淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用的制作方法
专利名称：淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及淫羊藿提取物的新用途，具体地说是涉及淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。
背景技术：
抑郁症指情感性精神障碍综合症，以心境低落为主要特征。临床主要表现为抑郁心情、疲劳感、快感缺乏、思维和运动迟滞，伴有焦虑、睡眠障碍、食欲不振、绝望及自杀妄想等。临床上抑郁症常与其它严重疾病如心脏病、脑中风、癌症、免疫性疾病等并存。世界卫生组织精神病流行情况调查报告显示，抑郁症已经成为现代社会危害人类身心健康的常见病，且有愈加严重的趋势。
目前临床上常用的抗抑郁药物大多为人工合成的有机物，有如下几类(1)单胺氧化酶抑制剂(MAO-AI)(如吗氯贝胺)；(2)5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)(如氟西汀)；(3)5-羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂(SNRI)；(4)双重5-HT阻断剂(奈法唑酮)；(5)NE和DA重摄取抑制剂(如bupropin)。已有大量的研究和临床资料表明，这些合成的抗抑郁药大多具有难以克服的缺点，例如抗抑郁谱较窄、毒副作用较大、停药后易复发等，即便是临床首选西药氟西汀，近来也不断有其诱发自杀倾向的负面报道。如何保证并保持抗抑郁药物的疗效、同时降低其毒副作用，或者筛选出一种疗效好且毒副作用小的新型抗抑郁药物成为科研工作者所面临的一个课题。
中医上讲抑郁症是指情志不宁、气机郁滞引起的一类病症，与西医上讲的抑郁症有很多共同之处。一部分传统中药名方具有与西药相当甚至更好的抗抑郁效果且安全可靠。但传统中药复方缺点在于起效较慢，组分复杂，活性成分不明确，难以制定和实施严格的质量控制标准。因此找到疗效确切的单体，成为解决应用中药治疗抑郁症的关键。
中药材淫羊藿最早记载于《神农本草经》，为传统的补虚壮阳中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。
淫羊藿的主要成分是淫羊藿总黄酮(包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷等)和淫羊藿多糖。前人对淫羊藿，淫羊藿总黄酮提取物(包含淫羊藿苷)和单成分淫羊藿苷的研究已经证明它们有多种生物学活性
淫羊藿具有明显性激素样作用，对心血管系统和免疫系统有调节作用，此外还有促进骨细胞增殖，抗衰老等活性。
淫羊藿总黄酮具有性激素样作用，对心血管系统和免疫系统有调节作用，可用以降血糖、降血脂、降血压，改善脑血流量和脑缺血并改变血液流变学指标，改善造血系统障碍，提高人体免疫力，此外还有促进骨细胞增殖，抗衰老，抗炎，抗病毒等活性。
淫羊藿苷具有性激素样作用，对心血管系统和免疫系统有调节作用，有促进骨细胞增殖，抗衰老，抗炎，抗病毒等活性，此外还有抗肿瘤活性的报道。
近年来针对淫羊藿化学成分和药理作用的研究十分活跃，受到国内外广泛关注。且淫羊藿在我国产地分布广，产量大，具有巨大的研究和开发潜力。
此前，国内外均无淫羊藿提取物、淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷三者具有抗抑郁活性的相关报道。
发明内容
1、发明目的本发明的目的在于提供淫羊藿提取物的新用途，具体地说是指淫羊藿提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷在制备预防和治疗抑郁症的药物中的应用。
2、技术方案本发明人用中药材淫羊藿分别经水、75％乙醇、90％乙醇回流提取，再经石油醚脱脂后分别用酸碱沉淀法、乙酸乙酯萃取法、铅盐沉淀法或用重结晶等方法获得提取物，经干燥可得到外观为黄绿色粉末的总黄酮提取物，经检测其中含淫羊藿苷含量在5～90％。经实验验证，该总黄酮提取物具有抗抑郁活性；本发明人将该总黄酮提取物进一步纯化，用多种浓度甲醇水溶液反复提取纯化，再经HPLC分离得到外观为浅黄绿色粉末，经检测，确定其为淫羊藿苷，含量达到98％以上。
淫羊藿苷的结构式如下 淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用，该提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮，还包括活性成分淫羊藿苷单体，在淫羊藿总黄酮提取物中含有5-90％的淫羊藿苷。
本发明人的实验研究表明，以淫羊藿苷为主要活性成分(5～90％)的淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷单体都具有明显的抗抑郁作用，其抗抑郁效果与目前临床上广泛使用的盐酸氟西汀相似。中药淫羊藿在很多中药滋补方剂中都有应用，由此可以推知淫羊藿苷作为药物是相对安全的，且可通过动物的药理和毒理实验验证。
本发明所述中药成分淫羊藿苷及含淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮提取物经过以下抑郁动物模型和有关抑郁的生化指标的实验结果，验证了其抗抑郁效果(1)淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对小鼠悬尾不动时间的影响在小鼠悬尾行为绝望模型上，口服给予淫羊藿苷(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)和淫羊藿总黄酮(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)均可显著缩短小鼠悬尾不动时间，显示有抗抑郁作用。
(2)淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对小鼠强迫游泳不动时间的影响在小鼠强迫游泳行为绝望模型上，口服给予淫羊藿苷(100mg/kg、50mg/kg和25mg/kg)和淫羊藿总黄酮(200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg)均可显著缩短强迫游泳不动时间，显示有抗抑郁作用。
(3)淫羊藿苷对慢性刺激应激(CMS)大鼠蔗糖摄入量的影响在CMS模型上，口服给予淫羊藿苷(75mg/kg和37.5mg/kg)，可显著逆转CMS引起大鼠蔗糖摄入量的减少，进一步证明淫羊藿苷具有抗抑郁作用。
(4)淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对抑郁动物体内单胺氧化酶-A和B(MAO-A、MAO-B)活性的影响口服给予淫羊藿苷(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)和淫羊藿总黄酮(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)均可显著抑制模型动物脑部MAO-A、MAO-B活性，表明淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮可通过抑制MAO活性而达到抗抑郁的目的。
3、有益效果本发明提供的淫羊藿苷和含主要成分淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮在制备预防和治疗抗抑郁症药物中的新应用，它具有以下优点(1)药效成分明确，淫羊藿苷为结构稳定的单体，易于该药物进行质量控制，适合工业规模化生产；(2)经实验验证抗抑郁活性明显；(3)该提取物为天然中药成分，安全性好。
(4)淫羊藿在我国产地分布广、产量大，药源丰富，可以降低生产成本。
具体实施例方式
通过以下实施例来进一步说明本发明的有益效果实施例1淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量为55％)对小鼠悬尾模型行为指标的影响动物模型小鼠悬尾模型原理抑郁症的一个主要症状是动机行为的减少。悬尾实验模型中，悬尾小鼠为克服不正常体位而挣扎活动，这是小鼠的动机行为，但活动到一定时间后，出现间断性不动，显示“失望”状态。这里所指的不动性反映了一种被称之为“行为绝望和扭曲(behavioral despair and variant)”或“对强压环境适应的失败(failure to adapt to stress)”状态，是一种消极的无动机绝望状态。小鼠悬尾行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感，并且操作简单、快捷，因此被广泛用于该类药物的筛选。
实验药物盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量为55％)实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物饲养于25±1℃室内，自由饮水进食，适应1周后随机分组，每组15只。
动物分组情况C 生理盐水对照组F 氟西汀给药组(10mg/kg)YH淫羊藿总黄酮高剂量给药组(200mg/kg)YM淫羊藿总黄酮中剂量给药组(100mg/kg)YL淫羊藿总黄酮低剂量给药组(50mg/kg)实验方法1)给药剂量和方式阳性药盐酸氟西汀(10mg/kg)和样品淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿苷含量55％)高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)剂量按所需浓度在生理盐水中分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药14天，行为实验分别在第1、7、14天进行，实验前一小时给药。
2)小鼠开场行为实验在直径80cm、高20cm的柱形箱内设3个同心圆，直径分别为14，28，42cm，将箱内分为36个无壁小室。箱中心用一个悬挂在40cm高处的60W的电灯泡照亮，整个实验过程中，操作间保持黑暗。单只小鼠被放在整个装置的中央，可自由活动。记录3min内小鼠的移动次数(小鼠四爪都跨越小室边界的次数)、竖起次数(小鼠前肢抬起、后肢站立的次数)和理毛次数。
3)小鼠悬尾实验夹住小鼠尾端2cm的部位，使其倒挂于金属桶中，头部离桶底约5cm，观察6min，记录后4min内的不动时间。
4)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为试验结果显示，与不给药的空白对照组相比，本实验3个剂量的淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)口服给药对小鼠开场行为无显著影响(实验数据略)，说明淫羊藿总黄酮减少悬尾小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠悬尾实验结果显示，3个剂量淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)口服给药后均能不同程度地减少悬尾模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效趋于稳定并有增强趋势。给药2周后，3个剂量都达到显著减少悬尾模型小鼠绝望时间的抗抑郁效果，低剂量(25mg/kg)给药显示出的效果最好，其药效与阳性药氟西汀相当。数据详见表1。
-5-表1淫羊藿总黄酮对悬尾实验中小鼠不动时间的影响组别给药剂量不动时间(s)mg/kg 第1天 第7天第14天C 57.88±3.66 70.85±4.06 78.87±5.08F 1032.69±2.25*34.71±1.76**35.52±2.61*YH200 55.81±3.34 44.46±1.81*43.20±1.33*YM100 48.00±2.70 43.84±3.46 41.39±2.56*YL5044.49±2.91 30.08±1.90*36.76±2.69*与生理盐水对照组比较*P＜0.05**P＜0.01实施例2淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量为55％)对小鼠强迫游泳模型行为指标的影响动物模型小鼠强迫游泳模型原理抑郁症的一个主要症状是动机行为的减少。强迫游泳模型中，小鼠被迫在一局限的空间内游泳，它们首先表现出挣扎和试图逃跑的动机行为，随后处于一种被称为“绝望”的不动状态。这里所指的不动性反映了一种被称之为“行为绝望和扭曲(behavioral despair and variant)”或“对强压环境适应的失败(failure to adapt to stress)”状态，是一种消极的无动机绝望状态。小鼠强迫游泳行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感，并且操作简单、快捷，因此被广泛用于该类药物的筛选。
实验药物同实施例1实验动物同实施例1实验方法1)给药方式和剂量同实施例12)开场行为试验同实施例13)小鼠强迫游泳试验将小鼠放入水深10cm烧杯(18cm高，14cm直径)中，水温25±1℃。观察6min，记录后4min内的不动时间。
4)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为试验结果显示，与不给药的空白对照组相比，本实验3个剂量的淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿苷含量55％)口服给药对小鼠开场行为无显著影响(实验数据略)，说明淫羊藿总黄酮减少强迫游泳小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠强迫游泳试验结果显示，3个剂量淫羊藿总黄酮(含淫羊藿苷55％)提取物口服给药均能不同程度地减少强迫游泳模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效趋于稳定并有增强趋势。给药2周后，高、低2个剂量达到极显著而中剂量达到显著减少强迫游泳模型小鼠绝望时间的抗抑郁效果，高剂量效果为最好，与阳性药盐酸氟西汀相当。数据详见表2。
表2淫羊藿总黄酮提取物对强迫游泳实验中小鼠不动时间的影响动物分组 剂量不动时间(s)mg/kg 第1天 第7天 第14天C138.63±3.40 161.63±3.02 60.85±2.91F10 124.61±5.24 100.89±3.67 101.95±3.97YH 200 117.57±5.05 107.79±3.46***106.80±4.02***YM 100 123.38±4.33 136.73±4.04 134.03±4.03*YL 50 110.11±2.66*110.54±3.82**109.97±4.35**与生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001实施例3淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)对抑郁模型小鼠脑部MAO酶(包括MAO-A、MAO-B)活性的影响原理近年来对抗抑郁作用机理的研究表明，药物的抗抑郁作用与生物体的单胺神经元功能状态密切相关通过抑制单胺氧化酶活性，可以选择性抑制突触间相关单胺递质的降解，增高其浓度，从而增强单胺神经元功能。因此单胺氧化酶(MAO)的活性被认为是抑郁病理的一个重要指标。本发明人对小鼠的脑部的MAO-A和MAO-B的酶活性进行了检测。
实验材料与仪器实验材料盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)阿米替林(常州四药厂)牛血清蛋白(SIGMA公司产品)5-HT，苄胺(SIGMA公司产品)乙酸丁酯A.R.(上海凌峰化学试剂有限公司)环己烷A.R.(上海凌峰化学试剂有限公司)实验主要仪器WH-3微型旋涡混合仪上海沪西仪器厂XHF-1高速分散器(上海金达生化仪器厂)U-3000 spectrophotometer(Hitachi，Ltd.Tokyo Japan)TDA系列温度显示调节仪(宁波自动化仪表厂)(水浴锅)TGL-16G台式高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物分组情况C 正常生理盐水对照组M 模型生理盐水对照组F 模型氟西汀给药组(10mg/kg)YH模型淫羊藿总黄酮提取物高剂量给药组(100mg/kg)YL模型淫羊藿总黄酮提取物低剂量给药组(50mg/kg)实验方法1)给药方式阳性药盐酸氟西汀(10mg/kg)和样品淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿苷含量55％)高剂量按所需浓度在生理盐水中分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药21天。每组动物数15只。
2)试验方法模型小鼠给药21天后置冰盘中上眼球取血、断头处死，迅速于冰台上取脑，于称量纸上称重，置-20℃冰箱保存，MAO酶活性采用紫外分光法测定。
3)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果
抑郁模型生理盐水对照小鼠脑部MAO酶活力明显高于空白生理盐水对照组小鼠，有极显著差异(P＜0.01)。而通过口服2个剂量淫羊藿总黄酮提取物21天后，抑郁模型小鼠脑部的MAO酶活力水平均被极显著降低，效果优于阳性药盐酸氟西汀。数据详见表3表3淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)对小鼠脑部MAO酶活力的影响动物分组酶活力(U/g pro)抑制率(％)MAO-AMAO-B MAO-A MAO-BC 14.13±0.53 4.21±0.31M 19.03±0.17##7.80±0.29##F 10.80±0.34***5.19±0.35*43.3％33.4％YH 7.02±0.27***2.82±0.19***63.1％63.8％YL 9.59±0.20***4.14±0.35**49.6％46.9％与模型生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与同正常生理盐水对照组比较##P＜0.01实施例4淫羊藿苷对小鼠悬尾模型中行为指标的影响动物模型同实施例1原理同实施例1实验药物盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)阿米替林(常州四药厂)淫羊藿苷单体(含量98％)实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物饲养于25±1℃室内，自由饮水进食，适应1周后随机分组。
分组情况C 生理盐水对照组F 氟西汀给药组(10mg/kg)AM阿米替林给药组(10mg/kg)YH淫羊藿苷高剂量组给药(100mg/kg)YM淫羊藿苷中剂量组给药(50mg/kg)
YL淫羊藿苷低剂量组给药(25mg/kg)实验方法1)开场行为实验同实施例12)小鼠悬尾实验同实施例13)给药方式2种阳性药和淫羊藿苷按上述浓度在生理盐水分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃给药方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药21天，行为实验分别在第1、3、7、14、21天进行，实验前一小时给药。每组实验动物数15只。
4)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为实验结果表明与空白对照组比较，本实验3个剂量淫羊藿苷口服给药对小鼠开场行为无显著影响，说明本实验中淫羊藿苷减少悬尾小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠悬尾实验结果显示，3个剂量淫羊藿苷口服给药后均能不同程度地减少悬尾模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效药效趋于稳定并有增强趋势。给药3周后，3个剂量都达到显著和极显著减少模型动物绝望不动时间的抗抑郁效果，低剂量(25mg/kg)给药显示出的效果最好，其药效与阳性药氟西汀和阿米替林相当。数据详见表4。
表4淫羊藿苷对悬尾实验中小鼠不动时间的影响组别不动时间(s)第1天 第3天第7天 第14天 第21天C 80.3±1.4 62.5±1.669.8±1.8 87.8±2.6 96.1±2.5F 47.4±1.5***46.3±2.447.1±1.9*48.0±1.6**39.3±1.8***AM 49.7±2.0**50.2±1.838.1±1.5**54.1±1.9*45.0±2.6***YH 77.3±2.1 63.4±2.257.7±1.4 63.8±2.0*64.2±1.8**YM 64.9±2.1 68.1±1.656.9±1.9 64.1±2.1 66.3±2.4*YL 69.2±2.9 62.4±2.358.2±3.0 50.6±2.6*47.9±2.6***与生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例5淫羊藿苷对小鼠强迫游泳模型中行为指标的影响动物模型同实施例2原理同实施例2实验药物与动物同实施例4实验方法1)开场行为实验同实施例12)小鼠强迫游泳实验同实施例23)给药方式同实施例44)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为实验结果表明开场行为实验结果表明与空白对照组比较，本实验3个剂量淫羊藿苷口服给药对小鼠开场行为无显著影响，说明本实验中淫羊藿苷减少强迫游泳小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠强迫游泳实验结果显示，3个剂量淫羊藿苷口服给药后均能不同程度地减少悬尾模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效药效趋于稳定并有增强趋势。给药3周后，高、低剂量都达到显著和极显著减少模型动物绝望不动时间的抗抑郁效果，高剂量(100mg/kg)给药显示出的效果最好，其药效优于阳性药氟西汀和阿米替林相当。数据详见表5表5淫羊藿苷对强迫游泳实验小鼠不动时间的影响组别不动时间(s)样本量15 第1天 第3天 第7天 第14天第21天C 96.5±2.4 104.5±3.1108.7±3.1128.9±6.2152.6±3.7F 75.8±2.5 94.8±3.6 100.5±4.0128.3±5.4159.0±3.6AM 63.4±2.9*61.5±3.0*79.2±3.2 104.0±3.6111.7±4.0*YH 98.8±3.8 94.4±3.2 130.0±3.3127.9±3.386.0±3.3***YM 86.6±2.9 133.7±3.3161.4±2.7179.2±3.0190.1±3.4YL 85.0±3.2 90.7±3.3 116.3±3.579.0±3.7 118.7±3.2*与生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001实施例6淫羊藿苷对抑郁模型小鼠脑部MAO酶(包括MAO-A、B)活力的影响原理同实施例3。
实验材料与仪器同实施例3。
实验动物实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物分组情况C 正常生理盐水对照组M 模型生理盐水对照组F 模型氟西汀给药组(10mg/kg)YH模型淫羊藿苷高剂量给药组(50mg/kg)YL模型组淫羊藿苷低剂量给药组(12.5mg/kg)给药方式阳性药盐酸氟西汀，阿米替林和样品淫羊藿苷按上述浓度在生理盐水分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃给药方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药21天。每组动物数15只。
实验方法同实施例3。
统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果抑郁模型小鼠脑部MAO酶活力极显著高于空白对照组，而口服给药2个剂量淫羊藿苷21天后抑郁模型小鼠脑部的MAO酶活性水平都被极显著降低。
效果都都优于阳性药。数据详见表6。
表6淫羊藿苷对小鼠脑部MAO酶活性的影响组别酶活力(U/g pro)抑制率(％)MAO-A MAO-B MAO-A MAO-BC 41.88±0.49 38.00±0.64M 60.04±0.67###52.73±0.56###F 44.35±0.42***47.42±0.90 26.1％10.1％A 40.05±0.66***44.36±0.72**33.3％15.9％YH 31.83±0.41***33.35±0.88***35.3％36.7％YL 45.40±1.43**40.56±1.11**24.4％23.1％与模型生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与正常生理盐水对照组比较###P＜0.001实施例7淫羊藿苷对CMS模型大鼠蔗糖水饮用量的影响动物模型CMS(慢性温和刺激模型)模型原理CMS模型是近年来抑郁症病理和药理研究方面的一个得到广泛认同的模型，该模型模拟了一系列恶劣的生存环境对动物进行刺激，在一个段较长的时间里，多种刺激循环组合进行。与其它一些抑郁模型比较，CMS模型造模方式与人的抑郁症的成因更加相似，可信度更高。且经过验证，临床应用的绝大多数的抗抑郁药如经典抗抗抑郁药如三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、5-羟色胺重摄取抑制剂等在该模型上均有效。目前，CMS模型已经作为一个公认的抗抑郁药筛选模型得到广泛应用。
抑郁症的一个主要行为症状是病态动物对环境改变的敏感度下降，对奖赏性刺激敏感度减小。CMS模型大鼠在断水断食18小时后给予1％蔗糖水1小时，动物相对蔗糖水摄入量(蔗糖水绝对摄入量g/大鼠体重kg)的大小可以表明其对奖赏性刺激的敏感度大小。
实验动物动物雄性SD大鼠，体重300-350g，南京中医药大学动物中心提供阳性药物盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)动物分组和剂量说明如下C 正常5％CMC-Na对照组M 模型5％CMC-Na对照组YC正常淫羊藿给药对照组(25mg/kg)FC正常盐酸氟西汀给药对照组(7mg/kg)F 模型盐酸氟西汀给药组(7mg/kg)YH模型淫羊藿苷高剂量给药组(35mg/kg)YL模型淫羊藿苷低剂量给药组(17.5mg/kg)实验方法1)给药方式阳性药和淫羊藿苷按上述浓度在5％CMC-Na中分散成混悬液。5％CMC-Na作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃给药方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药6周(1周进行一次糖水实验)。
实验方法低频频闪，断水断食，45度斜笼，陌生动物配对，污笼，噪声6种刺组合循环刺激造模，CMS模型成功后连续给药6周(1周进行一次糖水实验)。
2)糖水实验具体步骤为断水断食18小时后于中午11-12点给予动物1％蔗糖水饮用，测定这1小时动物的相对蔗糖水摄入量(蔗糖水绝对摄入量g/大鼠体重kg)。
3)数据统计处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果CMS模型大鼠给药前相对蔗糖水摄入量显著低于空白对照组大鼠，高、低两个剂量的淫羊藿苷口服给药均能不同程度增加大鼠相对蔗糖水的摄入量。并且随给药时间的延长药效保持并有增强趋势。6周给药结果显示，低剂量给药效果较好，达到极其显著，其效果接近阳性药盐酸氟西汀；而正常淫羊藿给药对照组的动物相对蔗糖水摄入量无显著影响。数据详见表9。
表9淫羊藿苷对CMS模型大鼠相对蔗糖水摄入量影响组别相对糖水摄入量(g/kg体重)0 1 23 45 6weekC 28.20±0.63 29.81±1.18 25.79±1.18 30.50±1.70 32.88±1.79 28.90±1.14 29.94±0.88YC 27.28±1.38 29.16±1.67 26.64±1.32 32.23±1.36 31.01±2.08 27.74±1.45 31.98±0.99FC 30.28±1.02 32.52±2.20 28.98±2.13 31.67±0.66 28.82±2.62 30.52±2.44 33.40±2.71M 20.77±1.37#21.33±1.00#19.69±1.29#22.36±1.46#22.22±0.75#21.52±0.89#18.67±1.01##F 19.90±1.18#27.92±2.40 30.57±0.89**32.47±1.16*36.76±1.68**35.58±1.99*37.64±1.51***YL 22.99±1.17#25.62±1.12 27.77±1.58 30.96±0.83*33.20±1.22**32.16±1.95*35.15±1.34***YH 19.20±1.59#24.96±2.01 25.47±1.63 24.33±1.07 29.12±1.59*29.78±2.82 31.76±2.24**与模型空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与正常空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.0权利要求
1.淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的淫羊藿提取物的应用，其特征在于所述的提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用
3.根据权利要求1所述的淫羊藿提取物的应用，其特征在于所述的提取物还包括活性成分淫羊藿苷单体在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用
4.根据权利要求2所述的淫羊藿提取物的应用，其特征在于所述的淫羊藿总黄酮含有5-90％的活性成分淫羊藿苷。
全文摘要
本发明涉及淫羊藿提取物在制药领域中的新用途，该提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷单体在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷单体经药效学试验的结果表明可显著缩短小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间，可显著逆转CMS引起大鼠蔗糖摄入量的减少，显示有抗抑郁作用，并可显著抑制动物脑部单胺氧化酶A和B的活性，从而达到抗抑郁的目的。该药物的药效成分明确，淫羊藿苷为结构稳定的单体，易于该药物的质量控制，适合于工业规模化生产，并经实验验证抗抑郁活性明显，安全可靠，药源丰富，从而降低生产成本。
文档编号A61P25/00GK1628777SQ200410041720
公开日2005年6月22日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者孔令东, 潘颖, 钟海波 申请人:南京大学
技术领域：
本发明涉及淫羊藿提取物的新用途，具体地说是涉及淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。
背景技术：
抑郁症指情感性精神障碍综合症，以心境低落为主要特征。临床主要表现为抑郁心情、疲劳感、快感缺乏、思维和运动迟滞，伴有焦虑、睡眠障碍、食欲不振、绝望及自杀妄想等。临床上抑郁症常与其它严重疾病如心脏病、脑中风、癌症、免疫性疾病等并存。世界卫生组织精神病流行情况调查报告显示，抑郁症已经成为现代社会危害人类身心健康的常见病，且有愈加严重的趋势。
目前临床上常用的抗抑郁药物大多为人工合成的有机物，有如下几类(1)单胺氧化酶抑制剂(MAO-AI)(如吗氯贝胺)；(2)5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)(如氟西汀)；(3)5-羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂(SNRI)；(4)双重5-HT阻断剂(奈法唑酮)；(5)NE和DA重摄取抑制剂(如bupropin)。已有大量的研究和临床资料表明，这些合成的抗抑郁药大多具有难以克服的缺点，例如抗抑郁谱较窄、毒副作用较大、停药后易复发等，即便是临床首选西药氟西汀，近来也不断有其诱发自杀倾向的负面报道。如何保证并保持抗抑郁药物的疗效、同时降低其毒副作用，或者筛选出一种疗效好且毒副作用小的新型抗抑郁药物成为科研工作者所面临的一个课题。
中医上讲抑郁症是指情志不宁、气机郁滞引起的一类病症，与西医上讲的抑郁症有很多共同之处。一部分传统中药名方具有与西药相当甚至更好的抗抑郁效果且安全可靠。但传统中药复方缺点在于起效较慢，组分复杂，活性成分不明确，难以制定和实施严格的质量控制标准。因此找到疗效确切的单体，成为解决应用中药治疗抑郁症的关键。
中药材淫羊藿最早记载于《神农本草经》，为传统的补虚壮阳中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。
淫羊藿的主要成分是淫羊藿总黄酮(包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷等)和淫羊藿多糖。前人对淫羊藿，淫羊藿总黄酮提取物(包含淫羊藿苷)和单成分淫羊藿苷的研究已经证明它们有多种生物学活性
淫羊藿具有明显性激素样作用，对心血管系统和免疫系统有调节作用，此外还有促进骨细胞增殖，抗衰老等活性。
淫羊藿总黄酮具有性激素样作用，对心血管系统和免疫系统有调节作用，可用以降血糖、降血脂、降血压，改善脑血流量和脑缺血并改变血液流变学指标，改善造血系统障碍，提高人体免疫力，此外还有促进骨细胞增殖，抗衰老，抗炎，抗病毒等活性。
淫羊藿苷具有性激素样作用，对心血管系统和免疫系统有调节作用，有促进骨细胞增殖，抗衰老，抗炎，抗病毒等活性，此外还有抗肿瘤活性的报道。
近年来针对淫羊藿化学成分和药理作用的研究十分活跃，受到国内外广泛关注。且淫羊藿在我国产地分布广，产量大，具有巨大的研究和开发潜力。
此前，国内外均无淫羊藿提取物、淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷三者具有抗抑郁活性的相关报道。
发明内容
1、发明目的本发明的目的在于提供淫羊藿提取物的新用途，具体地说是指淫羊藿提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷在制备预防和治疗抑郁症的药物中的应用。
2、技术方案本发明人用中药材淫羊藿分别经水、75％乙醇、90％乙醇回流提取，再经石油醚脱脂后分别用酸碱沉淀法、乙酸乙酯萃取法、铅盐沉淀法或用重结晶等方法获得提取物，经干燥可得到外观为黄绿色粉末的总黄酮提取物，经检测其中含淫羊藿苷含量在5～90％。经实验验证，该总黄酮提取物具有抗抑郁活性；本发明人将该总黄酮提取物进一步纯化，用多种浓度甲醇水溶液反复提取纯化，再经HPLC分离得到外观为浅黄绿色粉末，经检测，确定其为淫羊藿苷，含量达到98％以上。
淫羊藿苷的结构式如下 淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用，该提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮，还包括活性成分淫羊藿苷单体，在淫羊藿总黄酮提取物中含有5-90％的淫羊藿苷。
本发明人的实验研究表明，以淫羊藿苷为主要活性成分(5～90％)的淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷单体都具有明显的抗抑郁作用，其抗抑郁效果与目前临床上广泛使用的盐酸氟西汀相似。中药淫羊藿在很多中药滋补方剂中都有应用，由此可以推知淫羊藿苷作为药物是相对安全的，且可通过动物的药理和毒理实验验证。
本发明所述中药成分淫羊藿苷及含淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮提取物经过以下抑郁动物模型和有关抑郁的生化指标的实验结果，验证了其抗抑郁效果(1)淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对小鼠悬尾不动时间的影响在小鼠悬尾行为绝望模型上，口服给予淫羊藿苷(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)和淫羊藿总黄酮(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)均可显著缩短小鼠悬尾不动时间，显示有抗抑郁作用。
(2)淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对小鼠强迫游泳不动时间的影响在小鼠强迫游泳行为绝望模型上，口服给予淫羊藿苷(100mg/kg、50mg/kg和25mg/kg)和淫羊藿总黄酮(200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg)均可显著缩短强迫游泳不动时间，显示有抗抑郁作用。
(3)淫羊藿苷对慢性刺激应激(CMS)大鼠蔗糖摄入量的影响在CMS模型上，口服给予淫羊藿苷(75mg/kg和37.5mg/kg)，可显著逆转CMS引起大鼠蔗糖摄入量的减少，进一步证明淫羊藿苷具有抗抑郁作用。
(4)淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对抑郁动物体内单胺氧化酶-A和B(MAO-A、MAO-B)活性的影响口服给予淫羊藿苷(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)和淫羊藿总黄酮(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)均可显著抑制模型动物脑部MAO-A、MAO-B活性，表明淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮可通过抑制MAO活性而达到抗抑郁的目的。
3、有益效果本发明提供的淫羊藿苷和含主要成分淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮在制备预防和治疗抗抑郁症药物中的新应用，它具有以下优点(1)药效成分明确，淫羊藿苷为结构稳定的单体，易于该药物进行质量控制，适合工业规模化生产；(2)经实验验证抗抑郁活性明显；(3)该提取物为天然中药成分，安全性好。
(4)淫羊藿在我国产地分布广、产量大，药源丰富，可以降低生产成本。
具体实施例方式
通过以下实施例来进一步说明本发明的有益效果实施例1淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量为55％)对小鼠悬尾模型行为指标的影响动物模型小鼠悬尾模型原理抑郁症的一个主要症状是动机行为的减少。悬尾实验模型中，悬尾小鼠为克服不正常体位而挣扎活动，这是小鼠的动机行为，但活动到一定时间后，出现间断性不动，显示“失望”状态。这里所指的不动性反映了一种被称之为“行为绝望和扭曲(behavioral despair and variant)”或“对强压环境适应的失败(failure to adapt to stress)”状态，是一种消极的无动机绝望状态。小鼠悬尾行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感，并且操作简单、快捷，因此被广泛用于该类药物的筛选。
实验药物盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量为55％)实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物饲养于25±1℃室内，自由饮水进食，适应1周后随机分组，每组15只。
动物分组情况C 生理盐水对照组F 氟西汀给药组(10mg/kg)YH淫羊藿总黄酮高剂量给药组(200mg/kg)YM淫羊藿总黄酮中剂量给药组(100mg/kg)YL淫羊藿总黄酮低剂量给药组(50mg/kg)实验方法1)给药剂量和方式阳性药盐酸氟西汀(10mg/kg)和样品淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿苷含量55％)高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)剂量按所需浓度在生理盐水中分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药14天，行为实验分别在第1、7、14天进行，实验前一小时给药。
2)小鼠开场行为实验在直径80cm、高20cm的柱形箱内设3个同心圆，直径分别为14，28，42cm，将箱内分为36个无壁小室。箱中心用一个悬挂在40cm高处的60W的电灯泡照亮，整个实验过程中，操作间保持黑暗。单只小鼠被放在整个装置的中央，可自由活动。记录3min内小鼠的移动次数(小鼠四爪都跨越小室边界的次数)、竖起次数(小鼠前肢抬起、后肢站立的次数)和理毛次数。
3)小鼠悬尾实验夹住小鼠尾端2cm的部位，使其倒挂于金属桶中，头部离桶底约5cm，观察6min，记录后4min内的不动时间。
4)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为试验结果显示，与不给药的空白对照组相比，本实验3个剂量的淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)口服给药对小鼠开场行为无显著影响(实验数据略)，说明淫羊藿总黄酮减少悬尾小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠悬尾实验结果显示，3个剂量淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)口服给药后均能不同程度地减少悬尾模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效趋于稳定并有增强趋势。给药2周后，3个剂量都达到显著减少悬尾模型小鼠绝望时间的抗抑郁效果，低剂量(25mg/kg)给药显示出的效果最好，其药效与阳性药氟西汀相当。数据详见表1。
-5-表1淫羊藿总黄酮对悬尾实验中小鼠不动时间的影响组别给药剂量不动时间(s)mg/kg 第1天 第7天第14天C 57.88±3.66 70.85±4.06 78.87±5.08F 1032.69±2.25*34.71±1.76**35.52±2.61*YH200 55.81±3.34 44.46±1.81*43.20±1.33*YM100 48.00±2.70 43.84±3.46 41.39±2.56*YL5044.49±2.91 30.08±1.90*36.76±2.69*与生理盐水对照组比较*P＜0.05**P＜0.01实施例2淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量为55％)对小鼠强迫游泳模型行为指标的影响动物模型小鼠强迫游泳模型原理抑郁症的一个主要症状是动机行为的减少。强迫游泳模型中，小鼠被迫在一局限的空间内游泳，它们首先表现出挣扎和试图逃跑的动机行为，随后处于一种被称为“绝望”的不动状态。这里所指的不动性反映了一种被称之为“行为绝望和扭曲(behavioral despair and variant)”或“对强压环境适应的失败(failure to adapt to stress)”状态，是一种消极的无动机绝望状态。小鼠强迫游泳行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感，并且操作简单、快捷，因此被广泛用于该类药物的筛选。
实验药物同实施例1实验动物同实施例1实验方法1)给药方式和剂量同实施例12)开场行为试验同实施例13)小鼠强迫游泳试验将小鼠放入水深10cm烧杯(18cm高，14cm直径)中，水温25±1℃。观察6min，记录后4min内的不动时间。
4)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为试验结果显示，与不给药的空白对照组相比，本实验3个剂量的淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿苷含量55％)口服给药对小鼠开场行为无显著影响(实验数据略)，说明淫羊藿总黄酮减少强迫游泳小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠强迫游泳试验结果显示，3个剂量淫羊藿总黄酮(含淫羊藿苷55％)提取物口服给药均能不同程度地减少强迫游泳模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效趋于稳定并有增强趋势。给药2周后，高、低2个剂量达到极显著而中剂量达到显著减少强迫游泳模型小鼠绝望时间的抗抑郁效果，高剂量效果为最好，与阳性药盐酸氟西汀相当。数据详见表2。
表2淫羊藿总黄酮提取物对强迫游泳实验中小鼠不动时间的影响动物分组 剂量不动时间(s)mg/kg 第1天 第7天 第14天C138.63±3.40 161.63±3.02 60.85±2.91F10 124.61±5.24 100.89±3.67 101.95±3.97YH 200 117.57±5.05 107.79±3.46***106.80±4.02***YM 100 123.38±4.33 136.73±4.04 134.03±4.03*YL 50 110.11±2.66*110.54±3.82**109.97±4.35**与生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001实施例3淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)对抑郁模型小鼠脑部MAO酶(包括MAO-A、MAO-B)活性的影响原理近年来对抗抑郁作用机理的研究表明，药物的抗抑郁作用与生物体的单胺神经元功能状态密切相关通过抑制单胺氧化酶活性，可以选择性抑制突触间相关单胺递质的降解，增高其浓度，从而增强单胺神经元功能。因此单胺氧化酶(MAO)的活性被认为是抑郁病理的一个重要指标。本发明人对小鼠的脑部的MAO-A和MAO-B的酶活性进行了检测。
实验材料与仪器实验材料盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)阿米替林(常州四药厂)牛血清蛋白(SIGMA公司产品)5-HT，苄胺(SIGMA公司产品)乙酸丁酯A.R.(上海凌峰化学试剂有限公司)环己烷A.R.(上海凌峰化学试剂有限公司)实验主要仪器WH-3微型旋涡混合仪上海沪西仪器厂XHF-1高速分散器(上海金达生化仪器厂)U-3000 spectrophotometer(Hitachi，Ltd.Tokyo Japan)TDA系列温度显示调节仪(宁波自动化仪表厂)(水浴锅)TGL-16G台式高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物分组情况C 正常生理盐水对照组M 模型生理盐水对照组F 模型氟西汀给药组(10mg/kg)YH模型淫羊藿总黄酮提取物高剂量给药组(100mg/kg)YL模型淫羊藿总黄酮提取物低剂量给药组(50mg/kg)实验方法1)给药方式阳性药盐酸氟西汀(10mg/kg)和样品淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿苷含量55％)高剂量按所需浓度在生理盐水中分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药21天。每组动物数15只。
2)试验方法模型小鼠给药21天后置冰盘中上眼球取血、断头处死，迅速于冰台上取脑，于称量纸上称重，置-20℃冰箱保存，MAO酶活性采用紫外分光法测定。
3)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果
抑郁模型生理盐水对照小鼠脑部MAO酶活力明显高于空白生理盐水对照组小鼠，有极显著差异(P＜0.01)。而通过口服2个剂量淫羊藿总黄酮提取物21天后，抑郁模型小鼠脑部的MAO酶活力水平均被极显著降低，效果优于阳性药盐酸氟西汀。数据详见表3表3淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷含量55％)对小鼠脑部MAO酶活力的影响动物分组酶活力(U/g pro)抑制率(％)MAO-AMAO-B MAO-A MAO-BC 14.13±0.53 4.21±0.31M 19.03±0.17##7.80±0.29##F 10.80±0.34***5.19±0.35*43.3％33.4％YH 7.02±0.27***2.82±0.19***63.1％63.8％YL 9.59±0.20***4.14±0.35**49.6％46.9％与模型生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与同正常生理盐水对照组比较##P＜0.01实施例4淫羊藿苷对小鼠悬尾模型中行为指标的影响动物模型同实施例1原理同实施例1实验药物盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)阿米替林(常州四药厂)淫羊藿苷单体(含量98％)实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物饲养于25±1℃室内，自由饮水进食，适应1周后随机分组。
分组情况C 生理盐水对照组F 氟西汀给药组(10mg/kg)AM阿米替林给药组(10mg/kg)YH淫羊藿苷高剂量组给药(100mg/kg)YM淫羊藿苷中剂量组给药(50mg/kg)
YL淫羊藿苷低剂量组给药(25mg/kg)实验方法1)开场行为实验同实施例12)小鼠悬尾实验同实施例13)给药方式2种阳性药和淫羊藿苷按上述浓度在生理盐水分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃给药方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药21天，行为实验分别在第1、3、7、14、21天进行，实验前一小时给药。每组实验动物数15只。
4)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为实验结果表明与空白对照组比较，本实验3个剂量淫羊藿苷口服给药对小鼠开场行为无显著影响，说明本实验中淫羊藿苷减少悬尾小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠悬尾实验结果显示，3个剂量淫羊藿苷口服给药后均能不同程度地减少悬尾模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效药效趋于稳定并有增强趋势。给药3周后，3个剂量都达到显著和极显著减少模型动物绝望不动时间的抗抑郁效果，低剂量(25mg/kg)给药显示出的效果最好，其药效与阳性药氟西汀和阿米替林相当。数据详见表4。
表4淫羊藿苷对悬尾实验中小鼠不动时间的影响组别不动时间(s)第1天 第3天第7天 第14天 第21天C 80.3±1.4 62.5±1.669.8±1.8 87.8±2.6 96.1±2.5F 47.4±1.5***46.3±2.447.1±1.9*48.0±1.6**39.3±1.8***AM 49.7±2.0**50.2±1.838.1±1.5**54.1±1.9*45.0±2.6***YH 77.3±2.1 63.4±2.257.7±1.4 63.8±2.0*64.2±1.8**YM 64.9±2.1 68.1±1.656.9±1.9 64.1±2.1 66.3±2.4*YL 69.2±2.9 62.4±2.358.2±3.0 50.6±2.6*47.9±2.6***与生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例5淫羊藿苷对小鼠强迫游泳模型中行为指标的影响动物模型同实施例2原理同实施例2实验药物与动物同实施例4实验方法1)开场行为实验同实施例12)小鼠强迫游泳实验同实施例23)给药方式同实施例44)统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果1)开场行为实验结果表明开场行为实验结果表明与空白对照组比较，本实验3个剂量淫羊藿苷口服给药对小鼠开场行为无显著影响，说明本实验中淫羊藿苷减少强迫游泳小鼠不动时间的抗抑郁作用与中枢神经系统兴奋性无关。
2)小鼠强迫游泳实验结果显示，3个剂量淫羊藿苷口服给药后均能不同程度地减少悬尾模型小鼠的绝对不动时间，并且随给药时间的延长药效药效趋于稳定并有增强趋势。给药3周后，高、低剂量都达到显著和极显著减少模型动物绝望不动时间的抗抑郁效果，高剂量(100mg/kg)给药显示出的效果最好，其药效优于阳性药氟西汀和阿米替林相当。数据详见表5表5淫羊藿苷对强迫游泳实验小鼠不动时间的影响组别不动时间(s)样本量15 第1天 第3天 第7天 第14天第21天C 96.5±2.4 104.5±3.1108.7±3.1128.9±6.2152.6±3.7F 75.8±2.5 94.8±3.6 100.5±4.0128.3±5.4159.0±3.6AM 63.4±2.9*61.5±3.0*79.2±3.2 104.0±3.6111.7±4.0*YH 98.8±3.8 94.4±3.2 130.0±3.3127.9±3.386.0±3.3***YM 86.6±2.9 133.7±3.3161.4±2.7179.2±3.0190.1±3.4YL 85.0±3.2 90.7±3.3 116.3±3.579.0±3.7 118.7±3.2*与生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001实施例6淫羊藿苷对抑郁模型小鼠脑部MAO酶(包括MAO-A、B)活力的影响原理同实施例3。
实验材料与仪器同实施例3。
实验动物实验动物雄性ICR小鼠，25±2g，购于南京中医药大学实验动物中心。
动物分组情况C 正常生理盐水对照组M 模型生理盐水对照组F 模型氟西汀给药组(10mg/kg)YH模型淫羊藿苷高剂量给药组(50mg/kg)YL模型组淫羊藿苷低剂量给药组(12.5mg/kg)给药方式阳性药盐酸氟西汀，阿米替林和样品淫羊藿苷按上述浓度在生理盐水分散成混悬液。生理盐水作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃给药方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药21天。每组动物数15只。
实验方法同实施例3。
统计学处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果抑郁模型小鼠脑部MAO酶活力极显著高于空白对照组，而口服给药2个剂量淫羊藿苷21天后抑郁模型小鼠脑部的MAO酶活性水平都被极显著降低。
效果都都优于阳性药。数据详见表6。
表6淫羊藿苷对小鼠脑部MAO酶活性的影响组别酶活力(U/g pro)抑制率(％)MAO-A MAO-B MAO-A MAO-BC 41.88±0.49 38.00±0.64M 60.04±0.67###52.73±0.56###F 44.35±0.42***47.42±0.90 26.1％10.1％A 40.05±0.66***44.36±0.72**33.3％15.9％YH 31.83±0.41***33.35±0.88***35.3％36.7％YL 45.40±1.43**40.56±1.11**24.4％23.1％与模型生理盐水对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与正常生理盐水对照组比较###P＜0.001实施例7淫羊藿苷对CMS模型大鼠蔗糖水饮用量的影响动物模型CMS(慢性温和刺激模型)模型原理CMS模型是近年来抑郁症病理和药理研究方面的一个得到广泛认同的模型，该模型模拟了一系列恶劣的生存环境对动物进行刺激，在一个段较长的时间里，多种刺激循环组合进行。与其它一些抑郁模型比较，CMS模型造模方式与人的抑郁症的成因更加相似，可信度更高。且经过验证，临床应用的绝大多数的抗抑郁药如经典抗抗抑郁药如三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、5-羟色胺重摄取抑制剂等在该模型上均有效。目前，CMS模型已经作为一个公认的抗抑郁药筛选模型得到广泛应用。
抑郁症的一个主要行为症状是病态动物对环境改变的敏感度下降，对奖赏性刺激敏感度减小。CMS模型大鼠在断水断食18小时后给予1％蔗糖水1小时，动物相对蔗糖水摄入量(蔗糖水绝对摄入量g/大鼠体重kg)的大小可以表明其对奖赏性刺激的敏感度大小。
实验动物动物雄性SD大鼠，体重300-350g，南京中医药大学动物中心提供阳性药物盐酸氟西汀(fluoxetine，常州四药厂)动物分组和剂量说明如下C 正常5％CMC-Na对照组M 模型5％CMC-Na对照组YC正常淫羊藿给药对照组(25mg/kg)FC正常盐酸氟西汀给药对照组(7mg/kg)F 模型盐酸氟西汀给药组(7mg/kg)YH模型淫羊藿苷高剂量给药组(35mg/kg)YL模型淫羊藿苷低剂量给药组(17.5mg/kg)实验方法1)给药方式阳性药和淫羊藿苷按上述浓度在5％CMC-Na中分散成混悬液。5％CMC-Na作为模型对照组药物。所有药液均采用灌胃给药方式给药。给药时间固定在每天的10:00，连续给药6周(1周进行一次糖水实验)。
实验方法低频频闪，断水断食，45度斜笼，陌生动物配对，污笼，噪声6种刺组合循环刺激造模，CMS模型成功后连续给药6周(1周进行一次糖水实验)。
2)糖水实验具体步骤为断水断食18小时后于中午11-12点给予动物1％蔗糖水饮用，测定这1小时动物的相对蔗糖水摄入量(蔗糖水绝对摄入量g/大鼠体重kg)。
3)数据统计处理采用t-Student检测方法对实验数据进行统计学处理。实验数据用MEAN±S.E.M表示。
实验结果CMS模型大鼠给药前相对蔗糖水摄入量显著低于空白对照组大鼠，高、低两个剂量的淫羊藿苷口服给药均能不同程度增加大鼠相对蔗糖水的摄入量。并且随给药时间的延长药效保持并有增强趋势。6周给药结果显示，低剂量给药效果较好，达到极其显著，其效果接近阳性药盐酸氟西汀；而正常淫羊藿给药对照组的动物相对蔗糖水摄入量无显著影响。数据详见表9。
表9淫羊藿苷对CMS模型大鼠相对蔗糖水摄入量影响组别相对糖水摄入量(g/kg体重)0 1 23 45 6weekC 28.20±0.63 29.81±1.18 25.79±1.18 30.50±1.70 32.88±1.79 28.90±1.14 29.94±0.88YC 27.28±1.38 29.16±1.67 26.64±1.32 32.23±1.36 31.01±2.08 27.74±1.45 31.98±0.99FC 30.28±1.02 32.52±2.20 28.98±2.13 31.67±0.66 28.82±2.62 30.52±2.44 33.40±2.71M 20.77±1.37#21.33±1.00#19.69±1.29#22.36±1.46#22.22±0.75#21.52±0.89#18.67±1.01##F 19.90±1.18#27.92±2.40 30.57±0.89**32.47±1.16*36.76±1.68**35.58±1.99*37.64±1.51***YL 22.99±1.17#25.62±1.12 27.77±1.58 30.96±0.83*33.20±1.22**32.16±1.95*35.15±1.34***YH 19.20±1.59#24.96±2.01 25.47±1.63 24.33±1.07 29.12±1.59*29.78±2.82 31.76±2.24**与模型空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与正常空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.0权利要求
1.淫羊藿提取物在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的淫羊藿提取物的应用，其特征在于所述的提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用
3.根据权利要求1所述的淫羊藿提取物的应用，其特征在于所述的提取物还包括活性成分淫羊藿苷单体在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用
4.根据权利要求2所述的淫羊藿提取物的应用，其特征在于所述的淫羊藿总黄酮含有5-90％的活性成分淫羊藿苷。
全文摘要
本发明涉及淫羊藿提取物在制药领域中的新用途，该提取物包括活性成分淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷单体在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷单体经药效学试验的结果表明可显著缩短小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间，可显著逆转CMS引起大鼠蔗糖摄入量的减少，显示有抗抑郁作用，并可显著抑制动物脑部单胺氧化酶A和B的活性，从而达到抗抑郁的目的。该药物的药效成分明确，淫羊藿苷为结构稳定的单体，易于该药物的质量控制，适合于工业规模化生产，并经实验验证抗抑郁活性明显，安全可靠，药源丰富，从而降低生产成本。
文档编号A61P25/00GK1628777SQ200410041720
公开日2005年6月22日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者孔令东, 潘颖, 钟海波 申请人:南京大学
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