的Tat通过模拟CCR5扩展嗜R5HIV-1毒株的细胞向性，进行实验来确定能够阻滞CCR5的活性分子是否还能够阻滞CCR5-细胞的Tat辅助的感染。为了这一目的，在定向抗CCR5、CXCR4或CCR3的抗体存在下，将CD4+/CCR5-(CCR5RT-PCR+)CEMss细胞接种到Tat-包被的孔中，所述孔先前与含有嗜R5ADA/HIV-CAT单轮感染重组病毒的细胞上清液一起温育。Tat辅助的感染几乎完全被抗-CCR5抗体消除了，而使用抗-CXCR4或CCR3抗体作为对照比较没有观察到感染性的减少。由于CEMss细胞在蛋白水平上为CCR5-，这些数据表明所述抗体的阻滞能力归因于其识别模拟CCR5构象表位的Tat结构基序的能力，如在实施例3和4中详述的那样。并且，这些数据确定了Tat对CCR5的分子模拟是在CCR5-的细胞中嗜CCR5HIV-1毒株进入所必需的。
实施例7Tat和Env之间的复合物是新型免疫原。
为了确定Tat/Env复合物是否代表新型免疫原，即，隐蔽表位被暴露出来，将小鼠用下述物质的混合物免疫已知暴露V3环的Tat和Env蛋白；Tat和V3环肽；或者使用单一抗原，作为对照。这些实验的基本原理是基于这样的预测由于在复合物形成时，产生新的表位，暴露隐蔽表位，和/或隐藏了先前存在的表位，与单一抗原的情况相比较，2个组合抗原的B细胞表位决定簇所有组成部分将不同。因此，预计一些复合物放大和/或增加抗Tat和/或Env的体液应答的强度，并且其它复合物缩小/减少至少部分体液应答的强度，其取决于所述复合物的性质以及产生的B细胞表位的暴露或隐藏。
选择了3个Env分子野生型单体gp120(野生型Env)，与在病毒包膜中存在的三聚体形式相比，由于更好的V3环暴露，已表明其产生更强的抗V3环抗体应答(Fouts TR等.，J Virol 1997；Earl PL等.，J Virol 1994)；Env分子的三聚体gp140形式，其保留部分gp41并且缺少V2环(ΔV2Env)，并且已知暴露V3环(Srivastava IK等.，J.Virol.2003，Vol7711244-11259)；以及，对应V3环的环状肽。为了通过选择的Env分子确定V3环的暴露，对于抗多克隆抗V3环血清的反应性，将单体野生型Env和三聚体ΔV2Env用ELISA检测，显示阳性结果。
在第一次2-arm实验中，在第0、14和28天，将小鼠用Tat、野生型Env、ΔV2Env、或Tat和野生型Env的组合、或Tat和ΔV2Env的组合(在作为佐剂的明矾的存在下)免疫。通过ELISA对在第38天获得的小鼠血清检测体液应答(IgG效价)。与只用ΔV2Env免疫的小鼠相比，在用组合的Tat和ΔV2Env接种的小鼠中，抗Env IgG效价强烈的提高了。相反，在用组合的野生型Env和Tat或只用野生型Env免疫的小鼠中，它们是相当的。另外，当与野生型Env组合时，抗Tat的抗体效价减少了，但是当与ΔV2Env组合时，没有减少。
这些数据确定Tat与野生型Env或ΔV2Env的组合导致形成新的分子种类(复合物)，其特征在于新的B细胞表位决定簇所有组成成分。另外，它们表明，当保护相反地在接种时被野生型Env抑制的高抗Tat抗体效价的激发时，Tat/ΔV2Env复合物具有极大地增加抗Env体液应答的能力。由于单体野生型Env通过HIV和感染的细胞大量流出(shed)，这与天然感染中的抗Tat抗体的低频度相一致(Buttò等.，J Infect Dis，2002；Rezza等.，J Infect Dis，in press)。
还将小鼠用Tat、V3环肽、或Tat和V3环肽在明矾中的组合物免疫。注意单独的V3环肽是非免疫原性的，其不激发或激发临界的抗体效价，而Tat和V3环肽的组合物非常高地增加抗V3环肽的抗体效价，其对于抗Tat的抗体效价没有作用。
因此，这些数据证明Tat/Env或Tat/V3环复合物是新型的免疫原，其能够激发更高和更新的免疫应答。特别地，Tat复合物与ΔV2Env或V3环肽一起诱导更好的抗HIV Env的体液应答，并且，与对应的单一抗原或Tat和野生型Env之间的复合物激发的那些相比，证明这些是不同的。
实施例8Tat和Env的复合改变Env上存在的个别表位的抗体识别为了确定Tat/Env复合物是否诱导针对Env表位的体液应答，其中所述Env表位与用只Env分子免疫时识别的那些表位不同，将来自在实施例7中描述的第一次免疫方案的相同小鼠血清用来分析对于具体的线性Env B细胞表位的反应性。为了这一目的，将跨越野生型Env或ΔV2Env(SHIV-1SF162.P3)的15-mer肽混合在一起，以形成由3个邻近的15-mers(即，覆盖了Env或ΔV2Env的45个氨基酸)以及3个15-mers组成的肽库，所述3个15-mer的每一个重叠2个邻近肽间的连接处。
用与Tat组合的野生型Env或ΔV2Env免疫的小鼠的血清识别在残基77-132之间(即，跨越HIV-1V1环的前14个氨基酸)存在的线性表位。相反，这些表位不被用作单一抗原的Env或ΔV2Env免疫的小鼠的血清识别。与ΔV2Env中的V2环缺失一致，只有野生型Env激发针对V2环的抗体，并且反应性在与Tat组合时极大地增加了。通过比较，只用野生型Env免疫激发抗跨越HIV SF162Env中残基28-83区域的强烈的反应性，其在用Tat共同免疫时完全失去。因此，这些数据表明，Tat和Env或DV2Env之间的相互作用暴露/隐藏线性Env/ΔV2Env表位，其与复合物形成一致。
显著地，用与ΔV2Env组合的Tat，而不是只用ΔV2Env免疫的小鼠的血清，表现出抗跨越gp41的N和C螺旋的区域的强烈的反应性，这表明gp41的构象修饰，其已知在依次Env与CD4结合时及V3环与CCR5或其它共同受体结合时发生，并且其已知是必需的，而且领先于病毒包膜与细胞膜的融合。因此，这些数据一致于Tat和V3环的结合以及结合于Env的CCR5的模拟，其是病毒进入必需的。最重要地，这些数据表明Tat和ΔV2Env之间的复合物可以诱导抗HIV gp41的抗体，因此能够中和病毒感染性。
这些线性gp41表位不被只用ΔV2Env免疫的小鼠的血清识别，这表明Tat和ΔV2Env之间的复合物是一种新的免疫原。
表位识别中的相似变化可能用于构象表位。
实施例9在用Tat/ΔV2Env或V3环肽复合物免疫时抗-Env抗体效价的增加是由于形成存在于所述复合物中的新的/更强的B细胞表位，并不是由于抗Env的Th2应答的增加。
本领域公知2型T辅助细胞(Th2)应答，诸如由T细胞生成白介素4(IL-4)，对于产生抗抗原的体液应答是关键的。因此，除了复合物上新表位的产生之外，通过增加的和/或放大的抗Env的Th2应答，可以解释至少部分的用组合ΔV2Env或V3环肽的Tat免疫所激发的抗Env抗体效价的增加。因此，我们研究用Tat/ΔV2Env复合物免疫对于Th2应答的作用。
为了这一目的，对于抗Env的抗原特异性细胞应答，通过IL-4ELISPOT测定法评估用Tat和ΔV2Env组合物、或只用ΔV2Env免疫的小鼠(参见实施例7的流程)。这一测定法测量IL-4的产生，并且在本领域用来评估抗抗原或T细胞-表位肽的Th2应答。应用含有跨越整个ΔV2Env分子的Env 15-mer(由11个氨基酸重叠)的肽库的基质，评估抗-Env细胞应答。这些实验表明，与只用ΔV2Env相比，用组合Tat的ΔV2Env免疫没有增加或放大抗Env的Th2应答，但是激发了针对相同的Env表位的Th2应答。因此，这些数据表明，用组合了ΔV2Env或V3环肽的Tat免疫时，抗Env的抗体效价的增加是由于在复合物形成时新的/更强的B细胞表位的产生/暴露。
实施例10在用2种抗原共同免疫的小鼠中，Tat放大对Env的细胞应答。
已知Tat可以作为佐剂，增加细胞介导的抵抗抗原的免疫应答，并且将所述免疫应答向Th1表型极化(Fanales Belasio等.，J Immunol 2002；Ensoli B.，WO03/009867)。另外，Tat通过改变其经由蛋白酶体的加工而放大抵抗抗原的Th1应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。这导致诱导抵抗通常为次优势的抗原性细胞毒性T细胞(CTL)表位的应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。
为了研究用在复合物中组合的Tat和Env免疫对于Th1应答以及通过Tat的极化的作用，使用含有Env 15-mers(由11个氨基酸重叠)的肽库的基质，分析由脾细胞产生的γIFN(典型的Th1细胞因子)，所述脾细胞来自用Tat和ΔV2Env的组合物或者只用ΔV2Env免疫的小鼠(参见实施例7的方案)。与只用ΔV2Env免疫的小鼠相比，在用Tat+ΔV2Env免疫的小鼠中，抗-Env g-ELISPOTS显示出抗更多数目的肽库和表位的Env特异性T细胞应答(未显示)。这些数据表明，在免疫的小鼠中，与ΔV2Env组合的Tat保持放大抗Env的Th1应答的能力，如对于组合了野生型Env的Tat已经显示的那样(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。因此，Env复合物可以用作免疫原来诱导有效的/中和体液应答，以及同时放大抗Env的CTL应答。
序列表<110>国家高等卫生院<120>新型Tat复合物，及包含其的疫苗<130>WPP89320<150>UK 0405480.5<151>2004-03-11<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>102<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>1Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Thr Asp Pro Val His Gln100<210>2<211>853<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<220>
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权利要求
1.一种包括第一种和第二种肽的复合物，所述第一种肽包括gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，所述结合区包含至少SEQ ID NO 1的残基21-40和46-60，或其片段，突变体或变体，所述片段，变体或突变体能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。
2.一种包括第一种肽和第二种肽的复合物，所述第一种肽包括gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，所述结合区包含至少SEQ ID NO 1的残基21-40和46-60。
3.一种包括第一肽和第二种肽的复合物，所述第一种肽包括gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，所述结合区衍生于Tat并且可被单克隆抗体所识别，所述单克隆抗体针对Lee，B.，等.，J.Biol.Chem.，1999，Vol.274，9617-9626中所述的CCR5第二个细胞外环。
4.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述Tat结合区包括至少SEQID NO 1的残基21-60，或其片段，突变体或变体，所述片段，变体或突变体能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。
5.按照前述权利要求任一项的复合物，其用生物活性的Tat制备。
6.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽除了V3环之外还包括一些或全部的Env。
7.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽包括SEQID NO 2的完整序列，或者其片段，变体或突变体，所述片段，变体或突变体能够结合由SEQ ID NO 1的残基21-60组成的肽。
8.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽基本上由gp120的V3环区组成。
9.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽包括至少SEQ ID NO.2的残基301-419，或者其片段，变体或突变体，所述片段，变体或突变体能够结合由SEQ ID NO 1的残基21-60组成的肽。
10.按照前述权利要求任一项的复合物，其具有全部或部分的gp160作为其组分，所述gp160包括至少gp120的V3环，并且缺少至少gp120的V2环的大部分。
11.按照前述权利要求任一项的复合物，其具有ΔV2Env作为其组分。
12.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽包括至少如SEQ ID NO.2中所示的残基301-419。
13.按照前述权利要求任一项的复合物，其还包括能够与Env相互作用以暴露功能性V3环的分子或物质。
14.按照权利要求13的复合物，其中所述分子或物质是CD4或者其片段，突变体或变体。
15.按照前述权利要求任一项的复合物，其还包括硫酸乙酰肝素，任选地其还包括至少1种能够结合所述硫酸乙酰肝素的其它分子。
16.按照前述权利要求任一项的复合物，其还包括选自整联蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、CD26、VEGF受体和趋化因子受体的物质。
17.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述Tat结合区包含在暴露于Tat时可由人细胞的蛋白酶体产生的Tat片段内。
18.按照权利要求17的复合物，其中所述Tat片段选自含有Tat的半胱氨酸区、碱性区和RGD区的片段；含有Tat的半胱氨酸区和碱性区的片段；含有Tat的碱性区和RGD区的片段；以及，只含有Tat的碱性区的片段。
19.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述肽是交联的。
20.按照前述权利要求任一项的复合物的应用，其用来产生针对其的抗体。
21.按照权利要求20的应用，其用在获得单克隆细胞系的方法中。
22.按照权利要求21或22的应用，其中所述抗体这样选择，即当存在于来自所述组的任何其它物质的分离物中时，其不识别由下列物质组成的组的任何一个天然Tat、gp160、CD4或gp120、CCR5以及gp120的V3环区，但是其能够结合按照权利要求1-19任一项的复合物。
23.一种抗体，其按照权利要求20-22任一项获得。
24.权利要求23的抗体，其被人源化，以防止或减少当注射到人体时的不利免疫应答。
25.权利要求23或24的抗体的应用，其用于抗病毒感染的预防性或治疗性的被动免疫，其中所述病毒表达Tat。
26.按照权利要求25的应用，其中所述病毒是HIV。
27.权利要求25或26的应用，其中所述受体是预期者或养育的母亲。
28.按照权利要求1-19任一项的复合物的应用，其用作接种的免疫原。
29.按照权利要求28的应用，其中所述病毒是HIV。
30.按照权利要求1-19任一项的复合物，其作为在适于注射的赋形剂中的肽组合物提供。
31.一种试剂盒，其包括至少2种按照权利要求1-19任一项的复合物组分的分离的制剂。
32.按照权利要求1-19任一项的复合物在治疗中的应用。
33.按照权利要求1-19任一项的复合物的应用，其用于制备治疗或预防病毒感染的药物中，其中所述感染的病毒表达一种分子，所述分子能够在所述分子、CD4和CCR5之间形成三元复合物。
34.按照权利要求1-19任一项的复合物的应用，其用来确定来自患者的样品是否含有抗所述复合物的抗体。
全文摘要
包括HIV Tat和gp120的V3环的复合物提供新型表位，并且是免疫原性的，用来预防或抑制HIV感染。
文档编号A61K39/42GK1930184SQ200580007704
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者B·恩索利 申请人:国家高等卫生院
技术领域：
本发明涉及包含gp120 V3环的蛋白质物质在制备抗表达gp120的病毒的疫苗中的应用。
靶细胞的细胞膜对HIV的吸收发生在HIV gp120与细胞受体CD4相互作用时。这种相互作用诱导gp120中的构象变换，导致gp120 V3环的暴露。按照一种提议的模型，所述gp120 V3环又与作为HIV共同受体的其它细胞表面分子相互作用。最重要的HIV共同受体是趋化因子受体CCR5和CXCR4。现在普遍接受的是，嗜巨噬细胞(M-tropic)HIV分离物通过CCR5感染巨噬细胞，而嗜T细胞系(TCL-tropic)HIV毒株通过CXCR4感染TCL，以及双嗜性(dual-tropic)毒株通过任一共同受体感染。
所述gp120V3环与HIV共同受体的相互作用允许共同受体，CD4和gp120之间三元复合物的形成，又导致gp41中的构象变化。gp41与gp120一起形成病毒包膜糖蛋白复合物(Env)。据信，为了暴露在gp41的N端的融合序列，其与细胞表面相互作用并导致病毒包膜和细胞膜之间的融合，要求这些构象变化。在这种分步机制的过程中，由于gp120与CD4之间的相互作用，暴露出gp41和gp120上的隐蔽表位。否则，这些表位是隐藏的，并且，在gp120的情形下，是被针对抗gp120与共同受体相互作用的部分的抗体所识别的。
这些隐蔽表位已经成为对于接种和被动免疫目的的热点研究对象，并且有相当多的证据表明，gp120 V3环参与共同受体识别和应用。特别地，已经表明V3中的点突变或缺失可消除或置换共同受体的作用；已经证明V3肽与CXCR4相互作用；并且抗V3抗体削弱或阻滞gp120-CCR5结合。因此，这一模型被普遍接受，尽管各种观测已经导致认识到有另外的事件参与共同受体的应用，特别地在巨噬细胞中。
Tat是与1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)相关的在感染后很早产生的调节蛋白，并且其对于病毒基因的表达、复制和感染性是必需的(Arya 1985；Fisher 1986；Chang 1995)。在T细胞被HIV急性感染过程中，Tat还被释放到细胞外环境中，并被相邻的细胞吸收(Frankel 1988；Ensoli 1990；Ensoli1993；Chang 1997)，在其中，取决于浓度，构象状态，和细胞类型，其可以增加病毒感染性。具体地，Tat的吸收可以在感染的细胞中增加病毒基因的表达和复制(Frankel 1988；Ensoli 1993；Chang 1997)，然而，在未感染的细胞中，它增强共同受体CCR5和CXCR4两者的表达，这有助于嗜巨噬细胞和嗜T淋巴细胞的两种HIV-1毒株的传递(Huang 1998；Secchiero1999)。
与这些发现相一致，已经表明，对Tat的免疫应答在控制AIDS和AIDS相关疾病的进展中起关键作用，并且保护接种Tat的猴子免受SHIV感染(Cafaro et al.，Nat Med 1999)。然而，基于现有的研究，还没有认识到或假定在调控HIV吸收或膜融合的分子事件中Tat的特别作用。
WO 01/54719公开以功能性的、灭活的、突变的形式，作为抗原，或作为抗原肽，与野生型Env一同的Tat和/或Nef的用途，其基于这些抗原的结合在保护接种的猴子抵抗SHIV攻击方面是有效的观察结果。对所述抗原形式的抗原的衍生化作用使它们更安全和/或更稳定。没有迹象表明在Tat，或Nef，与Evn之间形成了复合物。
令人吃惊地，我们已经发现Tat可以与gp120 V3环相互作用，由此在分子的(结构的)和功能的水平上模拟所述CCR5共同受体，从而赋予嗜CCR5HIV毒株感染表达仅很少量CCR5的细胞靶点的能力，并且在固定的Tat不存在时，其不会受到输入的同种病毒的感染。
因此，在第一方面，提供一种用于在治疗中应用的复合物，其包含第一种和第二种肽，第一种肽包含gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，结合区衍生于Tat并且可被单克隆抗体所识别，所述单克隆抗体针对CCR5第二个细胞外环，如Lee，B.，等.，J.Biol.Chem.，1999，Vol.274，9617-9626中所述。所述鉴别的单克隆抗体可从Pharmingen获得，目录号是36460D。
在备选的方面，本发明提供一种包含第一种和第二种肽的复合物，第一种肽包含gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，结合区至少包含SEQ ID NO 1的残基21-40和46-60，或21-60，或其片段，突变体或变体，其能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。
优选地，结合区至少由SEQ ID NO 1的残基21-58组成。优选地，通过合适的接头结合SEQ ID NO 1的残基21-48和46-60，或46-58，并且将其适当排列，以便它们能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。备选地，一段包含SEQ ID NO 1的21-58的单个连续序列也是优选的，条件仍是保留结合SEQ ID NO.2的残基301-419的能力。
优选地，结合区至少包括SEQ ID NO 1的残基21-58。备选地，还优选结合区至少包括SEQ ID NO 1的残基21-40和46-58。
本发明还提供一种用于在治疗中使用的，特别地用作疫苗中的免疫原性成分的复合物，其包含第一种肽和第二种肽，所述第一种肽包含gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，结合区衍生于Tat并且可被抗-CCR5抗体所识别。
应该理解，本文使用术语“肽”来表示一种其中具有肽或拟肽结合的物质，并且其可能是包含其它类型的化合物，诸如糖残基，的更大的分子的一部分。通常优选肽包含大部分天然存在的氨基酸，并且特别优选地，天然存在的氨基酸形成超过90％的肽。在一个优选实施方案中，肽由天然存在的肽组成，任选地，其在任一端或两端和/或糖苷残基处用封闭基团取代。
特别令人惊讶地，Tat能够结合gp120的V3环，并且结合所述V3环的Tat的区域被抗-CCR5抗体识别。假定单克隆抗体的非常高的特异性，非常可能，Tat对gp120的V3环的作用与CCR5的作用类似，或相同。实际上，至少在涉及HIV感染性的范围内，我们已经确定细胞外Tat能够有效地为表达很少量这种共同受体的T细胞提供CCR5的功能性。
关于WO 01/54719，例如，尽管Tat和Env可以一同施用，但由于CD4尚未激活Env，并且由于为了避免只是在形成复合物之后的诸如复合交联的Tat V3环相互作用的干扰或添加佐剂而未采取特别的预防，Tat不能结合制剂中Env的V3环。在WO 01/54719情形下，直到Env被CD4激活时，其才不再接近Tat，以致从联合施用所获得唯一优势就是已知的Tat作为佐剂的优势。在本发明中，Tat不仅能够，尤其在其存在时，像这样作为佐剂，而且其与所述V3环的缔合产生新的抗原表位或有效用于防止HIV感染，或防止感染扩散的表位。
所以，M-tropic毒株起初只靶向巨噬细胞，但是，一旦释放出Tat，即使表达很少量CCR5的T细胞也可以被迅速感染，其可以导致建立持续感染所必需的病毒的大量集结。
通过认识到这一点，现在可能提供一种用于预防或治疗的至少Tat和Env相关部分的抗原复合物，从而在个体中刺激免疫原性应答。
这样的复合物也可以用来产生用于被动免疫的抗体，例如在怀疑个体可能已经暴露于HIV的情况下。这样的抗体可以在动物中产生以用于人类，并且还可以通过本领域公知的方法测序并人源化。
虽然复合物，和针对其的抗体，是专用于抗嗜CCR5病毒毒株，它们也可以用于抗嗜TCL毒株，以阻碍，或者甚至阻滞Tat-介导的从一个T细胞到另一个的病毒扩散。同样地，也可以靶向双嗜性毒株。
由于通过Tat的CCR5的分子拟态，复合物和抗这些复合物产生的抗体还将部分地模仿或针对抗CCR5中或CCR5/V3环复合物中存在的表位，其进一步对用于被动免疫的疫苗或抗体的功效作出贡献。
本发明的复合物一般可以适合提供为在适于注射的赋形剂中两种肽种类的组合。含有所述复合物的赋形剂可以这样储存，或者可以提供为在使用前组合的单个肽和/或赋形剂的分离制剂。
本发明的复合物典型地包含相互接触的两种肽种类。同时优选地，不是必需地，两个种类以化学计量的量存在，甚至任一种类的大部分是被复合的或结合于另一种类。所有必需的是，为了能够刺激与之相对的免疫应答，应该存在足量的两个种类的抗原性组合。
本发明的复合物可以仅依赖于Tat和gp120的V3环之间的天然的相互作用。还可以应用较弱的复合物，但是一般优选增强所述复合物。在这一方面，例如，可能应用能够与Tat蛋白的半胱氨酸-富集(reach)区发生缔合的二硫键，或使用本领域已知的其它蛋白交联技术，诸如，例如，BS3交联剂。
所述复合物可以只包含Tat和gp120的相关区域。在gp120的情形下，V3环区的全部或基本部分(substantial part)是足够的，尽管，如分子对接(docking)数据所指示的那样，也可以在体内包括接近V3环的残基。在Tat的情形下，尽管氨基酸1-61，和可能地，直到氨基酸70并超过70，参与同V3环的结合，但是应用残基21-58似乎特别有利。Tat序列的这一片段特别强地与单克隆抗CCR5抗体结合。
本发明中，一般看起来重要的那一部分Tat分子包括涉及到SEQ IDNO 1的残基1，2，4，16，19-22，25，26，29，34，35，45-47，51，55，57，59和61。然而，抗-CCR5很强地识别Tat(21-58)肽，并且，强度稍弱地识别Tat(46-60)肽，其包含Tat的碱性区域(basic region)。已知残基21-58的Tat片段包含2个重要的蛋白功能结构域半胱氨酸富集区(21-40)和碱性区域(46-58)。Tat(21-58)肽，而不是21-40，即半胱氨酸富集区，还是Tat-介导的HIV向性向低量CCR5表达TCLs扩增所需的最小的肽。这些数据强烈地预示所述Tat半胱氨酸富集区是用于CCR5模拟的Tat碱性区的最好的构象结构所需的。因此，在本发明应用短于全长的Tat的情形中，那时优选应用至少残基21-58或21-60，具有中等长度的剪截的肽，或者在单个的重组肽中至少残基21-40和46-58都存在，连接在一起或者通过接头区，并且还优选形成本发明的一部分。在应用上述序列的突变体或变体的情形，那时这可以通过删除、插入或倒置一个或多个残基而变化，条件是由此获得的肽能够如按照附属实施例中描述的测定法所确定的那样结合天然存在的gp120的V3环。优选保留的残基为，适当地1，2，4，16，19-22，25，26，29，34，35，45-47，51，55，57，59和61。
SEQ ID NO 1显示Tat的完整氨基酸序列。
应该理解所述载体肽或框架分子可以包括Tat的相关部分，但是这样可能产生其它表位，因而在多余表位的产生不被需要的情形中一般不优选。
包括V3环的肽可以包括或者由gp120组成，其任选地剪截和/或删除，或者可以包括更大或更小的分子。在一个优选实施方案中，包括V3环的肽可以包括一些或全部的Env。在这点上，认为处于其天然形式的Env是由病毒产生的未被加工的蛋白，其为gp120-gp41之间的融合蛋白，并且还已知为gp160。所述肽还可以包括Env的片段，并且应该理解，如此处所用，Env不仅仅是指Env及其片段，还指表达或能够表达V3环的任何肽。为了参考，本文提供完整的gp120序列，为SEQ ID NO 2。在本文中，应该理解所述肽可以只由V3环区域组成，并且还可以由任何中间体分子组成，诸如表达或暴露一个或多个V3环的载体分子，如本文在其它部分所讨论的那样。
所述Env分子或复合物可以是天然存在的那个分子，或者可以在其上进行任何删除或变化，条件是其仍保留V3环。优选删除突变体，诸如ΔV2Env突变体，其缺少V2环，但是其保留部分gp41。已发现这种突变体在与Tat组合时提供特别好的结果，产生高的抗-Env效价。
ΔV2Env与Tat形成复合物，并且增加抗Env的体液应答，而没有抑制抗Tat的体液应答。通过比较，野生型Env形成复合物，但是没有增加抗Env的体液应答，并且抑制抗Tat的体液应答，因而这证明ΔV2Env的应用比野生型Env刺激更多的B细胞全部组成部分。
因此，在优选实施方案中，本发明的复合物具有ΔV2Env作为其成分。
含有Env区域的V3环优选地包括至少SEQ ID NO.2的残基301-412，并且可以包括在这一序列上的任何变异或突变，诸如通过删除、插入或倒置一个或多个氨基酸，条件是由此获得的环能够结合如SEQ ID NO.1所示的Tat，正如通过附属实施例中的测定法所确定的那样。更加优选地，任何含有V3环的序列包括至少如在SEQ ID NO.2中所示的残基301，316，317，318，321，322，324，325，327，328，329，331，332，405，407，412，416-419。然而，包括SEQ ID NO.2.中的核苷酸299-333的V3环本身也是本发明的目标。
已知Tat可以用作为佐剂，增加细胞介导的抵抗抗原的免疫应答，并且将所述免疫应答向Th1表型极化(Fanales Belasio等.，J Immunol 2002；Ensoli B.，WO03/009867)。另外，Tat通过改变其经由蛋白酶体的加工而扩大抵抗抗原的Th1应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。这导致诱导抵抗通常为次优势的抗原性细胞毒性T细胞(CTL)表位的应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。
我们已经发现的是，这些性质不受影响，以致Tat与Env一起应用激发了更广泛的抵抗次优势表位，甚至Env，还有可以一起施用的其它抗原的应答。
更加优选的，例如，为了刺激抗体生产，能够与Env相互作用以暴露功能V3环的任何分子或物质可以有效用于本发明。在这种情形下，功能V3环能够结合如SEQ ID NO.1所示的Tat，正如通过附属实施例中的测定法所确定的那样。
一个适宜的实例是CD4或其片段，其能够在与Env相互作用时引起V3环的暴露。还包括病毒颗粒的包膜成分，以及其片段，所述病毒颗粒在Tat结合于病毒表面时，将通过诱导Env中存在的V3环的暴露而起作用。
已知V3环是对于Env与存在于胞外基质和细胞膜的硫酸乙酰肝素结合的主要决定簇。还已知Tat通过其碱性区域结合于硫酸乙酰肝素。因此，由于已经证明了Tat和Env形成复合物，本发明进一步延伸到还包括硫酸乙酰肝素，任选地以及其它已知结合硫酸乙酰肝素的分子的复合物，并且其与感染/炎症位点相关。例如，所述其它分子可以包括碱性成纤维细胞生长因子，并且所述复合物特别用作接种的免疫原。
由于本领域内已知Tat结合整联蛋白，其为细胞黏着受体，包括αvβ3、α5β1、αvβ3，并且其调控Tat进入细胞，所以本发明还延伸到本发明的复合物，其具有整联蛋白作为其它成分，特别用作接种的免疫原。例如，用于形成本发明中应用的复合物的其它分子包括结合Tat或Env或者两者的分子和物质，并且可以包括CD26、VEGF受体和趋化因子受体。
重要的是所述复合物应该足以刺激免疫应答，以便由此产生的抗体将在体内识别Tat/Env复合物。因此，尽管一般可能应用Tat序列的变体来结合gp120 V3环，但是可能的是，抗由此获得的复合物产生的抗体将不能在体内识别Tat或Tat21-58和Env的复合物，其中在体内，Tat肽和环的复合物的三级构型与在Tat或Tat21-58和Env之间形成的复合物的三级构型不同。
因此，一般优选地，对于产生抗体或作为疫苗制剂的免疫原而应用的复合物基本上包括免疫学的天然构象中的Tat的全部序列，或者优选地至少Tat21-58。在这一点上，可能实行某些氨基酸取代，而不影响Tat的免疫原性，尽管这样的取代可以影响由此获得的Tat在其它方面中的生物功效。例如，由于诸如确保Tat和V3环之间的更大的结合或者这样的取代可以通过优选的遗传工程方法获得的原因，进行这样的取代是可取的。
对于复合物形成，不那么重要的是，V3环是全部Env分子的部分，并且这种环可以由载体分子中适当的前后序列提供，条件是其可以以这样能够与Tat肽形成复合物的形式加以利用。特别地，应该理解这样的载体分子可以表达多于1个的V3环，以与不同的Tat蛋白形成多聚体复合物。
一般地，优选应用天然存在的Env、或者相似或相关蛋白，诸如其变体或工程突变体，条件是在构象上其暴露V3环。例如，这种暴露可以通过向其它两种肽种类的制剂中添加CD4、或CD4的gp120结合表位而获得，并且可以任选地包括硫酸乙酰肝素，例如，优选地以这样的方式-即成分可以连接成为融合蛋白，或者通过化学交联的方式，由此使得gp120能在这样的系统中暴露V3环。
在优选的方面，本发明提供如上文所述的复合物在制备用于治疗或预防病毒感染的药物中的应用，由此所述感染的病毒表达能够在其本身、CD4和CCR5之间形成三级复合物的分子。
用于复合物的肽可以通过任何常规方法衍生或取代，条件是它们仍然能够完成它们需要的用途，如上文所述。特别地，例如，尤其在所述肽是短的时，N-和/或C-端可以进行化学封闭，以抑制肽酶的作用。当所述肽是化学合成的或半合成的时，用更不易受攻击的部分取代易受影响的键也是可取的。在一些情形中，可以适当地用拟肽基团取代肽的大部分。
在本发明优选的复合物中，第二种肽包括HIV Tat半胱氨酸和碱性区，以及第一种肽包括HIV Env的V3环。第二种肽可以包括HIV Tat片段或其衍生物，以及第一种肽可以包括HIV Env片段或其衍生物。第二种肽可以包括HIV Tat肽或表位，以及第一种肽可以包括HIV Env肽或表位。
在优选的实施方案中，本发明的复合物包括至少1个肽间共价键。例如，所述复合物可以是HIV1 Tat、其片段或衍生物，和HIV Env、其片段或衍生物之间的共价连接的嵌合体。
在一个优选的复合物中，在第二种肽的结合区包括Tat的氨基酸残基1-61，或者其免疫原性等价物。所述Tat成分可以是反式激活突变体。
应该理解优选的复合物基本上没有细胞和细胞碎片。
本发明还提供用于预防或抑制母婴或在暴露于HIV的个体之间的HIV传播的方法，其包括给母亲或个体施用本文所定义的被动疫苗。
例如，一般地，用于这种治疗或预防的靶病毒是HIV或HTLV的毒株，而且可以是动物毒株，诸如SHIV。
抗本发明的复合物的抗体可以通过标准方法产生，并且产生适宜的单克隆或多克隆抗体，优选单克隆抗体。优选地，这样的抗体不能单独地结合CCR5、Tat、Env或gp120的V3环区的任何一个，但是能够结合Tat和Env或共同受体和Env的复合物。因此，由此获得的抗体可以在体内结合并且封闭Tat或共同受体和Env的复合物，因此预防或抑制感染。应该理解所述抗体不必需通过与在复合物形成时产生的新表位相互作用而结合所述复合物的两个或全部成分，并且可以只结合在Tat与Env结合时暴露的隐蔽表位。这样的表位可以发生在Tat、Env或者甚至CCR5上，并且这代表了本发明的优点。
在抗本发明的复合物的适宜的抗体制剂中，可以通过个别地消除抗体或结合Tat、Env或gp120的V3环的品系的简单方法将结合通常在Tat或Env上存在的表位的抗体从所选择的多克隆制剂或那些单克隆品系上移除，由此只留下多克隆制剂，或者表达结合只在复合物中存在的表位的抗体的品系。
应该理解通过这种方法产生的单克隆抗体，如果在动物中产生，可以通过本领域公知的方法适当地人源化。本发明延伸到对本文所描述的复合物特异的多克隆、单克隆以及人源化抗体。
提供了包括本发明的复合物的活性疫苗，对于包括本发明的抗体的用于被动免疫的抗体制剂也一样，适合这样的疫苗的赋形剂在本领域内是公知的，并且可以包括适宜的物质，诸如稳定剂、等渗剂和抗菌剂。
携带所述复合物或抗体的赋形剂可以以浓缩的或无活性形式贮存，需要时用于稀释和/或活化。适宜的赋形剂可以是含盐的或含盐的衍生物，或者对于本领域的技术人员显而易见的其它物质，并且优选地以可注射的形式，或者可以制成可注射的形式。
复合物或抗体的量应该足以作为免疫原或刺激物，或者适当地具有或强化生物效应。
本发明还延伸到复合物本身。这样的复合物的一种应用是在层析技术中确定来自患者的样品是否含有抗所述复合物的抗体。例如，可以以任何方式将所述复合物用在这样的技术中，诸如固定在载体上用于柱子中，适宜的检测试剂是标记的抗-抗体。
例如，本发明的复合物还可以用于靶细胞，并且用于鉴别妨碍HIV细胞进入的药物。例如，可以评估包括所述细胞和复合物并且经受感染剂量的病毒的培养物，以确定感染是否发生或者发生了多少。
因此，Tat-V3环复合物提供一种新型抗原，其可以用于预防性或治疗性接种，其通过诱导能够阻滞或结合体内Tat-V3环相互作用的保护抗体而实现，由此中断后续感染。抗体还可以阻滞CCR5-V3环相互作用，并且所述复合物可以用来产生用于阻滞母婴传播或在暴露的个体之间的水平HIV传播的被动免疫的保护抗体。
在优选的实施方案中，本发明提供在HIV Tat蛋白和HIV包膜蛋白Env之间形成的分子复合物，其在Tat的半胱氨酸富集区和碱性区与gp120V3环相互作用时产生。优选使用完整Tat蛋白、其突变体、片段或衍生物，以及HIV包膜蛋白gp120、其片段或衍生物而获得的分子复合物，对于它们作为用于抗HIV/AIDS预防性或治疗性接种的抗原的应用也一样。
优选的复合物包括HIV Tat半胱氨酸和碱性区以及HIV Env的V3环。由于暴露于Tat的细胞的蛋白酶体对蛋白进行不同处理(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)，另一种优选的复合物包括由暴露于Tat的细胞的蛋白酶体产生的Tat片段，其包括含有Tat的半胱氨酸区、碱性区和RGD区，Tat的半胱氨酸区和碱性区，Tat的碱性区和RGD区，或者只有碱性区的片段。另一种包括HIV Tat片段或其衍生物以及HIV Env片段或其衍生物，而另一种包括HIV Tat肽或表位以及HIV Env肽或表位。
在HIV 1Tat、其片段或衍生物，和HIV Env、其片段或衍生物之间共价连接的嵌合体也是优选的。
在一个实施方案中，Tat成分可以是反式激活的沉默突变体，例如Tat-cys22突变体。
这些实施方案的HIV优选地为HIV-1。优选的分化体是HIV-1分化体A，B，C，D，E，F，G和O。应该理解本发明延伸到嗜CCR5、嗜CXCR4和双嗜性毒株，并且涉及的任何具体病毒、或者其类型或种类同样适用于本发明的所有病毒主体。
本发明的疫苗特别用于预防或抑制母婴或在暴露于HIV个体之间的HIV传播。
通过下述非限制性的实施例进一步举例说明本发明。
实施例1HIV-1 Tat与gp120 V3环的分子相互作用应用分子对接模型(molecular docking model)研究HIV-1 Tat与HIV-1gp120 V3环的结合，其中允许Tat(BH10 HIV毒株)与Env蛋白的V3环(Ba-L HIV毒株)相互作用。使用到2003年7月为止保存在Protein DataBank中所有可利用的Tat蛋白和Env蛋白的结构作为模板，计算所有结构模型(Berman，H.M等.，Nucl.Acids Res.28，235-242，2000)。应用ClustalW比对各种蛋白的序列(Thompson，J.D等.，Nucl.Acids Res.22，4673-4680，1994)，并且使用Modeller6v2产生结构模型(Sali，A.和Blundell，T.L.J.Mol.Biol.234，779-815，1993)。使用AMBER-5通过能量最小化对所有计算的结构模型进行最优化(Pearlman，D.A.等.，in AMBER 5.0，University of California，San Francisco，1997)。然后，应用这些结构模型通过BIGGER程序来计算蛋白-蛋白加合物(Palma，P.N.等.，Proteins Struct.Funct.Genet.39，372-384，2000)。后一程序基于形状互补性和非键合(静电的和Van der Waals)相互作用产生蛋白-蛋白复合物并将其排列。
使用分离的V3环(a.a.297-336)进行初始分子对接(docking)计算，并且产生3种类型的低能加合物，其特征在于3种独特的相互作用区域。这些加合物特征在于与V3环相互作用的不同的Tat残基，尽管，通过比较，所述V3环只表现出单一的相互作用区，其包含残基Thr300，Arg301，Ala331，His332，Asn334以及V3环306-328片段的一些氨基酸。
接着计算Tat和暴露V3环的HIV-1Bal gp120的相对大的结构域(291a.a)的相互作用。由于没有关于V3环的构象以及其关于剩余的gp120结构域的相对定向的结构信息，将对于V3环可及的构象和柔性的范围定为样本。事实上，所述环构象的可变性可以对复合物几何学具有相当大的作用。通过在明确(explicit)溶剂中的长期分子动力学模拟进行构象取样。进行了对接计算，其允许Tat与Env蛋白的gp120的5个不同构象相互作用，所述构象包括2个最不相同的V3环构象加上3个中间体构象。
这些计算鉴定一种与Tat在包括V3环的区域相互作用的加合物，其与只用V3环进行计算发现的一种加合物中发现的基本相同。因此，预计这种加合物是最稳定的，并且当完整力场(由2个分子的原子产生)生效时，进行分子动力学(MD)计算，以最优化其构象并估计其稳定性。进行关于Env蛋白的氧化(即，在V3环上带有二硫键)和还原两种状态的计算，并且表明所述加合物在2种氧化状态下同样稳定。为了验证用所述方法发现的相互作用模型，并且为了分析蛋白-蛋白界面，还进行了使用Haddock程序的对接计算。发现5种最低能态的加合物具有与使用BIGGER计算发现的模型相同的几何学。
因此，所有这些计算都指向一种独特的相互作用模式。发现所述加合物的最终结构模型非常稳定，其具有2260±1122的平均相互作用表面，和-412±14kcal mol-1的平均蛋白-蛋白分子间能量。对相互作用能的最大贡献归因于具有-325±14kcal mol-1的平均能量的静电贡献所述相互作用表面包括Tat上的残基1，2，4，16，19-22，25，26，29，34，35，45-47，51，55，57，59，61和Env上的残基301，316，317，318，321，322，324，325，327，328，329，331，332，405，407，412，416-419。
Tat和gp120残基之间的3个分子间盐桥键(Asp5-Arg316，Lys50-Glu407和Lysl9-Asp327)分别发现在所有的各种模型以及在分子动力学模拟过程中是完全保守的。发现所述加合物通过额外的分子间氢键而更加稳定，在模拟过程中，所述氢键的数目在6-11之间变化，但是总是包括共同相互作用区的至少1个残基。还确定对所述加合物的稳定性的相当大的贡献是由30-40个疏水相互作用引起。这些相互作用中的20-30个由属于V3环的残基贡献，而大约其中的20个由属于Tat的20-59片段的残基引起。
实施例2在ELISA检测中Tat结合gp120 V3环。
进行酶联免疫吸附测定(ELISA)检测来确定Tat实际上是否在体外结合gp120 V3环。为了这一目的，将ELISA培养板用包含完整V3环的肽包被，接着使用载体牛血清白蛋白(BSA)广泛封闭，多重洗涤步骤，和与生物活性Tat蛋白或者，作为对照，其缓冲液(PBS-BSA 0.1％)一起额外温育(Cafaro等.，Nat Med 1999；Fanales-Belasio等.，Immunology 2001)。单克隆抗-V3和多克隆抗-Tat抗体用作检测结合的蛋白的初级抗体。
当未包被的(即BSA-封闭的)孔与抗-Tat或抗-V3抗体一起用于ELISA检测时，检测到微弱的背景信号，其范围为约0.1-0.4OD。结果显示在下文的表1中。然而，当用V3肽包被的孔与Tat一起温育时，信号增加到约1光学密度(OD)。相反，只与缓冲液一起温育的孔产生与背景水平(未包被的孔)相当的信号。正如期望的那样，V3包被的孔与抗-V3抗体一起产生高的ELISA信号。这些实验表明生物活性的Tat在体外结合于gp120V3环，这确定了使用分子对接计算获得的数据。通过用Tat包被孔以及将包被的孔与增加量的V3环肽一起温育，获得了相似的结果，如期望的那样，其表明V3环肽与固定的Tat的剂量-依赖型结合(表1bis)。
表1bis将孔用Tat(100ng)包被并用牛血清白蛋白(BSA)(100μg)封闭V3环肽量(ng)0 50 100 200 500抗V3抗体 0,119OD 0,181OD 0,285OD 0,435OD 0,787OD抗TAT抗体1,438OD 1,545OD 1,51OD 1,515OD 1,567OD
将孔用BSA(BSA)(100μg)包被抗V3抗体0,103OD 0,124OD 0,148OD 0,142OD 0,179OD实施例3Tat由针对CCR5 HIV共同受体的抗体所识别由于gp120V3环似乎是HIV毒株的共同受体选择和应用的主要决定簇，进行实验来确定Tat结合V3肽的能力是否归因于共同受体分子的Tat的拟态。为了这一目的，在ELISA检测中使用针对主要HIV-1共同受体(CCR5和CXCR4)的单克隆抗体(Pharmingen)，来确定它们是否能识别Tat，或者由具体的Tat序列和/或结构与功能结构域组成的Tat肽。已知这些单克隆抗体识别在HIV-1共同受体上存在的构象表位(Lee B等.，J Biol.Chem.，1999；Baribaud F等.，J Virol.2001)。因此，通过这些抗体的任何Tat识别将表明Tat与相关的共同受体共享结构相似性。
将ELISA培养板用天然Tat或下述Tat肽的一种(这些肽本质上对应的一个或多个区域在圆括号中给出)包被Tat(1-20)(N-端结构域)；Tat(21-40)(半胱氨酸-富集区-反式激活结构域)；Tat(36-50)(核心区)；Tat(46-60)(碱性区-核定位信号)；Tat(56-70)(谷氨酰胺-富集区)；Tat(65-80)(RGD序列)；Tat(73-86)(RGD序列)；Tat(83-102)(C-端结构域)；以及Tat(21-58)(半胱氨酸，核心，和碱性区)。
将单克隆抗-CCR5或抗CXCR4抗体用于检测步骤。抗-CCR5特异地识别重组天然Tat蛋白、Tat(21-58)肽以及，尽管具有更低的功效，Tat(46-60)肽。结果显示在下述表2中。相反，使用针对CXCR4的抗体没有观察到识别。
已知在这些实验中所用的抗-CCR5抗体识别在CCR5第二个细胞外环(ECL2)中存在的构象表位，并且中和HIV(Lee B等.，J Biol.Chem.，1999)。另外，已知RCL2参与导致膜融合的Env构象变化(Lee B等.，J Biol.Chem.，1999)。因此，这些数据表明包含Tat反式激活结构域和碱性富集区的Tat序列在结构水平上模拟CCR5的一个区域，其在gp120识别CCR5时参与细胞融合。
实施例4天然的、生物活性的Tat是抗-CCR5抗体识别CCR5所必需的在上述实施例3中描述的数据表明在肽21-58中存在的Tat序列能够折叠，以模拟CCR5共同受体的构象表位。为了确定Tat的具体构象是否是抗-CCR5抗体识别所必需的，将被抗-CCR5抗体识别的天然的、生物活性的Tat的能力与氧化的Tat制剂比较，所述氧化的Tat制剂通过将蛋白暴露于空气和直射光，按照已知的消除其大部分生物活性的方法获得(Fanales-Belasio，Immunology，2001)。这种方法导致-SH基团的氧化以及分子内和分子间二硫键的形成，其由在Tat反式激活结构域存在的半胱氨酸残基介导。已知Tat的反式激活特性又激活包括HIV共同受体的宿主基因的表达(Huang 1998；Secchiero 1999)。然而，Tat反式激活特性在反式激活突变体中被消除，在该突变体中半胱氨酸22被甘氨酸取代(Tat-cys22)(Caputo A等.，Gene Ther.1996)。然而，这种Tat突变体保持其免疫原特性、完整性(Caselli E等.，J Immunol.1999)。因此，Tat-cys22也包含在这一系列的实验中。
将ELISA孔用天然Tat、氧化的Tat(Tat OX)或Tat-cys22包被，并且在检测步骤中应用抗-CCR5、抗-CXCR4抗体。这些实验表明所述抗体特异性识别重组的天然Tat蛋白和Tat-cys22突变体，但是不识别氧化的Tat蛋白。结果显示在下述表3中。相反，并且作为对照，多克隆(兔)抗-Tat抗体识别，如预期的，具有相似功效的蛋白，这证明所有的孔都是均一地包被的。
因此，这些实验表明，包含Tat反式激活结构域、核心区和碱性区的Tat序列折叠，以模拟CCR5上存在的主要表位，并且消除Tat的反式激活特性的点突变不妨碍表位形成。
实施例5细胞外Tat增加CD4+易感细胞的HIV感染性并且在CCR5低表达细胞系中扩展HIV-1向性。
为了确定Tat是否可以通过模拟CCR5调节HIV-1进入，有必要确定在CCR5-依赖型系统中Tat对HIV进入的作用。为了这一目的，以单循环测定进行感染实验，所述单循环测定其使用编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的复制-缺陷重组HIV-1，所述感染实验将嗜CXCR4HXBc2HIV分离物、或者嗜CCR5ADA或YU2HIV分离物的包膜糖蛋白假定为假模标本。这些复制-缺失病毒(此处称为嗜R4HXBc2/HIV-CAT或嗜R5ADA/或YU2/HIV-CAT病毒)通过CD4/CXCR4或CD4/CCR5进入易感细胞，将它们的cDNA′s整合到细胞基因组中，并且表达报告基因CAT，但是它们不能产生后代(即，它们不能通过后续循环的病毒生产支持进一步的细胞感染(Helseth E.J Virol 1990))。因此，HIV-CAT病毒产生单轮的靶细胞感染循环，CAT乙酰化水平的定量允许定量评估HIV感染的功效。
基于上述在实施例1-4中获得的数据，进行实验来确定是否由于Tat对CCR5共同受体的分子模拟，Tat能够帮助HIV感染，扩展HIV向性，并且使得TCLs易受嗜R5(即，嗜-单核/巨噬细胞)HIV毒株的感染。为了这一目的，将CEMss和Jurkat细胞，2种表达CD4和CXCR4的TCLs，但是其缺乏蛋白水平上通过标准流式细胞术或蛋白质印迹可检测的量的CCR5表达的细胞，或者CD4-293细胞系接种在Tat-包被的孔中，所述孔先前与HIV-CAT病毒温育，所述HIV-CAT病毒用嗜X4HXBc2毒株、或者嗜CCR5ADA或YU2毒株的包膜假定为假模标本。如预计的，CEMss和Jurkat细胞系被HXBc2/HIV-CAT有效地感染，而由于缺乏初级HIV-1受体，使用CD4-293细胞系没有检测到感染。并且引人注目地，ADA或YU2假型的HIV-CAT还高效率地感染了CEMss和Jurkat细胞，尽管上述细胞已知抗嗜R5HIV-1毒株的感染。因此，这些数据确定了出乎意料的预测固定的Tat能够通过特别CCR5细胞外结构结构域的分子模拟，增加HIV-1细胞向性，即，使得嗜CCR5毒株能够感染TCLs，所述TCLs表达少量的CCR5以至于在不存在Tat时不会被连续地感染。
进一步的实验表明Tat21-58，而不是Tat21-40，足以帮助嗜R5 ADA Cat病毒感染CEMss细胞，这表明调节与gp120V3环的结合的Tat区域与HIV扩展向性必需的区域相同。
实施例6抗-CCR5抗体，而不是抗-CXCR4抗体，阻滞低CCR5表达细胞系的Tat-辅助的感染为了进一步证明固定的Tat通过模拟CCR5扩展嗜R5HIV-1毒株的细胞向性，进行实验来确定能够阻滞CCR5的活性分子是否还能够阻滞CCR5-细胞的Tat辅助的感染。为了这一目的，在定向抗CCR5、CXCR4或CCR3的抗体存在下，将CD4+/CCR5-(CCR5RT-PCR+)CEMss细胞接种到Tat-包被的孔中，所述孔先前与含有嗜R5ADA/HIV-CAT单轮感染重组病毒的细胞上清液一起温育。Tat辅助的感染几乎完全被抗-CCR5抗体消除了，而使用抗-CXCR4或CCR3抗体作为对照比较没有观察到感染性的减少。由于CEMss细胞在蛋白水平上为CCR5-，这些数据表明所述抗体的阻滞能力归因于其识别模拟CCR5构象表位的Tat结构基序的能力，如在实施例3和4中详述的那样。并且，这些数据确定了Tat对CCR5的分子模拟是在CCR5-的细胞中嗜CCR5HIV-1毒株进入所必需的。
实施例7Tat和Env之间的复合物是新型免疫原。
为了确定Tat/Env复合物是否代表新型免疫原，即，隐蔽表位被暴露出来，将小鼠用下述物质的混合物免疫已知暴露V3环的Tat和Env蛋白；Tat和V3环肽；或者使用单一抗原，作为对照。这些实验的基本原理是基于这样的预测由于在复合物形成时，产生新的表位，暴露隐蔽表位，和/或隐藏了先前存在的表位，与单一抗原的情况相比较，2个组合抗原的B细胞表位决定簇所有组成部分将不同。因此，预计一些复合物放大和/或增加抗Tat和/或Env的体液应答的强度，并且其它复合物缩小/减少至少部分体液应答的强度，其取决于所述复合物的性质以及产生的B细胞表位的暴露或隐藏。
选择了3个Env分子野生型单体gp120(野生型Env)，与在病毒包膜中存在的三聚体形式相比，由于更好的V3环暴露，已表明其产生更强的抗V3环抗体应答(Fouts TR等.，J Virol 1997；Earl PL等.，J Virol 1994)；Env分子的三聚体gp140形式，其保留部分gp41并且缺少V2环(ΔV2Env)，并且已知暴露V3环(Srivastava IK等.，J.Virol.2003，Vol7711244-11259)；以及，对应V3环的环状肽。为了通过选择的Env分子确定V3环的暴露，对于抗多克隆抗V3环血清的反应性，将单体野生型Env和三聚体ΔV2Env用ELISA检测，显示阳性结果。
在第一次2-arm实验中，在第0、14和28天，将小鼠用Tat、野生型Env、ΔV2Env、或Tat和野生型Env的组合、或Tat和ΔV2Env的组合(在作为佐剂的明矾的存在下)免疫。通过ELISA对在第38天获得的小鼠血清检测体液应答(IgG效价)。与只用ΔV2Env免疫的小鼠相比，在用组合的Tat和ΔV2Env接种的小鼠中，抗Env IgG效价强烈的提高了。相反，在用组合的野生型Env和Tat或只用野生型Env免疫的小鼠中，它们是相当的。另外，当与野生型Env组合时，抗Tat的抗体效价减少了，但是当与ΔV2Env组合时，没有减少。
这些数据确定Tat与野生型Env或ΔV2Env的组合导致形成新的分子种类(复合物)，其特征在于新的B细胞表位决定簇所有组成成分。另外，它们表明，当保护相反地在接种时被野生型Env抑制的高抗Tat抗体效价的激发时，Tat/ΔV2Env复合物具有极大地增加抗Env体液应答的能力。由于单体野生型Env通过HIV和感染的细胞大量流出(shed)，这与天然感染中的抗Tat抗体的低频度相一致(Buttò等.，J Infect Dis，2002；Rezza等.，J Infect Dis，in press)。
还将小鼠用Tat、V3环肽、或Tat和V3环肽在明矾中的组合物免疫。注意单独的V3环肽是非免疫原性的，其不激发或激发临界的抗体效价，而Tat和V3环肽的组合物非常高地增加抗V3环肽的抗体效价，其对于抗Tat的抗体效价没有作用。
因此，这些数据证明Tat/Env或Tat/V3环复合物是新型的免疫原，其能够激发更高和更新的免疫应答。特别地，Tat复合物与ΔV2Env或V3环肽一起诱导更好的抗HIV Env的体液应答，并且，与对应的单一抗原或Tat和野生型Env之间的复合物激发的那些相比，证明这些是不同的。
实施例8Tat和Env的复合改变Env上存在的个别表位的抗体识别为了确定Tat/Env复合物是否诱导针对Env表位的体液应答，其中所述Env表位与用只Env分子免疫时识别的那些表位不同，将来自在实施例7中描述的第一次免疫方案的相同小鼠血清用来分析对于具体的线性Env B细胞表位的反应性。为了这一目的，将跨越野生型Env或ΔV2Env(SHIV-1SF162.P3)的15-mer肽混合在一起，以形成由3个邻近的15-mers(即，覆盖了Env或ΔV2Env的45个氨基酸)以及3个15-mers组成的肽库，所述3个15-mer的每一个重叠2个邻近肽间的连接处。
用与Tat组合的野生型Env或ΔV2Env免疫的小鼠的血清识别在残基77-132之间(即，跨越HIV-1V1环的前14个氨基酸)存在的线性表位。相反，这些表位不被用作单一抗原的Env或ΔV2Env免疫的小鼠的血清识别。与ΔV2Env中的V2环缺失一致，只有野生型Env激发针对V2环的抗体，并且反应性在与Tat组合时极大地增加了。通过比较，只用野生型Env免疫激发抗跨越HIV SF162Env中残基28-83区域的强烈的反应性，其在用Tat共同免疫时完全失去。因此，这些数据表明，Tat和Env或DV2Env之间的相互作用暴露/隐藏线性Env/ΔV2Env表位，其与复合物形成一致。
显著地，用与ΔV2Env组合的Tat，而不是只用ΔV2Env免疫的小鼠的血清，表现出抗跨越gp41的N和C螺旋的区域的强烈的反应性，这表明gp41的构象修饰，其已知在依次Env与CD4结合时及V3环与CCR5或其它共同受体结合时发生，并且其已知是必需的，而且领先于病毒包膜与细胞膜的融合。因此，这些数据一致于Tat和V3环的结合以及结合于Env的CCR5的模拟，其是病毒进入必需的。最重要地，这些数据表明Tat和ΔV2Env之间的复合物可以诱导抗HIV gp41的抗体，因此能够中和病毒感染性。
这些线性gp41表位不被只用ΔV2Env免疫的小鼠的血清识别，这表明Tat和ΔV2Env之间的复合物是一种新的免疫原。
表位识别中的相似变化可能用于构象表位。
实施例9在用Tat/ΔV2Env或V3环肽复合物免疫时抗-Env抗体效价的增加是由于形成存在于所述复合物中的新的/更强的B细胞表位，并不是由于抗Env的Th2应答的增加。
本领域公知2型T辅助细胞(Th2)应答，诸如由T细胞生成白介素4(IL-4)，对于产生抗抗原的体液应答是关键的。因此，除了复合物上新表位的产生之外，通过增加的和/或放大的抗Env的Th2应答，可以解释至少部分的用组合ΔV2Env或V3环肽的Tat免疫所激发的抗Env抗体效价的增加。因此，我们研究用Tat/ΔV2Env复合物免疫对于Th2应答的作用。
为了这一目的，对于抗Env的抗原特异性细胞应答，通过IL-4ELISPOT测定法评估用Tat和ΔV2Env组合物、或只用ΔV2Env免疫的小鼠(参见实施例7的流程)。这一测定法测量IL-4的产生，并且在本领域用来评估抗抗原或T细胞-表位肽的Th2应答。应用含有跨越整个ΔV2Env分子的Env 15-mer(由11个氨基酸重叠)的肽库的基质，评估抗-Env细胞应答。这些实验表明，与只用ΔV2Env相比，用组合Tat的ΔV2Env免疫没有增加或放大抗Env的Th2应答，但是激发了针对相同的Env表位的Th2应答。因此，这些数据表明，用组合了ΔV2Env或V3环肽的Tat免疫时，抗Env的抗体效价的增加是由于在复合物形成时新的/更强的B细胞表位的产生/暴露。
实施例10在用2种抗原共同免疫的小鼠中，Tat放大对Env的细胞应答。
已知Tat可以作为佐剂，增加细胞介导的抵抗抗原的免疫应答，并且将所述免疫应答向Th1表型极化(Fanales Belasio等.，J Immunol 2002；Ensoli B.，WO03/009867)。另外，Tat通过改变其经由蛋白酶体的加工而放大抵抗抗原的Th1应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。这导致诱导抵抗通常为次优势的抗原性细胞毒性T细胞(CTL)表位的应答(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。
为了研究用在复合物中组合的Tat和Env免疫对于Th1应答以及通过Tat的极化的作用，使用含有Env 15-mers(由11个氨基酸重叠)的肽库的基质，分析由脾细胞产生的γIFN(典型的Th1细胞因子)，所述脾细胞来自用Tat和ΔV2Env的组合物或者只用ΔV2Env免疫的小鼠(参见实施例7的方案)。与只用ΔV2Env免疫的小鼠相比，在用Tat+ΔV2Env免疫的小鼠中，抗-Env g-ELISPOTS显示出抗更多数目的肽库和表位的Env特异性T细胞应答(未显示)。这些数据表明，在免疫的小鼠中，与ΔV2Env组合的Tat保持放大抗Env的Th1应答的能力，如对于组合了野生型Env的Tat已经显示的那样(Ensoli等.，PCT/EP2004/11950)。因此，Env复合物可以用作免疫原来诱导有效的/中和体液应答，以及同时放大抗Env的CTL应答。
序列表<110>国家高等卫生院<120>新型Tat复合物，及包含其的疫苗<130>WPP89320<150>UK 0405480.5<151>2004-03-11<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>102<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>1Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Thr Asp Pro Val His Gln100<210>2<211>853<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<220>
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<221>misc_feature<222>(830)..(830)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>2Met Arg Val Thr Glu Ile Arg Lys Ser Tyr Gln His Trp Trp Arg Trp1 5 10 15Gly Ile Met Leu Leu Gly Xaa Leu Met Ile Cys Asn Ala Glu Glu Lys20 25 30Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr35 40 45Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val50 55 60His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro65 70 75 80Gln Glu Val Xaa Xaa Xaa Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys85 90 95Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp100 105 110Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu115 120 125Asn Cys Thr Asp Leu Arg Asn Ala Thr Xaa Xaa Asn Xaa Thr Xaa Thr130 135 140Thr Ser Ser Ser Arg Gly Met Val Gly Gly Gly Glu Xaa Lys Asn Cys145 150 155 160Ser Phe Asn Ile Thr Thr Xaa Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr
165 170 175Ala Leu Phe Tyr Glu Leu Asp Ile Val Pro Ile Asp Asn Xaa Ile Asp180 185 190Arg Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys195 200 205Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala210 215 220Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Lys Asp Lys Lys Phe Asn Gly Lys Gly225 230 235 240Pro Cys Xaa Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro245 250 255Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu260 265 270Val Val Ile Arg Ser Xaa Asn Phe Xaa Asx Asn Ala Lys Xaa Ile Ile275 280 285Val Gln Leu Asn Glu Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn290 295 300Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr305 310 315 320Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Leu Ser325 330 335Arg Ala Lys Trp Asn Asp Thr Leu Asn Lys Ile Val Xaa Lys Leu Arg340 345 350Glu Gln Phe Gly Asn Lys Thr Ile Val Phe Lys His Ser Ser Gly Gly355 360 365Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe370 375 380Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Asn Val Thr Glu385 390 395 400Glu Ser Asn Asn Thr Val Glu Asn Asn Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg405 410 415Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Xaa Val Gly Arg Ala Met Tyr420 425 430Ala Pro Pro Ile Arg Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly
435 440 445Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Pro-Glu Asp Asn Lys Thr Glu Val450 455 460Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu465 470 475 480Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr485 490 495Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Ile500 505 510Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly515 520 525Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly530 535 540Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln545 550 555 560His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg565 570 575Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile580 585 590Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn595 600 605Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Asn Lys Ile Trp Asp Asn Met Thr610 615 620Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Ile Ile Tyr625 630 635 640Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu645 650 655Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile660 665 670Thr Xaa Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Gly675 680 685Leu Ile Gly Leu Arg Ile Val Phe Ser Val Leu Ser Ile Val Asn Arg690 695 700Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr His Leu Pro Ala
705 710 715 720Ser Arg Gly Pro Asp Arg Pro Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu725 730 735Arg Asp Arg Asp Arg Ser Gly Pro Leu Val Asn Gly Phe Leu Xaa Leu740 745 750Ile Trp Val Asp Leu Arg Ser Leu Xaa Leu Phe Ser Tyr His Arg Leu755 760 765Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu Leu Leu Gly Arg770 775 780Arg Gly Trp Glu Val Leu Lys Tyr Trp Trp Xaa Leu Leu Gln Tyr Trp785 790 795 800Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn Xaa Xaa Ala805 810 815Xaa Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val Xaa Gln Arg820 825 830Ala Val Arg Ala Ile Leu His Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu835 840 845Glu Arg Ala Leu Leu850
权利要求
1.一种包括第一种和第二种肽的复合物，所述第一种肽包括gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，所述结合区包含至少SEQ ID NO 1的残基21-40和46-60，或其片段，突变体或变体，所述片段，变体或突变体能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。
2.一种包括第一种肽和第二种肽的复合物，所述第一种肽包括gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，所述结合区包含至少SEQ ID NO 1的残基21-40和46-60。
3.一种包括第一肽和第二种肽的复合物，所述第一种肽包括gp120的V3环，所述V3环能够与第二种肽上的结合区配位，所述结合区衍生于Tat并且可被单克隆抗体所识别，所述单克隆抗体针对Lee，B.，等.，J.Biol.Chem.，1999，Vol.274，9617-9626中所述的CCR5第二个细胞外环。
4.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述Tat结合区包括至少SEQID NO 1的残基21-60，或其片段，突变体或变体，所述片段，变体或突变体能够结合SEQ ID NO.2的残基301-419。
5.按照前述权利要求任一项的复合物，其用生物活性的Tat制备。
6.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽除了V3环之外还包括一些或全部的Env。
7.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽包括SEQID NO 2的完整序列，或者其片段，变体或突变体，所述片段，变体或突变体能够结合由SEQ ID NO 1的残基21-60组成的肽。
8.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽基本上由gp120的V3环区组成。
9.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽包括至少SEQ ID NO.2的残基301-419，或者其片段，变体或突变体，所述片段，变体或突变体能够结合由SEQ ID NO 1的残基21-60组成的肽。
10.按照前述权利要求任一项的复合物，其具有全部或部分的gp160作为其组分，所述gp160包括至少gp120的V3环，并且缺少至少gp120的V2环的大部分。
11.按照前述权利要求任一项的复合物，其具有ΔV2Env作为其组分。
12.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述包括V3环的肽包括至少如SEQ ID NO.2中所示的残基301-419。
13.按照前述权利要求任一项的复合物，其还包括能够与Env相互作用以暴露功能性V3环的分子或物质。
14.按照权利要求13的复合物，其中所述分子或物质是CD4或者其片段，突变体或变体。
15.按照前述权利要求任一项的复合物，其还包括硫酸乙酰肝素，任选地其还包括至少1种能够结合所述硫酸乙酰肝素的其它分子。
16.按照前述权利要求任一项的复合物，其还包括选自整联蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、CD26、VEGF受体和趋化因子受体的物质。
17.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述Tat结合区包含在暴露于Tat时可由人细胞的蛋白酶体产生的Tat片段内。
18.按照权利要求17的复合物，其中所述Tat片段选自含有Tat的半胱氨酸区、碱性区和RGD区的片段；含有Tat的半胱氨酸区和碱性区的片段；含有Tat的碱性区和RGD区的片段；以及，只含有Tat的碱性区的片段。
19.按照前述权利要求任一项的复合物，其中所述肽是交联的。
20.按照前述权利要求任一项的复合物的应用，其用来产生针对其的抗体。
21.按照权利要求20的应用，其用在获得单克隆细胞系的方法中。
22.按照权利要求21或22的应用，其中所述抗体这样选择，即当存在于来自所述组的任何其它物质的分离物中时，其不识别由下列物质组成的组的任何一个天然Tat、gp160、CD4或gp120、CCR5以及gp120的V3环区，但是其能够结合按照权利要求1-19任一项的复合物。
23.一种抗体，其按照权利要求20-22任一项获得。
24.权利要求23的抗体，其被人源化，以防止或减少当注射到人体时的不利免疫应答。
25.权利要求23或24的抗体的应用，其用于抗病毒感染的预防性或治疗性的被动免疫，其中所述病毒表达Tat。
26.按照权利要求25的应用，其中所述病毒是HIV。
27.权利要求25或26的应用，其中所述受体是预期者或养育的母亲。
28.按照权利要求1-19任一项的复合物的应用，其用作接种的免疫原。
29.按照权利要求28的应用，其中所述病毒是HIV。
30.按照权利要求1-19任一项的复合物，其作为在适于注射的赋形剂中的肽组合物提供。
31.一种试剂盒，其包括至少2种按照权利要求1-19任一项的复合物组分的分离的制剂。
32.按照权利要求1-19任一项的复合物在治疗中的应用。
33.按照权利要求1-19任一项的复合物的应用，其用于制备治疗或预防病毒感染的药物中，其中所述感染的病毒表达一种分子，所述分子能够在所述分子、CD4和CCR5之间形成三元复合物。
34.按照权利要求1-19任一项的复合物的应用，其用来确定来自患者的样品是否含有抗所述复合物的抗体。
全文摘要
包括HIV Tat和gp120的V3环的复合物提供新型表位，并且是免疫原性的，用来预防或抑制HIV感染。
文档编号A61K39/42GK1930184SQ200580007704
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者B·恩索利 申请人:国家高等卫生院
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