治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法
专利名称：治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法
技术领域：
本发明涉及组合中药材的提取物及提取方法，特别是治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法。
背景技术：
呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，随着现代工业发展，空气污染日益严重。外界的有害物质，如各种有害气体、粉尘、致敏微生物和致敏原直接吸入肺部，使呼吸系统发病率和病死率都在增加。1998年我国农村地区抽样调查显示呼吸系统疾病死亡率居于首位，占总死亡率的25％。上海地区居民医院就诊占首位的也是呼吸道疾病。据不完全统计，这一疾病成人的发病率为5％，而老人和儿童的发病率更高。急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病主要是由于风、寒、暑、湿、燥、火六气之邪犯肺所致。风、寒、暑、湿、燥、火六气皆能致咳，急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病久延不愈可转为内伤咳嗽，内伤咳嗽复感外邪，又易诱发和加重。但是由于四时气候变化的不同，人体所感受的致病外邪亦有区别，因而在临床上有风寒、风热及燥热等不同咳嗽。不论由于风寒、风热或燥热，多以风为先导，挟寒、热、燥等外邪入侵，伤于肺系而为咳嗽。近年来对呼吸系统疾病常见的咳、痰、喘的病因病理学及其相互关系有了进一步的了解，也试用过多种疗法，但仍以药物治疗为主。呼吸系统疾病最近几年来开发出的新药也不少，但疗效尚不够理想。现有技术中，虽有一些临床经验组方，药效方中的成份因产地、气侯等不可预知因素，无法控制稳定的质量和疗效。但用药极度为不便。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，通过对祛邪宣肺，肃肺止咳的临床经验组方的进行药理研究筛选，提高治疗急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病的疗效。提出了一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法。
本发明的目的是由以下技术方案来达到的，本发明是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是组合中药材提取物原料的重量配方为桑叶400～600前胡400～600黄芩400～600杏仁400～600桔梗160～240浙贝母400～600枇杷叶400～600 南沙参400～600 姜半夏400～600陈皮240～360甘草120～180(a)桑叶、陈皮加4～8倍量水浸泡2～4小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集4～10倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡0.5～2.0小时后，煎煮2～4次，每次2～3小时，每次用水4～8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加50～80％乙醇浸泡0.5～2.0小时后，加热回流提取2～4次，每次1.0～2.0小时，每次乙醇用量为4～7倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物；上述方法为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物的提取方法；桑叶和陈皮挥发油和组合中药材液体提取物为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物。
本发明的目的由以下技术方案来进一步达到，根据前述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为6～9∶1的重量比，在20～40℃的包合温度下，将(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为2.5～3.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
本发明的目的由以下技术方案来进一步达到，根据前述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加分散剂，再加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，混匀，制成软胶囊。
本发明的目的由以下技术方案来进一步达到，根据前述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，按药剂学所述的常规方法制成口服液。
本发明与现有技术相比，本发明依据上述中医理论而确立治法，其中筛选的是祛邪宣肺，肃肺止咳的临床经验组方的进行药理研究筛选，将临床上用于急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病经验方中的药材经现代化提取工艺制成新剂型，提高了临床疗效。并根据其组成药物在处方中的地位及其所含活性成分的理化特性，制订了较为客观的质量标准，有稳定可控的质量和疗效。选用本发明的剂型。它不仅保持了汤剂的特色，而且提高疗效、减少用药体积、便于患者服用；克服了汤剂服前临时煎煮、容易变质霉败的缺点，有利于大批量生产和贮运。实验也证明，本发明的组合中药材的提取物制得的制剂，在急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病方面有确切的疗效。
具体实施例方式
下面为本发明的实施例，进一步描述本发明的发明内容。
实施例一、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，组合中药材提取物原料的重量(克)配方为桑叶500前胡500 黄芩500杏仁500桔梗200浙贝母500枇杷叶500 南沙参500姜半夏500 陈皮300 甘草150(a)桑叶、陈皮加6倍量水浸泡3小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集6倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡1小时后，煎煮3次，每次2.5小时，每次用水7倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.08，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加60％乙醇浸泡1小时后，加热回流提取3次，每次1.8小时，每次乙醇用量为6倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.08，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物。
实施例二、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为8∶1的重量比，在30℃的包合温度下，将实施例一中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为3小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将实施例一中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
实施例三、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为6∶1的重量比，在20℃的包合温度下，将实施例一中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为2.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将实施例一中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
实施例四、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为9∶1的重量比，在40℃的包合温度下，将实施例一中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为3.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将实施例一中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
实施例五、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，组合中药材提取物原料的重量(克)配方为
桑叶400前胡400黄芩400 杏仁600桔梗160浙贝母600 枇杷叶600南沙参400姜半夏600 陈皮360甘草120(a)桑叶、陈皮加4倍量水浸泡4小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集4倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡0.5小时后，煎煮4次，每次2小时，每次用水4倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.1，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加50％重量浓度的乙醇浸泡2小时后，加热回流提取2次，每次2小时，每次乙醇用量为7倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.1，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物。
实施例六、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，将实施例五中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加分散剂，再加入将实施例五中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，混匀，制成软胶囊。
实施例七、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，组合中药材提取物原料的重量(克)配方为
桑叶600前胡600黄芩600 杏仁400桔梗240浙贝母400 枇杷叶400南沙参600姜半夏400 陈皮240甘草180(a)桑叶、陈皮加8倍量水浸泡2小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集10倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡2小时后，煎煮2次，每次3小时，每次用水8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.05，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加80％重量浓度的乙醇浸泡0.5小时后，加热回流提取4次，每次1小时，每次乙醇用量为4倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.05，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物。
实施例八、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，将实施例七中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加入实施例七中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，按药剂学所述的常规方法制成口服液。
药效实验在下述药效实验中定义本发明的药剂名称为止咳桑杏颗粒一、概述经主要药效学试验，止咳桑杏颗粒具有抗菌、抗病毒、止咳、祛痰、抗炎等药理作用。
1)体外抗菌实验表明，止咳桑杏颗粒对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、不动杆菌、表葡萄球菌、洋葱假单孢杆菌、人葡萄球菌、链球菌、变形杆菌有一定的抑菌作用。
2)体内抗菌实验表明，止咳桑杏颗粒对小鼠体内感染金黄色葡萄球菌有明显的保护作用。
3)体内外抗病毒实验表明，止咳桑杏颗粒体外虽未显示直接抑制甲型流感病毒的作用，但体内对小鼠流感病毒性肺炎均有明显的保护作用，提示其具有一定的抗病毒作用。
4)止咳桑杏颗粒能明显减少豚鼠电刺激所致咳嗽次数；延长氨水所致小鼠引咳潜伏期，减少其咳嗽次数，具有一定的止咳作用。
5)止咳桑杏颗粒能明显增加小鼠气道酚红排出量，表明止咳桑杏颗粒具有增加气道分泌物，促进痰液排出的作用。止咳桑杏颗粒能明显增加大鼠的排痰量，表明止咳桑杏颗粒有显著的化痰作用。
6)止咳桑杏颗粒能明显减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀；抑制HAc所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高，表明具有一定的抗炎作用。
二、实验目的通过主要药效学实验验证止咳桑杏颗粒与临床功能主治有关的作用。
三、实验结果3.1体外抑菌实验3.1.1平板打洞法取16小时培养的各菌株营养肉汤培养物，用营养肉汤作10-3稀释用于实验，在直径9cm的灭菌平皿中加菌液1ml，然后倒入已熔化冷却至45℃的营养琼脂培养物20ml，旋转混匀，等凝固后用直径6mm的灭菌铜管于琼脂平皿上打3个小孔，用无菌镊子取出孔内培养基，于每个孔内分别加入1.0g/ml、0.5g/ml和0.25g/ml药液0.1ml，置37℃培养20h，取出平皿，量取抑菌圈直径，重复一次，取二次实验的平均值。实验按常规设定只有药物不接种细菌的阴性对照和没有药物只接种细菌的阳性对照，结果见表1。
表1 止咳桑杏颗粒对标准菌株和临床分离菌株的抑菌作用
3.1.2试管法取16h培养的各营养菌株营养肉汤培养物，用营养肉汤作10-3稀释用于实验，取止咳桑杏颗粒药液(200mg/ml)0.4ml加入第1管中，混匀后取1ml至第2管，再从第2管中吸取1ml加入第3管中，从第3管吸取1ml弃去，第4管不加药液作为对照，每管加入菌液0.1ml，37℃培养18h。取出观察，结果见表2。
表2 止咳桑杏颗粒对标准菌株和临床分离菌株的MIC(试管法)
*两次实验平均值。
实验结果显示止咳桑杏颗粒对标准金黄色葡萄球菌、不动杆菌、标准枯草芽孢杆菌、标准藤黄微球菌、标准短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、洋葱假单孢杆菌有较强的抑菌作用。
3.2体内抑菌实验3.2.1对肺炎克雷百氏球菌的抑菌作用取昆明种小鼠100只，雌雄各半，随机分为5组，分别为(1)止咳桑杏颗粒小剂量组，9.0g/kg鼠重给药；(2)止咳桑杏颗粒中剂量组，18.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒大剂量组，36.0g/kg鼠重给药；(4)阳性对照组，双黄连口服液0.2ml/10g鼠重给药；(5)空白对照组，给0.2ml/10g鼠重等量生理盐水。各组灌胃容积为20ml/kg，连续8天，于第五天给药后1h腹腔注射肉汤培养的肺炎克雷百氏菌液0.5ml/只，观察72h内感染小鼠的死亡数，计算死亡率和保护率。结果见表3。
表3 止咳桑杏颗粒对小鼠体内肺炎克雷百氏菌的抑菌
结果表明止咳桑杏颗粒对小鼠感染肺炎克雷百氏菌无明显的抑菌作用。
3.2.2对金黄色葡萄球菌的抑制作用取昆明种小鼠100只，雌雄各半，随机分为5组，分别为(1)止咳桑杏颗粒小剂量组，9.0g/kg鼠重给药；(2)止咳桑杏颗粒中剂量组，18.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒大剂量组，36.0g/kg鼠重给药；(4)阳性对照组，双黄连口服液0.2ml/10g鼠重给药；(5)空白对照组，给予生理盐水。各组灌胃容积为20ml.kg-1，连续8天，于第五天给药后1h腹腔注射肉汤培养的金黄色葡萄球菌菌液0.5ml/只，观察72h内的死亡数，计算死亡率和保护率。结果见表4。
表4 止咳桑杏颗粒对小鼠体内感染金黄色葡萄球菌的保护作用
与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01结果表明止咳桑杏颗粒在9.0g/kg、18.0g/kg、36.0g/kg剂量时对小鼠感染金黄色葡萄球菌有明显的保护作用。
3.3抗病毒实验3.3.1体外抗病毒实验3.3.1.1细胞培养半数感染量TCID50滴定病毒鸡胚尿囊液用培养基作10倍递次稀释。将已长成单层细胞的96孔微孔塑料培养板的培养液弃去，每个病毒稀释度接种4孔，每孔100μl，摇匀，37℃吸附1h，弃病毒液，Hank‘s液洗3次，加维持液，每孔0.1ml，放37℃5％CO2孵箱培养。每日用倒置显微镜检查，以最高稀释度不再出现新病变时进行观察。细胞病变在25％以下为+，25～50％为++，50～75％为+++，＞75％为++++。以病变++为终点，用Reed and Muench法计算TCID50。结果TCID50为5.5。
3.3.1.2药物对细胞毒性鉴定细胞长成单层细胞后，弃培养基，将药液按2倍稀释，每孔加各稀释度药液100μl，每个稀释度加4孔，37℃5％CO2孵箱培养。
用倒置显微镜观察细胞病变。对细胞无毒性浓度为10.0mg/ml。应用10.0mg/ml、5.0mg/ml浓度进行实验。
3.3.1.3止咳桑杏颗粒体外抗病毒作用挑选生长良好的Hep-2细胞，经消化、洗脱，细胞计数为2.8×105/ml，取0.1ml接种到96孔微孔塑料培养板，37℃5％CO2培养2d，使长成单层细胞。弃生长液，30TCID50病毒悬液感染宿主细胞(0.1ml)，37℃吸附1h，弃病毒液，加含有药液的维持0.1ml，每个浓度4孔，37℃5％CO2培养，同时取正常细胞对照、病毒对照、病毒唑对照。试验结果见表5。
表5 止咳桑杏颗粒对体外培养流感病毒的影响
注n＝4。
结果表明止咳桑杏颗粒在体外抗病毒实验中，未显示直接抑制甲型流感病毒的作用。
3.3.2体内抗病毒实验3.3.2.1病毒致小鼠半数死亡量的测定(LD50)昆明种小鼠35只，分为7组，取甲型流感病毒(H1N1)鸡胚尿囊液(血凝效价为640)作10倍稀释，每个病毒稀释浓度感染小鼠5只，30μl/只鼠滴鼻观察14天内死亡数，按Reed and Muench法计算LD50。结果LD50为6.5。
3.3.2.2对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用取昆明种小鼠120只，体重12～14g。随机分为6组，每组20只，♀♂各半。(1)常对照组给予等量生理盐水；(2)病毒对照组给予等量生理盐水；(3)病毒唑对照组0.07g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒I组，9.0g/kg鼠重给药；(5)止咳桑杏颗粒II组，18.0g/kg鼠重给药；(6)止咳桑杏颗粒III组，36.0g/kg鼠重给药。
上述各组动物ig给药，1次/d，连续5d。给药后第2d，各组小鼠在乙醚浅麻醉下，以病毒尿囊液滴鼻感染，每鼠30μl(15个LD50攻击量)。观察动物感染后发病症状，记录感染后15d内死亡数。结果如表6所示。
表6 止咳桑杏颗粒对流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
实验结果表明止咳桑杏颗粒三个剂量组，对流感病毒感染小鼠死亡未显示明显的保护作用。
3.3.2.3对小鼠甲型流感病毒性肺炎的作用取昆明种小鼠60只体重12～14g，随机分为6组，每组10只，雌雄各半(1)空白对照组，给予生理盐水；(2)病毒对照组，等量生理盐水；(3)病毒唑组，0.07g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒I组，9.0g/kg鼠重给药；(5)止咳桑杏颗粒II组，18.0g/kg鼠重给药；(6)止咳桑杏颗粒III组，36.0g/kg鼠重给药。各组均ig给药，容量为0.2ml/10g鼠重，1次/d，连续5d。除(1)组外，各组小鼠于给药后第二天以病毒尿囊液滴鼻感染，每鼠30μl，15倍LD50攻击量，正常对照组以生理盐水滴鼻，感染后继续给药4d。实验前各组小鼠禁食12h，不禁水，称重，脱颈椎处死，解剖，肉眼观察肺部病变，取全肺称重，计算肺指数值、肺指数抑制率。实验结果见表7。
表7 止咳桑杏颗粒对流感病毒感染小鼠肺炎的作用
与病毒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果所示止咳桑杏颗粒18.0g/kg和36.0g/kg剂量组的肺指数明显低于病毒对照组，表明该药可减轻甲型流感病毒引起的小鼠肺炎的病变程度。
3.4止咳、祛痰和抗炎实验3.4.1止咳作用3.4.1.1小鼠氨水引咳法取昆明种小鼠60只，雄性，体重18～22g，随机分6组(1)空白对照组给予生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg鼠重给药；(5)急支糖浆组22ml/kg鼠重给药；(6)咳必清组20mg/kg鼠重给药。(1)～(4)给药容积均为10ml/kg，各组每天给药一次，连续给药5d，咳必清组连续给药3d。末次给药45min，将小鼠置于500ml的钟罩中，以超声雾化器将25％浓氨水喷雾5秒钟，然后观察和记录小鼠咳嗽的潜伏期和5分钟内咳嗽的次数。结果见表8。
表8 止咳桑杏颗粒对小鼠氨水所致引咳潜伏期和咳嗽次数的影响(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明止咳桑杏颗粒36.0g/kg剂量组能明显延长氨水所致小鼠引咳潜伏期，减少小鼠的咳嗽次数。
3.4.1.2豚鼠电刺激法取豚鼠30只，雌雄兼用，体重300～400g，随机分6组(1)空白对照组给予生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组3.7g/kg；(3)止咳桑杏颗粒II组7.5g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组15.0g/kg鼠重给药；(5)咳必清组7.0mg/kg鼠重给药；(6)急支糖浆组8.6ml/kg鼠重给药；(1)～(5)给药容积均为10ml/kg，各组每天给药一次，连续给药5d，咳必清组连续给药3d，末次给药后30min，以25％的乌拉坦1g/kg ip麻醉，分离气管，插入Y形气管套管，一个支管与压力换能器相连，连接二道生理记录仪器，记录呼吸运动。用一白金制的单极电极固定于气管背面，另一无关电极插入胸部皮下组织中(手术过程10min做完)。于给药45min时，采用刺激强度3.5V，脉冲宽度50ms，频率10次/秒，刺激时间20s，从记录纸读取咳嗽次数。结果见表9。
表9 止咳桑杏颗粒对豚鼠电刺激所致的咳嗽次数的影响(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明止咳桑杏颗粒15.0g/kg剂量组能明显减少豚鼠电刺激所致咳嗽次数。中、小剂量组与对照组比较没有显著性差异，但仍具有作用的趋势。
3.4.2祛痰试验3.4.2.1小鼠酚红法取昆明种小鼠50只，雄性，体重20～25g，随机分5组(1)空白对照组给予容积生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg鼠重给药；(5)氯化氨组1.0g/kg鼠重给药；各组每天给药一次，连续给药3d，给药容积均为10ml/kg。末次给药30min后，腹腔注射5％酚红生理盐水溶液500mg/kg，注射后30分钟，处死动物，分离气管，以1ml注射器取2.24mmol/LNaHCO3溶液0.5ml，冲洗气道3次，吸取灌洗液0.5ml，重复上述操作3次，共吸取灌洗液1.5ml，将冲洗液吸入试管。在波长546nm处，测量OD值。结果见表10。
表10 止咳桑杏颗粒对小鼠气道内酚红排出量的影响(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明止咳桑杏颗粒36.0g/kg剂量组能明显增加小鼠气道酚红排出量，与对照组比较具有明显差异。表明止咳桑杏颗粒具有增加气道分泌物，促进痰液排出的作用。
3.4.2.2大鼠毛细玻管法取大鼠80只，随机分5组(1)空白对照组给予容积生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组4.5g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒II组9.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组18.0g/kg鼠重给药；(5)氯化氨组0.5g/kg鼠重给药。实验前禁食不禁水12小时。大鼠乌拉坦1g/kg腹腔麻醉后，仰位固定。剪开颈中部皮肤，分离出气管，在甲状腺软骨下缘正中两软骨环之间用尖锐的注射针头扎一小孔，然后插入玻璃毛细管一根，使毛细管刚好接触气管底部表面，借以吸取气管后部之痰液。当毛细管内被液充满时，立即换一根。以毛细管吸取痰液长度作为药物的化痰效果。记录前2小时的正常分必量后，灌胃给药，继续再观察4小时分泌量。结果见表11。
表11 止咳桑杏颗粒对大鼠的祛痰作用(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明，止咳桑杏颗粒4.5g/kg、9.0g/kg、18.0g/kg给药，能明显增加大鼠的排痰量。表明止咳桑杏颗粒有显著的化痰作用。
3.4.3抗炎作用3.4.3.1止咳桑杏颗粒对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响取昆明小鼠60只，雌雄兼用，18～22g，随机分7组(1)空白对照组给予生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg；(3)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg；(4)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg；(5)阿司匹林组0.3g/kg；(6)模型组给予生理盐水。连续给药5d，阿司匹林组连续给药3d，给药容积均为10ml/kg。末次给药1h后，将30μl二甲苯涂于小鼠右耳廓两面致炎，左耳不涂作为对照，致炎后45min处死小鼠，用直径8mm的打孔器打下左、右耳片，称重，以左、右耳重量差作为肿胀度，计算肿胀抑制百分率，结果见表12。
表12 止咳桑杏颗粒对小鼠耳二甲苯致炎的影响(X±S)
与空白对照组比较##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果显示止咳桑杏颗粒36.0g/kg能明显减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀，其中、小剂量组具有一定的作用趋势；提示止咳桑杏颗粒具有一定的抗炎作用。
3.4.3.2止咳桑杏颗粒对小鼠腹腔毛细血管通透性影响取昆明小鼠50只，雌雄兼用，体重18～22g，随机分5组(1)空白对照组给予等容积的生理盐水；(2)阿司匹林组0.3g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg鼠重给药；(5)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg鼠重给药。连续给药5d，阿司匹林组连续给药3d，给药容积为10ml/kg。末次给药45分钟后，每鼠尾静脉注射0.5％伊文思兰0.1ml/10g鼠重，随即腹腔注射0.6％HAc 0.2ml/只，20分钟后脱颈椎处死，用6ml生理盐水分数次洗涤腹腔，吸出洗涤液后，加入生理盐水至10ml，3000rpm离心15分钟；取上清液于590nm处比色，记录OD值，结果见表13。
表13 止咳桑杏颗粒对小鼠腹腔毛细血管通透性影响(X±S)
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果显示止咳桑杏颗粒18.0g/kg和36.0g/kg剂量组可以显著抑制HAc所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高。
权利要求
1.一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于组合中药材提取物原料的重量配方为桑叶400～600前胡400～600黄芩400～600杏仁400～600桔梗160～240浙贝母400～600枇杷叶400～600 南沙参400～600 姜半夏400～600陈皮240～360甘草120～180(a)桑叶、陈皮加4～8倍量水浸泡2～4小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集4～10倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡0.5～2.0小时后，煎煮2～4次，每次2～3小时，每次用水4～8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加50～80％乙醇浸泡0.5～2.0小时后，加热回流提取2～4次，每次1.0～2.0小时，每次乙醇用量为4～7倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物；上述方法为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物的提取方法；桑叶和陈皮挥发油和组合中药材液体提取物为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物。
2.根据权利要求1所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于按β-环糊精∶桑叶和陈皮挥发油为6～9∶1的重量比，在20～40℃的包合温度下，将(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为2.5～3.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
3.根据权利要求1所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加分散剂，再加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，混匀，制成软胶囊。
4.根据权利要求1所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，按药剂学所述的常规方法制成口服液。
全文摘要
一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，桑叶、陈皮水蒸气蒸馏法提取挥发油；桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡，煎煮，滤液浓缩得水提取物；黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，加乙醇浸泡，回流提取，滤液减压回收乙醇，浓缩得醇提取物；合并水提取物、醇提取物得组合中药材液体提取物。将其制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂、软胶囊口服液。本发明疗效高、减少用药体积、便于患者服用；有稳定可控的质量和疗效；克服了汤剂的缺点。实验证明，本发明的制剂，在急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病方面有确切的疗效。
文档编号A61K9/16GK1733194SQ20041004173
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月15日 优先权日2004年8月15日
发明者蔡宝昌, 潘扬, 章晨峰, 曹亮 申请人:江苏中康药物科技有限公司
技术领域：
本发明涉及组合中药材的提取物及提取方法，特别是治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法。
背景技术：
呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，随着现代工业发展，空气污染日益严重。外界的有害物质，如各种有害气体、粉尘、致敏微生物和致敏原直接吸入肺部，使呼吸系统发病率和病死率都在增加。1998年我国农村地区抽样调查显示呼吸系统疾病死亡率居于首位，占总死亡率的25％。上海地区居民医院就诊占首位的也是呼吸道疾病。据不完全统计，这一疾病成人的发病率为5％，而老人和儿童的发病率更高。急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病主要是由于风、寒、暑、湿、燥、火六气之邪犯肺所致。风、寒、暑、湿、燥、火六气皆能致咳，急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病久延不愈可转为内伤咳嗽，内伤咳嗽复感外邪，又易诱发和加重。但是由于四时气候变化的不同，人体所感受的致病外邪亦有区别，因而在临床上有风寒、风热及燥热等不同咳嗽。不论由于风寒、风热或燥热，多以风为先导，挟寒、热、燥等外邪入侵，伤于肺系而为咳嗽。近年来对呼吸系统疾病常见的咳、痰、喘的病因病理学及其相互关系有了进一步的了解，也试用过多种疗法，但仍以药物治疗为主。呼吸系统疾病最近几年来开发出的新药也不少，但疗效尚不够理想。现有技术中，虽有一些临床经验组方，药效方中的成份因产地、气侯等不可预知因素，无法控制稳定的质量和疗效。但用药极度为不便。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，通过对祛邪宣肺，肃肺止咳的临床经验组方的进行药理研究筛选，提高治疗急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病的疗效。提出了一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法。
本发明的目的是由以下技术方案来达到的，本发明是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是组合中药材提取物原料的重量配方为桑叶400～600前胡400～600黄芩400～600杏仁400～600桔梗160～240浙贝母400～600枇杷叶400～600 南沙参400～600 姜半夏400～600陈皮240～360甘草120～180(a)桑叶、陈皮加4～8倍量水浸泡2～4小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集4～10倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡0.5～2.0小时后，煎煮2～4次，每次2～3小时，每次用水4～8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加50～80％乙醇浸泡0.5～2.0小时后，加热回流提取2～4次，每次1.0～2.0小时，每次乙醇用量为4～7倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物；上述方法为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物的提取方法；桑叶和陈皮挥发油和组合中药材液体提取物为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物。
本发明的目的由以下技术方案来进一步达到，根据前述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为6～9∶1的重量比，在20～40℃的包合温度下，将(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为2.5～3.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
本发明的目的由以下技术方案来进一步达到，根据前述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加分散剂，再加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，混匀，制成软胶囊。
本发明的目的由以下技术方案来进一步达到，根据前述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特点是将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，按药剂学所述的常规方法制成口服液。
本发明与现有技术相比，本发明依据上述中医理论而确立治法，其中筛选的是祛邪宣肺，肃肺止咳的临床经验组方的进行药理研究筛选，将临床上用于急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病经验方中的药材经现代化提取工艺制成新剂型，提高了临床疗效。并根据其组成药物在处方中的地位及其所含活性成分的理化特性，制订了较为客观的质量标准，有稳定可控的质量和疗效。选用本发明的剂型。它不仅保持了汤剂的特色，而且提高疗效、减少用药体积、便于患者服用；克服了汤剂服前临时煎煮、容易变质霉败的缺点，有利于大批量生产和贮运。实验也证明，本发明的组合中药材的提取物制得的制剂，在急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病方面有确切的疗效。
具体实施例方式
下面为本发明的实施例，进一步描述本发明的发明内容。
实施例一、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，组合中药材提取物原料的重量(克)配方为桑叶500前胡500 黄芩500杏仁500桔梗200浙贝母500枇杷叶500 南沙参500姜半夏500 陈皮300 甘草150(a)桑叶、陈皮加6倍量水浸泡3小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集6倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡1小时后，煎煮3次，每次2.5小时，每次用水7倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.08，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加60％乙醇浸泡1小时后，加热回流提取3次，每次1.8小时，每次乙醇用量为6倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.08，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物。
实施例二、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为8∶1的重量比，在30℃的包合温度下，将实施例一中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为3小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将实施例一中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
实施例三、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为6∶1的重量比，在20℃的包合温度下，将实施例一中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为2.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将实施例一中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
实施例四、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，按β-环糊精桑叶和陈皮挥发油为9∶1的重量比，在40℃的包合温度下，将实施例一中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为3.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将实施例一中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
实施例五、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，组合中药材提取物原料的重量(克)配方为
桑叶400前胡400黄芩400 杏仁600桔梗160浙贝母600 枇杷叶600南沙参400姜半夏600 陈皮360甘草120(a)桑叶、陈皮加4倍量水浸泡4小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集4倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡0.5小时后，煎煮4次，每次2小时，每次用水4倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.1，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加50％重量浓度的乙醇浸泡2小时后，加热回流提取2次，每次2小时，每次乙醇用量为7倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.1，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物。
实施例六、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，将实施例五中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加分散剂，再加入将实施例五中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，混匀，制成软胶囊。
实施例七、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，组合中药材提取物原料的重量(克)配方为
桑叶600前胡600黄芩600 杏仁400桔梗240浙贝母400 枇杷叶400南沙参600姜半夏400 陈皮240甘草180(a)桑叶、陈皮加8倍量水浸泡2小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集10倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡2小时后，煎煮2次，每次3小时，每次用水8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.05，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加80％重量浓度的乙醇浸泡0.5小时后，加热回流提取4次，每次1小时，每次乙醇用量为4倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.05，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物。
实施例八、本实施例是一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，将实施例七中(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加入实施例七中(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，按药剂学所述的常规方法制成口服液。
药效实验在下述药效实验中定义本发明的药剂名称为止咳桑杏颗粒一、概述经主要药效学试验，止咳桑杏颗粒具有抗菌、抗病毒、止咳、祛痰、抗炎等药理作用。
1)体外抗菌实验表明，止咳桑杏颗粒对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、不动杆菌、表葡萄球菌、洋葱假单孢杆菌、人葡萄球菌、链球菌、变形杆菌有一定的抑菌作用。
2)体内抗菌实验表明，止咳桑杏颗粒对小鼠体内感染金黄色葡萄球菌有明显的保护作用。
3)体内外抗病毒实验表明，止咳桑杏颗粒体外虽未显示直接抑制甲型流感病毒的作用，但体内对小鼠流感病毒性肺炎均有明显的保护作用，提示其具有一定的抗病毒作用。
4)止咳桑杏颗粒能明显减少豚鼠电刺激所致咳嗽次数；延长氨水所致小鼠引咳潜伏期，减少其咳嗽次数，具有一定的止咳作用。
5)止咳桑杏颗粒能明显增加小鼠气道酚红排出量，表明止咳桑杏颗粒具有增加气道分泌物，促进痰液排出的作用。止咳桑杏颗粒能明显增加大鼠的排痰量，表明止咳桑杏颗粒有显著的化痰作用。
6)止咳桑杏颗粒能明显减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀；抑制HAc所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高，表明具有一定的抗炎作用。
二、实验目的通过主要药效学实验验证止咳桑杏颗粒与临床功能主治有关的作用。
三、实验结果3.1体外抑菌实验3.1.1平板打洞法取16小时培养的各菌株营养肉汤培养物，用营养肉汤作10-3稀释用于实验，在直径9cm的灭菌平皿中加菌液1ml，然后倒入已熔化冷却至45℃的营养琼脂培养物20ml，旋转混匀，等凝固后用直径6mm的灭菌铜管于琼脂平皿上打3个小孔，用无菌镊子取出孔内培养基，于每个孔内分别加入1.0g/ml、0.5g/ml和0.25g/ml药液0.1ml，置37℃培养20h，取出平皿，量取抑菌圈直径，重复一次，取二次实验的平均值。实验按常规设定只有药物不接种细菌的阴性对照和没有药物只接种细菌的阳性对照，结果见表1。
表1 止咳桑杏颗粒对标准菌株和临床分离菌株的抑菌作用
3.1.2试管法取16h培养的各营养菌株营养肉汤培养物，用营养肉汤作10-3稀释用于实验，取止咳桑杏颗粒药液(200mg/ml)0.4ml加入第1管中，混匀后取1ml至第2管，再从第2管中吸取1ml加入第3管中，从第3管吸取1ml弃去，第4管不加药液作为对照，每管加入菌液0.1ml，37℃培养18h。取出观察，结果见表2。
表2 止咳桑杏颗粒对标准菌株和临床分离菌株的MIC(试管法)
*两次实验平均值。
实验结果显示止咳桑杏颗粒对标准金黄色葡萄球菌、不动杆菌、标准枯草芽孢杆菌、标准藤黄微球菌、标准短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、洋葱假单孢杆菌有较强的抑菌作用。
3.2体内抑菌实验3.2.1对肺炎克雷百氏球菌的抑菌作用取昆明种小鼠100只，雌雄各半，随机分为5组，分别为(1)止咳桑杏颗粒小剂量组，9.0g/kg鼠重给药；(2)止咳桑杏颗粒中剂量组，18.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒大剂量组，36.0g/kg鼠重给药；(4)阳性对照组，双黄连口服液0.2ml/10g鼠重给药；(5)空白对照组，给0.2ml/10g鼠重等量生理盐水。各组灌胃容积为20ml/kg，连续8天，于第五天给药后1h腹腔注射肉汤培养的肺炎克雷百氏菌液0.5ml/只，观察72h内感染小鼠的死亡数，计算死亡率和保护率。结果见表3。
表3 止咳桑杏颗粒对小鼠体内肺炎克雷百氏菌的抑菌
结果表明止咳桑杏颗粒对小鼠感染肺炎克雷百氏菌无明显的抑菌作用。
3.2.2对金黄色葡萄球菌的抑制作用取昆明种小鼠100只，雌雄各半，随机分为5组，分别为(1)止咳桑杏颗粒小剂量组，9.0g/kg鼠重给药；(2)止咳桑杏颗粒中剂量组，18.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒大剂量组，36.0g/kg鼠重给药；(4)阳性对照组，双黄连口服液0.2ml/10g鼠重给药；(5)空白对照组，给予生理盐水。各组灌胃容积为20ml.kg-1，连续8天，于第五天给药后1h腹腔注射肉汤培养的金黄色葡萄球菌菌液0.5ml/只，观察72h内的死亡数，计算死亡率和保护率。结果见表4。
表4 止咳桑杏颗粒对小鼠体内感染金黄色葡萄球菌的保护作用
与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01结果表明止咳桑杏颗粒在9.0g/kg、18.0g/kg、36.0g/kg剂量时对小鼠感染金黄色葡萄球菌有明显的保护作用。
3.3抗病毒实验3.3.1体外抗病毒实验3.3.1.1细胞培养半数感染量TCID50滴定病毒鸡胚尿囊液用培养基作10倍递次稀释。将已长成单层细胞的96孔微孔塑料培养板的培养液弃去，每个病毒稀释度接种4孔，每孔100μl，摇匀，37℃吸附1h，弃病毒液，Hank‘s液洗3次，加维持液，每孔0.1ml，放37℃5％CO2孵箱培养。每日用倒置显微镜检查，以最高稀释度不再出现新病变时进行观察。细胞病变在25％以下为+，25～50％为++，50～75％为+++，＞75％为++++。以病变++为终点，用Reed and Muench法计算TCID50。结果TCID50为5.5。
3.3.1.2药物对细胞毒性鉴定细胞长成单层细胞后，弃培养基，将药液按2倍稀释，每孔加各稀释度药液100μl，每个稀释度加4孔，37℃5％CO2孵箱培养。
用倒置显微镜观察细胞病变。对细胞无毒性浓度为10.0mg/ml。应用10.0mg/ml、5.0mg/ml浓度进行实验。
3.3.1.3止咳桑杏颗粒体外抗病毒作用挑选生长良好的Hep-2细胞，经消化、洗脱，细胞计数为2.8×105/ml，取0.1ml接种到96孔微孔塑料培养板，37℃5％CO2培养2d，使长成单层细胞。弃生长液，30TCID50病毒悬液感染宿主细胞(0.1ml)，37℃吸附1h，弃病毒液，加含有药液的维持0.1ml，每个浓度4孔，37℃5％CO2培养，同时取正常细胞对照、病毒对照、病毒唑对照。试验结果见表5。
表5 止咳桑杏颗粒对体外培养流感病毒的影响
注n＝4。
结果表明止咳桑杏颗粒在体外抗病毒实验中，未显示直接抑制甲型流感病毒的作用。
3.3.2体内抗病毒实验3.3.2.1病毒致小鼠半数死亡量的测定(LD50)昆明种小鼠35只，分为7组，取甲型流感病毒(H1N1)鸡胚尿囊液(血凝效价为640)作10倍稀释，每个病毒稀释浓度感染小鼠5只，30μl/只鼠滴鼻观察14天内死亡数，按Reed and Muench法计算LD50。结果LD50为6.5。
3.3.2.2对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用取昆明种小鼠120只，体重12～14g。随机分为6组，每组20只，♀♂各半。(1)常对照组给予等量生理盐水；(2)病毒对照组给予等量生理盐水；(3)病毒唑对照组0.07g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒I组，9.0g/kg鼠重给药；(5)止咳桑杏颗粒II组，18.0g/kg鼠重给药；(6)止咳桑杏颗粒III组，36.0g/kg鼠重给药。
上述各组动物ig给药，1次/d，连续5d。给药后第2d，各组小鼠在乙醚浅麻醉下，以病毒尿囊液滴鼻感染，每鼠30μl(15个LD50攻击量)。观察动物感染后发病症状，记录感染后15d内死亡数。结果如表6所示。
表6 止咳桑杏颗粒对流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
实验结果表明止咳桑杏颗粒三个剂量组，对流感病毒感染小鼠死亡未显示明显的保护作用。
3.3.2.3对小鼠甲型流感病毒性肺炎的作用取昆明种小鼠60只体重12～14g，随机分为6组，每组10只，雌雄各半(1)空白对照组，给予生理盐水；(2)病毒对照组，等量生理盐水；(3)病毒唑组，0.07g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒I组，9.0g/kg鼠重给药；(5)止咳桑杏颗粒II组，18.0g/kg鼠重给药；(6)止咳桑杏颗粒III组，36.0g/kg鼠重给药。各组均ig给药，容量为0.2ml/10g鼠重，1次/d，连续5d。除(1)组外，各组小鼠于给药后第二天以病毒尿囊液滴鼻感染，每鼠30μl，15倍LD50攻击量，正常对照组以生理盐水滴鼻，感染后继续给药4d。实验前各组小鼠禁食12h，不禁水，称重，脱颈椎处死，解剖，肉眼观察肺部病变，取全肺称重，计算肺指数值、肺指数抑制率。实验结果见表7。
表7 止咳桑杏颗粒对流感病毒感染小鼠肺炎的作用
与病毒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果所示止咳桑杏颗粒18.0g/kg和36.0g/kg剂量组的肺指数明显低于病毒对照组，表明该药可减轻甲型流感病毒引起的小鼠肺炎的病变程度。
3.4止咳、祛痰和抗炎实验3.4.1止咳作用3.4.1.1小鼠氨水引咳法取昆明种小鼠60只，雄性，体重18～22g，随机分6组(1)空白对照组给予生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg鼠重给药；(5)急支糖浆组22ml/kg鼠重给药；(6)咳必清组20mg/kg鼠重给药。(1)～(4)给药容积均为10ml/kg，各组每天给药一次，连续给药5d，咳必清组连续给药3d。末次给药45min，将小鼠置于500ml的钟罩中，以超声雾化器将25％浓氨水喷雾5秒钟，然后观察和记录小鼠咳嗽的潜伏期和5分钟内咳嗽的次数。结果见表8。
表8 止咳桑杏颗粒对小鼠氨水所致引咳潜伏期和咳嗽次数的影响(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明止咳桑杏颗粒36.0g/kg剂量组能明显延长氨水所致小鼠引咳潜伏期，减少小鼠的咳嗽次数。
3.4.1.2豚鼠电刺激法取豚鼠30只，雌雄兼用，体重300～400g，随机分6组(1)空白对照组给予生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组3.7g/kg；(3)止咳桑杏颗粒II组7.5g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组15.0g/kg鼠重给药；(5)咳必清组7.0mg/kg鼠重给药；(6)急支糖浆组8.6ml/kg鼠重给药；(1)～(5)给药容积均为10ml/kg，各组每天给药一次，连续给药5d，咳必清组连续给药3d，末次给药后30min，以25％的乌拉坦1g/kg ip麻醉，分离气管，插入Y形气管套管，一个支管与压力换能器相连，连接二道生理记录仪器，记录呼吸运动。用一白金制的单极电极固定于气管背面，另一无关电极插入胸部皮下组织中(手术过程10min做完)。于给药45min时，采用刺激强度3.5V，脉冲宽度50ms，频率10次/秒，刺激时间20s，从记录纸读取咳嗽次数。结果见表9。
表9 止咳桑杏颗粒对豚鼠电刺激所致的咳嗽次数的影响(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明止咳桑杏颗粒15.0g/kg剂量组能明显减少豚鼠电刺激所致咳嗽次数。中、小剂量组与对照组比较没有显著性差异，但仍具有作用的趋势。
3.4.2祛痰试验3.4.2.1小鼠酚红法取昆明种小鼠50只，雄性，体重20～25g，随机分5组(1)空白对照组给予容积生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg鼠重给药；(5)氯化氨组1.0g/kg鼠重给药；各组每天给药一次，连续给药3d，给药容积均为10ml/kg。末次给药30min后，腹腔注射5％酚红生理盐水溶液500mg/kg，注射后30分钟，处死动物，分离气管，以1ml注射器取2.24mmol/LNaHCO3溶液0.5ml，冲洗气道3次，吸取灌洗液0.5ml，重复上述操作3次，共吸取灌洗液1.5ml，将冲洗液吸入试管。在波长546nm处，测量OD值。结果见表10。
表10 止咳桑杏颗粒对小鼠气道内酚红排出量的影响(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明止咳桑杏颗粒36.0g/kg剂量组能明显增加小鼠气道酚红排出量，与对照组比较具有明显差异。表明止咳桑杏颗粒具有增加气道分泌物，促进痰液排出的作用。
3.4.2.2大鼠毛细玻管法取大鼠80只，随机分5组(1)空白对照组给予容积生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组4.5g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒II组9.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒III组18.0g/kg鼠重给药；(5)氯化氨组0.5g/kg鼠重给药。实验前禁食不禁水12小时。大鼠乌拉坦1g/kg腹腔麻醉后，仰位固定。剪开颈中部皮肤，分离出气管，在甲状腺软骨下缘正中两软骨环之间用尖锐的注射针头扎一小孔，然后插入玻璃毛细管一根，使毛细管刚好接触气管底部表面，借以吸取气管后部之痰液。当毛细管内被液充满时，立即换一根。以毛细管吸取痰液长度作为药物的化痰效果。记录前2小时的正常分必量后，灌胃给药，继续再观察4小时分泌量。结果见表11。
表11 止咳桑杏颗粒对大鼠的祛痰作用(X±S)
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明，止咳桑杏颗粒4.5g/kg、9.0g/kg、18.0g/kg给药，能明显增加大鼠的排痰量。表明止咳桑杏颗粒有显著的化痰作用。
3.4.3抗炎作用3.4.3.1止咳桑杏颗粒对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响取昆明小鼠60只，雌雄兼用，18～22g，随机分7组(1)空白对照组给予生理盐水；(2)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg；(3)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg；(4)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg；(5)阿司匹林组0.3g/kg；(6)模型组给予生理盐水。连续给药5d，阿司匹林组连续给药3d，给药容积均为10ml/kg。末次给药1h后，将30μl二甲苯涂于小鼠右耳廓两面致炎，左耳不涂作为对照，致炎后45min处死小鼠，用直径8mm的打孔器打下左、右耳片，称重，以左、右耳重量差作为肿胀度，计算肿胀抑制百分率，结果见表12。
表12 止咳桑杏颗粒对小鼠耳二甲苯致炎的影响(X±S)
与空白对照组比较##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果显示止咳桑杏颗粒36.0g/kg能明显减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀，其中、小剂量组具有一定的作用趋势；提示止咳桑杏颗粒具有一定的抗炎作用。
3.4.3.2止咳桑杏颗粒对小鼠腹腔毛细血管通透性影响取昆明小鼠50只，雌雄兼用，体重18～22g，随机分5组(1)空白对照组给予等容积的生理盐水；(2)阿司匹林组0.3g/kg鼠重给药；(3)止咳桑杏颗粒I组9.0g/kg鼠重给药；(4)止咳桑杏颗粒II组18.0g/kg鼠重给药；(5)止咳桑杏颗粒III组36.0g/kg鼠重给药。连续给药5d，阿司匹林组连续给药3d，给药容积为10ml/kg。末次给药45分钟后，每鼠尾静脉注射0.5％伊文思兰0.1ml/10g鼠重，随即腹腔注射0.6％HAc 0.2ml/只，20分钟后脱颈椎处死，用6ml生理盐水分数次洗涤腹腔，吸出洗涤液后，加入生理盐水至10ml，3000rpm离心15分钟；取上清液于590nm处比色，记录OD值，结果见表13。
表13 止咳桑杏颗粒对小鼠腹腔毛细血管通透性影响(X±S)
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果显示止咳桑杏颗粒18.0g/kg和36.0g/kg剂量组可以显著抑制HAc所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高。
权利要求
1.一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于组合中药材提取物原料的重量配方为桑叶400～600前胡400～600黄芩400～600杏仁400～600桔梗160～240浙贝母400～600枇杷叶400～600 南沙参400～600 姜半夏400～600陈皮240～360甘草120～180(a)桑叶、陈皮加4～8倍量水浸泡2～4小时后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集4～10倍量的蒸馏液，蒸馏液经重蒸馏-冷藏后，得桑叶和陈皮挥发油；(b)取上述桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡0.5～2.0小时后，煎煮2～4次，每次2～3小时，每次用水4～8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得水提取物；取黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，先加50～80％乙醇浸泡0.5～2.0小时后，加热回流提取2～4次，每次1.0～2.0小时，每次乙醇用量为4～7倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至50℃下相对密度1.05～1.1，得醇提取物；合并以上水提取物、醇提取物，混匀，得组合中药材液体提取物；上述方法为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物的提取方法；桑叶和陈皮挥发油和组合中药材液体提取物为所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物。
2.根据权利要求1所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于按β-环糊精∶桑叶和陈皮挥发油为6～9∶1的重量比，在20～40℃的包合温度下，将(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油用β-环糊精包合，包合时间为2.5～3.5小时，得桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物；再将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物，浓缩，干燥，粉碎加入桑叶和陈皮挥发油的β-环糊精包合物，混匀，制粒，制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂。
3.根据权利要求1所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加分散剂，再加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，混匀，制成软胶囊。
4.根据权利要求1所述的治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，其特征在于将(b)步骤得到的组合中药材液体提取物加入(a)步骤得到的桑叶和陈皮挥发油，按药剂学所述的常规方法制成口服液。
全文摘要
一种治疗呼吸系统疾病的组合中药材的提取物及提取方法，桑叶、陈皮水蒸气蒸馏法提取挥发油；桑叶、陈皮蒸馏后的药渣与前胡、枇杷叶、南沙参、姜半夏、甘草加水浸泡，煎煮，滤液浓缩得水提取物；黄芩、杏仁、浙贝母、桔梗，加乙醇浸泡，回流提取，滤液减压回收乙醇，浓缩得醇提取物；合并水提取物、醇提取物得组合中药材液体提取物。将其制成药剂学所述的颗粒剂、胶囊剂和片剂、软胶囊口服液。本发明疗效高、减少用药体积、便于患者服用；有稳定可控的质量和疗效；克服了汤剂的缺点。实验证明，本发明的制剂，在急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病方面有确切的疗效。
文档编号A61K9/16GK1733194SQ20041004173
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月15日 优先权日2004年8月15日
发明者蔡宝昌, 潘扬, 章晨峰, 曹亮 申请人:江苏中康药物科技有限公司
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