阿比朵尔在制备预防和治疗乙型肝炎、hiv病毒药物中的用途的制作方法
专利名称：阿比朵尔在制备预防和治疗乙型肝炎、hiv病毒药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及阿比朵尔新的药物用途，具体而言是涉及该化合物在制备预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒药物中的应用。
背景技术：
HIV对辅助T淋巴有选择趋向性，同时也能感染单核细胞、巨噬细胞及中枢神经系统细胞。HIV复制过程需要3种酶蛋白酶、逆转录酶和整合酶，进入细胞后，HIV利用逆转录酶将病毒核糖核酸(RNA)逆转录为去氧核糖核酸(DNA)，随后在整合酶作用下，整合到宿主细胞的染色体中，从而成为人体细胞基因的一部分，和细胞一起繁殖。由于这些病毒可以在人体细胞内潜伏，若一旦开始复制繁殖，会导致患者的T辅助淋巴细胞严重伤亡，造成免疫力下降，进而诱发一系列相关疾病。
乙肝病毒急性感染后，人体对病毒抗原产生相应的抗体，即表面抗体、e抗体及核心抗体等。这些抗体在血清中企图中和乙肝病毒及其相应的抗原；另一方面人体的细胞免疫发生启动，特别是细胞毒T细胞，它会瞄准已经窜入乙肝病毒的肝细胞(靶细胞)进行攻击。病毒所制造的核心抗原(还有表面抗原、e抗原或前S抗原等)在肝细胞膜上都采用与肝细胞膜脂蛋白结合的攻击。结果在清除这靶抗原和肝细胞内病毒的同时。肝细胞成了牺牲品。根据肝细胞破坏的多少就出现相应不同轻重的急性期临床征象。
阿比朵尔为非核苷类抗病毒新药，是一种防治甲型和乙型流感及其它急性呼吸道病毒感染的高效药物，通过激活2，5-寡聚腺苷酸合成酶，特异性抑制病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，从而阻断流感病毒的复制。相比其他类抗流感病毒药物具有以下特点1、对流感病毒甲型、乙型均有效。2、兼有直接抑制病毒复制和诱导内源性干扰素的双重作用。3、毒性低、耐受性良好。
阿比朵尔具有以下药效学性质
1、抗流感病毒本品对甲型和乙型流感病毒均有抑制作用。酶联免疫吸附试验显示它对甲型和乙型流感病毒的抑制率分别为80％和60％，对所有甲型流感病毒的抗原亚型均有活性。
国内体外试验结果显示阿比朵尔对流感病毒甲型的H1N1、H2N2、临床分离株均有抑制作用，其50％抑制病毒病变浓度(IC50)分别为1.22±0.015、1.50±0.056和1.65±0.12μg/mL；其治疗指数(TI)分别为37.6±0.48、30.6±1.13和27.9±1.94。表明阿比朵尔有直接抗甲型流感病毒作用。
体内试验结果显示连续给药7～8次，阿比朵尔15～125mg/kg，使小鼠平均生活日明显延长、死亡率显著降低、病变明显减轻，而且其作用明显优于阳性对照药病毒唑。表明阿比朵尔对整体动物具有显著的抗流感病毒作用。
2、诱生干扰素作用国内试验结果表明小鼠灌胃给予阿比朵尔31.3～125mg/kg或腹腔注射阿比朵尔15～45mg/kg后，其血清中均出现一定浓度的IFN，峰值出现在给药后18h，以后滴度下降，表明阿比朵尔具有诱生干扰素作用。
国外文献报道阿比朵尔对人和动物都有诱生干扰素作用，给药24h可见最大滴度。人口服阿比朵尔300mg/kg，24小时的干扰素滴度为160IU/mL。
3、免疫调节作用国内试验结果阿比朵尔灌胃给药5d，剂量为25～100mg/kg·d使正常昆明种小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数显著增加；剂量为50～100mg/kg·d，使氢化可的松所致免疫低下昆明种小鼠碳廓清K值明显增加，剂量为12.5～50mg/kg·d使环磷酰胺所致免疫低下昆明种小鼠DTH反应明显增加，表明给予阿比朵尔不同剂量对正常及免疫低下昆明种小鼠的非特异性免疫功能、体液免疫功能和免疫低下小鼠的细胞免疫功能均有一定的促进作用。
国外文献报道阿比朵尔在体内外试验中对巨噬细胞吞噬功能有明显的激活作用，对迟发型超敏反应和宿主移植反应等细胞免疫功能，对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的体液免疫功能均有明显的促进作用。
本品毒性很低。国外文献报道大鼠和豚鼠单剂口服2000mg/kg，耐受良好，表明口服急性毒性很低，估计LD50＞3000mg/kg。小鼠口服LD＝340mg/kg慢性毒性试验，大鼠100～125mg/kg，狗25mg/kg，口服给药6个月，均未出现病理学变化。对兔和豚鼠长期用药也是安全的。
体内外试验均表明本品无诱变作用。大鼠繁殖毒性研究表明本品无致畸作用。
发明内容
鉴于上述阿比朵尔的作用，为了深入了解阿比朵尔对一系列病毒的作用机制，我们通过分子、细胞水平上的筛选实验来证明阿比朵尔对乙型肝炎、HIV病毒是否敏感，是否对乙型肝炎、HIV有效，因此以乙型肝炎病毒及HIV病毒为例，通过阿比朵尔在分子及细胞水平上对乙型肝炎病毒(包括HBsAg、HBeAg、DNA斑点)、乙型肝炎病毒DNA多聚酶等的生物活性以及对HIV病毒的生物活性的检测，以此判定阿比朵尔对乙型肝炎病毒、HIV病毒的治疗效果。从而获得治疗乙型肝炎、HIV病毒感染的治疗药物。通过阿比朵尔作用机制及己有的体外细胞学实验、动物整体实验，我们设计了以下两个实验在阿比朵尔体外抗HIV-1蛋白酶活性实验中，发现阿比朵尔在体外具有抗HIV-1蛋白酶的活性。
在阿比朵尔抗乙型肝炎病毒实验中，发现阿比朵尔具有抑制细胞分泌HBsAg及HBV DNA复制的作用。
具体实施例方式
本发明阿比朵尔对预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒有效，通过以下实验说明。
实施例1、阿比朵尔体外抗HIV-1蛋白酶活性筛选实验测试原理HIV-1蛋白酶在最佳反应条件和反应体系中可将荧光标记底物酶切开，检测酶反应产物中荧光强度来反映酶的活性，在反应体系中加入样品可用于筛选该酶的抑制剂。
测试材料和方法1、HIV-1蛋白酶国家新药筛选中心提取，-85□保存。
2、样品及处理阿比朵尔，样品临用前溶于DMSO或双蒸水配成适当浓度，2倍稀释，各5个稀释度。
3、阳性对照药印地那韦(indinavir)，葛兰素公司提供。
4、底物MP公司提供。
5、测试方法样品稀释后加入含有荧光标记底物的反应缓冲液中，并加入基因工程靶酶，在最佳反应条件下孵育，用FLUO star Galaxy荧光仪测定荧光值。
测试结果表1起始浓度250μg/ml的样品各实验浓度抑制率及IC50
结论阿比朵尔体外对HIV-Pr有抑制作用，其IC50为188.37μg/ml。
实施例2、阿比朵尔抗乙型肝炎病毒初筛实验测试原理以2.2.15细胞为乙型肝炎病毒载体，测定样品抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制和产生HBsAg、HBeAg的能力。
测试材料和方法1、细胞株2.2.15细胞；由国家新药筛选中心提供。
2、样品及处理阿比朵尔，样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，检测时各样品用培养液作3倍稀释，共8个稀释度。
3、阳性对照药拉米夫定(3TC)，由葛兰素威康公司生产。
4、主要试剂乙肝病毒e抗原及s抗原放免疫测试剂盒，北京北方生物技术研究所提供；□32PdCTP，中国福瑞生物工程有限公司提供。
5、测试方法2.2.15细胞种96孔培养板，36小时后按以上稀释度分别加入样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔，72小时后分别更换含不同稀释浓度的样品培养液，于种板第8天分别收集细胞上清及2.2.15细胞，采用RIA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的分泌量，点杂交的方法检测细胞中HBV DNA复制程度，分别计算IC50及SI。
测试结果表2
注(1)表中“-”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50对细胞半数有毒浓度；IC50对病毒半数抑制浓度；SI为选择指数，SI＝TC50/IC50结论阿比朵尔对2.2.15细胞分泌HBsAg及HBV DNA复制有抑制作用，IC50分别是22.25和11.48μg/ml；SI分别是3.46和6.71。
权利要求
1.阿比朵尔在制备预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于阿比朵尔具有抑制细胞分泌HbsAg及HBV DNA复制的作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于阿比朵尔阿比朵尔在体外具有抗HIV-1蛋白酶的活性。
全文摘要
本发明涉及阿比朵尔在制备预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒药物中的应用。本发明通过体外实验证明，阿比朵尔对乙型肝炎、HIV病毒具有显著的抑制作用，因此本品可以作为预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒的药物应用于临床。
文档编号A61K31/403GK1596892SQ03159638
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月19日 优先权日2003年9月19日
发明者李建青, 刘振涛, 王荣端, 张宏武, 申东民 申请人:中奇制药技术(石家庄)有限公司
技术领域：
本发明涉及阿比朵尔新的药物用途，具体而言是涉及该化合物在制备预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒药物中的应用。
背景技术：
HIV对辅助T淋巴有选择趋向性，同时也能感染单核细胞、巨噬细胞及中枢神经系统细胞。HIV复制过程需要3种酶蛋白酶、逆转录酶和整合酶，进入细胞后，HIV利用逆转录酶将病毒核糖核酸(RNA)逆转录为去氧核糖核酸(DNA)，随后在整合酶作用下，整合到宿主细胞的染色体中，从而成为人体细胞基因的一部分，和细胞一起繁殖。由于这些病毒可以在人体细胞内潜伏，若一旦开始复制繁殖，会导致患者的T辅助淋巴细胞严重伤亡，造成免疫力下降，进而诱发一系列相关疾病。
乙肝病毒急性感染后，人体对病毒抗原产生相应的抗体，即表面抗体、e抗体及核心抗体等。这些抗体在血清中企图中和乙肝病毒及其相应的抗原；另一方面人体的细胞免疫发生启动，特别是细胞毒T细胞，它会瞄准已经窜入乙肝病毒的肝细胞(靶细胞)进行攻击。病毒所制造的核心抗原(还有表面抗原、e抗原或前S抗原等)在肝细胞膜上都采用与肝细胞膜脂蛋白结合的攻击。结果在清除这靶抗原和肝细胞内病毒的同时。肝细胞成了牺牲品。根据肝细胞破坏的多少就出现相应不同轻重的急性期临床征象。
阿比朵尔为非核苷类抗病毒新药，是一种防治甲型和乙型流感及其它急性呼吸道病毒感染的高效药物，通过激活2，5-寡聚腺苷酸合成酶，特异性抑制病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，从而阻断流感病毒的复制。相比其他类抗流感病毒药物具有以下特点1、对流感病毒甲型、乙型均有效。2、兼有直接抑制病毒复制和诱导内源性干扰素的双重作用。3、毒性低、耐受性良好。
阿比朵尔具有以下药效学性质
1、抗流感病毒本品对甲型和乙型流感病毒均有抑制作用。酶联免疫吸附试验显示它对甲型和乙型流感病毒的抑制率分别为80％和60％，对所有甲型流感病毒的抗原亚型均有活性。
国内体外试验结果显示阿比朵尔对流感病毒甲型的H1N1、H2N2、临床分离株均有抑制作用，其50％抑制病毒病变浓度(IC50)分别为1.22±0.015、1.50±0.056和1.65±0.12μg/mL；其治疗指数(TI)分别为37.6±0.48、30.6±1.13和27.9±1.94。表明阿比朵尔有直接抗甲型流感病毒作用。
体内试验结果显示连续给药7～8次，阿比朵尔15～125mg/kg，使小鼠平均生活日明显延长、死亡率显著降低、病变明显减轻，而且其作用明显优于阳性对照药病毒唑。表明阿比朵尔对整体动物具有显著的抗流感病毒作用。
2、诱生干扰素作用国内试验结果表明小鼠灌胃给予阿比朵尔31.3～125mg/kg或腹腔注射阿比朵尔15～45mg/kg后，其血清中均出现一定浓度的IFN，峰值出现在给药后18h，以后滴度下降，表明阿比朵尔具有诱生干扰素作用。
国外文献报道阿比朵尔对人和动物都有诱生干扰素作用，给药24h可见最大滴度。人口服阿比朵尔300mg/kg，24小时的干扰素滴度为160IU/mL。
3、免疫调节作用国内试验结果阿比朵尔灌胃给药5d，剂量为25～100mg/kg·d使正常昆明种小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数显著增加；剂量为50～100mg/kg·d，使氢化可的松所致免疫低下昆明种小鼠碳廓清K值明显增加，剂量为12.5～50mg/kg·d使环磷酰胺所致免疫低下昆明种小鼠DTH反应明显增加，表明给予阿比朵尔不同剂量对正常及免疫低下昆明种小鼠的非特异性免疫功能、体液免疫功能和免疫低下小鼠的细胞免疫功能均有一定的促进作用。
国外文献报道阿比朵尔在体内外试验中对巨噬细胞吞噬功能有明显的激活作用，对迟发型超敏反应和宿主移植反应等细胞免疫功能，对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的体液免疫功能均有明显的促进作用。
本品毒性很低。国外文献报道大鼠和豚鼠单剂口服2000mg/kg，耐受良好，表明口服急性毒性很低，估计LD50＞3000mg/kg。小鼠口服LD＝340mg/kg慢性毒性试验，大鼠100～125mg/kg，狗25mg/kg，口服给药6个月，均未出现病理学变化。对兔和豚鼠长期用药也是安全的。
体内外试验均表明本品无诱变作用。大鼠繁殖毒性研究表明本品无致畸作用。
发明内容
鉴于上述阿比朵尔的作用，为了深入了解阿比朵尔对一系列病毒的作用机制，我们通过分子、细胞水平上的筛选实验来证明阿比朵尔对乙型肝炎、HIV病毒是否敏感，是否对乙型肝炎、HIV有效，因此以乙型肝炎病毒及HIV病毒为例，通过阿比朵尔在分子及细胞水平上对乙型肝炎病毒(包括HBsAg、HBeAg、DNA斑点)、乙型肝炎病毒DNA多聚酶等的生物活性以及对HIV病毒的生物活性的检测，以此判定阿比朵尔对乙型肝炎病毒、HIV病毒的治疗效果。从而获得治疗乙型肝炎、HIV病毒感染的治疗药物。通过阿比朵尔作用机制及己有的体外细胞学实验、动物整体实验，我们设计了以下两个实验在阿比朵尔体外抗HIV-1蛋白酶活性实验中，发现阿比朵尔在体外具有抗HIV-1蛋白酶的活性。
在阿比朵尔抗乙型肝炎病毒实验中，发现阿比朵尔具有抑制细胞分泌HBsAg及HBV DNA复制的作用。
具体实施例方式
本发明阿比朵尔对预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒有效，通过以下实验说明。
实施例1、阿比朵尔体外抗HIV-1蛋白酶活性筛选实验测试原理HIV-1蛋白酶在最佳反应条件和反应体系中可将荧光标记底物酶切开，检测酶反应产物中荧光强度来反映酶的活性，在反应体系中加入样品可用于筛选该酶的抑制剂。
测试材料和方法1、HIV-1蛋白酶国家新药筛选中心提取，-85□保存。
2、样品及处理阿比朵尔，样品临用前溶于DMSO或双蒸水配成适当浓度，2倍稀释，各5个稀释度。
3、阳性对照药印地那韦(indinavir)，葛兰素公司提供。
4、底物MP公司提供。
5、测试方法样品稀释后加入含有荧光标记底物的反应缓冲液中，并加入基因工程靶酶，在最佳反应条件下孵育，用FLUO star Galaxy荧光仪测定荧光值。
测试结果表1起始浓度250μg/ml的样品各实验浓度抑制率及IC50
结论阿比朵尔体外对HIV-Pr有抑制作用，其IC50为188.37μg/ml。
实施例2、阿比朵尔抗乙型肝炎病毒初筛实验测试原理以2.2.15细胞为乙型肝炎病毒载体，测定样品抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制和产生HBsAg、HBeAg的能力。
测试材料和方法1、细胞株2.2.15细胞；由国家新药筛选中心提供。
2、样品及处理阿比朵尔，样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，检测时各样品用培养液作3倍稀释，共8个稀释度。
3、阳性对照药拉米夫定(3TC)，由葛兰素威康公司生产。
4、主要试剂乙肝病毒e抗原及s抗原放免疫测试剂盒，北京北方生物技术研究所提供；□32PdCTP，中国福瑞生物工程有限公司提供。
5、测试方法2.2.15细胞种96孔培养板，36小时后按以上稀释度分别加入样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔，72小时后分别更换含不同稀释浓度的样品培养液，于种板第8天分别收集细胞上清及2.2.15细胞，采用RIA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的分泌量，点杂交的方法检测细胞中HBV DNA复制程度，分别计算IC50及SI。
测试结果表2
注(1)表中“-”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50对细胞半数有毒浓度；IC50对病毒半数抑制浓度；SI为选择指数，SI＝TC50/IC50结论阿比朵尔对2.2.15细胞分泌HBsAg及HBV DNA复制有抑制作用，IC50分别是22.25和11.48μg/ml；SI分别是3.46和6.71。
权利要求
1.阿比朵尔在制备预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于阿比朵尔具有抑制细胞分泌HbsAg及HBV DNA复制的作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于阿比朵尔阿比朵尔在体外具有抗HIV-1蛋白酶的活性。
全文摘要
本发明涉及阿比朵尔在制备预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒药物中的应用。本发明通过体外实验证明，阿比朵尔对乙型肝炎、HIV病毒具有显著的抑制作用，因此本品可以作为预防和治疗乙型肝炎、HIV病毒的药物应用于临床。
文档编号A61K31/403GK1596892SQ03159638
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月19日 优先权日2003年9月19日
发明者李建青, 刘振涛, 王荣端, 张宏武, 申东民 申请人:中奇制药技术(石家庄)有限公司
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