以rna介导的干扰来控制陆生和水产养殖动物疾病的制作方法
专利名称：以rna介导的干扰来控制陆生和水产养殖动物疾病的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及农业和水产业种群中的疾病预防领域。
背景技术：
农业和水产业中的疾病预防主要目标是将动物健康和养殖动物的商业生存力最大化。药物和疫苗在该成果中居一席之地，但是为了使动物不适最小化以及使其生长收益最大化，需要更低花费和具更低侵害性的方法来治疗或预防特定疾病症候群。
一个实施例为虾水产养殖。在过去的几十年，虾(对虾)养殖已经从维持生计水平的养殖发展为能向全球数百万人口直接或间接提供工作的主要工业。在虾养殖业发展的同时，其也被许多挑战所平衡。其中，病毒病是虾农主要关心的问题。在过去的几年，象由白斑综合症病毒(WSSV)引起的白斑病这样的疾病，已经在亚洲，中南美洲的虾养殖区域引发了严重的动物流行病并导致巨大损失(Krishna et al.，1997，World Aquaculture 1214-19；Joryet al.，1999，Aquacult.Mag.2583-91)。白斑综合症病毒含有约300kb长的环形双链DNA基因组，能感染对所有商业上重要的对虾类的种类和许多其他的甲壳类动物包括螃蟹和小龙虾(Flegel，1997，World J.Micro.Biotech.13433-442；van Hulten et al.，2001，Virology 2867-22；Yanget al.，2001，J.Virol.7511811-11820)。自从1992年到1993年期间东亚有了白斑综合症病毒首次记载以来(Inouye et al.，1994，Fish Pathol.9149-158)，许多白斑综合症病毒编码基因例如衣壳基因(van Hulten et al.，2000，J.Gen.Virol.812525-2529；van Hulten et al.，2000，Virology266227-236；Zhang et al.，2001，Virus Res.79137-144；Chen et al.，2002，Virology 29344-53；Marks et al.，2003，J.Gen.Virol.841517-1523)；核糖核酸还原酶基因(Tsai et al.，2000，Virology27792-99)；和胸苷激酶(Tsai et al.，2000b，Vi rology 277100-110)已经被详细研究。另外，也开发了基于实时PCR的高敏感性检测方法来检测并定量白斑综合症病毒(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。然而，开发白斑病治疗的成果是非常有限的。不过在近期，据报道以10g/kg的水平加入β-1，3-葡聚糖作为虾饮食添加剂持续20天，能提高虾的免疫力及感染白斑综合症病毒后的存活能力(Chang et al.，2003，Fish Shellfish Immunol.15297-310)。使用噬菌体表面展示技术，Yi etal(2003，J.Gen.Virol.842545-255)已经确定了一种对白斑综合症病毒具有高度特异性的10-mer的小肽(2E6)，并在小龙虾中阻断白斑综合症病毒感染。注射重组白斑综合症病毒衣壳蛋白(VP26和VP28)被证明能促进虾抗病性(P.japonicus；Namikoshia et al.，2004，Aquaculture 22925-35)。
与其他甲壳类动物相似，虾不具有获得性免疫。相反他们依靠先天免疫反应。虽然无脊椎动物中细菌和真菌免疫所涉及的许多免疫基因已经被详细描述，但是至今虾或任何其他无脊椎动物中病毒发病机理所涉及的免疫基因没几个是已知的。因此，急需分离及描述虾免疫基因并且急需开发抗击虾病毒病的疗法。
近年来，一种被称为RNA干扰(RNAi)的现象已被用于敲除靶基因的表达(细胞基因和病毒基因都可作为靶基因；Xia et al.，2002，Nat.Biotechnol.201006-1010；McCown et al.，2003，Virology 313514-524；Wilson et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002783-2788)，而不引起细胞内基因表达的全部变化。RNA干扰是一种现象，其中双链RNA(dsRNA)通过增强互补目的mRNA的特异性降解来抑制靶基因的表达(Hannon，2002，Nature418244-251)。RNA干扰机制包括酶RNA酶III识别dsRNA并将其切割成21-23核苷酸长的小片段干扰RNA(siRNA)。然后该siRNA结合成RNAi寻靶复合物，被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，并切割与siRNA同源的目的mRNA。这导致目标mRNA快速降解并使蛋白质合成减少(Hannon，2002，Nature418244-251)。最近已证明RNA介导的干扰可通过摄入华丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)dsRNA获得(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。
该发明的目的在于利用RNAi现象开发控制虾，水产养殖，及陆生物种中病毒性和细菌性疾病的疗法。双链RNA通过饮食口服喂食动物，并可测量其在预防疾病中的功效。已开发出控制虾白斑综合症疾病的方法。五种白斑综合症病毒基因被用作靶基因包括编码白斑综合症病毒早期表达的基因(核糖核酸还原酶)，蛋白酶抑制因子，DNA聚合酶基因，核壳基因(VP26)和衣壳基因(VP28)。代表上述基因的21-23核苷酸长的白斑综合症病毒DNA是化学合成的，并被克隆成给食载体(L4440)。用重组质粒转化大肠杆菌菌株(Escherichia coli)HT115DE3(携带有T7聚合酶的IPTG诱导表达，并缺失双链特异性核糖核苷酸III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。携带白斑综合症病毒特异性基因的重组克隆被测序以证实身份。完整细菌细胞或破碎细胞与饮食混合并喂食虾类。虾受到活体传染性白斑综合症病毒口服攻击，并记录死亡率。可使用实时PCR在治疗和对照动物中测量五种白斑综合症病毒靶基因的mRNA表达(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396；Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)，以确定两个处理组中的表达差异。
重大疾病攻击也存在于其他水产养殖物种以及陆生动物中。在母牛，绵羊，和山羊中慢速生长的生物体例如分枝杆菌对牧群造成广泛伤害和破坏。约尼氏病(由副结核分枝杆菌Mycobacterium paratuberculosis johnii引起的)是一典型疾病实例。其他可用此方法治疗的慢速生长细菌是支原体。牛疾病例如新包虫病(Neospora caninum)，普鲁氏菌病，结核病，牛白血性增生，和腹泻可用该发明控制。由原生动物例如隐孢子虫(Cryptosporidia)和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia)引起的动物原生动物疾病能被处理。病毒病例如牛腹泻和冠状病毒也可被处理。鸡饲养业中的长期问题是存在沙门氏菌(salmonellidae)。另外存在许多能造成大范围损害的病毒病，例如鸡传染性支气管炎，外来纽卡斯尔病，禽流感(造成数百万禽类毁灭)。
与细菌系统相对，存在其他替代系统能为在该系统中产生任何RNAi产物提供成本利益。该系统可以是藻类(例如，蓝绿藻Synechocystis或小球藻Chlorella)，真菌(例如，黑曲霉Aspergillus niger，链孢霉Neurosporacrassa)，植物(例如，烟草，紫花苜蓿，马铃薯，拟南芥Arabidopsis))，和昆虫(例如，粉纹夜蛾T.ni和草地夜蛾Spodoptera frugiperda)。至少为了达到该发明的目的，在细菌系统中生产dsRNA结构所需的分子手段很可能适合于上述其他生物体，并能为生产与饲料结合的生物量提供生产成本利益。为了该发明的目的，焦点集中于植物系统。然而，在其他系统中表达手段被充分开发，正如以下参考文献所证明的，该参考文献包含于本文内作为在真菌系统中表达手段的参考(el-Enshasy et al.，2001，Appl.Biochem.Biotechnol.9057-66；Wiebe et al.，2001，Biotechnol.Bioeng.76164-174；Liu et al.，2003，Lett.Appl.Microbiol.36358-361)，藻类(Mayfield et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872087-2091；US Patent no.5,270,175；US Patent no.5,977,437；PCT publication WO00/73455；Toyomizu et al.，2001，J.Appl.Phycol.13209-214；US patentpublication no.2002/0164706；US Patent no.6,379,968；Shapira et al.，2002，Plant Physiol.1297-12；Ton et al.，2002，FASEB J.16A542；Mayfield et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100438-442)，酵母(Guthrie et al.，1991，In；Abelson J，Simon M(eds.)Methods Enzymol.Academic Press，San Diego，CA；Mason et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911745-11749；Wery et al.，1997，Gene 18489-97；Martinezet al.，1998，Antonie Van Leeuwenhoek 73147-153；Cereghino et al.，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10422-427；Fischer et al.，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.30(Pt2)117-120；Cereghino et al.，2000，FEMS Microbiol.Rev.2445-66；Cregg et al.，2000，Mol.Biotechnol.1623-52)，和昆虫(Schmal john et al.，1990，J.Virol.643162-3170；Saliki et al.，1992，J.Gen.Virol.73369-374；Jarvis et al.，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9528-533；Altmann et al.，1999，Glycoconj.J.16109-123；Cha et al.，1999，Biotechnol.Bioeng.65316-324)。在植物系统中充分开发了使用植物病毒作为传递遗传物质的载体。烟草花叶病毒(TMV)和紫花苜蓿花叶病毒(AMV)是上述系统中的两种病毒，烟草花叶病毒被更广泛利用。利用基于来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA区域的Ti质粒在不同植物中，例如，番茄，马铃薯，羽扁豆，和莴苣(Kapusta et al.，1999，FASEB J.131796-1799；Walmsley et al.，2000，Curr.Opin.Biotechnol.11126-129；Khandelwal et al.，2003，Plant Sci.16577-84)，表达同源DNA。
发明内容
本发明的目的是产生21-23个核苷酸长的小片断干扰RNA(siRNA)，其对动物病原体例如细菌，真菌，藻类，或酵母具有特异性。RNA可作为siRNA或双链RNA(dsRNA)被递送，然后将其加工成siRNA。siRNA或祖先dsRNA在细胞中产生，以完整细胞或破碎细胞配入食物并递送给动物。这些食物将会被喂给动物以实现口服治疗剂siRNA的传递，该治疗剂siRNA对目标病原体具有特异性以改善疾病或疾病症状。
与目标RNA互补的长达约1000个碱基的较长核苷酸序列可在细菌细胞中产生，以完整细胞或破碎细胞与食物混合并被递送。
本发明的目的是通过充分利用RNA干扰现象特异性降解由互补的目的mRNA编码的病原体以保护动物免受病原体感染。
具体实施例方式
本发明的目的可由以下实施方案描述。
在本发明的一个实施方案中，产生siRNA，其对水产业病原体具有特异性。
在进一步的实施方案中，产生的siRNA对病毒性水产业病原体具有特异性。
在进一步的实施方案中，产生的siRNA对虾病毒性病原体具有特异性。
在进一步的实施方案中，产生的siRNA对白斑综合症病毒，黄头病毒，桃拉综合症病毒，和传染性表皮与造血组织坏死症病毒具有特异性。
在另一实施方案中，siRNA对鱼病毒性病原体具有特异性。
在另一实施方案中，siRNA对传染性鲑鱼贫血病毒，传染性胰坏死病，鲤鱼春季病毒血症，草鱼呼肠孤病毒，河鲶病毒，河鲶疱疹病毒，海洋双RNA病毒，马拉石斑神经坏死病毒，龙胆石斑神经坏死病毒，条纹石、胡瓜鱼、大西洋鲑和大菱鲆轮状病毒，虹鳟鱼病毒性出血性败血症病毒，虹鳟鱼棒状病毒，虹鳟鱼传染性造血组织坏死病毒和发自睡病病毒有特异性。
本发明的目的在于提供保护动物免受病毒感染的方法，包括在细菌或酵母宿主中产生病毒性病原体特异性RNA，加工含有生物量的该特异性RNA于不再进一步纯化的饲料或饲料补充物中，用所述饲料供给动物以递送足够量的病毒病原体特异性RNA，以抑制病毒对生物体造成致病反应。
在本发明一实施方案中，提供了保护动物免受病毒感染的方法。该方法包括以下步骤在细菌宿主中生产白斑综合症病毒(WSSV)特异性RNA，加工含有用作生产白斑综合症病毒特异性RNA的细菌的生物量于不再进一步纯化的饲料或饲料补充物中，然后用所述饲料供给动物，以递送足够数量的含有白斑综合症病毒特异性RNA的细菌，以阻止病毒对虾造成的反应。本发明对象白斑病这样的病毒性疾病提供了快速保护。该方法也可应用于其他类型的虾类疾病中，其由其他病毒、细菌、真菌引起的，以及应用于遭受真菌、细菌和病毒疾病的包括鱼、软体动物的其他水产养殖物种疾病中。在水生无脊椎动物物种中，例如虾，具有“先天免疫系统”，本发明提供了通过递送制备的RNAi分子治疗急性和慢性疾病的方法。
在本发明一实施方案中，提供了保护动物免受细菌感染的方法。该方法包括以下步骤在细菌宿主中生产细菌性病原体特异性RNA，加工含有用作生产细菌性病原体特异性RNA的细菌的生物量于不再进一步纯化的饲料或饲料补充物中，用所加工的生物量供给动物，以占总饲料1％的量递送含有细菌性病原体特异性RNA的细菌。
在水生脊椎动物物种中，例如鱼类，具有进化良好的免疫系统，本发明提供了一种首选反应法来延迟急性感染迹象的发作和消除慢性感染。
在本发明的进一步实施方案中，其他类型的表达系统，例如，酵母，藻类，和真菌也被用来生产病原体特异性RNA。用以保护动物的方法与上述描述的实施方案类似。
定义为了全面理解本发明，提供以下定义以明确该技术领域的术语，如果不在本文中做适当的定义，这些术语可有不同的理解或者成为激烈研究的主题，这也许会改变本发明的范围。对于本发明，以下术语以本文所给出的定义使用。
“基因沉默”是一新的基因调节机制，其通过抑制转录(称为转录基因沉默)或通过激活序列特异性RNA降解过程(转录后基因沉默)限制转录水平。
“RNA干扰”或“RNAi”是基因沉默机制，其通过序列特异性RNA降解过程限制转录水平。
“小片断干扰RNA”或“siRNA”是少于1000个碱基的双链RNA。
“反义RNA”是单链RNA或RNA的非编码链，其作为合成mRNA的模板。
“正义RNA”作为生成蛋白质的模板或是与用作蛋白质合成模板的mRNA相同的序列。
实施例目前所述的本发明以以下实施例为参考。提供这些实施例仅作举例说明的目的，本发明并不局限于这些实施例，而是包括明显作为本文所教导结果的所有改变。
实施例1构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与白斑综合症病毒(WSSV)基因同源的21-23个核苷酸组成。
RNAi序列由Ambion，Inc.(Austin，Texas)用其所拥有的siRNA设计公式设计。RNAi序列是设计用于白斑综合症病毒的五个基因，该五个基因包括编码核壳蛋白VP26、衣壳蛋白VP28、核苷酸还原酶、DNA聚合酶酶、和含有Kunitz蛋白酶抑制因子特征域的蛋白的基因。所有五种白斑综合症病毒的siRNA都是基于白斑综合症病毒基因组序列设计的，该基因组序列可在GenBank数据库获得，登记号AF369029。此外，siRNA也是设计用于感染性表皮与造血阻止坏死症病毒的非结构基因和衣壳基因(GenBank数据库获得，登记号AF273215)；黄头病毒的糖蛋白基因(GenBank数据库获得，登记号AF540644)；桃拉综合症病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶和衣壳蛋白基因，VP1(GenBank数据库获得，登记号AF277675)。
设计用于白斑综合症病毒基因VP28(AF369029)的siRNA能够使用几种不同方法完成。如Ambion所设计的，siRNA的一个设计是基于正义siRNA链(5’→3’)GGUUGGAUCA GGCUACUUCT T(SEQ ID NO___)和反义siRNA链(5’→3’)GAAGUAGCCU GAUCCAACCT C(SEQ ID NO___)的。为使用pSilencerTMsiRNA表达载体(来自Ambion的2.0，2.1，3.0，&3.1)而设计的模板是顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTTG GATCAGGCTA CTTCTTCAAG AGAGAAGTAG CCTGATCCAACCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGGT TGGATCAGGC TACTTCTCTC TTGAAGAAGT AGCCTGATCC AACCG-3’(SEQID NO___)。
第二个VP28 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGCUACUUCAAGAUGACUGT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)CAGUCAUCUUGAAGUAGCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencer载体，顶链寡核苷酸模板为5’-GATCCGGCTA CTTCAAGATG ACTGTTCAAG AGACAGTCA TCTTGAAGTA GCCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)而底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGCTACTTCAAGA TGACTGTCT CTTGAACAGT CATCTTGAAG TAGCC G-3’(SEQ ID NO___)。
第三个可能的VP28 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGUGUGGAACAACACAUCAT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UGAUGUGUUGUUCCACACCT T(SEQ ID NO___)。这需要为pSilencerTMsiRNA表达载体设计模板，其具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTGT GGAACAACACATCATTCAAG AGA TGATGT GTTGTTCCAC ACCTTTTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGTGT GGAACAACACATCATCTCTT GAA TGATGT GTTGTTCCAC ACC G-3’(SEQ ID NO___)。
设计用于白斑综合症病毒基因VP26(AF369029)的siRNA能够使用几种不同方法完成。如Ambion所设计的，siRNA的一个设计是基于正义siRNA链(5’→3’)GGGCAAAGGU AAUGUCAAUT T(SEQ ID NO___)和反义siRNA链(5’→3’)AUUGACAUUA CCUUUGCCCT T(SEQ ID NO___)的。为pSilencerTMsiRNA表达载体(2.0，2.1，3.0，&3.1)而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGGCA AAGGTAATGT CAATTTCAA GAGAATTGAC ATTACCTTTG CCCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GGGCAAAGGTAATG TCAATTCTCT TGAAATTGAC ATTACCTTTG CCC G-3’(SEQ ID NO___)。
第二个可能的VP26 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGUCCUACAAUACUCCUCUT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)AGAGGAGUAUUGUAGGACC TC(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体(2.0，2.1，3.0，&3.1)而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCC TACAATACTCCTCTTTCAAG AGAAGAGGA GTATTGTAGG ACCTCTTTTT TGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGT CCTACAATAC TCCTCTTCTCTTGAAAGAGG AGTATTGTAG GACC G-3’(SEQ ID NO___)。
第三个可能的VP26 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGAAACAUUAAGGGAAAUAT I(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UAUUUCCCUUAAUGUUUCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMisRNA表达载体设计模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGAAAC ATTAAGGGAA ATATTCAAGAGATATTTCCC TTAATGTTTC CTG TTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GAAA CATTAAGGGA AATATCTCTTGAATATTTCC CTTAATGTTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
另一个白斑综合症病毒基因ProIn(AF369029)有一siRNA设计，其具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGGAAGAAUU CUACAAGAAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UUCUUGUAGA AUUCUUCCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGGAA GAATTCTACA AGAATTCAAG AGATTCTTGT AGAATTCTTCC CTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCAAAAAACAGGG AAGAATTCTA CAAGAATCTC TTGAATTCTT GTAGAATTCT TCCC G-3’(SEQID NO___)。
为ProIn设计的第二个siRNA具有一正义siRNA链(5’→3’)GGGACCCUUUCAUGAAACAT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UGUUUCAUGAAAGGGUCCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGGAC CCTTTCATGA AACATTCAAG AGATGTTTCATGAAAGGGTC CC TTTTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GGGAC CCTTTCATGA AACATCTCTT GAATGTTTC ATGAAAGGGTCCC G-3’(SEQ ID NO___)。
为ProIn设计的第三个siRNA具有一正义siRNA链(5’→3’)GGCAUACAGAUGCCCUUUAT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UAAAGGGCAUCUGUAUGCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGCAT ACAGATGCCC TTTATTCAAGAGATAAAGGG CATCTGTATG CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCC AAAAAA GGCA TACAGATGCC CTTTATCTCTTGAATAAAGG GCATCTGTAT GCC G-3’(SEQ ID NO___)。
用于RNA干扰的另一潜在基因是白斑病毒Rr092基因(AF369029)。为Rr092设计的一个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAGAUUCAUCUGUUCGAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCGAACAGAUGAAUCUUCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGAAGA TTCATCTGTT CGATTCAAGAGATCGAACAG ATGAATCTTC CTGTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCA AAAAA CAGG AAGATTCATC TGTTCGATCTCTTGAATCGA ACAGATGAAT CTTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
为Rr092设计的第二个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGACAUGAUU AUGCGUGUGT T(SEQ ID NO___)和一条反义小片断干扰RNA链(5’→3’)CACACGCAUA AUCAUGUCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGACATGATTATGCG TGTGTTCAAG AGACACACGC ATAATCATGT CCTGTTTTTT GGAAA-3’(SEQID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA CAGGA CATGATTATGCGTGTGTCTC TTGAACACAC GCATAATCAT GTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
为Rr092设计的第三个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUACCAUC AAUAGAAAGT T(SEQ ID NO___)和一条反义小片断干扰RNA链(5’→3’)CUUUCUAUUG AUGGUAUCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATACCATCAATAG AAAGTTCAAG AGACTTTCTA TTGATGGTAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CCATCAATAGAAAG TCTCT TGAACTTTCT ATTGATGGTA TCC G-3’(SEQ ID NO___)。
可用RNAi调节的另一个白斑综合症病毒基因是DNAPol(AF369029)基因。为DNAPol设计的一个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAGUGGUC AUCUACGACT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GUCGUAGAUG ACCACUUCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGAAGTGGTCATCTA CGACTTCAAG AGAGTCGTAG ATGACCACTT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和一条底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAGTGGTCATCTA CGACTCTCTT GAAGTCGTAG ATGACCACTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
为DNAPol设计的第二个siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAGAACAU GAAACUGUCT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GACAGUUUCA UGUUCUUCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAAGAACATGAAAC TGTC TTCAA GAGAGACAGT TTCATGTTCT TCCTTTTTTG GAAA-3’(SEQ IDNO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAG AACATGAAACTGTCTCTCTT GAAGACAGTT TCATGTTCTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
为DNAPol设计的第三个siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAGCAUUGU CAUUUAAUAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAUUAAAUGA CAAUGCUCCT C(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGCATTGTCATTT AATA TTCAAG AGATATTAAA TGACAATGCT CCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GAGGA GCATTGTCATTTAATATCTC TTGAATATTA AATGACAATG CTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
对以下五种白斑综合症病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成核糖核酸还原酶，蛋白酶抑制因子，DNA聚合酶基因，核壳基因(VP26)和衣壳基因(VP28)。基于公开的白斑综合症病毒基因组序列，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸，GenBank登记号AF369029(vanHulten et al.，2001，Virology 2867-22)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体例如L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)或一可商业获得的质粒(例如，来自Clonetech的pSIREN-DNR或来自Ambion的pSILENCER)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)菌株HT115DE3(携带诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有白斑综合症病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。基于不同的白斑综合症病毒菌株，制造可替代的克隆如Yang和其同事所描述的(Yang et al.，2001，J.Virol.7511811-11820)。
实施例2用于表达白斑综合症病毒dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导白斑综合症病毒基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达白斑综合症病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。含有表达白斑综合症病毒基因的细胞细菌量与虾饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠。存在替代微结合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarrington K(ed)4th Intl.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸盐(Sultana etal.，2000，Int.J.Food Microbiol.6247-55；USpatent publication no.2002/0137723；PCT publication WO 03/103692)，和壳聚糖(US patentpublication no.2001/0055807)。加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠(以虾为例，磷虾粉是很好的引诱剂)。
实施例3保护虾类免受白斑综合症病毒感染的方法。
用控制饮食或含有白斑综合症病毒特异性dsRNA细菌生物量(实施例2)的饮食喂养虾类。动物受到白斑综合症病毒攻击，适应病毒感染的存活率被测量。载入对照样品和治疗样品中的白斑综合症病毒通过下面公开的实时PCR方法测量(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。使用下面公开的实时PCR方法在治疗动物和对照动物中测量五种白斑综合症病毒靶基因的mRNA表达，以确定两个处理组中的表达差异(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
实施例4构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与传染性胰坏死病毒(IPNV)基因同源的21-23个核苷酸组成。
RNAi序列由Ambion，Inc.(Austin，Texas)用其所拥有的siRNA设计公式设计。siRNA也设计用于传染性表皮与造血组织坏死症病毒的非结构基因和衣壳基因(GenBank数据库，登记号AF273215)。对以下两种传染性胰坏死病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成衣壳蛋白VP2和VP3。基于公开的传染性胰坏死病毒基因组序列，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸，GenBank登记号AF283780。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有传染性胰坏死病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。
实施例5用于表达传染性胰坏死病毒dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导传染性胰坏死病毒基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，以IPTG诱导表达传染性胰坏死病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。含有表达传染性胰坏死病毒基因的细胞细菌量与虾饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠。存在替代的微结合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarrington K(ed)4th Intl.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸盐，和壳聚糖。加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠(以鱼类为例，鱼粉是很好的引诱剂)。
实施例6保护虾类免受传染性胰坏死病毒感染的方法。
用控制饮食或含有传染性胰坏死病毒特异性dsRNA细菌生物量(实施例5)的饮食喂养虹鳟鱼。动物受到传染性胰坏死病毒攻击，适应病毒感染的存活率被测量。载入对照样品和治疗样品的传染性胰坏死病毒通过下面的实时PCR方法测量，该方法与测量虾中白斑综合症病毒的方法相似(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。通过使用实时PCR，在治疗动物和对照动物中测量两种传染性胰坏死病毒靶基因的mRNA表达，以确定两个处理组中的表达差异，依据与测量虾中细胞基因表达的方法相似的方法(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
实施例7构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)基因同源的21-23个核苷酸组成。
对以下两种传染性鲑鱼贫血病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成血凝素(HA)和糖蛋白P3。基于公开的传染性鲑鱼贫血病毒基因组序列，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸，GenBank登记号AF309075(Krossoy et al.，2001，J.Gen.Virol.821757-1765)和AJ514403(Snow et al.，2003，Virus Res.9299-105)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有传染性鲑鱼贫血病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。
实施例8用于表达传染性鲑鱼贫血病毒dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3(实施例7)在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达传染性鲑鱼贫血病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。含有表达HA和/或糖蛋白P3基因的细胞细菌量与鲑鱼饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠。存在替代的微结合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarringtonK(ed)4th Int l.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸盐，和壳聚糖。加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠(以鲑鱼为例，AQUASAVOR(RTM)是很好的引诱剂)。
实施例9保护鲑鱼类免受传染性鲑鱼贫血病毒感染的方法用控制饮食或含有传染性鲑鱼贫血病毒特异性dsRNA细菌量的饮食喂养鲑鱼类，例如鲑鱼和虹鳟鱼(实施例8)。动物受到传染性鲑鱼贫血病毒攻击，适应病毒感染的存活率被测量。通过下面的实时PCR方法测量，该方法与测量白斑综合症病毒的方法相似(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)，载入对照样品和治疗样品的传染性鲑鱼贫血病毒。使用实时PCR方法在治疗动物和对照动物中测量两种传染性鲑鱼贫血病毒靶基因的mRNA表达，以确定两个处理组中的表达差异，下面的方法与测量白斑综合症病毒使用的方法相似(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
实施例10构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与鲤鱼春季病毒血症基因同源的21-23个核苷酸组成鲤鱼春季病毒血症，其是由鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)引起的，是普通鲤鱼中存在的一种重要的病毒性疾病。在欧洲和亚洲鲤鱼饲养中，该种疾病被广泛传播(Ahne et al.，2002，Dis.Aquat.Organ.52261-272)。受鲤鱼春季病毒血症病毒感染的鲤鱼表现出肾、脾、及肝脏组织损坏，导致大出血，水盐平衡失调以及免疫应答缺陷(Ahne et al.，2002，Dis.Aquat.Organ.52261-272)。鲤鱼春季病毒血症病毒基因组含有单一线性，反义，单链RNA，其编码核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)，和依赖RNA的RNA聚合酶(L)的单一分子，并在3’→5’方向具有一段短的前导序列和尾随序列(Hoffman et al.，2002，Virus Res.8489-100)。
对上述五种鲤鱼春季病毒血症病毒基因(N，P，M，G，和L)具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成，基于公开的鲤鱼春季病毒血症病毒基因组序列，GenBank登记号AJ318079(Hoffman et al.，2002，Virus Res.8489-100)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有鲤鱼春季病毒血症病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。
实施例11用于表达鲤鱼春季病毒血症dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导鲤鱼春季病毒血症病毒基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达鲤鱼春季病毒血症病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。表达鲤鱼春季病毒血症病毒基因的细菌细胞与鲑鱼饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠，并加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠。
实施例12用于表达鲤鱼春季病毒血症dsRNA及饲料配方的真菌诱导。
制作缺失突变或者使用缺乏dsRNA酶活性的菌株。使用的真菌可选自半知菌(酵母例如酿酒酵母，粟酒裂殖酵母(Raponi et al.，2003，Nucl.AcidsRes.314481-4489)或红法夫酵母)，也可选自丝状真菌(例如，粗糙脉孢菌；Buxton et al.，1990，Biotechnol.Adv.8388-389)。已知红法夫酵母菌株以dsRNA存在，此dsRNA与病毒感染有关(Castillo et al.，1994，Curr.Genet.26364-368)。为达到本实施例的目的，使用标准分子技术剔除与公开的酵母基因组一致的dsRNA酶以构建酿酒酵母dsRNA酶缺失突变株。然后用载体例如pESC-URA(Stratagene)来转化该突变株。转化载体需要具备的主要功能是存在两个能共同表达互补的RNA的强启动子。用类似于实施例1和2所述的方法，pESC-URA载体被修改以含有两个DNA片断，该DNA片断对鲤鱼春季病毒血症dsRNA具有特异性。制成感受态的酵母，按Stratagene使用者手册中所述的标准分子生物学技术对其进行转化(Ausubel et al.，1997，InShort Protocols in Molecular Biology，3edn.John Wiley & Sons，Inc.，New York)。营养缺陷型筛选将被使用，在尿嘧啶上生长的菌株将含有载体。在半乳糖培养基中扩增酵母突变株，以驱使由pESC载体提供的两个启动子(Ga11和Ga110)插入两个序列。然后此酵母可用作对鲤鱼春季病毒血症病毒具特异性的dsRNA源。作为生物量提供的酵母可直接加入到饲料中或微囊化并混入饲料以阻止感染。
实施例13保护鲑鱼类免受鲤鱼春季病毒血症病毒感染的方法用控制饮食或含有表达代表鲤鱼春季病毒血症病毒N，P，M，G，和L基因的dsRNA的细菌(实施例11)或真菌(实施例12)的饮食喂养鲤鱼。动物受到被鲤鱼春季病毒血症病毒污染的水的攻击，因为水路传播被认为是感染鲤鱼春季病毒血症病毒的主要途径(Ahne et al.，2002，Dis.Aqua t.Organ.52261-272)。受鲤鱼春季病毒血症病毒攻击后，将动物维持在10-17℃，因为在此温度会出现高死亡率。记录适应鲤鱼春季病毒血症病毒攻击的存活率，并通过实时PCR测量载入对照样品和治疗样品的鲤鱼春季病毒血症病毒。
实施例14构建含有鱼型链球菌基因21-23个核苷酸的重组质粒鱼型链球菌是一种重要的鱼类细菌性病原体，其感染在全世界其他鱼类中的鲑鱼类，罗非鱼类，河鲶鱼，斑马鱼(Zlotkin et al.，1998，Appl.Environ.Microbiol.644065-4067；Shoemaker et al.，2001，Am.J.Vet.Res.62174-177；Neely et al.，2002，Infect.Immun.703904-3914)。除了鱼类，在北美洲和亚洲也有鱼型链球菌感染人类的报道(Weinstein et al.，1997，N.Engl.J.Med.337589-594；Lau et al.，2003，J.Clin.Microbiol.411004-1009)。在水产养殖业中，按常规使用抗生素来控制鱼型链球菌感染。考虑到在陆生和水生动物饲养业中广泛使用抗生素对动物生长的担忧，急需开发控制细菌性疾病的替代手段。为达到此目的，本发明提出了控制鱼型链球菌以及其他感染鱼类的细菌性疾病的解决办法。
对鱼型链球菌和乳酸氧化酶基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成，基于公开的鱼型链球菌序列(Gibello et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.654346-4350；Fuller et al.，2002，Infect.Immun.705730-5739)。细胞溶素与由A组链球菌产生的链球菌溶血素功能上同源，而且局部组织坏死需要细胞溶素表达(Fuller et al.，2002，Infect.Immun.705730-5739)。另一方面，乳酸氧化酶基因涉及鱼型链球菌的左旋乳酸代谢。代表细胞溶素和乳酸氧化酶基因的正义和反义寡核苷酸被退火产生双链DNA，并在转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)之前被克隆成质粒载体L4440。对携带有鱼型链球菌基因的重组克隆进行测序以确定重组克隆的身份。
实施例15表达鱼型链球菌双链RNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导鱼型链球菌基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达鱼型链球菌特异性RNA。通过变换在细菌介质中的IPTG浓度，依经验最优化表达双链RNA。表达鱼型链球菌基因的细菌细胞与鱼饮食混合，以微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠，并加入引诱剂制成对鱼类更加美味的小珠。
实施例16保护鱼类免受鱼型链球菌感染的方法用控制饮食或含有表达鱼型链球菌双链RNA的饮食喂养条纹石。条纹石 受到鱼型链球菌的攻击。然后在控制组和治疗组鱼中记录适应鱼型链球菌攻击的存活率。
实施例17
构建含有猪细小病毒(PPV)，一种猪病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对猪细小病毒的VP1衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的猪细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC001718(Bergeron et al.，1993，Virology 19786-98)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。猪细小病毒的主要抗原决定部位是在VP2衣壳基因内，选择该基因用于此设计(Kamstrup et al.，1998，Virus Res.53163-173)。正义和反义寡核苷酸被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有猪细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，按前面实施例描述的方法治疗其他动物(实施例2和3)，被用于预防猪感染猪细小病毒的治疗，。
实施例18构建含有外来纽卡斯尔疾病，一种鸡病毒性病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对外来纽卡斯尔疾病病毒衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的犬细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC002617(Sellers et al.，2000，Complete sequence for the B1 strainof Newcastle disease virus.InU.S.Department ofAgriculture/Agriculture Research Services)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体例如L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)，其含有两个启动子以产生RNA。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有犬细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，并且按前面实施例描述的方法治疗其他动物(例如见，实施例15)，被用于预防鸡感染外来纽卡斯尔疾病病毒的治疗。
实施例19构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与口蹄疫(FMD)，一种牛病毒性病原体，互补的21-23个核苷酸长组成对VP1衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的犬细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC004915(Saravanan et al.，2003，Foot-and-mouth disease virus Asia 1(FMDV-Asial)，InMolecular Virolgy，Indian Veterinary ResearchInstitute，India)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。比口蹄疫单链菌株，各种菌株的可选序列能够平行使用来，提供更广泛的预防。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamathet al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有犬细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，按前面实施例描述的方法治疗其他动物(见实施例15)，用于预防牛感染犬细小病毒的治疗。
实施例20构建含有猫白血病病毒(FLV)，一种猫病毒性病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对包膜蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的含有包膜蛋白基因的猫白血病病毒片断序列，GenBank登记号AF403716(Anderson et al.，2001，J.Virol.7510563-10572)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有猫白血病病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，使用类似于前面实施例所描述的方法治疗其他动物(实施例2和3)，被用于预防猫感染猫白血病病毒的治疗。
实施例21构建含有犬细小病毒(CPV)，一种犬科病毒性病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对VP1衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的犬细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC001539(Reedet al.，1988，J.Virol.62266-276)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。VP1的N-终点区域选择自这种设计，由于衣壳的核子传输和这种病毒的有效传染已经被显示(Vihinen-Ranta et al.，2002，J.Virol.761884-1891)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有犬细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，用于预防狗感染犬细小病毒的治疗，使用类似于前面实施例所述的方法治疗其他动物(实施例2和3)。
实施例22构建在植物中表达的含有白斑综合症病毒(WSSV)基因的21-23个核苷酸的重组质粒对以下五种白斑综合症病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成，正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，如实施例1中所述。为了用于植物系统，使用基于agrobacterium ti质粒T-DNA区域的不同质粒。存在大量这样的质粒，其适用于各种植物物种(插入参考书目)。退火双链DNA被克隆成在负链上含有两个的启动子例如，lac，trp，或PL启动子，的质粒载体，用标准方法构建质粒并扩增构建(Clark，1997，PlantMolecular Biology.Springer，Berlin)。该重组质粒被用来转化紫花苜蓿细胞(Taschner et al.，1994，Virology 203269-276；Larrick et al.，2001，Biomol.Eng.1887-94；Kelemen et al.，2002，Transgenic Res.1169-72)。对携带有白斑综合症病毒特异性基因的重组愈伤组织培养物进行测序以确定克隆的身份。使用愈伤组织重组表达白斑综合症病毒特异性RNA的基因工程植物。通过风干温和干燥植物材料，然后将其混合到饲料中，使用类似于实施例2和3中的方法，来用于预防虾类免受白斑综合症病毒感染。
实施例23使用顶部涂层配制可替代饲料生物量制作饲料的顶部涂层是使用标准饲养技术完成的，其中含有上述实施例(例如，实施例2，5，8，11，&12)所述生物量的生物量被涂到现存饲料上并喂养动物，以提供想要的活性调节。
实施例24桃拉综合症病毒siRNA设计RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)RdRp基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAGUGUCUA AUGCGGAGAT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCUCCGCAUU AGACACUCCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGT GTCTAATGCG GAGATTCAAG AGATCTCCGC ATTAGACACT CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGAGTGTCTAATG CGGAGATCTC TTGAATCTCC GCATTAGACA CTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的RdRp基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGGAAGAGCG GAAAGCAGATT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCUGCUUUCC GCUCUUCCCT T(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGGAA GAGCGGAAAGCAGATTCAAG AGATCTGCTT TCCGCTCTTCCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGGAA GAGCGGAAAG CAGATCTCTT GAATCTGCTT TCCGCTCTTC CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的RdRp基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAUUCAUU GUUGACAACTT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GUUGUCAACA AUGAAUUCCT C(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAAT TCATTGTTGA CAACTTCAAG AGAGTTGTCA ACAATGAATTCCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGGA ATTCATTGTT GACAACTCTC TTGAAGTTGT CAACAATGAA TTCCG-3’(SEQ IDNO___)。
RNA干扰用于被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)vp1基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUUGGAUG AGAUGUCUAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAGACAUCUC AUCCAAUCCT T(SEQ ID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATTGGATGAGATG TCTATTCAAG AGATAGACAT CTCATCCAAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATT GGATGAGATGTCTATCTCTT GAATAGACAT CTCATCCAAT CCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的vp1基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGUACGCUUG CUAAAGCAGT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)CUGCUUUAGC AAGCGUACCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTAC GCTTGCTAAA GCAGTTCAAG AGACTGCTTT AGCAAGCGTA CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGTACGCTTGCTA AAGCAGTCTC TTGAACTGCT TTAGCAAGCG TACCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的vp1基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义s iRNA链(5’→3’)GGAUACGAAG GUGUCUUUGT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)CAAAGACACC UUCGUAUCCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA CGAAGGTGTC TTTGTTCAAG AGACAAAGAC ACCTTCGTAT CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGATACGAAGGTG TCTTTGTCTC TTGAACAAAG ACACCTTCTT ATCCG-3’(SEQ ID NO___)。
实施例25虾黄头病毒siRNA设计RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的黄头病毒(YHV)结构糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用几个不同的方法完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGCUCGCAUA UCAUUUAUAT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAUAAAUGAU AUGCGAGCCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGCTC GCATATCATT TATATTCAAG AGATATAAAT GATATGCGAG CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGCTCGCATATCA TTTATATCTC TTGAATATAA ATGATATGCG AGCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的黄头病毒(YHV)结构糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUAUCCUC CCGCCAACATT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UGUUGGCGGG AGGAUAUCCT T(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA TCCTCCCGCC AACATTCAAG AGATGTTGGC GGGAGGATATCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGATA TCCTCCCGCC AACATCTCTT GAATGTTGGC GGGAGGATAT CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一个RNA干扰设计用于被RNA干扰调节的黄头病毒(YHV)结构糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用几个不同的方法完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGUCUUUGUU AUGAAGUAGT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)CUACUUCAUA ACAAAGACCT T(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCT TTGTTATGAA GTAGTTCAAG AGACTACTTC ATAACAAAGA CCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGTCTTTGTTATGAA GTAGTCTCTT GAACTACTTC ATAACAAAGA CCG-3’(SEQ ID NO___)。
实施例26传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)siRNA设计siRNA设计用于传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)基因orf1(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGACAUACUG CAUACACGUT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)ACGUGUAUGC AGUAUGUCCT T(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA表达载体(来自Ambion的2.0，2.1，3.0，&3.1)设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGACA TACTGCATACACGTTTCAAG AGAACGTGTA TGCAGTATGT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGACA TACTGCATAC ACGTTCTCTTGAAACGTGTA TGCAGTATGT CCG-3’(SEQ ID NO___)。
第二个RNA干扰设计用于传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf1(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGUCCAAAUC AAGACCCUAT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAGGGUCUUG AUUUGGACCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCC AAATCAAGAC CCTATTCAAG AGATAGGGTC TTGATTTGGA CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGTCCAAATCAAG ACCCTATCTC TTGAATAGGG TCTTGATTTG GACCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于为传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf1(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGACAAUAUA AAGACAAACT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GUUUGUCUUU AUAUUGUCCT C(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGACA ATATAAAGAC AAACTTCAAG AGAGTTTGTC TTTATATTGT CCTCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGACAATATAAAG ACAAACTCTC TTGAAGTTTG TCTTTATATT GTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
RNA干扰设计用于被RNA干扰调节的传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf2(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUCAAGUG GACCAGACCTT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GGUCUGGUCC ACUUGAUCCT T(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATC AAGTGGACCA GACCTTCAAG AGAGGTCTGG TCCACTTGATCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’一AGCTTTTCCAAAAAAGGATC AAGTGGACCA GACCTCTCTT GAAGGTCTGG TCCACTTGAT CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一个RNA干扰设计用于被RNA干扰调节的传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf2(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAGGCACAUCAUUUGAGAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCUCAAAUGAUGUGCCUCCT G(SEQ ID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGG CACATCATTT GAGATTCAAG AGATCTCAAATGATGTGCCT CCTGTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGA GGCACATCAT TTGAGATCTC TTGAATCTCA AATGATGTGCCTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf2(AF273215)可使用几个不同的方法完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUACUACUGGACUACAUT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)AUGUAGUCCAGUAGUAUCCT T(SEQ ID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA CTACTGGACT ACATTTCAAG AGAATGTAGTCCAGTAGTAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CTACTGGACT ACATTCTCTT GAAATGTAGT CCAGTAGTATCCG-3’(SEQ ID NO___)。
实施例27在细菌质粒载体中克隆siRNA正义和反义寡核苷酸序列被退火生成双链DNA，并被克隆成PetDirectional TOPTM表达载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，California)或Pcx-TOPO PuruProTM柄细菌质粒表达载体(Invitrogen，Inc.)或L4440质粒载体(Kamath et al.，2002)。用重组质粒分别转化大肠杆菌菌株BL21StarTM(DE3)One Shot Chemically Competent cells(Invitrogen，Inc.)或新月柄杆菌细胞或大肠杆菌HT115DE3细胞(Kamath et al.，2001)。对重组克隆进行测序以确定克隆的身份。含有病毒特异性基因的克隆在含有氨苄青霉素和IPTG的LB培养基上生长。依经验确定IPTG的浓度以获得最大程度的双链RNA表达。含有表达siRNA细胞的细菌量与虾饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以多聚形存在小珠。加入引诱剂例如磷虾粉制成对虾类更加美味的小珠。
实施例30水生和陆生动物疾病I.水生动物疾病A.原生动物i.卵圆鞭毛虫(腰鞭毛虫)(Amyloodinium ocellatum(dinoflagellate))ii.布鲁克原虫(纤毛虫)(Brooklynella hostilis(ciliate))iii.刺激隐核虫(纤毛虫)(Cryptocaryon irritans(ciliate))iv.多子小瓜虫(一种鱼型纤毛虫)(Ichthyopthirius multifilis(Ich-aciliate))v.鲤斜管虫(一种纤毛虫)(Chilodonella cyprini(a ciliate))vi.六鞭毛虫(鞭毛虫)(Hexamita(a fagellate))B.微孢子纲i.格留虫属，微孢子虫属(Glugea，Spraguea spp.)C.粘孢子i.尾孢虫属(Henneguya spp.)ii.粘体虫属(Myxobolus spp.)D.扁形动物门i.单殖目(吸虫纲)ii.复殖目(吸虫纲)iii.绦虫纲(吸虫纲)E.线虫i.cappilaria(艾美虫属)F.甲壳类i.鱼虱属(短尾亚目甲壳动物蟹)(Argulus spp.(Brachyuran))ii.鲑疮痂鱼虱(鲑鱼虱-一种绕足动物)(Lepeophtheirus salmonis(Salmon lice-a copepod))
iii.针虫属(棘头虫)(Learnea spp.(Acanthocephalan))G.孢子虫纲.
i.球虫属(Coccidia spp)H.真菌i.寄生水霉(一种卵菌)(Saprolegnia parasitica(an oomycete))ii.小□虾瘟疫(一种卵菌)(Aphanomyces astaci(an oomycete))iii.鱼孢霉菌病(类真菌制剂)(Ichthyophonus hoferi(fungus-like agent))iv.茄病镰刀菌(丝孢纲)(Fusarium solani(a hyphomycete))v.鲑鱼外瓶霉(丝孢纲)(Exophiala salmonis(a hyphomycete))II.陆生动物疾病非洲马病病毒(马科动物)(African horse sickness virus(equine))非洲猪瘟病毒(猪)(African swine fever virus(porcine))伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1)(Aujeszky′s disease virus(porcineherpesvirus 1))禽流感病毒(家禽)(Avian influenza viruses(poultry))驽巴贝斯虫和马巴贝西虫(马科动物)(Babesia caballi and B.equi(equine))炭疽杆菌(所有动物)(Bacillus anthracis(all))蓝舌病病毒(牛，绵羊，山羊，鹿)(Bluetongue virus(cattle，sheep，goats，deer))马耳他热布鲁氏菌(牛属动物)(Brucella melitensis(bovine))羊布氏杆菌(绵羊科动物)(Brucella ovis(ovine))猪布鲁菌(猪科动物)(Brucella suis(porcine))马鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽假单孢菌)(Burkholdaria(Pseudomonas)mallei equine))传统猪瘟病毒(猪科动物)(Classical swine fever virus(porcine))螺旋蝇蛆病(绵羊科动物，牛科动物)(Cochliomya hominivorax(ovines，bovines))
东西方马脑炎病毒(马科动物)(Eastern and western equine encephalomyelitisviruses(equine))多包绦虫和细粒棘球绦虫(犬科动物)(Echinococcus multilocularis and E.granulosus(canine))马传染性贫血症(马科动物)(Equine infectious anaemia virus(equine))口蹄疫病毒(绵羊科动物，牛科动物)(Foot and mouth disease virus(ovine，bovine)皮疽组织胞浆菌(许多类真菌物种)(Histoplasma farciminosum(fungus-like many species))马痘病毒(马科动物)(Horse pox virus(equine))支原体无乳症(牛科动物，绵羊科动物)(Mycoplasma agalactiae(bovine，ovine))丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides mycoides)山羊丝状支原体(公山羊)(Mycoplasma mycoides var Capri(caprine))纽卡斯尔疾病病毒(鸟类)(Newcastle disease virus(avian))小反刍兽疫病毒(Peste de petis ruminants virus)狂犬病毒和狂犬病相关病毒，如下杜文哈根病毒(Duvenhage)拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat)莫科拉病毒(Mokola)欧洲蝙蝠狂犬病毒I和II(European bat lyssaviruses I and II)里夫特裂谷热病毒(Riff Valley Fever virus)牛瘟病毒(绵羊科动物，牛科动物，公山羊)(Rinderpest virus(ovine，bovine，caprine))绵羊和山羊痘病毒(Sheep and goat pox virus)猪水泡病(Swine vesicular disease)捷申病病毒(Teschen disease virus)泰勒虫症(绵羊科动物，牛科动物)(Theileria annulata(ovine，bovine)
旋毛虫(猪科动物)一种原生动物(Trichinella spiralis(porcine)aprotozoan)马疫锥虫，伊氏锥虫&泰勒锥虫(原生动物)(Trypanosome equiperdum，T.evansi & T.theileri)委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(马科动物)(Venezuelan equineencephalomyelitis virus(equine))水泡性口炎病毒(猪科动物)(Vesicular stomatitis virus(porcine))布鲁氏菌病(Brucellosis)慢性萎缩病(Chronic Wasting Disease)马传染性贫血症(Equine Infectious anemia)马病毒性动脉炎(Equine viral artertis)约尼氏病(Johnes)狂犬病(Psedorabies)痒病(Scrapie)结核病(Tuberculosis)上述的是紊乱及紊乱引发制剂的非详细列表，可使用本文所述的方法和组合物对其进行治疗或抑制。
本文引用的每个专利，专利申请，及出版物所公开的内容被全部编入本文以供参考。
当本发明就其特定实施方案被公开时，很显然本技术领域的其他技术人员可以在不脱离本发明的基本精神和范围的条件下，设计本发明的其他实施方案及对本发明做变更。所附权利要求包括所有这样的实施方案和相对应的变更。
权利要求
1.一种饲料、饲料补充物、或治疗组合物，包括小片段干扰RNA和双链RNA，该小片段干扰RNA或双链RNA表达于生物体内，并能被加工成抑制动物病原体的小片段干扰RNA。
2.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病原体为病毒，细菌，或真菌。
3.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病毒选自白斑综合症病毒、桃拉综合症病毒、黄头病毒、和传染性皮下及造血组织坏死病毒。
4.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病毒选自猪细小病毒(PPV)、外来纽卡斯尔疾病、口蹄疫(FMD)、猫白血病病毒(FLV)、犬细小病毒。
5.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述细菌选自水产业或农业细菌性病原体。
6.根据权利要求5所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业细菌性病原体选自气单胞菌属、爱德华氏菌属、产黄菌属、屈杆菌属、分枝杆菌属、链球菌属、沙门氏菌属、弧菌属、和鲁氏耶尔森菌。
7.根据权利要求5所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业细菌性病原体选自分枝杆菌属、肠球菌属、链球菌属、沙门氏菌属、和鼠疫耶尔森氏菌。
8.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述真菌选自水产业或农业真菌性病原体。
9.根据权利要求8所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业真菌性病原体选自卵菌纲真菌，虾瘟疫真菌，和鱼孢霉菌属。
10.根据权利要求8所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业真菌性病原体选自发癣菌属、茄镰孢菌、和假丝酵母属。
11.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病原体为真核生物。
12.根据权利要求10所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述真核生物选自纤毛虫、变形虫、原生动物、微孢子纲、粘孢子、扁形动物、线虫、和孢子虫。
13.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为水生动物。
14.根据权利要求13所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水生动物为甲壳纲动物。
15.根据权利要求14所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述甲壳纲动物选自虾、丰年虫、龙虾、螃蟹、小龙虾或对虾。
16.根据权利要求13所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为鱼类。
17.根据权利要求16所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述鱼类选自鲑鱼、鳟鱼、庸鲽、大菱鲆、条纹石、河鲈、罗非鱼、鲶鱼，和鲤鱼。
18.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为陆生动物。
19.根据权利要求18所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述陆生动物选自马、狗、猫，母牛，绵羊，山羊，家禽，鸟类，水貂，猪，仓鼠，小鼠，兔，大鼠，沙鼠和豚鼠。
20.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述小片段干扰RNA或双链RNA表达于选自昆虫，细菌，真菌，噬菌体，植物，和酵母的生物体中。
21.根据权利要求20所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述生物体以完整或大部分完整细胞包含在饲料中。
22.根据权利要求20所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述生物体以破碎或大部分破碎细胞包含在饲料中。
23.根据权利要求20所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述生物体的生物量被封装。
24.根据权利要求23所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述的封装是使用选自可消化聚合物、不可消化聚合物、磷脂、壳聚糖和藻酸盐的材料完成。
25.一种保护动物免受病原体感染的方法，包括喂食所述动物饲料，其进一步包括小片段干扰RNA或双链RNA，其中所述的小片段干扰RNA或双链RNA表达于生物体内，并且所述的小片段干扰RNA或双链RNA能被加工成小片段干扰RNA，以及通过RNA干扰，负调节动物病原体的表达。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病原体为病毒、细菌、或真菌。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒选自白斑综合症病毒、桃拉综合症病毒、黄头病毒、和传染性皮下及造血组织坏死病毒。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒选自猪细小病毒(PPV)、外来纽卡斯尔病、口蹄疫(FMD)、猫白血病病毒(FLV)、犬细小病毒。
29.根据权利要求26所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述细菌选自水产业或农业细菌性病原体。
30.根据权利要求29所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业细菌性病原体选自气单胞菌属、爱德华氏菌属、产黄菌属、屈杆菌属、分枝杆菌属、链球菌属、沙门氏菌属、弧菌属、和鲁氏耶尔森菌。
31.根据权利要求29所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业细菌性病原体选自分枝杆菌属、肠球菌属、链球菌属、沙门氏菌属、和鼠疫耶尔森氏菌。
32.根据权利要求26所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述真菌选自水产业或农业真菌性病原菌。
33.根据权利要求32所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业真菌性病原体选自卵菌纲真菌、虾瘟疫真菌、和鱼孢霉菌属。
34.根据权利要求32所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业真菌性病原体选自发癣菌属、茄镰孢菌、和假丝酵母菌属。
35.根据权利要求25所述的方法，其中所述病原体为真核生物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述真核生物选自纤毛虫、变形虫、原生动物、微孢子纲、粘孢子、扁形动物、线虫、和孢子虫。
37.根据权利要求25所述的方法，其中所述动物为水生动物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述水生动物为甲壳纲动物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述甲壳纲动物选自虾、丰年虫、龙虾、螃蟹、小龙虾、对虾。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述水生动物为鱼类。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述鱼类选自鲑鱼、鳟鱼、庸鲽、大菱鲆、条纹石、河鲈、罗非鱼、鲶鱼、和鲤鱼。
42.根据权利要求25所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为陆生动物。
43.根据权利要求42所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述陆生动物选自马、狗、猫、母牛、绵羊、山羊、家禽、鸟类、水貂、猪、仓鼠、小鼠、兔、大鼠、沙鼠或豚鼠。
44.根据权利要求25所述的方法，其中所述的小片段干扰RNA或双链RNA表达在选自昆虫、细菌、真菌、噬菌体、植物、和酵母的生物体中。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物体以完整或大部分完整细胞包含在饲料中。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物体以破碎或大部分破碎细胞包含在饲料中。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物体的生物量被封装。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述的封装是使用选自可消化聚合物、不可消化聚合物、磷脂、壳聚糖和藻酸盐的材料完成。
49.根据权利要求25所述的方法，其中饲料补充有含有21-23个核苷酸长的重组细菌细胞，其选择性分解与疾病引起的成分同源的mRNA来减少或减轻疾病状态。
全文摘要
本发明涉及使用RNA干扰技术来抑制动物病原体的组合物(例如，饲料、饲料补充物和治疗产品)和方法。
文档编号A61K48/00GK1946733SQ200580007978
公开日2007年4月11日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月6日
发明者大卫·J·凯尔, 阿伦·K·达尔 申请人:高级生物营养公司
技术领域：
本发明通常涉及农业和水产业种群中的疾病预防领域。
背景技术：
农业和水产业中的疾病预防主要目标是将动物健康和养殖动物的商业生存力最大化。药物和疫苗在该成果中居一席之地，但是为了使动物不适最小化以及使其生长收益最大化，需要更低花费和具更低侵害性的方法来治疗或预防特定疾病症候群。
一个实施例为虾水产养殖。在过去的几十年，虾(对虾)养殖已经从维持生计水平的养殖发展为能向全球数百万人口直接或间接提供工作的主要工业。在虾养殖业发展的同时，其也被许多挑战所平衡。其中，病毒病是虾农主要关心的问题。在过去的几年，象由白斑综合症病毒(WSSV)引起的白斑病这样的疾病，已经在亚洲，中南美洲的虾养殖区域引发了严重的动物流行病并导致巨大损失(Krishna et al.，1997，World Aquaculture 1214-19；Joryet al.，1999，Aquacult.Mag.2583-91)。白斑综合症病毒含有约300kb长的环形双链DNA基因组，能感染对所有商业上重要的对虾类的种类和许多其他的甲壳类动物包括螃蟹和小龙虾(Flegel，1997，World J.Micro.Biotech.13433-442；van Hulten et al.，2001，Virology 2867-22；Yanget al.，2001，J.Virol.7511811-11820)。自从1992年到1993年期间东亚有了白斑综合症病毒首次记载以来(Inouye et al.，1994，Fish Pathol.9149-158)，许多白斑综合症病毒编码基因例如衣壳基因(van Hulten et al.，2000，J.Gen.Virol.812525-2529；van Hulten et al.，2000，Virology266227-236；Zhang et al.，2001，Virus Res.79137-144；Chen et al.，2002，Virology 29344-53；Marks et al.，2003，J.Gen.Virol.841517-1523)；核糖核酸还原酶基因(Tsai et al.，2000，Virology27792-99)；和胸苷激酶(Tsai et al.，2000b，Vi rology 277100-110)已经被详细研究。另外，也开发了基于实时PCR的高敏感性检测方法来检测并定量白斑综合症病毒(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。然而，开发白斑病治疗的成果是非常有限的。不过在近期，据报道以10g/kg的水平加入β-1，3-葡聚糖作为虾饮食添加剂持续20天，能提高虾的免疫力及感染白斑综合症病毒后的存活能力(Chang et al.，2003，Fish Shellfish Immunol.15297-310)。使用噬菌体表面展示技术，Yi etal(2003，J.Gen.Virol.842545-255)已经确定了一种对白斑综合症病毒具有高度特异性的10-mer的小肽(2E6)，并在小龙虾中阻断白斑综合症病毒感染。注射重组白斑综合症病毒衣壳蛋白(VP26和VP28)被证明能促进虾抗病性(P.japonicus；Namikoshia et al.，2004，Aquaculture 22925-35)。
与其他甲壳类动物相似，虾不具有获得性免疫。相反他们依靠先天免疫反应。虽然无脊椎动物中细菌和真菌免疫所涉及的许多免疫基因已经被详细描述，但是至今虾或任何其他无脊椎动物中病毒发病机理所涉及的免疫基因没几个是已知的。因此，急需分离及描述虾免疫基因并且急需开发抗击虾病毒病的疗法。
近年来，一种被称为RNA干扰(RNAi)的现象已被用于敲除靶基因的表达(细胞基因和病毒基因都可作为靶基因；Xia et al.，2002，Nat.Biotechnol.201006-1010；McCown et al.，2003，Virology 313514-524；Wilson et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002783-2788)，而不引起细胞内基因表达的全部变化。RNA干扰是一种现象，其中双链RNA(dsRNA)通过增强互补目的mRNA的特异性降解来抑制靶基因的表达(Hannon，2002，Nature418244-251)。RNA干扰机制包括酶RNA酶III识别dsRNA并将其切割成21-23核苷酸长的小片段干扰RNA(siRNA)。然后该siRNA结合成RNAi寻靶复合物，被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，并切割与siRNA同源的目的mRNA。这导致目标mRNA快速降解并使蛋白质合成减少(Hannon，2002，Nature418244-251)。最近已证明RNA介导的干扰可通过摄入华丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)dsRNA获得(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。
该发明的目的在于利用RNAi现象开发控制虾，水产养殖，及陆生物种中病毒性和细菌性疾病的疗法。双链RNA通过饮食口服喂食动物，并可测量其在预防疾病中的功效。已开发出控制虾白斑综合症疾病的方法。五种白斑综合症病毒基因被用作靶基因包括编码白斑综合症病毒早期表达的基因(核糖核酸还原酶)，蛋白酶抑制因子，DNA聚合酶基因，核壳基因(VP26)和衣壳基因(VP28)。代表上述基因的21-23核苷酸长的白斑综合症病毒DNA是化学合成的，并被克隆成给食载体(L4440)。用重组质粒转化大肠杆菌菌株(Escherichia coli)HT115DE3(携带有T7聚合酶的IPTG诱导表达，并缺失双链特异性核糖核苷酸III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。携带白斑综合症病毒特异性基因的重组克隆被测序以证实身份。完整细菌细胞或破碎细胞与饮食混合并喂食虾类。虾受到活体传染性白斑综合症病毒口服攻击，并记录死亡率。可使用实时PCR在治疗和对照动物中测量五种白斑综合症病毒靶基因的mRNA表达(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396；Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)，以确定两个处理组中的表达差异。
重大疾病攻击也存在于其他水产养殖物种以及陆生动物中。在母牛，绵羊，和山羊中慢速生长的生物体例如分枝杆菌对牧群造成广泛伤害和破坏。约尼氏病(由副结核分枝杆菌Mycobacterium paratuberculosis johnii引起的)是一典型疾病实例。其他可用此方法治疗的慢速生长细菌是支原体。牛疾病例如新包虫病(Neospora caninum)，普鲁氏菌病，结核病，牛白血性增生，和腹泻可用该发明控制。由原生动物例如隐孢子虫(Cryptosporidia)和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia)引起的动物原生动物疾病能被处理。病毒病例如牛腹泻和冠状病毒也可被处理。鸡饲养业中的长期问题是存在沙门氏菌(salmonellidae)。另外存在许多能造成大范围损害的病毒病，例如鸡传染性支气管炎，外来纽卡斯尔病，禽流感(造成数百万禽类毁灭)。
与细菌系统相对，存在其他替代系统能为在该系统中产生任何RNAi产物提供成本利益。该系统可以是藻类(例如，蓝绿藻Synechocystis或小球藻Chlorella)，真菌(例如，黑曲霉Aspergillus niger，链孢霉Neurosporacrassa)，植物(例如，烟草，紫花苜蓿，马铃薯，拟南芥Arabidopsis))，和昆虫(例如，粉纹夜蛾T.ni和草地夜蛾Spodoptera frugiperda)。至少为了达到该发明的目的，在细菌系统中生产dsRNA结构所需的分子手段很可能适合于上述其他生物体，并能为生产与饲料结合的生物量提供生产成本利益。为了该发明的目的，焦点集中于植物系统。然而，在其他系统中表达手段被充分开发，正如以下参考文献所证明的，该参考文献包含于本文内作为在真菌系统中表达手段的参考(el-Enshasy et al.，2001，Appl.Biochem.Biotechnol.9057-66；Wiebe et al.，2001，Biotechnol.Bioeng.76164-174；Liu et al.，2003，Lett.Appl.Microbiol.36358-361)，藻类(Mayfield et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872087-2091；US Patent no.5,270,175；US Patent no.5,977,437；PCT publication WO00/73455；Toyomizu et al.，2001，J.Appl.Phycol.13209-214；US patentpublication no.2002/0164706；US Patent no.6,379,968；Shapira et al.，2002，Plant Physiol.1297-12；Ton et al.，2002，FASEB J.16A542；Mayfield et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100438-442)，酵母(Guthrie et al.，1991，In；Abelson J，Simon M(eds.)Methods Enzymol.Academic Press，San Diego，CA；Mason et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911745-11749；Wery et al.，1997，Gene 18489-97；Martinezet al.，1998，Antonie Van Leeuwenhoek 73147-153；Cereghino et al.，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10422-427；Fischer et al.，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.30(Pt2)117-120；Cereghino et al.，2000，FEMS Microbiol.Rev.2445-66；Cregg et al.，2000，Mol.Biotechnol.1623-52)，和昆虫(Schmal john et al.，1990，J.Virol.643162-3170；Saliki et al.，1992，J.Gen.Virol.73369-374；Jarvis et al.，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9528-533；Altmann et al.，1999，Glycoconj.J.16109-123；Cha et al.，1999，Biotechnol.Bioeng.65316-324)。在植物系统中充分开发了使用植物病毒作为传递遗传物质的载体。烟草花叶病毒(TMV)和紫花苜蓿花叶病毒(AMV)是上述系统中的两种病毒，烟草花叶病毒被更广泛利用。利用基于来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA区域的Ti质粒在不同植物中，例如，番茄，马铃薯，羽扁豆，和莴苣(Kapusta et al.，1999，FASEB J.131796-1799；Walmsley et al.，2000，Curr.Opin.Biotechnol.11126-129；Khandelwal et al.，2003，Plant Sci.16577-84)，表达同源DNA。
发明内容
本发明的目的是产生21-23个核苷酸长的小片断干扰RNA(siRNA)，其对动物病原体例如细菌，真菌，藻类，或酵母具有特异性。RNA可作为siRNA或双链RNA(dsRNA)被递送，然后将其加工成siRNA。siRNA或祖先dsRNA在细胞中产生，以完整细胞或破碎细胞配入食物并递送给动物。这些食物将会被喂给动物以实现口服治疗剂siRNA的传递，该治疗剂siRNA对目标病原体具有特异性以改善疾病或疾病症状。
与目标RNA互补的长达约1000个碱基的较长核苷酸序列可在细菌细胞中产生，以完整细胞或破碎细胞与食物混合并被递送。
本发明的目的是通过充分利用RNA干扰现象特异性降解由互补的目的mRNA编码的病原体以保护动物免受病原体感染。
具体实施例方式
本发明的目的可由以下实施方案描述。
在本发明的一个实施方案中，产生siRNA，其对水产业病原体具有特异性。
在进一步的实施方案中，产生的siRNA对病毒性水产业病原体具有特异性。
在进一步的实施方案中，产生的siRNA对虾病毒性病原体具有特异性。
在进一步的实施方案中，产生的siRNA对白斑综合症病毒，黄头病毒，桃拉综合症病毒，和传染性表皮与造血组织坏死症病毒具有特异性。
在另一实施方案中，siRNA对鱼病毒性病原体具有特异性。
在另一实施方案中，siRNA对传染性鲑鱼贫血病毒，传染性胰坏死病，鲤鱼春季病毒血症，草鱼呼肠孤病毒，河鲶病毒，河鲶疱疹病毒，海洋双RNA病毒，马拉石斑神经坏死病毒，龙胆石斑神经坏死病毒，条纹石、胡瓜鱼、大西洋鲑和大菱鲆轮状病毒，虹鳟鱼病毒性出血性败血症病毒，虹鳟鱼棒状病毒，虹鳟鱼传染性造血组织坏死病毒和发自睡病病毒有特异性。
本发明的目的在于提供保护动物免受病毒感染的方法，包括在细菌或酵母宿主中产生病毒性病原体特异性RNA，加工含有生物量的该特异性RNA于不再进一步纯化的饲料或饲料补充物中，用所述饲料供给动物以递送足够量的病毒病原体特异性RNA，以抑制病毒对生物体造成致病反应。
在本发明一实施方案中，提供了保护动物免受病毒感染的方法。该方法包括以下步骤在细菌宿主中生产白斑综合症病毒(WSSV)特异性RNA，加工含有用作生产白斑综合症病毒特异性RNA的细菌的生物量于不再进一步纯化的饲料或饲料补充物中，然后用所述饲料供给动物，以递送足够数量的含有白斑综合症病毒特异性RNA的细菌，以阻止病毒对虾造成的反应。本发明对象白斑病这样的病毒性疾病提供了快速保护。该方法也可应用于其他类型的虾类疾病中，其由其他病毒、细菌、真菌引起的，以及应用于遭受真菌、细菌和病毒疾病的包括鱼、软体动物的其他水产养殖物种疾病中。在水生无脊椎动物物种中，例如虾，具有“先天免疫系统”，本发明提供了通过递送制备的RNAi分子治疗急性和慢性疾病的方法。
在本发明一实施方案中，提供了保护动物免受细菌感染的方法。该方法包括以下步骤在细菌宿主中生产细菌性病原体特异性RNA，加工含有用作生产细菌性病原体特异性RNA的细菌的生物量于不再进一步纯化的饲料或饲料补充物中，用所加工的生物量供给动物，以占总饲料1％的量递送含有细菌性病原体特异性RNA的细菌。
在水生脊椎动物物种中，例如鱼类，具有进化良好的免疫系统，本发明提供了一种首选反应法来延迟急性感染迹象的发作和消除慢性感染。
在本发明的进一步实施方案中，其他类型的表达系统，例如，酵母，藻类，和真菌也被用来生产病原体特异性RNA。用以保护动物的方法与上述描述的实施方案类似。
定义为了全面理解本发明，提供以下定义以明确该技术领域的术语，如果不在本文中做适当的定义，这些术语可有不同的理解或者成为激烈研究的主题，这也许会改变本发明的范围。对于本发明，以下术语以本文所给出的定义使用。
“基因沉默”是一新的基因调节机制，其通过抑制转录(称为转录基因沉默)或通过激活序列特异性RNA降解过程(转录后基因沉默)限制转录水平。
“RNA干扰”或“RNAi”是基因沉默机制，其通过序列特异性RNA降解过程限制转录水平。
“小片断干扰RNA”或“siRNA”是少于1000个碱基的双链RNA。
“反义RNA”是单链RNA或RNA的非编码链，其作为合成mRNA的模板。
“正义RNA”作为生成蛋白质的模板或是与用作蛋白质合成模板的mRNA相同的序列。
实施例目前所述的本发明以以下实施例为参考。提供这些实施例仅作举例说明的目的，本发明并不局限于这些实施例，而是包括明显作为本文所教导结果的所有改变。
实施例1构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与白斑综合症病毒(WSSV)基因同源的21-23个核苷酸组成。
RNAi序列由Ambion，Inc.(Austin，Texas)用其所拥有的siRNA设计公式设计。RNAi序列是设计用于白斑综合症病毒的五个基因，该五个基因包括编码核壳蛋白VP26、衣壳蛋白VP28、核苷酸还原酶、DNA聚合酶酶、和含有Kunitz蛋白酶抑制因子特征域的蛋白的基因。所有五种白斑综合症病毒的siRNA都是基于白斑综合症病毒基因组序列设计的，该基因组序列可在GenBank数据库获得，登记号AF369029。此外，siRNA也是设计用于感染性表皮与造血阻止坏死症病毒的非结构基因和衣壳基因(GenBank数据库获得，登记号AF273215)；黄头病毒的糖蛋白基因(GenBank数据库获得，登记号AF540644)；桃拉综合症病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶和衣壳蛋白基因，VP1(GenBank数据库获得，登记号AF277675)。
设计用于白斑综合症病毒基因VP28(AF369029)的siRNA能够使用几种不同方法完成。如Ambion所设计的，siRNA的一个设计是基于正义siRNA链(5’→3’)GGUUGGAUCA GGCUACUUCT T(SEQ ID NO___)和反义siRNA链(5’→3’)GAAGUAGCCU GAUCCAACCT C(SEQ ID NO___)的。为使用pSilencerTMsiRNA表达载体(来自Ambion的2.0，2.1，3.0，&3.1)而设计的模板是顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTTG GATCAGGCTA CTTCTTCAAG AGAGAAGTAG CCTGATCCAACCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGGT TGGATCAGGC TACTTCTCTC TTGAAGAAGT AGCCTGATCC AACCG-3’(SEQID NO___)。
第二个VP28 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGCUACUUCAAGAUGACUGT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)CAGUCAUCUUGAAGUAGCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencer载体，顶链寡核苷酸模板为5’-GATCCGGCTA CTTCAAGATG ACTGTTCAAG AGACAGTCA TCTTGAAGTA GCCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)而底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGCTACTTCAAGA TGACTGTCT CTTGAACAGT CATCTTGAAG TAGCC G-3’(SEQ ID NO___)。
第三个可能的VP28 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGUGUGGAACAACACAUCAT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UGAUGUGUUGUUCCACACCT T(SEQ ID NO___)。这需要为pSilencerTMsiRNA表达载体设计模板，其具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTGT GGAACAACACATCATTCAAG AGA TGATGT GTTGTTCCAC ACCTTTTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGTGT GGAACAACACATCATCTCTT GAA TGATGT GTTGTTCCAC ACC G-3’(SEQ ID NO___)。
设计用于白斑综合症病毒基因VP26(AF369029)的siRNA能够使用几种不同方法完成。如Ambion所设计的，siRNA的一个设计是基于正义siRNA链(5’→3’)GGGCAAAGGU AAUGUCAAUT T(SEQ ID NO___)和反义siRNA链(5’→3’)AUUGACAUUA CCUUUGCCCT T(SEQ ID NO___)的。为pSilencerTMsiRNA表达载体(2.0，2.1，3.0，&3.1)而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGGCA AAGGTAATGT CAATTTCAA GAGAATTGAC ATTACCTTTG CCCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GGGCAAAGGTAATG TCAATTCTCT TGAAATTGAC ATTACCTTTG CCC G-3’(SEQ ID NO___)。
第二个可能的VP26 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGUCCUACAAUACUCCUCUT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)AGAGGAGUAUUGUAGGACC TC(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体(2.0，2.1，3.0，&3.1)而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCC TACAATACTCCTCTTTCAAG AGAAGAGGA GTATTGTAGG ACCTCTTTTT TGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGT CCTACAATAC TCCTCTTCTCTTGAAAGAGG AGTATTGTAG GACC G-3’(SEQ ID NO___)。
第三个可能的VP26 siRNA设计具有一正义siRNA链(5’→3’)GGAAACAUUAAGGGAAAUAT I(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UAUUUCCCUUAAUGUUUCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMisRNA表达载体设计模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGAAAC ATTAAGGGAA ATATTCAAGAGATATTTCCC TTAATGTTTC CTG TTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GAAA CATTAAGGGA AATATCTCTTGAATATTTCC CTTAATGTTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
另一个白斑综合症病毒基因ProIn(AF369029)有一siRNA设计，其具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGGAAGAAUU CUACAAGAAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UUCUUGUAGA AUUCUUCCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGGAA GAATTCTACA AGAATTCAAG AGATTCTTGT AGAATTCTTCC CTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCAAAAAACAGGG AAGAATTCTA CAAGAATCTC TTGAATTCTT GTAGAATTCT TCCC G-3’(SEQID NO___)。
为ProIn设计的第二个siRNA具有一正义siRNA链(5’→3’)GGGACCCUUUCAUGAAACAT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UGUUUCAUGAAAGGGUCCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGGAC CCTTTCATGA AACATTCAAG AGATGTTTCATGAAAGGGTC CC TTTTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GGGAC CCTTTCATGA AACATCTCTT GAATGTTTC ATGAAAGGGTCCC G-3’(SEQ ID NO___)。
为ProIn设计的第三个siRNA具有一正义siRNA链(5’→3’)GGCAUACAGAUGCCCUUUAT T(SEQ ID NO___)和一反义siRNA链(5’→3’)UAAAGGGCAUCUGUAUGCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGCAT ACAGATGCCC TTTATTCAAGAGATAAAGGG CATCTGTATG CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCC AAAAAA GGCA TACAGATGCC CTTTATCTCTTGAATAAAGG GCATCTGTAT GCC G-3’(SEQ ID NO___)。
用于RNA干扰的另一潜在基因是白斑病毒Rr092基因(AF369029)。为Rr092设计的一个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAGAUUCAUCUGUUCGAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCGAACAGAUGAAUCUUCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGAAGA TTCATCTGTT CGATTCAAGAGATCGAACAG ATGAATCTTC CTGTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCA AAAAA CAGG AAGATTCATC TGTTCGATCTCTTGAATCGA ACAGATGAAT CTTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
为Rr092设计的第二个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGACAUGAUU AUGCGUGUGT T(SEQ ID NO___)和一条反义小片断干扰RNA链(5’→3’)CACACGCAUA AUCAUGUCCT G(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGACATGATTATGCG TGTGTTCAAG AGACACACGC ATAATCATGT CCTGTTTTTT GGAAA-3’(SEQID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA CAGGA CATGATTATGCGTGTGTCTC TTGAACACAC GCATAATCAT GTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
为Rr092设计的第三个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUACCAUC AAUAGAAAGT T(SEQ ID NO___)和一条反义小片断干扰RNA链(5’→3’)CUUUCUAUUG AUGGUAUCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATACCATCAATAG AAAGTTCAAG AGACTTTCTA TTGATGGTAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CCATCAATAGAAAG TCTCT TGAACTTTCT ATTGATGGTA TCC G-3’(SEQ ID NO___)。
可用RNAi调节的另一个白斑综合症病毒基因是DNAPol(AF369029)基因。为DNAPol设计的一个可能的siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAGUGGUC AUCUACGACT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GUCGUAGAUG ACCACUUCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGAAGTGGTCATCTA CGACTTCAAG AGAGTCGTAG ATGACCACTT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和一条底链寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAGTGGTCATCTA CGACTCTCTT GAAGTCGTAG ATGACCACTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
为DNAPol设计的第二个siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAGAACAU GAAACUGUCT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GACAGUUUCA UGUUCUUCCT T(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAAGAACATGAAAC TGTC TTCAA GAGAGACAGT TTCATGTTCT TCCTTTTTTG GAAA-3’(SEQ IDNO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAG AACATGAAACTGTCTCTCTT GAAGACAGTT TCATGTTCTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
为DNAPol设计的第三个siRNA具有一条正义siRNA链(5’→3’)GGAGCAUUGU CAUUUAAUAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAUUAAAUGA CAAUGCUCCT C(SEQ ID NO___)。为pSilencerTMsiRNA表达载体而设计的模板具有一条顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGCATTGTCATTT AATA TTCAAG AGATATTAAA TGACAATGCT CCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQID NO___)和一条底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GAGGA GCATTGTCATTTAATATCTC TTGAATATTA AATGACAATG CTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
对以下五种白斑综合症病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成核糖核酸还原酶，蛋白酶抑制因子，DNA聚合酶基因，核壳基因(VP26)和衣壳基因(VP28)。基于公开的白斑综合症病毒基因组序列，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸，GenBank登记号AF369029(vanHulten et al.，2001，Virology 2867-22)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体例如L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)或一可商业获得的质粒(例如，来自Clonetech的pSIREN-DNR或来自Ambion的pSILENCER)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)菌株HT115DE3(携带诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有白斑综合症病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。基于不同的白斑综合症病毒菌株，制造可替代的克隆如Yang和其同事所描述的(Yang et al.，2001，J.Virol.7511811-11820)。
实施例2用于表达白斑综合症病毒dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导白斑综合症病毒基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达白斑综合症病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。含有表达白斑综合症病毒基因的细胞细菌量与虾饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠。存在替代微结合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarrington K(ed)4th Intl.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸盐(Sultana etal.，2000，Int.J.Food Microbiol.6247-55；USpatent publication no.2002/0137723；PCT publication WO 03/103692)，和壳聚糖(US patentpublication no.2001/0055807)。加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠(以虾为例，磷虾粉是很好的引诱剂)。
实施例3保护虾类免受白斑综合症病毒感染的方法。
用控制饮食或含有白斑综合症病毒特异性dsRNA细菌生物量(实施例2)的饮食喂养虾类。动物受到白斑综合症病毒攻击，适应病毒感染的存活率被测量。载入对照样品和治疗样品中的白斑综合症病毒通过下面公开的实时PCR方法测量(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。使用下面公开的实时PCR方法在治疗动物和对照动物中测量五种白斑综合症病毒靶基因的mRNA表达，以确定两个处理组中的表达差异(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
实施例4构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与传染性胰坏死病毒(IPNV)基因同源的21-23个核苷酸组成。
RNAi序列由Ambion，Inc.(Austin，Texas)用其所拥有的siRNA设计公式设计。siRNA也设计用于传染性表皮与造血组织坏死症病毒的非结构基因和衣壳基因(GenBank数据库，登记号AF273215)。对以下两种传染性胰坏死病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成衣壳蛋白VP2和VP3。基于公开的传染性胰坏死病毒基因组序列，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸，GenBank登记号AF283780。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有传染性胰坏死病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。
实施例5用于表达传染性胰坏死病毒dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导传染性胰坏死病毒基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，以IPTG诱导表达传染性胰坏死病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。含有表达传染性胰坏死病毒基因的细胞细菌量与虾饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠。存在替代的微结合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarrington K(ed)4th Intl.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸盐，和壳聚糖。加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠(以鱼类为例，鱼粉是很好的引诱剂)。
实施例6保护虾类免受传染性胰坏死病毒感染的方法。
用控制饮食或含有传染性胰坏死病毒特异性dsRNA细菌生物量(实施例5)的饮食喂养虹鳟鱼。动物受到传染性胰坏死病毒攻击，适应病毒感染的存活率被测量。载入对照样品和治疗样品的传染性胰坏死病毒通过下面的实时PCR方法测量，该方法与测量虾中白斑综合症病毒的方法相似(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。通过使用实时PCR，在治疗动物和对照动物中测量两种传染性胰坏死病毒靶基因的mRNA表达，以确定两个处理组中的表达差异，依据与测量虾中细胞基因表达的方法相似的方法(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
实施例7构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)基因同源的21-23个核苷酸组成。
对以下两种传染性鲑鱼贫血病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成血凝素(HA)和糖蛋白P3。基于公开的传染性鲑鱼贫血病毒基因组序列，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸，GenBank登记号AF309075(Krossoy et al.，2001，J.Gen.Virol.821757-1765)和AJ514403(Snow et al.，2003，Virus Res.9299-105)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有传染性鲑鱼贫血病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。
实施例8用于表达传染性鲑鱼贫血病毒dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3(实施例7)在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达传染性鲑鱼贫血病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。含有表达HA和/或糖蛋白P3基因的细胞细菌量与鲑鱼饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠。存在替代的微结合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarringtonK(ed)4th Int l.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸盐，和壳聚糖。加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠(以鲑鱼为例，AQUASAVOR(RTM)是很好的引诱剂)。
实施例9保护鲑鱼类免受传染性鲑鱼贫血病毒感染的方法用控制饮食或含有传染性鲑鱼贫血病毒特异性dsRNA细菌量的饮食喂养鲑鱼类，例如鲑鱼和虹鳟鱼(实施例8)。动物受到传染性鲑鱼贫血病毒攻击，适应病毒感染的存活率被测量。通过下面的实时PCR方法测量，该方法与测量白斑综合症病毒的方法相似(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)，载入对照样品和治疗样品的传染性鲑鱼贫血病毒。使用实时PCR方法在治疗动物和对照动物中测量两种传染性鲑鱼贫血病毒靶基因的mRNA表达，以确定两个处理组中的表达差异，下面的方法与测量白斑综合症病毒使用的方法相似(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
实施例10构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与鲤鱼春季病毒血症基因同源的21-23个核苷酸组成鲤鱼春季病毒血症，其是由鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)引起的，是普通鲤鱼中存在的一种重要的病毒性疾病。在欧洲和亚洲鲤鱼饲养中，该种疾病被广泛传播(Ahne et al.，2002，Dis.Aquat.Organ.52261-272)。受鲤鱼春季病毒血症病毒感染的鲤鱼表现出肾、脾、及肝脏组织损坏，导致大出血，水盐平衡失调以及免疫应答缺陷(Ahne et al.，2002，Dis.Aquat.Organ.52261-272)。鲤鱼春季病毒血症病毒基因组含有单一线性，反义，单链RNA，其编码核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)，和依赖RNA的RNA聚合酶(L)的单一分子，并在3’→5’方向具有一段短的前导序列和尾随序列(Hoffman et al.，2002，Virus Res.8489-100)。
对上述五种鲤鱼春季病毒血症病毒基因(N，P，M，G，和L)具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成，基于公开的鲤鱼春季病毒血症病毒基因组序列，GenBank登记号AJ318079(Hoffman et al.，2002，Virus Res.8489-100)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有鲤鱼春季病毒血症病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。
实施例11用于表达鲤鱼春季病毒血症dsRNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导鲤鱼春季病毒血症病毒基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达鲤鱼春季病毒血症病毒特异性RNA。依经验使IPTG诱导最优化，以获得最大程度上的dsRNA表达诱导。表达鲤鱼春季病毒血症病毒基因的细菌细胞与鲑鱼饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠，并加入引诱剂制成对目的物种更加美味的小珠。
实施例12用于表达鲤鱼春季病毒血症dsRNA及饲料配方的真菌诱导。
制作缺失突变或者使用缺乏dsRNA酶活性的菌株。使用的真菌可选自半知菌(酵母例如酿酒酵母，粟酒裂殖酵母(Raponi et al.，2003，Nucl.AcidsRes.314481-4489)或红法夫酵母)，也可选自丝状真菌(例如，粗糙脉孢菌；Buxton et al.，1990，Biotechnol.Adv.8388-389)。已知红法夫酵母菌株以dsRNA存在，此dsRNA与病毒感染有关(Castillo et al.，1994，Curr.Genet.26364-368)。为达到本实施例的目的，使用标准分子技术剔除与公开的酵母基因组一致的dsRNA酶以构建酿酒酵母dsRNA酶缺失突变株。然后用载体例如pESC-URA(Stratagene)来转化该突变株。转化载体需要具备的主要功能是存在两个能共同表达互补的RNA的强启动子。用类似于实施例1和2所述的方法，pESC-URA载体被修改以含有两个DNA片断，该DNA片断对鲤鱼春季病毒血症dsRNA具有特异性。制成感受态的酵母，按Stratagene使用者手册中所述的标准分子生物学技术对其进行转化(Ausubel et al.，1997，InShort Protocols in Molecular Biology，3edn.John Wiley & Sons，Inc.，New York)。营养缺陷型筛选将被使用，在尿嘧啶上生长的菌株将含有载体。在半乳糖培养基中扩增酵母突变株，以驱使由pESC载体提供的两个启动子(Ga11和Ga110)插入两个序列。然后此酵母可用作对鲤鱼春季病毒血症病毒具特异性的dsRNA源。作为生物量提供的酵母可直接加入到饲料中或微囊化并混入饲料以阻止感染。
实施例13保护鲑鱼类免受鲤鱼春季病毒血症病毒感染的方法用控制饮食或含有表达代表鲤鱼春季病毒血症病毒N，P，M，G，和L基因的dsRNA的细菌(实施例11)或真菌(实施例12)的饮食喂养鲤鱼。动物受到被鲤鱼春季病毒血症病毒污染的水的攻击，因为水路传播被认为是感染鲤鱼春季病毒血症病毒的主要途径(Ahne et al.，2002，Dis.Aqua t.Organ.52261-272)。受鲤鱼春季病毒血症病毒攻击后，将动物维持在10-17℃，因为在此温度会出现高死亡率。记录适应鲤鱼春季病毒血症病毒攻击的存活率，并通过实时PCR测量载入对照样品和治疗样品的鲤鱼春季病毒血症病毒。
实施例14构建含有鱼型链球菌基因21-23个核苷酸的重组质粒鱼型链球菌是一种重要的鱼类细菌性病原体，其感染在全世界其他鱼类中的鲑鱼类，罗非鱼类，河鲶鱼，斑马鱼(Zlotkin et al.，1998，Appl.Environ.Microbiol.644065-4067；Shoemaker et al.，2001，Am.J.Vet.Res.62174-177；Neely et al.，2002，Infect.Immun.703904-3914)。除了鱼类，在北美洲和亚洲也有鱼型链球菌感染人类的报道(Weinstein et al.，1997，N.Engl.J.Med.337589-594；Lau et al.，2003，J.Clin.Microbiol.411004-1009)。在水产养殖业中，按常规使用抗生素来控制鱼型链球菌感染。考虑到在陆生和水生动物饲养业中广泛使用抗生素对动物生长的担忧，急需开发控制细菌性疾病的替代手段。为达到此目的，本发明提出了控制鱼型链球菌以及其他感染鱼类的细菌性疾病的解决办法。
对鱼型链球菌和乳酸氧化酶基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成，基于公开的鱼型链球菌序列(Gibello et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.654346-4350；Fuller et al.，2002，Infect.Immun.705730-5739)。细胞溶素与由A组链球菌产生的链球菌溶血素功能上同源，而且局部组织坏死需要细胞溶素表达(Fuller et al.，2002，Infect.Immun.705730-5739)。另一方面，乳酸氧化酶基因涉及鱼型链球菌的左旋乳酸代谢。代表细胞溶素和乳酸氧化酶基因的正义和反义寡核苷酸被退火产生双链DNA，并在转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)之前被克隆成质粒载体L4440。对携带有鱼型链球菌基因的重组克隆进行测序以确定重组克隆的身份。
实施例15表达鱼型链球菌双链RNA及饲料配方的细菌诱导。
携带有可诱导鱼型链球菌基因的IPTG的大肠杆菌菌株HT115DE3在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，然后以IPTG诱导表达鱼型链球菌特异性RNA。通过变换在细菌介质中的IPTG浓度，依经验最优化表达双链RNA。表达鱼型链球菌基因的细菌细胞与鱼饮食混合，以微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以聚合形式存在的小珠，并加入引诱剂制成对鱼类更加美味的小珠。
实施例16保护鱼类免受鱼型链球菌感染的方法用控制饮食或含有表达鱼型链球菌双链RNA的饮食喂养条纹石。条纹石 受到鱼型链球菌的攻击。然后在控制组和治疗组鱼中记录适应鱼型链球菌攻击的存活率。
实施例17
构建含有猪细小病毒(PPV)，一种猪病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对猪细小病毒的VP1衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的猪细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC001718(Bergeron et al.，1993，Virology 19786-98)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。猪细小病毒的主要抗原决定部位是在VP2衣壳基因内，选择该基因用于此设计(Kamstrup et al.，1998，Virus Res.53163-173)。正义和反义寡核苷酸被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有猪细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，按前面实施例描述的方法治疗其他动物(实施例2和3)，被用于预防猪感染猪细小病毒的治疗，。
实施例18构建含有外来纽卡斯尔疾病，一种鸡病毒性病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对外来纽卡斯尔疾病病毒衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的犬细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC002617(Sellers et al.，2000，Complete sequence for the B1 strainof Newcastle disease virus.InU.S.Department ofAgriculture/Agriculture Research Services)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体例如L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)，其含有两个启动子以产生RNA。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有犬细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，并且按前面实施例描述的方法治疗其他动物(例如见，实施例15)，被用于预防鸡感染外来纽卡斯尔疾病病毒的治疗。
实施例19构建含有寡核苷酸的重组质粒，该寡核苷酸由与口蹄疫(FMD)，一种牛病毒性病原体，互补的21-23个核苷酸长组成对VP1衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的犬细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC004915(Saravanan et al.，2003，Foot-and-mouth disease virus Asia 1(FMDV-Asial)，InMolecular Virolgy，Indian Veterinary ResearchInstitute，India)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。比口蹄疫单链菌株，各种菌株的可选序列能够平行使用来，提供更广泛的预防。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamathet al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有犬细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，按前面实施例描述的方法治疗其他动物(见实施例15)，用于预防牛感染犬细小病毒的治疗。
实施例20构建含有猫白血病病毒(FLV)，一种猫病毒性病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对包膜蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的含有包膜蛋白基因的猫白血病病毒片断序列，GenBank登记号AF403716(Anderson et al.，2001，J.Virol.7510563-10572)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG，并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有猫白血病病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，使用类似于前面实施例所描述的方法治疗其他动物(实施例2和3)，被用于预防猫感染猫白血病病毒的治疗。
实施例21构建含有犬细小病毒(CPV)，一种犬科病毒性病原体，的21-23个核苷酸的重组质粒对VP1衣壳蛋白基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成。基于公开的犬细小病毒基因组序列，GenBank登记号NC001539(Reedet al.，1988，J.Virol.62266-276)，合成代表上述基因的正义和反义寡核苷酸。VP1的N-终点区域选择自这种设计，由于衣壳的核子传输和这种病毒的有效传染已经被显示(Vihinen-Ranta et al.，2002，J.Virol.761884-1891)。正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，并被克隆成质粒载体L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010。该重组质粒被用来转化大肠杆菌菌株HT115DE3(携带能诱导表达T7聚合酶的IPTG并缺失双链特异性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。对携带有犬细小病毒特异性基因的重组克隆进行测序以确定克隆的身份。然后将这些siRNA配入饲料中，用于预防狗感染犬细小病毒的治疗，使用类似于前面实施例所述的方法治疗其他动物(实施例2和3)。
实施例22构建在植物中表达的含有白斑综合症病毒(WSSV)基因的21-23个核苷酸的重组质粒对以下五种白斑综合症病毒基因具有特异性的21-23-mer长的寡核苷酸被定做设计和合成，正义和反义寡核苷酸序列被退火产生双链DNA，如实施例1中所述。为了用于植物系统，使用基于agrobacterium ti质粒T-DNA区域的不同质粒。存在大量这样的质粒，其适用于各种植物物种(插入参考书目)。退火双链DNA被克隆成在负链上含有两个的启动子例如，lac，trp，或PL启动子，的质粒载体，用标准方法构建质粒并扩增构建(Clark，1997，PlantMolecular Biology.Springer，Berlin)。该重组质粒被用来转化紫花苜蓿细胞(Taschner et al.，1994，Virology 203269-276；Larrick et al.，2001，Biomol.Eng.1887-94；Kelemen et al.，2002，Transgenic Res.1169-72)。对携带有白斑综合症病毒特异性基因的重组愈伤组织培养物进行测序以确定克隆的身份。使用愈伤组织重组表达白斑综合症病毒特异性RNA的基因工程植物。通过风干温和干燥植物材料，然后将其混合到饲料中，使用类似于实施例2和3中的方法，来用于预防虾类免受白斑综合症病毒感染。
实施例23使用顶部涂层配制可替代饲料生物量制作饲料的顶部涂层是使用标准饲养技术完成的，其中含有上述实施例(例如，实施例2，5，8，11，&12)所述生物量的生物量被涂到现存饲料上并喂养动物，以提供想要的活性调节。
实施例24桃拉综合症病毒siRNA设计RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)RdRp基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAGUGUCUA AUGCGGAGAT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCUCCGCAUU AGACACUCCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGT GTCTAATGCG GAGATTCAAG AGATCTCCGC ATTAGACACT CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGAGTGTCTAATG CGGAGATCTC TTGAATCTCC GCATTAGACA CTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的RdRp基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGGAAGAGCG GAAAGCAGATT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCUGCUUUCC GCUCUUCCCT T(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGGAA GAGCGGAAAGCAGATTCAAG AGATCTGCTT TCCGCTCTTCCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGGAA GAGCGGAAAG CAGATCTCTT GAATCTGCTT TCCGCTCTTC CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的RdRp基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAAUUCAUU GUUGACAACTT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GUUGUCAACA AUGAAUUCCT C(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAAT TCATTGTTGA CAACTTCAAG AGAGTTGTCA ACAATGAATTCCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGGA ATTCATTGTT GACAACTCTC TTGAAGTTGT CAACAATGAA TTCCG-3’(SEQ IDNO___)。
RNA干扰用于被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)vp1基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUUGGAUG AGAUGUCUAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAGACAUCUC AUCCAAUCCT T(SEQ ID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATTGGATGAGATG TCTATTCAAG AGATAGACAT CTCATCCAAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATT GGATGAGATGTCTATCTCTT GAATAGACAT CTCATCCAAT CCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的vp1基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGUACGCUUG CUAAAGCAGT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)CUGCUUUAGC AAGCGUACCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTAC GCTTGCTAAA GCAGTTCAAG AGACTGCTTT AGCAAGCGTA CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGTACGCTTGCTA AAGCAGTCTC TTGAACTGCT TTAGCAAGCG TACCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的桃拉综合症病毒(TSV)的vp1基因(AF277675)能使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义s iRNA链(5’→3’)GGAUACGAAG GUGUCUUUGT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)CAAAGACACC UUCGUAUCCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA CGAAGGTGTC TTTGTTCAAG AGACAAAGAC ACCTTCGTAT CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGATACGAAGGTG TCTTTGTCTC TTGAACAAAG ACACCTTCTT ATCCG-3’(SEQ ID NO___)。
实施例25虾黄头病毒siRNA设计RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的黄头病毒(YHV)结构糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用几个不同的方法完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGCUCGCAUA UCAUUUAUAT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAUAAAUGAU AUGCGAGCCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGCTC GCATATCATT TATATTCAAG AGATATAAAT GATATGCGAG CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGCTCGCATATCA TTTATATCTC TTGAATATAA ATGATATGCG AGCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的黄头病毒(YHV)结构糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUAUCCUC CCGCCAACATT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UGUUGGCGGG AGGAUAUCCT T(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA TCCTCCCGCC AACATTCAAG AGATGTTGGC GGGAGGATATCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGATA TCCTCCCGCC AACATCTCTT GAATGTTGGC GGGAGGATAT CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一个RNA干扰设计用于被RNA干扰调节的黄头病毒(YHV)结构糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用几个不同的方法完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGUCUUUGUU AUGAAGUAGT T(SEQID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)CUACUUCAUA ACAAAGACCT T(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCT TTGTTATGAA GTAGTTCAAG AGACTACTTC ATAACAAAGA CCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGTCTTTGTTATGAA GTAGTCTCTT GAACTACTTC ATAACAAAGA CCG-3’(SEQ ID NO___)。
实施例26传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)siRNA设计siRNA设计用于传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)基因orf1(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGACAUACUG CAUACACGUT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)ACGUGUAUGC AGUAUGUCCT T(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA表达载体(来自Ambion的2.0，2.1，3.0，&3.1)设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGACA TACTGCATACACGTTTCAAG AGAACGTGTA TGCAGTATGT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGACA TACTGCATAC ACGTTCTCTTGAAACGTGTA TGCAGTATGT CCG-3’(SEQ ID NO___)。
第二个RNA干扰设计用于传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf1(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGUCCAAAUC AAGACCCUAT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UAGGGUCUUG AUUUGGACCT G(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCC AAATCAAGAC CCTATTCAAG AGATAGGGTC TTGATTTGGA CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGTCCAAATCAAG ACCCTATCTC TTGAATAGGG TCTTGATTTG GACCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于为传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf1(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGACAAUAUA AAGACAAACT T(SEQ IDNO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GUUUGUCUUU AUAUUGUCCT C(SEQ IDNO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGACA ATATAAAGAC AAACTTCAAG AGAGTTTGTC TTTATATTGT CCTCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGACAATATAAAG ACAAACTCTC TTGAAGTTTG TCTTTATATT GTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
RNA干扰设计用于被RNA干扰调节的传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf2(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUCAAGUG GACCAGACCTT(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)GGUCUGGUCC ACUUGAUCCT T(SEQID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATC AAGTGGACCA GACCTTCAAG AGAGGTCTGG TCCACTTGATCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’一AGCTTTTCCAAAAAAGGATC AAGTGGACCA GACCTCTCTT GAAGGTCTGG TCCACTTGAT CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一个RNA干扰设计用于被RNA干扰调节的传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf2(AF273215)可使用几个不同的方法来完成。。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAGGCACAUCAUUUGAGAT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)UCUCAAAUGAUGUGCCUCCT G(SEQ ID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGG CACATCATTT GAGATTCAAG AGATCTCAAATGATGTGCCT CCTGTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGA GGCACATCAT TTGAGATCTC TTGAATCTCA AATGATGTGCCTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一个RNA干扰设计用于可被RNA干扰调节的传染性表皮与造血组织坏死症病毒基因orf2(AF273215)可使用几个不同的方法完成。正如由Ambion设计的一个siRNA设计是基于一条正义siRNA链(5’→3’)GGAUACUACUGGACUACAUT T(SEQ ID NO___)和一条反义siRNA链(5’→3’)AUGUAGUCCAGUAGUAUCCT T(SEQ ID NO___)。为使用pSilencerTMsiRNA载体设计的模板具有顶链寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA CTACTGGACT ACATTTCAAG AGAATGTAGTCCAGTAGTAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底链寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CTACTGGACT ACATTCTCTT GAAATGTAGT CCAGTAGTATCCG-3’(SEQ ID NO___)。
实施例27在细菌质粒载体中克隆siRNA正义和反义寡核苷酸序列被退火生成双链DNA，并被克隆成PetDirectional TOPTM表达载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，California)或Pcx-TOPO PuruProTM柄细菌质粒表达载体(Invitrogen，Inc.)或L4440质粒载体(Kamath et al.，2002)。用重组质粒分别转化大肠杆菌菌株BL21StarTM(DE3)One Shot Chemically Competent cells(Invitrogen，Inc.)或新月柄杆菌细胞或大肠杆菌HT115DE3细胞(Kamath et al.，2001)。对重组克隆进行测序以确定克隆的身份。含有病毒特异性基因的克隆在含有氨苄青霉素和IPTG的LB培养基上生长。依经验确定IPTG的浓度以获得最大程度的双链RNA表达。含有表达siRNA细胞的细菌量与虾饲料混合，微结合成由藻酸盐和淀粉组成的以多聚形存在小珠。加入引诱剂例如磷虾粉制成对虾类更加美味的小珠。
实施例30水生和陆生动物疾病I.水生动物疾病A.原生动物i.卵圆鞭毛虫(腰鞭毛虫)(Amyloodinium ocellatum(dinoflagellate))ii.布鲁克原虫(纤毛虫)(Brooklynella hostilis(ciliate))iii.刺激隐核虫(纤毛虫)(Cryptocaryon irritans(ciliate))iv.多子小瓜虫(一种鱼型纤毛虫)(Ichthyopthirius multifilis(Ich-aciliate))v.鲤斜管虫(一种纤毛虫)(Chilodonella cyprini(a ciliate))vi.六鞭毛虫(鞭毛虫)(Hexamita(a fagellate))B.微孢子纲i.格留虫属，微孢子虫属(Glugea，Spraguea spp.)C.粘孢子i.尾孢虫属(Henneguya spp.)ii.粘体虫属(Myxobolus spp.)D.扁形动物门i.单殖目(吸虫纲)ii.复殖目(吸虫纲)iii.绦虫纲(吸虫纲)E.线虫i.cappilaria(艾美虫属)F.甲壳类i.鱼虱属(短尾亚目甲壳动物蟹)(Argulus spp.(Brachyuran))ii.鲑疮痂鱼虱(鲑鱼虱-一种绕足动物)(Lepeophtheirus salmonis(Salmon lice-a copepod))
iii.针虫属(棘头虫)(Learnea spp.(Acanthocephalan))G.孢子虫纲.
i.球虫属(Coccidia spp)H.真菌i.寄生水霉(一种卵菌)(Saprolegnia parasitica(an oomycete))ii.小□虾瘟疫(一种卵菌)(Aphanomyces astaci(an oomycete))iii.鱼孢霉菌病(类真菌制剂)(Ichthyophonus hoferi(fungus-like agent))iv.茄病镰刀菌(丝孢纲)(Fusarium solani(a hyphomycete))v.鲑鱼外瓶霉(丝孢纲)(Exophiala salmonis(a hyphomycete))II.陆生动物疾病非洲马病病毒(马科动物)(African horse sickness virus(equine))非洲猪瘟病毒(猪)(African swine fever virus(porcine))伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1)(Aujeszky′s disease virus(porcineherpesvirus 1))禽流感病毒(家禽)(Avian influenza viruses(poultry))驽巴贝斯虫和马巴贝西虫(马科动物)(Babesia caballi and B.equi(equine))炭疽杆菌(所有动物)(Bacillus anthracis(all))蓝舌病病毒(牛，绵羊，山羊，鹿)(Bluetongue virus(cattle，sheep，goats，deer))马耳他热布鲁氏菌(牛属动物)(Brucella melitensis(bovine))羊布氏杆菌(绵羊科动物)(Brucella ovis(ovine))猪布鲁菌(猪科动物)(Brucella suis(porcine))马鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽假单孢菌)(Burkholdaria(Pseudomonas)mallei equine))传统猪瘟病毒(猪科动物)(Classical swine fever virus(porcine))螺旋蝇蛆病(绵羊科动物，牛科动物)(Cochliomya hominivorax(ovines，bovines))
东西方马脑炎病毒(马科动物)(Eastern and western equine encephalomyelitisviruses(equine))多包绦虫和细粒棘球绦虫(犬科动物)(Echinococcus multilocularis and E.granulosus(canine))马传染性贫血症(马科动物)(Equine infectious anaemia virus(equine))口蹄疫病毒(绵羊科动物，牛科动物)(Foot and mouth disease virus(ovine，bovine)皮疽组织胞浆菌(许多类真菌物种)(Histoplasma farciminosum(fungus-like many species))马痘病毒(马科动物)(Horse pox virus(equine))支原体无乳症(牛科动物，绵羊科动物)(Mycoplasma agalactiae(bovine，ovine))丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides mycoides)山羊丝状支原体(公山羊)(Mycoplasma mycoides var Capri(caprine))纽卡斯尔疾病病毒(鸟类)(Newcastle disease virus(avian))小反刍兽疫病毒(Peste de petis ruminants virus)狂犬病毒和狂犬病相关病毒，如下杜文哈根病毒(Duvenhage)拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat)莫科拉病毒(Mokola)欧洲蝙蝠狂犬病毒I和II(European bat lyssaviruses I and II)里夫特裂谷热病毒(Riff Valley Fever virus)牛瘟病毒(绵羊科动物，牛科动物，公山羊)(Rinderpest virus(ovine，bovine，caprine))绵羊和山羊痘病毒(Sheep and goat pox virus)猪水泡病(Swine vesicular disease)捷申病病毒(Teschen disease virus)泰勒虫症(绵羊科动物，牛科动物)(Theileria annulata(ovine，bovine)
旋毛虫(猪科动物)一种原生动物(Trichinella spiralis(porcine)aprotozoan)马疫锥虫，伊氏锥虫&泰勒锥虫(原生动物)(Trypanosome equiperdum，T.evansi & T.theileri)委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(马科动物)(Venezuelan equineencephalomyelitis virus(equine))水泡性口炎病毒(猪科动物)(Vesicular stomatitis virus(porcine))布鲁氏菌病(Brucellosis)慢性萎缩病(Chronic Wasting Disease)马传染性贫血症(Equine Infectious anemia)马病毒性动脉炎(Equine viral artertis)约尼氏病(Johnes)狂犬病(Psedorabies)痒病(Scrapie)结核病(Tuberculosis)上述的是紊乱及紊乱引发制剂的非详细列表，可使用本文所述的方法和组合物对其进行治疗或抑制。
本文引用的每个专利，专利申请，及出版物所公开的内容被全部编入本文以供参考。
当本发明就其特定实施方案被公开时，很显然本技术领域的其他技术人员可以在不脱离本发明的基本精神和范围的条件下，设计本发明的其他实施方案及对本发明做变更。所附权利要求包括所有这样的实施方案和相对应的变更。
权利要求
1.一种饲料、饲料补充物、或治疗组合物，包括小片段干扰RNA和双链RNA，该小片段干扰RNA或双链RNA表达于生物体内，并能被加工成抑制动物病原体的小片段干扰RNA。
2.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病原体为病毒，细菌，或真菌。
3.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病毒选自白斑综合症病毒、桃拉综合症病毒、黄头病毒、和传染性皮下及造血组织坏死病毒。
4.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病毒选自猪细小病毒(PPV)、外来纽卡斯尔疾病、口蹄疫(FMD)、猫白血病病毒(FLV)、犬细小病毒。
5.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述细菌选自水产业或农业细菌性病原体。
6.根据权利要求5所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业细菌性病原体选自气单胞菌属、爱德华氏菌属、产黄菌属、屈杆菌属、分枝杆菌属、链球菌属、沙门氏菌属、弧菌属、和鲁氏耶尔森菌。
7.根据权利要求5所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业细菌性病原体选自分枝杆菌属、肠球菌属、链球菌属、沙门氏菌属、和鼠疫耶尔森氏菌。
8.根据权利要求2所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述真菌选自水产业或农业真菌性病原体。
9.根据权利要求8所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业真菌性病原体选自卵菌纲真菌，虾瘟疫真菌，和鱼孢霉菌属。
10.根据权利要求8所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业真菌性病原体选自发癣菌属、茄镰孢菌、和假丝酵母属。
11.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述病原体为真核生物。
12.根据权利要求10所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述真核生物选自纤毛虫、变形虫、原生动物、微孢子纲、粘孢子、扁形动物、线虫、和孢子虫。
13.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为水生动物。
14.根据权利要求13所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水生动物为甲壳纲动物。
15.根据权利要求14所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述甲壳纲动物选自虾、丰年虫、龙虾、螃蟹、小龙虾或对虾。
16.根据权利要求13所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为鱼类。
17.根据权利要求16所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述鱼类选自鲑鱼、鳟鱼、庸鲽、大菱鲆、条纹石、河鲈、罗非鱼、鲶鱼，和鲤鱼。
18.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为陆生动物。
19.根据权利要求18所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述陆生动物选自马、狗、猫，母牛，绵羊，山羊，家禽，鸟类，水貂，猪，仓鼠，小鼠，兔，大鼠，沙鼠和豚鼠。
20.根据权利要求1所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述小片段干扰RNA或双链RNA表达于选自昆虫，细菌，真菌，噬菌体，植物，和酵母的生物体中。
21.根据权利要求20所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述生物体以完整或大部分完整细胞包含在饲料中。
22.根据权利要求20所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述生物体以破碎或大部分破碎细胞包含在饲料中。
23.根据权利要求20所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述生物体的生物量被封装。
24.根据权利要求23所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述的封装是使用选自可消化聚合物、不可消化聚合物、磷脂、壳聚糖和藻酸盐的材料完成。
25.一种保护动物免受病原体感染的方法，包括喂食所述动物饲料，其进一步包括小片段干扰RNA或双链RNA，其中所述的小片段干扰RNA或双链RNA表达于生物体内，并且所述的小片段干扰RNA或双链RNA能被加工成小片段干扰RNA，以及通过RNA干扰，负调节动物病原体的表达。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病原体为病毒、细菌、或真菌。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒选自白斑综合症病毒、桃拉综合症病毒、黄头病毒、和传染性皮下及造血组织坏死病毒。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒选自猪细小病毒(PPV)、外来纽卡斯尔病、口蹄疫(FMD)、猫白血病病毒(FLV)、犬细小病毒。
29.根据权利要求26所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述细菌选自水产业或农业细菌性病原体。
30.根据权利要求29所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业细菌性病原体选自气单胞菌属、爱德华氏菌属、产黄菌属、屈杆菌属、分枝杆菌属、链球菌属、沙门氏菌属、弧菌属、和鲁氏耶尔森菌。
31.根据权利要求29所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业细菌性病原体选自分枝杆菌属、肠球菌属、链球菌属、沙门氏菌属、和鼠疫耶尔森氏菌。
32.根据权利要求26所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述真菌选自水产业或农业真菌性病原菌。
33.根据权利要求32所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述水产业真菌性病原体选自卵菌纲真菌、虾瘟疫真菌、和鱼孢霉菌属。
34.根据权利要求32所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述农业真菌性病原体选自发癣菌属、茄镰孢菌、和假丝酵母菌属。
35.根据权利要求25所述的方法，其中所述病原体为真核生物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述真核生物选自纤毛虫、变形虫、原生动物、微孢子纲、粘孢子、扁形动物、线虫、和孢子虫。
37.根据权利要求25所述的方法，其中所述动物为水生动物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述水生动物为甲壳纲动物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述甲壳纲动物选自虾、丰年虫、龙虾、螃蟹、小龙虾、对虾。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述水生动物为鱼类。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述鱼类选自鲑鱼、鳟鱼、庸鲽、大菱鲆、条纹石、河鲈、罗非鱼、鲶鱼、和鲤鱼。
42.根据权利要求25所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述动物为陆生动物。
43.根据权利要求42所述的饲料、饲料补充物、或治疗组合物，其中所述陆生动物选自马、狗、猫、母牛、绵羊、山羊、家禽、鸟类、水貂、猪、仓鼠、小鼠、兔、大鼠、沙鼠或豚鼠。
44.根据权利要求25所述的方法，其中所述的小片段干扰RNA或双链RNA表达在选自昆虫、细菌、真菌、噬菌体、植物、和酵母的生物体中。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物体以完整或大部分完整细胞包含在饲料中。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物体以破碎或大部分破碎细胞包含在饲料中。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物体的生物量被封装。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述的封装是使用选自可消化聚合物、不可消化聚合物、磷脂、壳聚糖和藻酸盐的材料完成。
49.根据权利要求25所述的方法，其中饲料补充有含有21-23个核苷酸长的重组细菌细胞，其选择性分解与疾病引起的成分同源的mRNA来减少或减轻疾病状态。
全文摘要
本发明涉及使用RNA干扰技术来抑制动物病原体的组合物(例如，饲料、饲料补充物和治疗产品)和方法。
文档编号A61K48/00GK1946733SQ200580007978
公开日2007年4月11日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月6日
发明者大卫·J·凯尔, 阿伦·K·达尔 申请人:高级生物营养公司
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