胃肠疾病的治疗方法和用于其中的聚合物组合物的制作方法
专利名称：胃肠疾病的治疗方法和用于其中的聚合物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗或预防胃肠疾病并促进动物生长的方法且涉及用于这类治疗的抗微生物组合物。
背景技术：
抗微生物药是杀伤微生物、诸如细菌的化合物。抗生素是(通常)来源于其它微生物并通过干扰靶微生物中的特定机制起作用的亚类抗微生物药。抗生素首次应用于二十世纪四十年代和五十年代且从那时起至今其应用逐步增加。抗生素耐受性的发生已经在全世界成为严重而潜在的威胁生命的问题。葡萄球菌属的某些菌株已经表现出耐几乎所有的抗生素且已经在医院中出现致命性感染。其它药物抗性生物体包括导致肺炎的肺炎球菌和导致腹泻的隐孢子虫属和大肠杆菌。
抗生素在动物饲料中的应用被广泛看作是加速耐受性发生的原因且结果是许多国家控制了其应用。这已经在动物饲养方面产生了问题，导致难以控制疾病和获得最佳生长率。这一问题特别是饲养猪和家禽中的难题。例如，胃肠疾病、诸如猪的大肠杆菌病和家禽的球虫病可能具有毁灭性的作用。
Melrose等(国际专利公开号96/38186)首次描述了丙烯醛聚合物制剂在治疗胃肠疾病中的应用。
这些聚合物具有通式I的重复单元
或由下列通式代表的其水合形式、半缩醛或缩醛形式的这种单元
其中R是氢且n是已经描述的1或1以上的整数。此前，Melrose等在国际申请WO88/04671中描述了丙烯醛聚合物在抗菌应用中的杀生物特性。德国专利申请P4404404及同族专利、诸如EP667358和AU 11686/95(目前以过期)中公开了在氢氧化钠水溶液介质中聚合丙烯醛的方法。该公开文献记载所得的聚丙烯醛在40-50℃下溶于多元醇而形成聚丙烯醛的多元醇溶液。正如下文所解释的，该德国申请的受让人随后发现这类聚合物存在问题且在水介质中具有低溶解性。
Werle等的欧洲公开号EP 792895(相当于US 6060571)涉及通过对丙烯醛单体与多元醇进行共聚合而制备的释放丙烯醛的聚合物。Werle等观察到德国申请号P4404404中所述的聚丙烯醛类存在问题，即产率低于理想产率且这些聚合物实际上不溶于水。欧洲申请EP792895中教导了通过经对丙烯醛单体与多元醇单体进行共聚合而形成释放丙烯醛的聚合物来克服这些难题。提出的共聚物的结构如下 尽管游离丙烯醛可作为抗微生物药起作用，但是它刺激眼、肺、组织和皮肤。存在对一定范围内应用、特别是对稳定、高水溶性和使用安全的胃肠抗微生物药疗法的应用存在需求。还存在对治疗或预防胃肠疾病的有效抗微生物药存在需求，它们可以降低发生抗生素耐受性的压力。
本文包括本发明背景技术的讨论是为了解释本发明的上下文。并不将其看作是任何所涉及材料在本专利申请的优先权日时公开、公知或作为一般常用知识的组成部分。
发明内容
我们目前已经发现了如果聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物与醇或多元醇反应而生成被护羰基、诸如缩醛和/或半缩醛衍生物，那么它们在治疗或预防胃肠疾病中的活性和稳定性得到实质性提高。我们令人意外地发现尽管在所述聚合物中游离丙烯醛的含量可能极低或可以忽略不计，但是其衍生物在治疗或预防胃肠疾病中的活性得到实质性提高。该聚合物在水中的溶解性也极高。
本发明提供了治疗或预防动物(包括人)的胃肠疾病的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的聚(2-丙烯醛、2-丙酸)衍生物的步骤，它是通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与诸如醇这样含有一个或多个羟基的有机化合物之间反应生成被护羰基而形成的，其中所述的含有一个或多个羟基的有机化合物优选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
本发明在另一个方面中提供了用于治疗胃肠疾病的抗微生物药，它包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与诸如醇这样含有一个或多个羟基的有机化合物之间反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛、2-丙酸)衍生物，其中所述的含有一个或多个羟基的有机化合物优选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
本文所用的术语多元醇指的是含有至少两个羟基的分子。
形成的衍生物一般选自半缩醛和缩醛衍生物。不希望受到理论约束，我们认为聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与醇的反应由至少一定比例的醛基侧链形成半缩醛和/或缩醛，由此使聚合物的羰基对由坎尼扎罗反应的碱降解保持稳定。已经发现缩醛基的形成显著减少或消除了游离丙烯醛的释放，同时令人意外地提高了所得衍生物的活性。
本发明的另一个实施方案提供了上述抗微生物药在制备用于治疗或预防胃肠疾病的药物中的应用。
在本说明书的描述和权利要求中，措词″包括″及该措词的变化形式、诸如″含有″和″包含″并不排除其它添加剂或成分或整体。
发明详述可以通过在有醇、优选多元醇、诸如聚乙二醇存在的情况下加热聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)来制备本发明的抗微生物药。醇类中总是存在水份，且应理解存在至少一定量的水有助于亲核反应，从而使半缩醛或缩醛形成。
一般在40℃-150℃、更优选40-115℃且最优选在70-115℃范围的温度下加热该溶液。
由聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物制备本发明的抗微生物药。这类聚合物及其制备方法描述在国际专利公开号WO 96/38186(PCT/AU96/00328)中，将该文献的内容引入本文作为参考。优选通过优选在水溶液中经阴离子聚合来聚合丙烯醛、随后自氧化来制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物。这些聚合物含有通式I和水合、半缩醛和缩醛形式中的至少一种(且一般是混合物)的重复单元。
已知通过聚合丙烯醛形成的水合、半缩醛和缩醛形式由丙烯醛的不同碳-碳和碳-氧聚合机制产生。例如，水合形式一般为水合二醇形式，半缩醛或缩醛形式可以由所述的二醇形式与醛或二醇形式缩合而形成，四氢吡喃或稠合四氢吡喃形式可以由所述二醇形式与羟醛-Michael自缩合形式缩合形成。
这些形式的典型实例如下面的通式(a)-(f)所示
其中R是氢而n是1或1以上的整数。通式I重复单元的比例一般低于20％且通常为5-15％。尽管这些单元的比例相对较低，但是我们已经发现它们对所述聚合物的稳定性具有显著作用。
聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)一般含有按摩尔计不超过10％的来自非丙烯醛单体的单体单元且最优选丙烯醛均聚物(自氧化前)。如果使用其它单体，那么它们可以选自丙烯酸和乙烯基吡咯烷酮组成的组。2-丙烯酸部分的含量一般为0.1-5摩尔羧基/千克。聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物一般具有超过1000且最优选超过2000的数均分子量。该分子量一般小于10,000。
本发明的抗微生物药是通过与醇或酚反应生成被护羰基制备的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物。由与醇反应形成半缩醛和缩醛基的2-丙烯醛基团形成被护羰基。所述的醇优选为多元醇，所谓多元醇指的是它优选含有至少两个羟基。可以使用诸如C1-C10这样的链烷醇类。如果所述醇为多元醇，那么该反应可以产生通过一个或一个以上醇基的反应形成缩醛类或半缩醛类。此外，当两个醇基参与反应时，能够使它们在聚合物中的同一羰基或不同羰基上反应。
本发明生产了涉及上述通式I以及半缩醛和缩醛形式的衍生物，其中存在较少通式I的单元且形成一种基团，其中一个或多个基团R来源于醇，或当该醇为多元醇时，两个以上基团R可以一起形成桥连基，诸如环状缩醛基。
多元醇类产生内部环状基团的倾向取决于该多元醇的间距和构型。优选醇类为聚(亚烷基)二醇类且更优选的醇类为聚乙二醇类。
聚(亚烷基)二醇类的分子量优选为200-2000且更优选200-1000。
优选诸如聚乙二醇这样的醇在制备抗微生物聚合物的过程中的含量为50-99％重量。特别优选相对稀的丙烯醛聚合物组合物，其中当通过稀释减少分子间交联的发生率时，所述的醇为多元醇。
更优选聚乙二醇在制备所述聚合物的过程中的含量为64-95％重量。
优选向聚合物中加入碱(base)或碱性物质(alkali)，随后在加热前和/或加热过程中使pH向酸性pH方向转变，此时发生聚合物的酸性基团中和，由此提高聚合物的抗微生物活性。优选最先加入碱或碱性物质使聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物的pH达到7-9。更优选在添加碱时的起始pH约为8。所述碱优选为碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或其混合物。
在本发明的另一种形式中，游离丙烯醛单体的释放从连续释放受到抑制，由此这些聚合物几乎不能够产生组织或皮肤刺激源。
我们已经发现本发明的抗微生物药在控制胃肠疾病方面的活性比聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)制备的抗微生物药得到显著改善。本发明超活化的衍生物可以用于治疗广泛动物(包括人)和广泛微生物的感染。
本发明的抗微生物药可以用于治疗人的胃肠疾病，不过，特别优选将其用于治疗其它动物，特别是选自狗、猪、绵羊、马、山羊、牛、猫、家禽、鸭子、火鸡和鹌鹑组成的组的动物。
本发明的抗微生物药可以制备成口服或直肠给药的形式。直肠给药特别可以用于反刍动物。还可以使用肠溶包衣材料制备反刍动物用的口服制剂以便在胃肠道下部提供最佳活性。
本发明的抗微生物药特别适用于治疗和预防胃肠溃疡、腹泻和胃肠癌。本发明的抗微生物药还可以通过改善动物体内饲料向体重的转化率而改善农场动物的体重增加率。
我们已经发现本发明的抗微生物药可以用作生长促进剂且所述聚合物可以用于取代目前使用的抗生素。在致病菌中存在的抗药性是人用药物中的主要临床重要难题。这一问题因在动物饲料中使用重要的抗生素以增加农场动物、特别是家禽和猪的体重而加剧。实际上，在某些欧洲国家中，已经禁止在动物饲料中使用常用抗生素。本发明的抗微生物药可以用于治疗动物以便明显延长在人体疗法中使用的常用抗生素的寿命。
我们已经发现本发明的抗微生物药对广泛的微生物有效，包括原生动物、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本发明的聚合物含有不同构型的多个结构且可以发现与在靶生物体细胞壁上发现的蛋白质相适合，这一结构加速了所述蛋白质的失活和对细胞的破坏。在革兰氏阴性菌中，已经发现本发明的抗微生物药特别适用于提供对大肠菌类或肠细菌类的广谱活性。它特别用于治疗因大肠杆菌、诸如肠毒性大肠杆菌和β-溶血大肠杆菌感染导致的胃肠疾病。大肠杆菌病是养猪工业中的一种毁灭性疾病。该病一般与断奶后小肠中的β-溶血大肠杆菌增殖有关并且在断奶的幼小猪仔中导致高死亡率和发病率。感染的断奶猪仔不能获得正常的体重增加。
球虫病是动物、特别是家禽的原生动物疾病，且如果不加控制，则具有毁灭性作用。我们已经发现本发明的抗微生物药可以用于治疗或预防鸟类、特别是家禽的球虫病。在小鸡中，球虫病的典型症候包括缺乏活力、体重快速下降、腹泻和痢疾。最严重的作用发生在肠中，其中原生动物倾向于侵害粘膜并导致上皮损伤、损害和出血。已经尝试将疫苗用于预防球虫病，但存在副作用，包括体重下降和食欲缺乏的倾向。
本发明的抗微生物药可以与其它已知具有抗球虫病活性的药物联用。这类药物包括硝基二苯脲、喹啉、吡啶酮、胍、喹喔啉、托曲珠利(toltrazural)、甲苯甲酰胺(toluamide)、增效磺胺药和含有二苯脲的离子载体。
梭状芽孢杆菌属是导致一定范围动物发生严重疾病的革兰氏阳性菌。例如，坏死性肠炎病是已知影响商品家禽的疾病。梭状芽孢杆菌属的细菌产生所有已知毒素中某些最具毒性的外毒素。坏死性肠炎病特别影响14-42日龄的小鸡。这种疾病导致声音黯然、腹泻并可以在数小时内导致死亡。
包括慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡在内的上部胃肠疾病是显著的人体健康问题。认为螺杆菌属是导致溃疡发生和胃肠癌、特别是胃腺癌发生的原因。我们已经发现本发明的抗微生物药特别用于抗动物、特别是人胃肠疾病中的螺杆菌属、包括幽门螺杆菌。
胃部感染幽门螺杆菌是世界上最常见的感染性疾病之一。约有50％的群体感染幽门螺杆菌。在发展中国家，据估计超过80％的人群在儿童时代就已经感染了幽门螺杆菌。
幽门螺杆菌是通过细胞一端上的鞭毛游动的革兰氏阴性微需氧螺旋形杆菌。对幽门螺杆菌感染的标准治疗是所谓的三联抗生素疗法，所有这些疗法均包括甲硝唑或克拉霉素。令人遗憾的是，幽门螺杆菌菌株已经显示出了对这两种抗生素的耐受性。
幽门螺杆菌生活在胃上皮细胞表面与其上面的粘液凝胶层之间的界面上。另外发现幽门螺杆菌位于十二指肠和食道中的胃上皮上部。其它动物种类在其胃肠道中存在其独特的螺杆菌属种类，它们具有与幽门螺杆菌类似的特性。除与胃肠癌有关外，幽门螺杆菌还与人体内的胃炎和消化溃疡形成有直接的关系。
螺杆菌属种类一般且特别是幽门螺杆菌通过分泌脲酶在胃部的极端条件下存活，而分泌的脲酶水解脲而得到氨和碳酸氢盐离子，由此使杆菌邻近周围的pH升高。这种局部条件的改变防止了细菌受到胃酸杀菌作用的影响。胃保护性粘液层下的优选部位对存活也是有利的且其运动使它通过该层而达到该部位。
胃上排列的上皮细胞难以自然透过；这是防止身体的其余部分接触胃液和消化液的功能的一部分。这种透过上的困难也使得身体的天然防御难以通过胃壁并达到幽门螺杆菌感染的部位。这存在两个结果身体将更多的营养物输送到辅助白细胞、T-细胞和其它防御结构的部位，伴随将营养物提供给杆菌；且防御细胞最终死亡，释放其荷载的超氧化物离子和其它致死性化学物质，破坏周围的上皮细胞。
显然这种活性导致可能易于发展成消化性溃疡的胃炎。如果侵害持续进行，那么发生胃腺癌和与粘膜相关的淋巴组织(MALT)淋巴瘤的可能性就会显著增加。胃腺癌从粘膜上发生且发生的第一个阶段肠组织转化是胃避免自身发生幽门螺杆菌感染的反应。此外，在UCL医学院进行的研究已经证实MALT淋巴瘤需要得到来自幽门螺杆菌特异性T-细胞的帮助而生长。已经证实治疗幽门螺杆菌感染在治愈MALT淋巴瘤上极为有效。世界卫生组织已经将这种病原体标记为I类致癌物。
因此，本发明还提供了治疗或预防由螺杆菌属感染导致的胃肠道疾病的方法，该方法包括经胃肠给予治疗量的活性剂的步骤，其中该活性剂包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物，所述的含有羟基的有机化合物选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。本文所用的术语多元醇指的是含有至少两个羟基的化合物。形成的衍生物一般选自半缩醛和缩醛衍生物。
因此，本发明方法的应用提供了手术、放疗或传统化疗治疗胃肠癌外的另一种方法。
本发明进一步提供了螺杆菌属细菌种类导致的胃肠感染的治疗方法，所述的胃肠感染诸如有胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃恶性淋巴瘤或胃癌，该方法包括经胃肠给予治疗量的活性剂的步骤，其中该活性剂包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物。
本发明提供了螺杆菌属感染的传统疗法外的另一种方法，一般来说，传统疗法包括所谓的三联抗生素疗法，其中所有疗法均包括甲硝唑或克拉霉素。幽门螺旋杆菌菌株已经出现了对这两种抗生素的耐受性且我们已经证实本发明的方法可以有效治疗这类抗生素抗性细菌。
已经证实属于聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物之间的反应的产物可比相应的非超活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)部分更有效地治疗螺杆菌属感染。
本发明进一步提供了聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物在制备用于治疗或预防由螺杆菌属感染导致的疾病的药物中的应用。
本发明的方法可以用于治疗或预防胃肠癌。它们可以包括例如食道癌、胃癌、肠癌和结肠癌。这类癌症的实例为人结肠癌细胞系HT-29。
当将本发明的抗微生物药混入动物饲料或水中时，可以按照常用方式实施该步骤。在优选的实施方案中，将本发明的抗微生物药混入预混合物。这种预混合物优选包括所述的抗微生物药、生理上可接受的载体和可选的食物。该预混合物一般为相对浓缩形式且适合于用其它物质稀释、诸如用一种或多种其它载体、维生素和矿物质添加剂和食物稀释成成品动物饲料。该预混合物优选包括浓度在0.1-70％重量、优选0.5-50％重量范围的抗微生物药。最佳浓度取决于疗法对控制或治疗而言是否是预防性的和本发明的抗微生物药是唯一具有活性的或是否将其用于与其它物质或抗微生物药相联合的伴随疗法。
在优选的实施方案中，抗微生物药的浓缩组合物是控释形式。控释剂型包括抗微生物药和用于提供抗微生物药从控释系统中释放的聚合物且特别适用于向固体饲料物质中添加的组合物。作为控释制剂的结果，抗微生物药可以延缓释放以便主要在十二指肠中出现。控释聚合物还可以将因味道导致的组合物排出(rejection)减少到最低限度或用于直肠用栓剂。
本发明的抗微生物组合物可以为丸粒、丸剂等固体组合物形式。可以通过下列步骤制备含有本发明抗微生物药的丸粒(i)将所述抗微生物药溶于碱或碱性的水溶液；(ii)用酸中和所述的溶液；(iii)向所述中和的溶液中加入不溶性交联的丙烯酸吸附剂聚合物和/或丙烯酰胺与丙烯酸共聚物以形成湿润的可溶胀丸粒；和(iv)任选全部或部分干燥所述湿润的可溶胀丸粒。
如此形成的湿润的可溶胀丸粒可以以湿润、部分干燥或完全干燥的形式用作例如动物饲料这样的添加剂。对这种系统进一步设计，从而外部聚合物基质的含羧基部分使得本发明主题的聚合物在胃的酸性环境中时基本上保持包含在所述基质内。然而，在十二指肠的碱性环境中，基质的羧基离子化且相互排斥，而所述丸粒快速溶胀，通过自身拥有的离子基团间的排斥的辅助使得本发明主题的聚合物被排除在扩散过程外，基本上与饲料通过十二指肠的速度相差无几。
在本发明中，使用的术语″控释系统″具有与《控释转运》(″Controlled Drug Delivery″)(Robinson & Lee，1987)上下文中相同含义且包括与《控释转运》(″Controlled Drug Delivery″)(Robinson &Lee，1987)中所述实例相同的范围。可以用本领域中公知的许多其它pH-敏感性控释系统(Robinson和Lee，1987)取代丙烯酸聚合物或丙烯酰胺与丙烯酸共聚物。例如，可溶性和阴离子型、或不溶性交联和阴离子型、纤维素类系统；或可溶性和阴离子型、或来源于任何普通丙烯酸聚合物和/或其衍生物的不溶性交联和阴离子型聚合物。优选这类交联和不溶性聚合物，因为它们可溶胀且几乎不能被代谢。
优选所述的控释系统包括pH-敏感性的交联吸水性丸粒，此时，湿丸粒为凝胶。
本发明还提供了包括本发明的抗微生物药和饲料的动物饲料组合物。抗微生物药的含量优选为总饲料组合物的0.0001-25％且优选为总饲料组合物的0.0001-5％。
在另一个优选的实施方案中，可以配制本发明抗微生物药以便将其加入到动物饮用水中。
优选给予0.05-5000mg/kg体重/天、更优选0.05-50mg/kg/天用量的本发明抗微生物药。
用于给予本发明抗微生物药的组合物的适宜惰性载体的实例包括水、橄榄油、花生油(peanut)、芝麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachis oil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇类、甘油三酯类、聚乙烯醇、部分水解的聚乙烯乙酸酯及其混合物。
口服或直肠给药用固体剂型可以含有药物上或兽药上可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延缓剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍树胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖或诸如新橙皮苷二氢查耳酮这样的类黄酮苷类。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露糖醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙或覆盆子香料。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯类和/或其酰胺类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇类、玉米蛋白、紫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的时间延缓剂包括单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯。
用于口服或直肠给药的混悬剂可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或鯨蜡醇。合适的分散剂包括卵磷脂、聚氧乙烯酯类或脂肪酸类、诸如硬脂酸、聚氧乙烯山梨糖醇的单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐的单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。
抗微生物药组合物可以进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上列举的分散剂或诸如阿拉伯树胶或黄蓍胶这样的天然树胶。
可以通过本领域中公知用于制备组合物的方式(诸如兽药和药物组合物领域中)制备本发明方法中用于给药的组合物，包括掺合、磨碎、匀化、悬浮、溶解、乳化、分散；且如果合适包括将本发明主题的聚合物与选择的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂彼此混合。
为了口服给药，所述的药物或兽药组合物可以为片剂、锭剂、丸剂、糖锭、胶囊、酏剂、粉剂、包括冻干粉、溶液、颗粒、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酊剂的形式。还可以制备例如包衣颗粒、多层片或微粒形式的缓慢释放或延缓释放剂型。
一般优选通过在空气中氧化固体而由聚(2-丙烯醛)制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)。开始可以将主要是干态形式的聚(2-丙烯醛)聚合物加热至80-110℃下。更优选开始时将所述聚合物加热至约85℃下。优选将聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)在醇中加热1小时-1400小时且更优选1小时-60小时的时间期限。
本发明进一步提供了包括本发明抗微生物药的防腐剂化合物或组合物。
本发明进一步提供了包括本发明抗微生物药的消毒剂或抗菌剂组合物。
我们在本发明的另一个方面中提供了治疗胃肠疾病的组合物，它包括如上所述的抗微生物药聚合物和另一种化疗剂，其中所述的另一种化疗剂吸附在所述的抗微生物药上。
这种吸附一般会减少所述另一种化疗剂的膜透过。用于该实施方案的合适的化疗剂是当与所述聚合物抗微生物药混合时表现出膜透过显著减少的那些化疗剂。优选将所述的透过至少抑制到原来的50％。
用于本发明该方面的化疗剂包括用于治疗胃肠疾病的抗生素和用于治疗胃肠癌抗癌药。
化疗剂与聚合物抗微生物药联用减少了所述化疗剂的膜透过，由此减少了全身副作用并提供了更为靶向的疗法。在许多情况中，气味也得到减少。
用于治疗胃肠疾病的化疗剂的实例包括抗生素和抗癌药。
可以与抗微生物药聚合物联用的抗生素的实例包括四环素类、青霉素类、氨基糖苷类、磺胺类药、头孢菌素类和硝基呋喃类。
抗生素可以是用于治疗胃肠道感染的常用抗生素。
可以与抗微生物药聚合物联用的抗癌药的实例为烷基化剂、抗代谢物质、抗癌抗生素、植物生物碱、激素和其它抗癌药、特别是仅含有碳、氢和氧的抗癌药。
本发明的组合物还可以包括一种或多种其它抗微生物药，诸如选自下列成分的组酚(优选用量为0.1-10％重量)；异噻唑烷酮(优选用量为0.001-1％)；对羟基苯甲酸烷基酯(优选用量为0.02-2％)；和低级链烷醇(优选用量为20-99％)，其中所述的用量为基于组合物重量的重量。
已经发现用于本发明方法的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物比聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物具有显著增加的稳定性。由于现有技术中记录了聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的某些不稳定性，正如其组合物中抗微生物药的活性下降所证实的，所以我们在升温、即在40℃下进行″加速老化″。然而，令我们最感到意外的是，在40℃升温下在水溶液中或在水-聚乙二醇溶液中″老化″聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)不仅减缓了抗微生物活性的降低，而实际上又表现出聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的抗微生物活性确切增加，参见实施例2(a)和(b)。现有技术预计升温应导致″加速老化″、即抗微生物药活性加速下降，本发明的这一发现与现有技术完全相矛盾且令人意外。
本文通过形成包括聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)在内的新构型的本发明主题的聚合物而使抗微生物活性增加的方法称作″超活化″且这些聚合物称作″超活化的聚合物″。
与现有技术相比，更令人意外的是本发明者已经发现使用碱性条件、随后使用酸性条件可以促进聚乙二醇水溶液中的超活化。此外，通过加热和水分促进超活化。
聚乙二醇类或多元醇类或链烷醇类的存在可促进超活化，我们认为，因为存在的聚乙二醇或多元醇或链烷醇类通过形成缩醛类而防止了坎尼扎罗反应导致的碱性降解且保护并稳定了所述聚合物的羰基。
超活化的其它优点在于减少或消除了能引起组织和皮肤刺激的污染物丙烯醛。
需要强调的是超活化与仅因在任意含水测试介质中使用更多的聚合物而导致的任何抗微生物活性增加十分不同且是对它们的补充，正如诸如过期的澳大利亚专利申请AU-A-11686/95(下面称之为″11686/95″)中证实的聚合物疏水性增加的结果。本发明者严格重复了11686/95中所述的方法，然后发现部分可溶性聚合物的随后超活化明显增加了另外的相当显著的抗微生物活性。应注意即使超活化也无法赋予来自11686/95的聚合物完全的可溶性，这一结果与首先在80-85℃下加热聚合物开始超活化的结果相反。
实现聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的超活化的最佳时间与温度成反比。显然即使可以将在室温下老化用于超活化，尤其是当在有羟基溶剂和/或碱、随后是酸度存在的情况下时，这一手段因需要较长时间期限而可能不切实际。
本发明者已经发现本文所述适合于胃肠疗法的超活化聚合物、基于水的产品或方法中的防腐剂以及消毒剂或抗菌剂中的活性组分具有提高的抗微生物活性的优点。此外，本发明者发现这类消毒剂或抗菌剂的抗微生物活性通过增加其pH、例如pH在6以上而得到提高。
本发明的一般特征在于通过半缩醛/缩醛形成或通过吸附使能够发生疏水作用的基团与本发明的抗微生物药结合而提高抗微生物活性。
现在参照几个实施例来描述本发明，但这些实施例不应看作是用来限定本发明的范围。
具体实施例方式
杀生物试验用1％重量的碳酸氢钠水溶液溶解样品以获得所需浓度(除非另有说明，浓度为0.125％重量的聚合物)。将19.9g稀释样品称重入无菌瓶并给其中接种0.1mL的107-108cfu(菌落形成单位)的铜绿假单胞菌并混合。在具体的时间间隔将1mL接种的样品转入9mL Letheen肉汤并涡旋。按1∶10系列稀释进行铺平板。向其中倾倒胰胨豆胨琼脂。在37℃下保温3天。
实施例1本实施例描述了通过在空气中氧化固体丙烯醛聚合物制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的方法。这种聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)是制备用于本发明方法优选方法中的原料。在通风橱内将水(720mL，环境温度下，约20℃)和丙烯醛(60g；新近蒸馏的，加入了氢醌至0.25％w/w)放入开口烧杯中并极为剧烈地进行机械搅拌。然后加入0.2M氢氧化钠水溶液(21.4mL)至pH达到10.5-11.0。
该溶液立即变成典型氢醌阴离子的黄色且这种颜色在几分钟内消失且该澄清溶液变成乳状。
约1分钟后，白色絮状聚合物开始沉淀且看起来在15-30分钟内沉淀完全。将沉淀过滤并用水(250mL)洗涤、在室温下在滤纸上干燥2天(产量25g)，然后在玻璃平皿上铺成薄层并以40℃/8小时下加热。按照下列方案持续这种加热50℃/15小时；65℃/4小时；75℃/18小时；84℃/24小时。
预计可以将该方法按比例放大以包括例如在密封容器内逐步添加丙烯醛且随后更为快速地干燥(比较实施例10)。
一般来说，在15-30分钟的时间内通过搅拌向1％w/w碳酸钠水溶液(100mL)中加入2g本发明主题的聚合物且然后按照需要稀释来制备所得聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的溶液。这类溶液优选是澄清的-与使用来源于11686/95的实施例5的聚合物尝试进行的溶解相反。
实施例2本实施例描述了由聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)形成缩醛。
(a)将5g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于64g聚乙二醇(″PEG″)200并与31g 0.71％w/w碳酸钠溶液合并。使部分该溶液(表观pH＝5.8)保持在室温下；同时(b)将来自部分(a)的样品的剩余部分在60℃下加热12或25天的期限。
用1％w/w碳酸氢钠稀释来自(a)和(b)的样品并在0.125％w/w的聚合物浓度下进行杀生物测试。令人意外的是，进行″加速老化″的样品表现出改善的抗微生物活性，正如可以参照表1所观察到的
表1
*菌落形成单位/mL将1g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于200mL 0.1％w/wNa2CO3并使该体系稳定过夜。加入0.05％w/w浓度的十二烷基硫酸钠并用HCl将该溶液酸化至pH5.9。将部分样品储存在室温和60℃下。用0.125％w/w聚合物溶液进行杀生物试验，用1％w/w NaHCO3作为稀释剂。″老化″样品在性能上表现出令人意外的改善，正如可以参照表2所观察到的表2
*菌落形成单位/mL(c)如实施例(2a)中所述制备5％w/w的超活化的聚合物溶液，但用PEG1000取代PEG200。用浓NaOH将部分该溶液处理至pH8.1。在60℃下加热样品并进行杀生物测试。使样品接触更为碱性的条件，令人意外地得到了优良的杀生物特性，正如可以参照表3所观察到的；
表3
*菌落形成单位/mL实施例3本实施例检验了通过使聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与聚乙二醇反应而得到的产物。
可以通过检验透析并浓缩所述聚合物溶液后遗留的固体残余物、使用质子(1H)和碳(13C)NMR光谱测定实施例2(b)聚合物中存在的缩醛类。透析除去了所有分子量低于1000的物质。表1提供了质子(1H)和碳(13C)NMR数据。正如可以从表1中所观察到的，残余物的核磁共振光谱在1H核磁共振光谱的δ3.58和3.56处和13C核磁共振光谱的δ71.62、69.48和60.25处显示出峰。这些峰表示聚乙二醇单位结合成缩醛类。
表4来自透析和浓缩后超活化聚合物固体残余物的1％w/wNa2CO3溶液在D2O中的600MHz1H-和125MHz13C-核磁共振光谱的数据
实施例4
(a)按照与实施例2(a)类似的方式制备一定范围超活化程度的表观pH5.7的5％w/w的聚合物溶液，但改变PEG 200的百分比。
在60℃下加热样品并在一定时间期限内监测稳定性。因出现沉淀或胶凝而认为物理稳定性不合格。对溶于1％w/w碳酸钠溶液的浓度为0.01％w/w的聚合物进行UV测定。将268nm∶230nm处的吸收比例减少看作与化学稳定性下降的含义相同。结果如表5中所示表5
物理和UV光谱结果证实PEG对稳定性具有正面作用；PEG含量越高，物理和活性稳定性越高。
(b)通过将4g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于196g 1％w/w碳酸氢钠并用稀HCl将pH调节至7(A)和5.5(B)来制备下列溶液A和B。通过在65-70℃下将50g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于PEG200(640g)来制备溶液C。然后加入4g碳酸钠溶于水(306g)所得到的溶液，表观pH为7，且随后在31天处理期限结束时表观pH为5.5。
将全部样品储存在40℃下。在不同时间间隔使含有等于0.125％w/w聚合物的样品进行杀生物测试。结果如表6中所示表6
实施例5在60℃下的干燥或潮湿的封闭室内将1g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)加热3天。分别制备0.125％w/w(对水分进行了校准)的干聚合物和加湿聚合物的溶液并通过杀生物试验对它们进行评估表7
*菌落形成单位/mL这些聚合物在I.R.1700-1730cm-1之间显示出羰基和/或羧基吸收，羰基(例如使用席夫(Schiff’s)试剂)且具有Mw＝约10000和Mn＝约5000；滴定显示羧基约为5mol％。这些参数与聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的参数类似(但不相同)。
实施例6在一式两份实验中，制备聚合物样品且然后将它们溶于乙-二醇，确切步骤如11686/95中的实施例5所述。将该物质的一半进一步在80℃下加热24小时(此后，在水介质中的溶解仍然不完全)。使用标准杀生物试验比较样品的抗微生物活性。通过加热、即超活化处理的样品表现出的抗微生物活性显著提高，正如表8中所示表8
*菌落形成单位/mL实施例7在65-70℃下将50g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于PEG200(640g)。然后加入碳酸钠(4g)溶于水(306g)所得到的水溶液。将样品分开并使它们或保持在室温下或在80℃下加热24小时。在一定时间内通过反相HPLC测定该溶液中丙烯醛的含量且结果如表9中所示
表9
实施例8如实施例7中所述制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的溶液并在40、60、80、100和115℃的温度下处理不同时间期限。使样品进行标准杀生物试验以证实杀灭率增加且结果如表10中所示表10
观察到超活化所需的时间与温度成反比。来源于超活化方法的全部聚合物溶液在所有比例下与含水溶剂完全易混溶。
实施例9(a)在65℃下将540g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于2304g PEG200，此后与43.2g碳酸钠在712g水中混合。然后将该溶液加热至100℃下4小时并加入36g十二烷基硫酸钠、7g ECOTERIC T20(非离子型洗涤剂)和2g柠檬香精。用硬水将pH6的该制品按1∶30稀释并使用Association of Agricultural Chemists Official Methods of Analysis(1995)991.47，991.48，(Hard Surface Carrier Test Method)分别攻击金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(革兰氏阳性菌，对在医院内的感染有特别重要性)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)(革兰氏阴性菌，对在食物制品领域中的感染有特别重要性)。结果如表11中所示
正如通过杀生物试验所监测到的，将该制品调节至较高pH增加了抗微生物活性。结果如表12(a)和12(b)中所示表12(a)对金黄色葡萄球菌的活性起始计数3×106cfu/mL；聚合物350ppm。
表12(b)起始计数3.7×106cfu/mL；聚合物350ppm。
(b)在60℃下将1200g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于7680gPEG200且然后加入96g Na2CO3在3024g水中的溶液。将该溶液在100℃下加热6小时。
将该制品加入到压力通风式冷却塔的盆中至浓度为300ppm(30ppm聚合物)，3次/周。在推荐的操作前，在晚上进行给药以便接触时间为8-12小时；预计残余浓度每操作3-6小时则减半。再循环水的平均温度为27℃、pH8.5、电导率3000μS。测定微生物计数并与相邻的相同的每天给予生物分散剂的塔相比较。结果如表13中所示表13
*菌落形成单位/mL数据表明处理步骤将微生物计数维持在了AS/NZ标准3666.3(Int)1998指南内，且低于含有生物分散剂的相邻塔(发现在极热的夏季试验期要求的条件中异常地不足)中的微生物计数。
实施例1010(a)对比实施例本实施例表示了不使用本发明方法的丙烯醛聚合物的制备方法。
1.0 0.8％w/w氢氧化钠将9.90kg去离子水放入10L不锈钢桶中并将0.08kg氢氧化钠加入到水中且搅拌至溶解为止。
2.0聚合将100.1kg去离子水放入200L不锈钢桶中并将4.99kg的0.8％w/w氢氧化钠溶液加入到200L水桶中。平衡该溶液至15-20℃。同时加入20kg丙烯醛单体并在1小时内以一定的速率将剩余的0.8％w/w氢氧化钠溶液加入到200L桶中，使得pH保持在10.5-11.0且温度不超过30℃。再持续聚合90分钟。
3.0洗涤过滤/离心聚合混合物并用去离子水将该聚合物洗涤至洗涤水的pH低于7.0。近似产量为8kg。
4.0干燥在空气中干燥所述聚合物，然后使用如下步骤在烘箱内加热。
步骤 时间 温度12小时25℃21小时40℃31小时70℃41小时75℃52小时85℃5.0溶解将400L水放入500L桶并加入4kg碳酸钠且搅拌至溶解。缓慢加入8kg干燥加热的聚合物并搅拌30分钟。
发现所得聚合物在1％w/w碳酸钠中具有约90-95％w/w的溶解度。
实施例10(b)本实施例描述了制备丙烯醛聚合物的方法，其中通过本发明的方法使对比实施例的聚合物超活化。
1.0碱的制备在适宜容器中将0.4kg碳酸钠溶于30.6kg水并将64kg聚乙二醇200放入该混合容器。使用机械搅拌器开始搅拌并将PEG200加热至65±3℃。将来自实施例10a的5kg干丙烯醛聚合物加入到PEG200中并搅拌至得到均匀混合物为止。
注意该固体在这一阶段可能并不完全溶解。
以确保溶液的pH保持在3.5-9.0范围的速率将碳酸钠溶液缓慢加入到乙二醇混合物中。
在65±3℃下将该溶液搅拌45分钟。
注意pH应在7-9的范围。温度应在65±3℃的范围。
2.0超活化覆盖混合容器并加热至100℃下四(4)小时。发现所得聚合物在水中具有约99.5-100％w/w的溶解度。
实施例11本实施例检验了实施例10a的干燥、正常活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物的抗微生物活性和实施例10b中所述的超活化缩醛衍生物的抗微生物活性。
按照下列步骤将每一次用所述的抗微生物药治疗的小鸡与对照组进行比较在每一试验中，20只1日龄Cob小鸡(品系53)购自商业孵卵处。给它们称重、分出性别并随机分入分离的动物居室室内的相邻围栏中。雄性和雌性小鸡均匀分布。可随意得到水和饲料。膳食为含有抑球虫剂(125ppm双硝米特)的市售食品屑(Chick Starter，Milne Feeds18％粗蛋白)。
对10只小鸡通过固定的饮水器给予来自实施例10a的0.1％w/w正常活化的抗微生物药的水溶液制剂，持续14天；剂量为30mg/kg/天。其它10只小鸡为对照组。
在第0、4、7、11和14天给两组小鸡称重。在本试验完成时，对全部小鸡实施安乐死并对治疗的小鸡在死后进行尸体解剖。对胸腔和腹腔进行彻底的总体检查。
结果表14a在试验过程中使用实施例10a的正常活化的抗微生物药增加的体重
在14天期限结束时，经测定治疗组具有的体重增加大于对照组。
在本试验完成时，处死后，在小鸡治疗组中进行的这种总体检查发现，没有观察到毒性的临床或病理学症候。
表14b在试验过程中使用实施例10b的超活化的抗微生物药增加的体重
在本试验完成时，对两组死后剩余的小鸡进行的总体检查发现，没有观察到临床或病理学症候。
结论在治疗组与对照组之间的体重增加存在显著性差异(x2；P＜0.015)。在本试验完成时，治疗组的体重高于对照组23％。
超活化的缩醛衍生物比对照组在体重增加方面得到显著改善，而在下一个实施例中，当与正常活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)比较时，表现出缩醛衍生物肠抗微生物活性的显著改善。
实施例12本实施例评价了实施例10b的聚合物抗微生物药在农场条件下对断奶后的猪大肠杆菌病(PWC)的控制。
方法在具有长期PWC问题史的大商业猪舍用与断奶相关的压力攻击口服接受掺入饲料或水中的超活化抗微生物药制剂APRALANO(Elanco)、自体疫苗接种或两者均不进行的146只幼猪[断奶者]。
评价它们在发生腹泻、体重增加和死亡率方面的反应并记录在表15中。
表15
注意1.治疗组编号i.1组＝0.1％w/w饲料中的超活化的聚合物抗微生物药。
ii.2组＝0.02％w/v水中的超活化聚合物抗微生物药。
2.本试验过程中死于PWC的组百分比。
3.当记录的粪便得分为1或2时组中每只猪的平均天数；粪便得分为腹泻强度的量度标准。
4.每只猪的粪便得分总和除以观察样品的数量。
5.F＝Fisher精确试验。
结论这种农场试验突出了以下观点对用于商业猪舍中的小猪在断奶后用β-溶血大肠杆菌攻击时聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的缩醛衍生物(超活化的抗微生物药)的功效具有的正面反映1.死亡率用超活化的聚合物抗微生物药治疗的组的死亡率低于未治疗的、接种疫苗或Apralan组。
2.腹泻天数超活化的聚合物抗微生物药治疗组的腹泻天数显著少于[F；P＜0.0001]未治疗的、接种疫苗或Apralan组。
3.粪便得分超活化的聚合物抗微生物药治疗的组的平均粪便得分显著低于[F；P＜0.0001]未治疗的、接种疫苗或Apralan组。
实施例13本实施例检验了使用某些添加剂的本发明抗微生物药的作用。
方法制备攻击培养物的过夜肉汤并估计过夜培养物中总的存活计数(TVC)。
使用无菌生理盐水(5mL)按1∶1连续稀释样品。当测试样品含有EDTA时，将无菌硬水(SHW)用作稀释剂。
用9份稀释剂稀释1份每一过夜培养物。将所得的稀释混悬液用作接种物。
给每一样品稀释液接种100uL的稀释的过夜培养物。(1种培养物/管)。充分混合。
将试管在37℃下保温≤24小时(将黑色曲霉(A.niger)在28℃下保温≤24小时)。
从每支试管中取1mL传代培养成9mL恢复(revovery)肉汤并充分混合(恢复(revovery)肉汤对聚合物抗微生物药和EDTA而言为营养肉汤+3％Tween 80(NBT)；对戊二醛而言为营养肉汤+3％Tween 80+0.1％氨(NBTA)；且对对羟基苯甲酸甲酯而言为Letheen肉汤(LB))。
将样品在37℃下进一步保温≤48小时(对黑色曲霉而言28℃下保温≤5天)。
检查每支试管的生长情况。然后在选择琼脂上传代培养全部试管内含物并在37℃下保温≤24小时。(对黑色曲霉而言28℃下保温≤5天)。将选择琼脂上的生长用于证实测试生物体生长。
使用接种了培养物的5mL稀释液进行阳性对照并进行保温、回收和验证。
使用未接种的5mL稀释液进行阴性对照并进行保温、回收和验证。
结果将结果绘制成下表。
表16选择的防腐剂的MKC和协同指数注意将所有比值表示为聚合物抗微生物药防腐剂之比
说明1)聚合物抗微生物药0.025％w/w2)聚合物抗微生物药0.2％w/w3)戊二醛0.025％w/w4)聚合物抗微生物药0.025％w/w+戊二醛0.025％w/w5)聚合物抗微生物药0.2％w/w+戊二醛0.025％w/w6)聚合物抗微生物药0.2％w/w7)EDTA 0.1％w/w8)聚合物抗微生物药0.2％w/w+EDTA 0.1％w/w9)聚合物抗微生物药0.2％w/w(溶于80％w/w甘油)10)对羟基苯甲酸甲酯1％w/w(溶于80％w/w甘油)11)聚合物抗微生物药0.2％w/w(溶于80％w/w甘油)+对羟基苯甲酸甲酯1％wlw(溶于80％w/w甘油)。
表17与聚合物抗微生物药的协同指数
注意协同作用＜1.0，加合作用＝1.0，拮抗作用＞1.0由此SI＝CD/A+CE/BA＝MKC聚合物抗微生物药B＝MKC防腐剂C＝MKC混合物D＝A与B之比
E＝B与A之比结论经证实聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的缩醛衍生物分别与戊二醛、EDTA和对羟基苯甲酸甲酯对黑色曲霉、白色假丝酵母、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌具有协同作用。
实施例14本实施例证实本发明的抗微生物药与″Dettol″商标的抗微生物药联用的活性。
使用无菌生理盐水(5mL)按1∶1连续稀释样品。
给每一样品稀释液接种100uL的稀释过夜培养物。(1种培养物/管)。充分混合样品。
将它们在37±2℃下保温≤24小时。(将接种黑色曲霉的试管在28±2℃下保温≤24小时)。
从每支试管中取1mL传代培养到9mL回收肉汤并充分涡旋(对黑色曲霉而言NBT或Sabouraud+3％Tween 80(SABT))。
将它们在37±2℃下保温≤48小时。(将黑色曲霉在28±2℃下再保温5天)。
检验回收肉汤的浊度(生长)并在选择琼脂上划线以证实生长。
表18以ppm计的超活化聚合物抗微生物药和/或″Dettol″的MKC结果
说明1)0.1％w/w聚合物抗微生物药2)0.2％w/w聚合物抗微生物药3)″Dettol″4.8％w/v(按1∶20稀释)4)0.1％w/w聚合物抗微生物药+″Dettol″(按1∶20稀释)5)0.2％w/w聚合物抗微生物药+″Dettol″(按1∶20稀释)表19聚合物抗微生物药与Dettol的协同指数
注意如果SI＞1，则为拮抗作用；如果SI＝1，则为加合作用；如果SI＜1，则为协同作用。
SI＝CD/A+CE/BA＝MKC聚合物抗微生物药(ppm)B＝MKC Dettol(ppm)C＝聚合物抗微生物药/″Dettol″混合物的MKC(ppm)D＝聚合物抗微生物药与Dettol之比E＝″Dettol″与聚合物抗微生物药之比注意使用″Dettol″商品名的活性抗微生物药为对氯二甲酚结论经证实本发明的聚合物抗微生物药与″Dettol″对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母和黑色曲霉具有协同作用。这一结果表明″Dettol″与聚合物抗微生物药在作为混合溶液联用时所起的作用基本上优于它们各自所起的作用。
实施例15聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的抗菌特性跟踪抗微生物药聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的抗菌特性。
在施用抗微生物药前后测定受试者手上存在的细菌数量，随后带上手术用手套。将聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的抗菌作用与常用手术抗菌剂4％氯己定术前洗消液(由位于Perth，Western Australia的Orion Laboratories生产)比较。
·3％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]水溶液在3小时后减少了带手套手上菌群的基线计数。
·含有70％乙醇的2％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]水溶液在3小时后使带手套的手上的基线细菌计数缓慢持续减少，正如使用4％氯己定所起的作用。
·在带上手术用手套前在手上施用含有3.1％十二烷基硫酸钠的3.2％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]水溶液、随后是4％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的70％乙醇的水溶液在3小时后使基线细菌计数显著减少。
这些结果表明聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]具有持续控制无菌手术中的细菌数量所需的良好剩余抗微生物活性。制剂中包含70％乙醇有助于细菌数量开始时快速减少。
实施例160.125％w/w和0.05％w/w超活化聚合物在pH7和pH4下对参比菌株幽门螺杆菌NCTC 11637的杀生物活性。
首先建立超活化聚合物对幽门螺杆菌参比菌株幽门螺杆菌NCTC11637的体外功效。作为变量，选择两种浓度；一种是实施例2中制备的5％超活化聚合物溶液的40倍稀释液，得到0.125％w/w浓度的超活化聚合物，模拟胃中的稀释液；另一种为100-倍稀释液，得到0.05％w/w浓度的超活化聚合物。选择两种pH，作为基线的pH7和模拟胃中条件的pH4。
使培养物幽门螺杆菌NCTC11637以微需氧方式在37±2℃下生长在选择琼脂平板上，直到观察到足量生长。以无菌方式从平板上取出生长物并制成用无菌生理盐水稀释的标准化10％T的浑浊混悬液，正如在Vitek比色计上显示的。称出19.9g样品并接种100μL培养物混悬液。立即将1mL样品转入失活/回收肉汤(营养肉汤+3％Tween80)且然后连续稀释。将100μL等分试样置于选择琼脂平板上并使用一次性无菌涂布器涂展。在5、10、15和20分钟的时间间隔重复转移步骤。将全部平板在37±2℃下以微需氧方式保温至获得足够生长(约5-7天)。对所有菌落计数且测定菌群对时间的减少数量。使用无菌生理盐水作为样品重复该试验以便测定在空气条件下的自然逐步死亡的比例。
说明培养物1.超活化的聚合物，pH7，0.125％w/w。
培养物2.超活化的聚合物，pH7，0.05％w/w。
培养物3.超活化的聚合物，pH4，0.125％w/w。
培养物4.超活化的聚合物，pH4，0.05％w/w。
培养物5.无菌生理盐水，pH7。
培养物6.无菌生理盐水，pH4。
表20CHEMEQRTM聚合物抗微生物药对幽门螺杆菌(NCTC 11637)的杀生物活性
注意以菌落形成单位(cfu)/mL失活肉汤计的计数对参比菌株的结果(表20)证实超活化的聚合物在pH7和0.125％w/w和0.05％w/w下有效且还在pH4和0.125％w/w下有效。
实施例17为了对实施例16进行进一步分析，在pH7和pH4下检验其它三种幽门螺杆菌菌株耐克拉霉素和甲硝唑的幽门螺杆菌01/303；具有对可能的动物模型有影响的高定居能力的在悉尼分离的临床菌株幽门螺杆菌SS1；和已经测序基因组且来源于UK的菌株幽门螺杆菌ATCC 700392。
表21超活化的聚合物在0.125％pH7下的杀生物活性
当用超活化的聚合物在0.125％w/w和pH7下处理时，所有菌株均被快速杀灭，其中抗生素抗性菌株特别易于在10分钟以内死亡(表21)。对照组菌株未经处理。
实施例18重复实施例3的方法测试0.125％w/w超活化的聚合物(pH4)对幽门螺杆菌的所有菌株的杀生物活性。
表22超活化的聚合物在0.125％pH7下的杀生物活性
在模拟胃的pH4和0.125％w/w的条件下测试超活化聚合物，结果所有菌株在20分钟内被杀灭(表3)。这一结果是显著的，因为这一杀伤幽门螺杆菌的时间范围比通过胃的时间短(40分钟-1小时)。这一结果证实超活化的聚合物在与治疗胃中幽门螺杆菌感染一致的pH、浓度下和时间范围内的有效性。对照组菌株是未经处理的。
实施例19本实施例证实按照实施例10b的步骤制备的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)缩醛衍生物的肠抗微生物活性。
材料和方法16只断奶的猪(年龄18天±2天；而体重为5.5kg±1.0kg)购自商业猪舍。将它们随机分成2组，每组8只猪(性别平均分布)并关在环境受控的分离的动物室内。
使动物在进入动物室时可随意进食和饮水且膳食为不含抗微生物药的商品断奶者用的丸粒[19％粗蛋白]。
通过静脉内注射巴比妥钠对全部断奶的猪实施安乐死且然后进行尸体解剖。使用Qiagen Dneasy组织试剂盒、按照提供的说明从24只断奶猪的胃的胃和食管区中提取DNA。将3uL提取的DNA用于测试活检组织样品中存在螺杆菌属的种类。对每一样品进行两次聚合酶链反应(PCR)，在每一次PCR试验中包括7份对照DNA样品。发现在进行的PCR之间无差异。
结果治疗的编号组1未治疗(阴性对照)组20.1％w/v实施例10b的超活化聚合物抗微生物药；30mg/kg/天。
表23使用预先最优化的属特异性引物对螺杆菌属种类进行的PCR结果，其中+代表对螺杆菌属种类的阳性检测结果，而-代表未检测。
在组1(未治疗)中，对螺杆菌属种类存在5个阳性PCR结果(1-胃；4-食管)，而在组2(0.1％w/v的聚合物抗微生物药)中，无阳性PCR结果。
结论0.1％w/v的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的缩醛衍生物显著(x2P＜0.025)减少了猪螺杆菌属在断奶猪的胃和食管粘膜中的发生率。
实施例20对比实施例20(a)本实施例表示未超活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的制备方法。
0.8％w/w氢氧化钠将9.90kg去离子水放入10L不锈钢桶中并向水中加入0.08kg氢氧化钠且搅拌至溶解。
聚合将100.1kg去离子水放入200L不锈钢桶中并向200L桶中加入4.99kg的0.8％w/w氢氧化钠溶液。平衡该溶液至15-20℃。同时加入20kg丙烯醛单体并在1小时内以一定的速率将剩余的0.8％w/w氢氧化钠溶液加入到200L桶中，使得pH保持在10.5-11.0，且温度不超过30℃。再持续聚合90分钟。
洗涤过滤/离心聚合混合物并用去离子水将该聚合物洗涤至洗涤水的pH低于7.0。产量约为8kg。
干燥在空气中干燥所述聚合物，然后使用如下步骤在烘箱内加热。
步骤时间 温度1 2小时25℃2 1小时40℃3 1小时70℃4 1小时75℃5 2小时85℃溶解将400L水放入500L桶并加入4kg碳酸钠且搅拌至溶解。缓慢加入8kg干燥加热的聚合物并搅拌30分钟。
发现所得聚合物在1％w/w碳酸钠中具有约90-95％w/w的溶解度。
实施例20(b)本实施例描述了丙烯醛聚合物的制备方法，其中对比实施例20(a)的聚合物被超活化。
碱的制备在适宜容器中将0.4kg碳酸钠溶于30.6kg水并将64kg聚乙二醇200放入该混合容器。使用机械搅拌器开始搅拌并将PEG200加热至65±3℃。将来自实施例20a的5kg干丙烯醛聚合物加入到PEG-200中并搅拌至得到均匀混合物为止。
注意该固体在这一阶段可能并不完全溶解。
以确保溶液的pH保持在3.5-9.0范围的速率将碳酸钠溶液缓慢加入到乙二醇混合物中。
在65±3℃下将该溶液搅拌45分钟。
注意pH应在7-9的范围。温度应在65±3℃的范围。
超活化覆盖含混合物的容器并加热至100℃下四(4)小时。发现所得超活化聚合物可以以所有比例与水混溶。
实施例21在PCT/AU9600328的实施例14中，证实聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物溶于0.5％w/w碳酸钠溶液所得到的溶液对小鼠模型中的埃利希(Ehrlich)腹水细胞系具有抗癌活性。
聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物[实施例20(a)]的抗癌活性与超活化的聚合物[实施例20(b)]的抗癌活性。对人结肠癌细胞系HT-29建立体外胃肠癌模型。以5％w/w浓缩物的形式使用聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)。所用的试验将癌细胞与不同浓度的聚合物一起保温而得到可以确定IC50的曲线。
方法将HT-29细胞(人结肠癌细胞)接种(以100ul)入96孔培养平板的各孔中并在37℃下和加湿5％CO2、95％空气中保温过夜。将聚合物[对比实施例20(a)中的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物和实施例20(b)中超活化的聚合物]溶于水且然后用介质稀释成4-log范围的10个浓度。随后将100ul的各溶液加入到5个孔中的每一个中。将平板再保温72小时，此后使用sulforhodamine B试验测定存活的细胞(Skehan等，(1990)《国际癌症研究学会》(J.Nat.Cancer Inst.)821107-1112；Monks等，(1991)《国际癌症研究学会》(J.Nat.Cancer Inst，)83757-766。)。然后用10％冷三氟乙酸将细胞在4℃下固定1小时并用蒸馏水冲洗平板，保持风干且然后用0.4％sulforhodamine B(Aldrich)的1％乙酸(v/v)溶液染色30分钟。接着通过用蒸馏水洗涤两次且最终用1％乙酸洗涤除去未结合的染料。随后将蛋白质结合的染料溶于10mM未缓冲的Tris碱并使用自动平板读取器在550nm处读取吸收度。将每一药物剂量的平均吸收表示为占未处理的对照孔中吸收度的百分比。
测试结果如表24中所示。
对比实施例20(a)的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物在两次测试中得到的平均IC50为0.030％；将聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物定为100％的值。将其转换成0.0015％w/w的活性聚合物。
对比实施例20(b)的超活化的聚合物在四次测试中得到的平均IC50为0.025％。将其转换成0.0015％w/w的超活化聚合物且表明超活化的聚合物具有抗癌活性。
表24CHEMEQRTM聚合物抗微生物药对HT-29人结肠癌细胞的IC50
IC50是抑制细胞生长达50％所需的浓度。
最后，应理解可以进行各种其它修改和/或改变而不会脱离本文概述的本发明的实质。
权利要求
1.治疗或预防动物(包括人)胃肠痰病的方法，该方法包括对所述动物经胃肠给予有效量的聚合物的步骤，所述的聚合物包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物。
2.权利要求1的方法，其中经口服给予所述的聚合物。
3.权利要求1的方法，其中所述的动物患有至少一种选自胃肠炎、溃疡、腹泻和胃肠癌以及痢疾加剧的体重增加不足组成的组的胃肠疾病。
4.权利要求1的方法，其中所述的动物患有腹泻、胃肠炎和痢疾中的至少一种疾病。
5.权利要求1的方法，其中所述的动物选自狗、猪、绵羊、马、牛、猫、家禽、鸭子、火鸡和鹌鹑组成的组。
6.权利要求1的方法，其中所述的动物选自反刍动物且经直肠给予所述的聚合物。
7.权利要求1的方法，其中所述的动物选自家禽和猪。
8.权利要求1的方法，其中所述的动物为部分生长的猪。
9.治疗或预防断奶后猪的大肠杆菌病的方法，该方法包括对断奶后的幼小猪口服给予抗微生物有效量的权利要求1所述的聚合物的步骤。
10.权利要求1的方法，其中给予0.05-5000mg/kg/天剂量的权利要求1的抗微生物药。
11.权利要求1的方法，其中给予0.5-500mg/kg/天剂量的权利要求1的抗微生物药。
12.权利要求1的方法，其中对幼小的猪给予0.05-50mg/kg/天范围剂量的抗微生物药。
13.权利要求1的方法，其中所述的胃肠疾病是因一种或多种微生物导致的，这些微生物选自大肠菌类、沙门氏菌属、铜绿假单胞菌、螺杆菌属、变形菌属、肠杆菌类、酵母、原生动物、梭状芽孢杆菌属、志贺氏菌属和球虫属组成的组。
14.治疗或预防因螺杆菌属感染导致的胃肠道疾病的方法，该方法包括经胃肠给予治疗量的聚合物的步骤，所述的聚合物包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物，所述的含有羟基的有机化合物选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
15.权利要求1的方法，其中所述的胃肠疾病是因肠毒性大肠杆菌和β-溶血大肠杆菌中的至少一种导致的。
16.治疗或预防家禽坏死性肠炎的方法，该方法包括对家禽给予有效量的权利要求1的抗微生物药的步骤。
17.权利要求1的方法，其中将所述的抗微生物药与吸附在其上的另一种化疗药联合给药而由此减少所述另一种化疗药的膜透过。
18.治疗或预防家禽球虫病的方法，该方法包括对家禽给予抗微生物有效量的权利要求1的抗微生物药的步骤。
19.权利要求1的方法，其中所述的衍生物含有多个选自半缩醛基和缩醛基中的至少一种的被护羰基。
20.权利要求20的方法，其中所述的被护羰基包括缩醛基。
21.权利要求1的方法，其中所述的醇选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
22.权利要求22的方法，其中所述的醇选自至少一种多元醇。
23.权利要求23的方法，其中所述的多元醇包括聚(亚烷基)二醇。
24.权利要求23的方法，其中所述的多元醇包括聚乙二醇。
25.权利要求23的方法，其中所述的多元醇为分子量在200-2000的聚乙二醇。
26.用于通过经胃肠给予下列抗微生物药组合物治疗或预防动物胃肠疾病的抗微生物药，包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物和用于对动物进行胃肠给药的药物或兽药上可接受的惰性载体。
27.权利要求27的用于治疗或预防胃肠疾病的抗微生物药，其中用于胃肠给药的载体选自水、控释聚合物、橄榄油、花生油、芝麻油、向日葵油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇类、甘油三酯类、聚乙烯醇、部分水解的聚乙烯乙酸酯及其混合物组成的组。
28.权利要求27的抗微生物药组合物，为饲料添加剂或饮用水添加剂的形式，包括0.1-70％重量的权利要求1所述的抗微生物药。
29.动物(包括人)饲料或饮用水组合物，包括饲料物质或水和抗微生物有效量的权利要求1的抗微生物药。
30.权利要求30的动物饲料组合物，其中抗微生物药的含量为总饲料或水组合物重量的0.001-25％。
31.抗微生物药组合物，包括权利要求1的抗微生物药和另一种选自抗微生物药和化疗剂组成的组的活性剂。
32.权利要求31的组合物，其中所述的另一种抗微生物药包括下列成分中的至少一种(以该组合物的重量计)(a)0.1-10％用量的酚；(b)0.001-1％用量的异噻唑烷酮；(c)0.02-2％用量的对羟基苯甲酸烷基酯；和(d)20-99.9％用量的低级链烷醇。
全文摘要
本发明公开了通过给予聚合物抗微生物药治疗胃肠疾病的方法，所述的聚合物抗微生物药包括通过聚(2－丙烯醛，2－丙烯酸)与醇或酚之间反应生成被护羰基而形成的聚(2－丙烯醛，2－丙烯酸)的衍生物。本发明还涉及用于治疗胃肠疾病的组合物。
文档编号A61K31/78GK1617733SQ03802387
公开日2005年5月18日 申请日期2003年1月17日 优先权日2002年1月18日
发明者G·J·H·梅尔罗斯, A·J·胡克斯哈姆, D·M·G·缇尔布鲁克, V·L·维柯克 申请人:凯米克有限公司
技术领域：
本发明涉及治疗或预防胃肠疾病并促进动物生长的方法且涉及用于这类治疗的抗微生物组合物。
背景技术：
抗微生物药是杀伤微生物、诸如细菌的化合物。抗生素是(通常)来源于其它微生物并通过干扰靶微生物中的特定机制起作用的亚类抗微生物药。抗生素首次应用于二十世纪四十年代和五十年代且从那时起至今其应用逐步增加。抗生素耐受性的发生已经在全世界成为严重而潜在的威胁生命的问题。葡萄球菌属的某些菌株已经表现出耐几乎所有的抗生素且已经在医院中出现致命性感染。其它药物抗性生物体包括导致肺炎的肺炎球菌和导致腹泻的隐孢子虫属和大肠杆菌。
抗生素在动物饲料中的应用被广泛看作是加速耐受性发生的原因且结果是许多国家控制了其应用。这已经在动物饲养方面产生了问题，导致难以控制疾病和获得最佳生长率。这一问题特别是饲养猪和家禽中的难题。例如，胃肠疾病、诸如猪的大肠杆菌病和家禽的球虫病可能具有毁灭性的作用。
Melrose等(国际专利公开号96/38186)首次描述了丙烯醛聚合物制剂在治疗胃肠疾病中的应用。
这些聚合物具有通式I的重复单元
或由下列通式代表的其水合形式、半缩醛或缩醛形式的这种单元
其中R是氢且n是已经描述的1或1以上的整数。此前，Melrose等在国际申请WO88/04671中描述了丙烯醛聚合物在抗菌应用中的杀生物特性。德国专利申请P4404404及同族专利、诸如EP667358和AU 11686/95(目前以过期)中公开了在氢氧化钠水溶液介质中聚合丙烯醛的方法。该公开文献记载所得的聚丙烯醛在40-50℃下溶于多元醇而形成聚丙烯醛的多元醇溶液。正如下文所解释的，该德国申请的受让人随后发现这类聚合物存在问题且在水介质中具有低溶解性。
Werle等的欧洲公开号EP 792895(相当于US 6060571)涉及通过对丙烯醛单体与多元醇进行共聚合而制备的释放丙烯醛的聚合物。Werle等观察到德国申请号P4404404中所述的聚丙烯醛类存在问题，即产率低于理想产率且这些聚合物实际上不溶于水。欧洲申请EP792895中教导了通过经对丙烯醛单体与多元醇单体进行共聚合而形成释放丙烯醛的聚合物来克服这些难题。提出的共聚物的结构如下 尽管游离丙烯醛可作为抗微生物药起作用，但是它刺激眼、肺、组织和皮肤。存在对一定范围内应用、特别是对稳定、高水溶性和使用安全的胃肠抗微生物药疗法的应用存在需求。还存在对治疗或预防胃肠疾病的有效抗微生物药存在需求，它们可以降低发生抗生素耐受性的压力。
本文包括本发明背景技术的讨论是为了解释本发明的上下文。并不将其看作是任何所涉及材料在本专利申请的优先权日时公开、公知或作为一般常用知识的组成部分。
发明内容
我们目前已经发现了如果聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物与醇或多元醇反应而生成被护羰基、诸如缩醛和/或半缩醛衍生物，那么它们在治疗或预防胃肠疾病中的活性和稳定性得到实质性提高。我们令人意外地发现尽管在所述聚合物中游离丙烯醛的含量可能极低或可以忽略不计，但是其衍生物在治疗或预防胃肠疾病中的活性得到实质性提高。该聚合物在水中的溶解性也极高。
本发明提供了治疗或预防动物(包括人)的胃肠疾病的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的聚(2-丙烯醛、2-丙酸)衍生物的步骤，它是通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与诸如醇这样含有一个或多个羟基的有机化合物之间反应生成被护羰基而形成的，其中所述的含有一个或多个羟基的有机化合物优选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
本发明在另一个方面中提供了用于治疗胃肠疾病的抗微生物药，它包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与诸如醇这样含有一个或多个羟基的有机化合物之间反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛、2-丙酸)衍生物，其中所述的含有一个或多个羟基的有机化合物优选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
本文所用的术语多元醇指的是含有至少两个羟基的分子。
形成的衍生物一般选自半缩醛和缩醛衍生物。不希望受到理论约束，我们认为聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与醇的反应由至少一定比例的醛基侧链形成半缩醛和/或缩醛，由此使聚合物的羰基对由坎尼扎罗反应的碱降解保持稳定。已经发现缩醛基的形成显著减少或消除了游离丙烯醛的释放，同时令人意外地提高了所得衍生物的活性。
本发明的另一个实施方案提供了上述抗微生物药在制备用于治疗或预防胃肠疾病的药物中的应用。
在本说明书的描述和权利要求中，措词″包括″及该措词的变化形式、诸如″含有″和″包含″并不排除其它添加剂或成分或整体。
发明详述可以通过在有醇、优选多元醇、诸如聚乙二醇存在的情况下加热聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)来制备本发明的抗微生物药。醇类中总是存在水份，且应理解存在至少一定量的水有助于亲核反应，从而使半缩醛或缩醛形成。
一般在40℃-150℃、更优选40-115℃且最优选在70-115℃范围的温度下加热该溶液。
由聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物制备本发明的抗微生物药。这类聚合物及其制备方法描述在国际专利公开号WO 96/38186(PCT/AU96/00328)中，将该文献的内容引入本文作为参考。优选通过优选在水溶液中经阴离子聚合来聚合丙烯醛、随后自氧化来制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物。这些聚合物含有通式I和水合、半缩醛和缩醛形式中的至少一种(且一般是混合物)的重复单元。
已知通过聚合丙烯醛形成的水合、半缩醛和缩醛形式由丙烯醛的不同碳-碳和碳-氧聚合机制产生。例如，水合形式一般为水合二醇形式，半缩醛或缩醛形式可以由所述的二醇形式与醛或二醇形式缩合而形成，四氢吡喃或稠合四氢吡喃形式可以由所述二醇形式与羟醛-Michael自缩合形式缩合形成。
这些形式的典型实例如下面的通式(a)-(f)所示
其中R是氢而n是1或1以上的整数。通式I重复单元的比例一般低于20％且通常为5-15％。尽管这些单元的比例相对较低，但是我们已经发现它们对所述聚合物的稳定性具有显著作用。
聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)一般含有按摩尔计不超过10％的来自非丙烯醛单体的单体单元且最优选丙烯醛均聚物(自氧化前)。如果使用其它单体，那么它们可以选自丙烯酸和乙烯基吡咯烷酮组成的组。2-丙烯酸部分的含量一般为0.1-5摩尔羧基/千克。聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物一般具有超过1000且最优选超过2000的数均分子量。该分子量一般小于10,000。
本发明的抗微生物药是通过与醇或酚反应生成被护羰基制备的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物。由与醇反应形成半缩醛和缩醛基的2-丙烯醛基团形成被护羰基。所述的醇优选为多元醇，所谓多元醇指的是它优选含有至少两个羟基。可以使用诸如C1-C10这样的链烷醇类。如果所述醇为多元醇，那么该反应可以产生通过一个或一个以上醇基的反应形成缩醛类或半缩醛类。此外，当两个醇基参与反应时，能够使它们在聚合物中的同一羰基或不同羰基上反应。
本发明生产了涉及上述通式I以及半缩醛和缩醛形式的衍生物，其中存在较少通式I的单元且形成一种基团，其中一个或多个基团R来源于醇，或当该醇为多元醇时，两个以上基团R可以一起形成桥连基，诸如环状缩醛基。
多元醇类产生内部环状基团的倾向取决于该多元醇的间距和构型。优选醇类为聚(亚烷基)二醇类且更优选的醇类为聚乙二醇类。
聚(亚烷基)二醇类的分子量优选为200-2000且更优选200-1000。
优选诸如聚乙二醇这样的醇在制备抗微生物聚合物的过程中的含量为50-99％重量。特别优选相对稀的丙烯醛聚合物组合物，其中当通过稀释减少分子间交联的发生率时，所述的醇为多元醇。
更优选聚乙二醇在制备所述聚合物的过程中的含量为64-95％重量。
优选向聚合物中加入碱(base)或碱性物质(alkali)，随后在加热前和/或加热过程中使pH向酸性pH方向转变，此时发生聚合物的酸性基团中和，由此提高聚合物的抗微生物活性。优选最先加入碱或碱性物质使聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物的pH达到7-9。更优选在添加碱时的起始pH约为8。所述碱优选为碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或其混合物。
在本发明的另一种形式中，游离丙烯醛单体的释放从连续释放受到抑制，由此这些聚合物几乎不能够产生组织或皮肤刺激源。
我们已经发现本发明的抗微生物药在控制胃肠疾病方面的活性比聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)制备的抗微生物药得到显著改善。本发明超活化的衍生物可以用于治疗广泛动物(包括人)和广泛微生物的感染。
本发明的抗微生物药可以用于治疗人的胃肠疾病，不过，特别优选将其用于治疗其它动物，特别是选自狗、猪、绵羊、马、山羊、牛、猫、家禽、鸭子、火鸡和鹌鹑组成的组的动物。
本发明的抗微生物药可以制备成口服或直肠给药的形式。直肠给药特别可以用于反刍动物。还可以使用肠溶包衣材料制备反刍动物用的口服制剂以便在胃肠道下部提供最佳活性。
本发明的抗微生物药特别适用于治疗和预防胃肠溃疡、腹泻和胃肠癌。本发明的抗微生物药还可以通过改善动物体内饲料向体重的转化率而改善农场动物的体重增加率。
我们已经发现本发明的抗微生物药可以用作生长促进剂且所述聚合物可以用于取代目前使用的抗生素。在致病菌中存在的抗药性是人用药物中的主要临床重要难题。这一问题因在动物饲料中使用重要的抗生素以增加农场动物、特别是家禽和猪的体重而加剧。实际上，在某些欧洲国家中，已经禁止在动物饲料中使用常用抗生素。本发明的抗微生物药可以用于治疗动物以便明显延长在人体疗法中使用的常用抗生素的寿命。
我们已经发现本发明的抗微生物药对广泛的微生物有效，包括原生动物、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本发明的聚合物含有不同构型的多个结构且可以发现与在靶生物体细胞壁上发现的蛋白质相适合，这一结构加速了所述蛋白质的失活和对细胞的破坏。在革兰氏阴性菌中，已经发现本发明的抗微生物药特别适用于提供对大肠菌类或肠细菌类的广谱活性。它特别用于治疗因大肠杆菌、诸如肠毒性大肠杆菌和β-溶血大肠杆菌感染导致的胃肠疾病。大肠杆菌病是养猪工业中的一种毁灭性疾病。该病一般与断奶后小肠中的β-溶血大肠杆菌增殖有关并且在断奶的幼小猪仔中导致高死亡率和发病率。感染的断奶猪仔不能获得正常的体重增加。
球虫病是动物、特别是家禽的原生动物疾病，且如果不加控制，则具有毁灭性作用。我们已经发现本发明的抗微生物药可以用于治疗或预防鸟类、特别是家禽的球虫病。在小鸡中，球虫病的典型症候包括缺乏活力、体重快速下降、腹泻和痢疾。最严重的作用发生在肠中，其中原生动物倾向于侵害粘膜并导致上皮损伤、损害和出血。已经尝试将疫苗用于预防球虫病，但存在副作用，包括体重下降和食欲缺乏的倾向。
本发明的抗微生物药可以与其它已知具有抗球虫病活性的药物联用。这类药物包括硝基二苯脲、喹啉、吡啶酮、胍、喹喔啉、托曲珠利(toltrazural)、甲苯甲酰胺(toluamide)、增效磺胺药和含有二苯脲的离子载体。
梭状芽孢杆菌属是导致一定范围动物发生严重疾病的革兰氏阳性菌。例如，坏死性肠炎病是已知影响商品家禽的疾病。梭状芽孢杆菌属的细菌产生所有已知毒素中某些最具毒性的外毒素。坏死性肠炎病特别影响14-42日龄的小鸡。这种疾病导致声音黯然、腹泻并可以在数小时内导致死亡。
包括慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡在内的上部胃肠疾病是显著的人体健康问题。认为螺杆菌属是导致溃疡发生和胃肠癌、特别是胃腺癌发生的原因。我们已经发现本发明的抗微生物药特别用于抗动物、特别是人胃肠疾病中的螺杆菌属、包括幽门螺杆菌。
胃部感染幽门螺杆菌是世界上最常见的感染性疾病之一。约有50％的群体感染幽门螺杆菌。在发展中国家，据估计超过80％的人群在儿童时代就已经感染了幽门螺杆菌。
幽门螺杆菌是通过细胞一端上的鞭毛游动的革兰氏阴性微需氧螺旋形杆菌。对幽门螺杆菌感染的标准治疗是所谓的三联抗生素疗法，所有这些疗法均包括甲硝唑或克拉霉素。令人遗憾的是，幽门螺杆菌菌株已经显示出了对这两种抗生素的耐受性。
幽门螺杆菌生活在胃上皮细胞表面与其上面的粘液凝胶层之间的界面上。另外发现幽门螺杆菌位于十二指肠和食道中的胃上皮上部。其它动物种类在其胃肠道中存在其独特的螺杆菌属种类，它们具有与幽门螺杆菌类似的特性。除与胃肠癌有关外，幽门螺杆菌还与人体内的胃炎和消化溃疡形成有直接的关系。
螺杆菌属种类一般且特别是幽门螺杆菌通过分泌脲酶在胃部的极端条件下存活，而分泌的脲酶水解脲而得到氨和碳酸氢盐离子，由此使杆菌邻近周围的pH升高。这种局部条件的改变防止了细菌受到胃酸杀菌作用的影响。胃保护性粘液层下的优选部位对存活也是有利的且其运动使它通过该层而达到该部位。
胃上排列的上皮细胞难以自然透过；这是防止身体的其余部分接触胃液和消化液的功能的一部分。这种透过上的困难也使得身体的天然防御难以通过胃壁并达到幽门螺杆菌感染的部位。这存在两个结果身体将更多的营养物输送到辅助白细胞、T-细胞和其它防御结构的部位，伴随将营养物提供给杆菌；且防御细胞最终死亡，释放其荷载的超氧化物离子和其它致死性化学物质，破坏周围的上皮细胞。
显然这种活性导致可能易于发展成消化性溃疡的胃炎。如果侵害持续进行，那么发生胃腺癌和与粘膜相关的淋巴组织(MALT)淋巴瘤的可能性就会显著增加。胃腺癌从粘膜上发生且发生的第一个阶段肠组织转化是胃避免自身发生幽门螺杆菌感染的反应。此外，在UCL医学院进行的研究已经证实MALT淋巴瘤需要得到来自幽门螺杆菌特异性T-细胞的帮助而生长。已经证实治疗幽门螺杆菌感染在治愈MALT淋巴瘤上极为有效。世界卫生组织已经将这种病原体标记为I类致癌物。
因此，本发明还提供了治疗或预防由螺杆菌属感染导致的胃肠道疾病的方法，该方法包括经胃肠给予治疗量的活性剂的步骤，其中该活性剂包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物，所述的含有羟基的有机化合物选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。本文所用的术语多元醇指的是含有至少两个羟基的化合物。形成的衍生物一般选自半缩醛和缩醛衍生物。
因此，本发明方法的应用提供了手术、放疗或传统化疗治疗胃肠癌外的另一种方法。
本发明进一步提供了螺杆菌属细菌种类导致的胃肠感染的治疗方法，所述的胃肠感染诸如有胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃恶性淋巴瘤或胃癌，该方法包括经胃肠给予治疗量的活性剂的步骤，其中该活性剂包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物。
本发明提供了螺杆菌属感染的传统疗法外的另一种方法，一般来说，传统疗法包括所谓的三联抗生素疗法，其中所有疗法均包括甲硝唑或克拉霉素。幽门螺旋杆菌菌株已经出现了对这两种抗生素的耐受性且我们已经证实本发明的方法可以有效治疗这类抗生素抗性细菌。
已经证实属于聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物之间的反应的产物可比相应的非超活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)部分更有效地治疗螺杆菌属感染。
本发明进一步提供了聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物在制备用于治疗或预防由螺杆菌属感染导致的疾病的药物中的应用。
本发明的方法可以用于治疗或预防胃肠癌。它们可以包括例如食道癌、胃癌、肠癌和结肠癌。这类癌症的实例为人结肠癌细胞系HT-29。
当将本发明的抗微生物药混入动物饲料或水中时，可以按照常用方式实施该步骤。在优选的实施方案中，将本发明的抗微生物药混入预混合物。这种预混合物优选包括所述的抗微生物药、生理上可接受的载体和可选的食物。该预混合物一般为相对浓缩形式且适合于用其它物质稀释、诸如用一种或多种其它载体、维生素和矿物质添加剂和食物稀释成成品动物饲料。该预混合物优选包括浓度在0.1-70％重量、优选0.5-50％重量范围的抗微生物药。最佳浓度取决于疗法对控制或治疗而言是否是预防性的和本发明的抗微生物药是唯一具有活性的或是否将其用于与其它物质或抗微生物药相联合的伴随疗法。
在优选的实施方案中，抗微生物药的浓缩组合物是控释形式。控释剂型包括抗微生物药和用于提供抗微生物药从控释系统中释放的聚合物且特别适用于向固体饲料物质中添加的组合物。作为控释制剂的结果，抗微生物药可以延缓释放以便主要在十二指肠中出现。控释聚合物还可以将因味道导致的组合物排出(rejection)减少到最低限度或用于直肠用栓剂。
本发明的抗微生物组合物可以为丸粒、丸剂等固体组合物形式。可以通过下列步骤制备含有本发明抗微生物药的丸粒(i)将所述抗微生物药溶于碱或碱性的水溶液；(ii)用酸中和所述的溶液；(iii)向所述中和的溶液中加入不溶性交联的丙烯酸吸附剂聚合物和/或丙烯酰胺与丙烯酸共聚物以形成湿润的可溶胀丸粒；和(iv)任选全部或部分干燥所述湿润的可溶胀丸粒。
如此形成的湿润的可溶胀丸粒可以以湿润、部分干燥或完全干燥的形式用作例如动物饲料这样的添加剂。对这种系统进一步设计，从而外部聚合物基质的含羧基部分使得本发明主题的聚合物在胃的酸性环境中时基本上保持包含在所述基质内。然而，在十二指肠的碱性环境中，基质的羧基离子化且相互排斥，而所述丸粒快速溶胀，通过自身拥有的离子基团间的排斥的辅助使得本发明主题的聚合物被排除在扩散过程外，基本上与饲料通过十二指肠的速度相差无几。
在本发明中，使用的术语″控释系统″具有与《控释转运》(″Controlled Drug Delivery″)(Robinson & Lee，1987)上下文中相同含义且包括与《控释转运》(″Controlled Drug Delivery″)(Robinson &Lee，1987)中所述实例相同的范围。可以用本领域中公知的许多其它pH-敏感性控释系统(Robinson和Lee，1987)取代丙烯酸聚合物或丙烯酰胺与丙烯酸共聚物。例如，可溶性和阴离子型、或不溶性交联和阴离子型、纤维素类系统；或可溶性和阴离子型、或来源于任何普通丙烯酸聚合物和/或其衍生物的不溶性交联和阴离子型聚合物。优选这类交联和不溶性聚合物，因为它们可溶胀且几乎不能被代谢。
优选所述的控释系统包括pH-敏感性的交联吸水性丸粒，此时，湿丸粒为凝胶。
本发明还提供了包括本发明的抗微生物药和饲料的动物饲料组合物。抗微生物药的含量优选为总饲料组合物的0.0001-25％且优选为总饲料组合物的0.0001-5％。
在另一个优选的实施方案中，可以配制本发明抗微生物药以便将其加入到动物饮用水中。
优选给予0.05-5000mg/kg体重/天、更优选0.05-50mg/kg/天用量的本发明抗微生物药。
用于给予本发明抗微生物药的组合物的适宜惰性载体的实例包括水、橄榄油、花生油(peanut)、芝麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachis oil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇类、甘油三酯类、聚乙烯醇、部分水解的聚乙烯乙酸酯及其混合物。
口服或直肠给药用固体剂型可以含有药物上或兽药上可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延缓剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍树胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖或诸如新橙皮苷二氢查耳酮这样的类黄酮苷类。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露糖醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙或覆盆子香料。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯类和/或其酰胺类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇类、玉米蛋白、紫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的时间延缓剂包括单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯。
用于口服或直肠给药的混悬剂可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或鯨蜡醇。合适的分散剂包括卵磷脂、聚氧乙烯酯类或脂肪酸类、诸如硬脂酸、聚氧乙烯山梨糖醇的单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐的单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。
抗微生物药组合物可以进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上列举的分散剂或诸如阿拉伯树胶或黄蓍胶这样的天然树胶。
可以通过本领域中公知用于制备组合物的方式(诸如兽药和药物组合物领域中)制备本发明方法中用于给药的组合物，包括掺合、磨碎、匀化、悬浮、溶解、乳化、分散；且如果合适包括将本发明主题的聚合物与选择的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂彼此混合。
为了口服给药，所述的药物或兽药组合物可以为片剂、锭剂、丸剂、糖锭、胶囊、酏剂、粉剂、包括冻干粉、溶液、颗粒、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酊剂的形式。还可以制备例如包衣颗粒、多层片或微粒形式的缓慢释放或延缓释放剂型。
一般优选通过在空气中氧化固体而由聚(2-丙烯醛)制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)。开始可以将主要是干态形式的聚(2-丙烯醛)聚合物加热至80-110℃下。更优选开始时将所述聚合物加热至约85℃下。优选将聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)在醇中加热1小时-1400小时且更优选1小时-60小时的时间期限。
本发明进一步提供了包括本发明抗微生物药的防腐剂化合物或组合物。
本发明进一步提供了包括本发明抗微生物药的消毒剂或抗菌剂组合物。
我们在本发明的另一个方面中提供了治疗胃肠疾病的组合物，它包括如上所述的抗微生物药聚合物和另一种化疗剂，其中所述的另一种化疗剂吸附在所述的抗微生物药上。
这种吸附一般会减少所述另一种化疗剂的膜透过。用于该实施方案的合适的化疗剂是当与所述聚合物抗微生物药混合时表现出膜透过显著减少的那些化疗剂。优选将所述的透过至少抑制到原来的50％。
用于本发明该方面的化疗剂包括用于治疗胃肠疾病的抗生素和用于治疗胃肠癌抗癌药。
化疗剂与聚合物抗微生物药联用减少了所述化疗剂的膜透过，由此减少了全身副作用并提供了更为靶向的疗法。在许多情况中，气味也得到减少。
用于治疗胃肠疾病的化疗剂的实例包括抗生素和抗癌药。
可以与抗微生物药聚合物联用的抗生素的实例包括四环素类、青霉素类、氨基糖苷类、磺胺类药、头孢菌素类和硝基呋喃类。
抗生素可以是用于治疗胃肠道感染的常用抗生素。
可以与抗微生物药聚合物联用的抗癌药的实例为烷基化剂、抗代谢物质、抗癌抗生素、植物生物碱、激素和其它抗癌药、特别是仅含有碳、氢和氧的抗癌药。
本发明的组合物还可以包括一种或多种其它抗微生物药，诸如选自下列成分的组酚(优选用量为0.1-10％重量)；异噻唑烷酮(优选用量为0.001-1％)；对羟基苯甲酸烷基酯(优选用量为0.02-2％)；和低级链烷醇(优选用量为20-99％)，其中所述的用量为基于组合物重量的重量。
已经发现用于本发明方法的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物比聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物具有显著增加的稳定性。由于现有技术中记录了聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的某些不稳定性，正如其组合物中抗微生物药的活性下降所证实的，所以我们在升温、即在40℃下进行″加速老化″。然而，令我们最感到意外的是，在40℃升温下在水溶液中或在水-聚乙二醇溶液中″老化″聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)不仅减缓了抗微生物活性的降低，而实际上又表现出聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的抗微生物活性确切增加，参见实施例2(a)和(b)。现有技术预计升温应导致″加速老化″、即抗微生物药活性加速下降，本发明的这一发现与现有技术完全相矛盾且令人意外。
本文通过形成包括聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)在内的新构型的本发明主题的聚合物而使抗微生物活性增加的方法称作″超活化″且这些聚合物称作″超活化的聚合物″。
与现有技术相比，更令人意外的是本发明者已经发现使用碱性条件、随后使用酸性条件可以促进聚乙二醇水溶液中的超活化。此外，通过加热和水分促进超活化。
聚乙二醇类或多元醇类或链烷醇类的存在可促进超活化，我们认为，因为存在的聚乙二醇或多元醇或链烷醇类通过形成缩醛类而防止了坎尼扎罗反应导致的碱性降解且保护并稳定了所述聚合物的羰基。
超活化的其它优点在于减少或消除了能引起组织和皮肤刺激的污染物丙烯醛。
需要强调的是超活化与仅因在任意含水测试介质中使用更多的聚合物而导致的任何抗微生物活性增加十分不同且是对它们的补充，正如诸如过期的澳大利亚专利申请AU-A-11686/95(下面称之为″11686/95″)中证实的聚合物疏水性增加的结果。本发明者严格重复了11686/95中所述的方法，然后发现部分可溶性聚合物的随后超活化明显增加了另外的相当显著的抗微生物活性。应注意即使超活化也无法赋予来自11686/95的聚合物完全的可溶性，这一结果与首先在80-85℃下加热聚合物开始超活化的结果相反。
实现聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的超活化的最佳时间与温度成反比。显然即使可以将在室温下老化用于超活化，尤其是当在有羟基溶剂和/或碱、随后是酸度存在的情况下时，这一手段因需要较长时间期限而可能不切实际。
本发明者已经发现本文所述适合于胃肠疗法的超活化聚合物、基于水的产品或方法中的防腐剂以及消毒剂或抗菌剂中的活性组分具有提高的抗微生物活性的优点。此外，本发明者发现这类消毒剂或抗菌剂的抗微生物活性通过增加其pH、例如pH在6以上而得到提高。
本发明的一般特征在于通过半缩醛/缩醛形成或通过吸附使能够发生疏水作用的基团与本发明的抗微生物药结合而提高抗微生物活性。
现在参照几个实施例来描述本发明，但这些实施例不应看作是用来限定本发明的范围。
具体实施例方式
杀生物试验用1％重量的碳酸氢钠水溶液溶解样品以获得所需浓度(除非另有说明，浓度为0.125％重量的聚合物)。将19.9g稀释样品称重入无菌瓶并给其中接种0.1mL的107-108cfu(菌落形成单位)的铜绿假单胞菌并混合。在具体的时间间隔将1mL接种的样品转入9mL Letheen肉汤并涡旋。按1∶10系列稀释进行铺平板。向其中倾倒胰胨豆胨琼脂。在37℃下保温3天。
实施例1本实施例描述了通过在空气中氧化固体丙烯醛聚合物制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的方法。这种聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)是制备用于本发明方法优选方法中的原料。在通风橱内将水(720mL，环境温度下，约20℃)和丙烯醛(60g；新近蒸馏的，加入了氢醌至0.25％w/w)放入开口烧杯中并极为剧烈地进行机械搅拌。然后加入0.2M氢氧化钠水溶液(21.4mL)至pH达到10.5-11.0。
该溶液立即变成典型氢醌阴离子的黄色且这种颜色在几分钟内消失且该澄清溶液变成乳状。
约1分钟后，白色絮状聚合物开始沉淀且看起来在15-30分钟内沉淀完全。将沉淀过滤并用水(250mL)洗涤、在室温下在滤纸上干燥2天(产量25g)，然后在玻璃平皿上铺成薄层并以40℃/8小时下加热。按照下列方案持续这种加热50℃/15小时；65℃/4小时；75℃/18小时；84℃/24小时。
预计可以将该方法按比例放大以包括例如在密封容器内逐步添加丙烯醛且随后更为快速地干燥(比较实施例10)。
一般来说，在15-30分钟的时间内通过搅拌向1％w/w碳酸钠水溶液(100mL)中加入2g本发明主题的聚合物且然后按照需要稀释来制备所得聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的溶液。这类溶液优选是澄清的-与使用来源于11686/95的实施例5的聚合物尝试进行的溶解相反。
实施例2本实施例描述了由聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)形成缩醛。
(a)将5g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于64g聚乙二醇(″PEG″)200并与31g 0.71％w/w碳酸钠溶液合并。使部分该溶液(表观pH＝5.8)保持在室温下；同时(b)将来自部分(a)的样品的剩余部分在60℃下加热12或25天的期限。
用1％w/w碳酸氢钠稀释来自(a)和(b)的样品并在0.125％w/w的聚合物浓度下进行杀生物测试。令人意外的是，进行″加速老化″的样品表现出改善的抗微生物活性，正如可以参照表1所观察到的
表1
*菌落形成单位/mL将1g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于200mL 0.1％w/wNa2CO3并使该体系稳定过夜。加入0.05％w/w浓度的十二烷基硫酸钠并用HCl将该溶液酸化至pH5.9。将部分样品储存在室温和60℃下。用0.125％w/w聚合物溶液进行杀生物试验，用1％w/w NaHCO3作为稀释剂。″老化″样品在性能上表现出令人意外的改善，正如可以参照表2所观察到的表2
*菌落形成单位/mL(c)如实施例(2a)中所述制备5％w/w的超活化的聚合物溶液，但用PEG1000取代PEG200。用浓NaOH将部分该溶液处理至pH8.1。在60℃下加热样品并进行杀生物测试。使样品接触更为碱性的条件，令人意外地得到了优良的杀生物特性，正如可以参照表3所观察到的；
表3
*菌落形成单位/mL实施例3本实施例检验了通过使聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与聚乙二醇反应而得到的产物。
可以通过检验透析并浓缩所述聚合物溶液后遗留的固体残余物、使用质子(1H)和碳(13C)NMR光谱测定实施例2(b)聚合物中存在的缩醛类。透析除去了所有分子量低于1000的物质。表1提供了质子(1H)和碳(13C)NMR数据。正如可以从表1中所观察到的，残余物的核磁共振光谱在1H核磁共振光谱的δ3.58和3.56处和13C核磁共振光谱的δ71.62、69.48和60.25处显示出峰。这些峰表示聚乙二醇单位结合成缩醛类。
表4来自透析和浓缩后超活化聚合物固体残余物的1％w/wNa2CO3溶液在D2O中的600MHz1H-和125MHz13C-核磁共振光谱的数据
实施例4
(a)按照与实施例2(a)类似的方式制备一定范围超活化程度的表观pH5.7的5％w/w的聚合物溶液，但改变PEG 200的百分比。
在60℃下加热样品并在一定时间期限内监测稳定性。因出现沉淀或胶凝而认为物理稳定性不合格。对溶于1％w/w碳酸钠溶液的浓度为0.01％w/w的聚合物进行UV测定。将268nm∶230nm处的吸收比例减少看作与化学稳定性下降的含义相同。结果如表5中所示表5
物理和UV光谱结果证实PEG对稳定性具有正面作用；PEG含量越高，物理和活性稳定性越高。
(b)通过将4g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于196g 1％w/w碳酸氢钠并用稀HCl将pH调节至7(A)和5.5(B)来制备下列溶液A和B。通过在65-70℃下将50g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于PEG200(640g)来制备溶液C。然后加入4g碳酸钠溶于水(306g)所得到的溶液，表观pH为7，且随后在31天处理期限结束时表观pH为5.5。
将全部样品储存在40℃下。在不同时间间隔使含有等于0.125％w/w聚合物的样品进行杀生物测试。结果如表6中所示表6
实施例5在60℃下的干燥或潮湿的封闭室内将1g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)加热3天。分别制备0.125％w/w(对水分进行了校准)的干聚合物和加湿聚合物的溶液并通过杀生物试验对它们进行评估表7
*菌落形成单位/mL这些聚合物在I.R.1700-1730cm-1之间显示出羰基和/或羧基吸收，羰基(例如使用席夫(Schiff’s)试剂)且具有Mw＝约10000和Mn＝约5000；滴定显示羧基约为5mol％。这些参数与聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的参数类似(但不相同)。
实施例6在一式两份实验中，制备聚合物样品且然后将它们溶于乙-二醇，确切步骤如11686/95中的实施例5所述。将该物质的一半进一步在80℃下加热24小时(此后，在水介质中的溶解仍然不完全)。使用标准杀生物试验比较样品的抗微生物活性。通过加热、即超活化处理的样品表现出的抗微生物活性显著提高，正如表8中所示表8
*菌落形成单位/mL实施例7在65-70℃下将50g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于PEG200(640g)。然后加入碳酸钠(4g)溶于水(306g)所得到的水溶液。将样品分开并使它们或保持在室温下或在80℃下加热24小时。在一定时间内通过反相HPLC测定该溶液中丙烯醛的含量且结果如表9中所示
表9
实施例8如实施例7中所述制备聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的溶液并在40、60、80、100和115℃的温度下处理不同时间期限。使样品进行标准杀生物试验以证实杀灭率增加且结果如表10中所示表10
观察到超活化所需的时间与温度成反比。来源于超活化方法的全部聚合物溶液在所有比例下与含水溶剂完全易混溶。
实施例9(a)在65℃下将540g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于2304g PEG200，此后与43.2g碳酸钠在712g水中混合。然后将该溶液加热至100℃下4小时并加入36g十二烷基硫酸钠、7g ECOTERIC T20(非离子型洗涤剂)和2g柠檬香精。用硬水将pH6的该制品按1∶30稀释并使用Association of Agricultural Chemists Official Methods of Analysis(1995)991.47，991.48，(Hard Surface Carrier Test Method)分别攻击金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(革兰氏阳性菌，对在医院内的感染有特别重要性)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)(革兰氏阴性菌，对在食物制品领域中的感染有特别重要性)。结果如表11中所示
正如通过杀生物试验所监测到的，将该制品调节至较高pH增加了抗微生物活性。结果如表12(a)和12(b)中所示表12(a)对金黄色葡萄球菌的活性起始计数3×106cfu/mL；聚合物350ppm。
表12(b)起始计数3.7×106cfu/mL；聚合物350ppm。
(b)在60℃下将1200g聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)溶于7680gPEG200且然后加入96g Na2CO3在3024g水中的溶液。将该溶液在100℃下加热6小时。
将该制品加入到压力通风式冷却塔的盆中至浓度为300ppm(30ppm聚合物)，3次/周。在推荐的操作前，在晚上进行给药以便接触时间为8-12小时；预计残余浓度每操作3-6小时则减半。再循环水的平均温度为27℃、pH8.5、电导率3000μS。测定微生物计数并与相邻的相同的每天给予生物分散剂的塔相比较。结果如表13中所示表13
*菌落形成单位/mL数据表明处理步骤将微生物计数维持在了AS/NZ标准3666.3(Int)1998指南内，且低于含有生物分散剂的相邻塔(发现在极热的夏季试验期要求的条件中异常地不足)中的微生物计数。
实施例1010(a)对比实施例本实施例表示了不使用本发明方法的丙烯醛聚合物的制备方法。
1.0 0.8％w/w氢氧化钠将9.90kg去离子水放入10L不锈钢桶中并将0.08kg氢氧化钠加入到水中且搅拌至溶解为止。
2.0聚合将100.1kg去离子水放入200L不锈钢桶中并将4.99kg的0.8％w/w氢氧化钠溶液加入到200L水桶中。平衡该溶液至15-20℃。同时加入20kg丙烯醛单体并在1小时内以一定的速率将剩余的0.8％w/w氢氧化钠溶液加入到200L桶中，使得pH保持在10.5-11.0且温度不超过30℃。再持续聚合90分钟。
3.0洗涤过滤/离心聚合混合物并用去离子水将该聚合物洗涤至洗涤水的pH低于7.0。近似产量为8kg。
4.0干燥在空气中干燥所述聚合物，然后使用如下步骤在烘箱内加热。
步骤 时间 温度12小时25℃21小时40℃31小时70℃41小时75℃52小时85℃5.0溶解将400L水放入500L桶并加入4kg碳酸钠且搅拌至溶解。缓慢加入8kg干燥加热的聚合物并搅拌30分钟。
发现所得聚合物在1％w/w碳酸钠中具有约90-95％w/w的溶解度。
实施例10(b)本实施例描述了制备丙烯醛聚合物的方法，其中通过本发明的方法使对比实施例的聚合物超活化。
1.0碱的制备在适宜容器中将0.4kg碳酸钠溶于30.6kg水并将64kg聚乙二醇200放入该混合容器。使用机械搅拌器开始搅拌并将PEG200加热至65±3℃。将来自实施例10a的5kg干丙烯醛聚合物加入到PEG200中并搅拌至得到均匀混合物为止。
注意该固体在这一阶段可能并不完全溶解。
以确保溶液的pH保持在3.5-9.0范围的速率将碳酸钠溶液缓慢加入到乙二醇混合物中。
在65±3℃下将该溶液搅拌45分钟。
注意pH应在7-9的范围。温度应在65±3℃的范围。
2.0超活化覆盖混合容器并加热至100℃下四(4)小时。发现所得聚合物在水中具有约99.5-100％w/w的溶解度。
实施例11本实施例检验了实施例10a的干燥、正常活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物的抗微生物活性和实施例10b中所述的超活化缩醛衍生物的抗微生物活性。
按照下列步骤将每一次用所述的抗微生物药治疗的小鸡与对照组进行比较在每一试验中，20只1日龄Cob小鸡(品系53)购自商业孵卵处。给它们称重、分出性别并随机分入分离的动物居室室内的相邻围栏中。雄性和雌性小鸡均匀分布。可随意得到水和饲料。膳食为含有抑球虫剂(125ppm双硝米特)的市售食品屑(Chick Starter，Milne Feeds18％粗蛋白)。
对10只小鸡通过固定的饮水器给予来自实施例10a的0.1％w/w正常活化的抗微生物药的水溶液制剂，持续14天；剂量为30mg/kg/天。其它10只小鸡为对照组。
在第0、4、7、11和14天给两组小鸡称重。在本试验完成时，对全部小鸡实施安乐死并对治疗的小鸡在死后进行尸体解剖。对胸腔和腹腔进行彻底的总体检查。
结果表14a在试验过程中使用实施例10a的正常活化的抗微生物药增加的体重
在14天期限结束时，经测定治疗组具有的体重增加大于对照组。
在本试验完成时，处死后，在小鸡治疗组中进行的这种总体检查发现，没有观察到毒性的临床或病理学症候。
表14b在试验过程中使用实施例10b的超活化的抗微生物药增加的体重
在本试验完成时，对两组死后剩余的小鸡进行的总体检查发现，没有观察到临床或病理学症候。
结论在治疗组与对照组之间的体重增加存在显著性差异(x2；P＜0.015)。在本试验完成时，治疗组的体重高于对照组23％。
超活化的缩醛衍生物比对照组在体重增加方面得到显著改善，而在下一个实施例中，当与正常活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)比较时，表现出缩醛衍生物肠抗微生物活性的显著改善。
实施例12本实施例评价了实施例10b的聚合物抗微生物药在农场条件下对断奶后的猪大肠杆菌病(PWC)的控制。
方法在具有长期PWC问题史的大商业猪舍用与断奶相关的压力攻击口服接受掺入饲料或水中的超活化抗微生物药制剂APRALANO(Elanco)、自体疫苗接种或两者均不进行的146只幼猪[断奶者]。
评价它们在发生腹泻、体重增加和死亡率方面的反应并记录在表15中。
表15
注意1.治疗组编号i.1组＝0.1％w/w饲料中的超活化的聚合物抗微生物药。
ii.2组＝0.02％w/v水中的超活化聚合物抗微生物药。
2.本试验过程中死于PWC的组百分比。
3.当记录的粪便得分为1或2时组中每只猪的平均天数；粪便得分为腹泻强度的量度标准。
4.每只猪的粪便得分总和除以观察样品的数量。
5.F＝Fisher精确试验。
结论这种农场试验突出了以下观点对用于商业猪舍中的小猪在断奶后用β-溶血大肠杆菌攻击时聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的缩醛衍生物(超活化的抗微生物药)的功效具有的正面反映1.死亡率用超活化的聚合物抗微生物药治疗的组的死亡率低于未治疗的、接种疫苗或Apralan组。
2.腹泻天数超活化的聚合物抗微生物药治疗组的腹泻天数显著少于[F；P＜0.0001]未治疗的、接种疫苗或Apralan组。
3.粪便得分超活化的聚合物抗微生物药治疗的组的平均粪便得分显著低于[F；P＜0.0001]未治疗的、接种疫苗或Apralan组。
实施例13本实施例检验了使用某些添加剂的本发明抗微生物药的作用。
方法制备攻击培养物的过夜肉汤并估计过夜培养物中总的存活计数(TVC)。
使用无菌生理盐水(5mL)按1∶1连续稀释样品。当测试样品含有EDTA时，将无菌硬水(SHW)用作稀释剂。
用9份稀释剂稀释1份每一过夜培养物。将所得的稀释混悬液用作接种物。
给每一样品稀释液接种100uL的稀释的过夜培养物。(1种培养物/管)。充分混合。
将试管在37℃下保温≤24小时(将黑色曲霉(A.niger)在28℃下保温≤24小时)。
从每支试管中取1mL传代培养成9mL恢复(revovery)肉汤并充分混合(恢复(revovery)肉汤对聚合物抗微生物药和EDTA而言为营养肉汤+3％Tween 80(NBT)；对戊二醛而言为营养肉汤+3％Tween 80+0.1％氨(NBTA)；且对对羟基苯甲酸甲酯而言为Letheen肉汤(LB))。
将样品在37℃下进一步保温≤48小时(对黑色曲霉而言28℃下保温≤5天)。
检查每支试管的生长情况。然后在选择琼脂上传代培养全部试管内含物并在37℃下保温≤24小时。(对黑色曲霉而言28℃下保温≤5天)。将选择琼脂上的生长用于证实测试生物体生长。
使用接种了培养物的5mL稀释液进行阳性对照并进行保温、回收和验证。
使用未接种的5mL稀释液进行阴性对照并进行保温、回收和验证。
结果将结果绘制成下表。
表16选择的防腐剂的MKC和协同指数注意将所有比值表示为聚合物抗微生物药防腐剂之比
说明1)聚合物抗微生物药0.025％w/w2)聚合物抗微生物药0.2％w/w3)戊二醛0.025％w/w4)聚合物抗微生物药0.025％w/w+戊二醛0.025％w/w5)聚合物抗微生物药0.2％w/w+戊二醛0.025％w/w6)聚合物抗微生物药0.2％w/w7)EDTA 0.1％w/w8)聚合物抗微生物药0.2％w/w+EDTA 0.1％w/w9)聚合物抗微生物药0.2％w/w(溶于80％w/w甘油)10)对羟基苯甲酸甲酯1％w/w(溶于80％w/w甘油)11)聚合物抗微生物药0.2％w/w(溶于80％w/w甘油)+对羟基苯甲酸甲酯1％wlw(溶于80％w/w甘油)。
表17与聚合物抗微生物药的协同指数
注意协同作用＜1.0，加合作用＝1.0，拮抗作用＞1.0由此SI＝CD/A+CE/BA＝MKC聚合物抗微生物药B＝MKC防腐剂C＝MKC混合物D＝A与B之比
E＝B与A之比结论经证实聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的缩醛衍生物分别与戊二醛、EDTA和对羟基苯甲酸甲酯对黑色曲霉、白色假丝酵母、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌具有协同作用。
实施例14本实施例证实本发明的抗微生物药与″Dettol″商标的抗微生物药联用的活性。
使用无菌生理盐水(5mL)按1∶1连续稀释样品。
给每一样品稀释液接种100uL的稀释过夜培养物。(1种培养物/管)。充分混合样品。
将它们在37±2℃下保温≤24小时。(将接种黑色曲霉的试管在28±2℃下保温≤24小时)。
从每支试管中取1mL传代培养到9mL回收肉汤并充分涡旋(对黑色曲霉而言NBT或Sabouraud+3％Tween 80(SABT))。
将它们在37±2℃下保温≤48小时。(将黑色曲霉在28±2℃下再保温5天)。
检验回收肉汤的浊度(生长)并在选择琼脂上划线以证实生长。
表18以ppm计的超活化聚合物抗微生物药和/或″Dettol″的MKC结果
说明1)0.1％w/w聚合物抗微生物药2)0.2％w/w聚合物抗微生物药3)″Dettol″4.8％w/v(按1∶20稀释)4)0.1％w/w聚合物抗微生物药+″Dettol″(按1∶20稀释)5)0.2％w/w聚合物抗微生物药+″Dettol″(按1∶20稀释)表19聚合物抗微生物药与Dettol的协同指数
注意如果SI＞1，则为拮抗作用；如果SI＝1，则为加合作用；如果SI＜1，则为协同作用。
SI＝CD/A+CE/BA＝MKC聚合物抗微生物药(ppm)B＝MKC Dettol(ppm)C＝聚合物抗微生物药/″Dettol″混合物的MKC(ppm)D＝聚合物抗微生物药与Dettol之比E＝″Dettol″与聚合物抗微生物药之比注意使用″Dettol″商品名的活性抗微生物药为对氯二甲酚结论经证实本发明的聚合物抗微生物药与″Dettol″对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母和黑色曲霉具有协同作用。这一结果表明″Dettol″与聚合物抗微生物药在作为混合溶液联用时所起的作用基本上优于它们各自所起的作用。
实施例15聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的抗菌特性跟踪抗微生物药聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的抗菌特性。
在施用抗微生物药前后测定受试者手上存在的细菌数量，随后带上手术用手套。将聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的抗菌作用与常用手术抗菌剂4％氯己定术前洗消液(由位于Perth，Western Australia的Orion Laboratories生产)比较。
·3％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]水溶液在3小时后减少了带手套手上菌群的基线计数。
·含有70％乙醇的2％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]水溶液在3小时后使带手套的手上的基线细菌计数缓慢持续减少，正如使用4％氯己定所起的作用。
·在带上手术用手套前在手上施用含有3.1％十二烷基硫酸钠的3.2％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]水溶液、随后是4％w/w聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]的70％乙醇的水溶液在3小时后使基线细菌计数显著减少。
这些结果表明聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)[超活化的]具有持续控制无菌手术中的细菌数量所需的良好剩余抗微生物活性。制剂中包含70％乙醇有助于细菌数量开始时快速减少。
实施例160.125％w/w和0.05％w/w超活化聚合物在pH7和pH4下对参比菌株幽门螺杆菌NCTC 11637的杀生物活性。
首先建立超活化聚合物对幽门螺杆菌参比菌株幽门螺杆菌NCTC11637的体外功效。作为变量，选择两种浓度；一种是实施例2中制备的5％超活化聚合物溶液的40倍稀释液，得到0.125％w/w浓度的超活化聚合物，模拟胃中的稀释液；另一种为100-倍稀释液，得到0.05％w/w浓度的超活化聚合物。选择两种pH，作为基线的pH7和模拟胃中条件的pH4。
使培养物幽门螺杆菌NCTC11637以微需氧方式在37±2℃下生长在选择琼脂平板上，直到观察到足量生长。以无菌方式从平板上取出生长物并制成用无菌生理盐水稀释的标准化10％T的浑浊混悬液，正如在Vitek比色计上显示的。称出19.9g样品并接种100μL培养物混悬液。立即将1mL样品转入失活/回收肉汤(营养肉汤+3％Tween80)且然后连续稀释。将100μL等分试样置于选择琼脂平板上并使用一次性无菌涂布器涂展。在5、10、15和20分钟的时间间隔重复转移步骤。将全部平板在37±2℃下以微需氧方式保温至获得足够生长(约5-7天)。对所有菌落计数且测定菌群对时间的减少数量。使用无菌生理盐水作为样品重复该试验以便测定在空气条件下的自然逐步死亡的比例。
说明培养物1.超活化的聚合物，pH7，0.125％w/w。
培养物2.超活化的聚合物，pH7，0.05％w/w。
培养物3.超活化的聚合物，pH4，0.125％w/w。
培养物4.超活化的聚合物，pH4，0.05％w/w。
培养物5.无菌生理盐水，pH7。
培养物6.无菌生理盐水，pH4。
表20CHEMEQRTM聚合物抗微生物药对幽门螺杆菌(NCTC 11637)的杀生物活性
注意以菌落形成单位(cfu)/mL失活肉汤计的计数对参比菌株的结果(表20)证实超活化的聚合物在pH7和0.125％w/w和0.05％w/w下有效且还在pH4和0.125％w/w下有效。
实施例17为了对实施例16进行进一步分析，在pH7和pH4下检验其它三种幽门螺杆菌菌株耐克拉霉素和甲硝唑的幽门螺杆菌01/303；具有对可能的动物模型有影响的高定居能力的在悉尼分离的临床菌株幽门螺杆菌SS1；和已经测序基因组且来源于UK的菌株幽门螺杆菌ATCC 700392。
表21超活化的聚合物在0.125％pH7下的杀生物活性
当用超活化的聚合物在0.125％w/w和pH7下处理时，所有菌株均被快速杀灭，其中抗生素抗性菌株特别易于在10分钟以内死亡(表21)。对照组菌株未经处理。
实施例18重复实施例3的方法测试0.125％w/w超活化的聚合物(pH4)对幽门螺杆菌的所有菌株的杀生物活性。
表22超活化的聚合物在0.125％pH7下的杀生物活性
在模拟胃的pH4和0.125％w/w的条件下测试超活化聚合物，结果所有菌株在20分钟内被杀灭(表3)。这一结果是显著的，因为这一杀伤幽门螺杆菌的时间范围比通过胃的时间短(40分钟-1小时)。这一结果证实超活化的聚合物在与治疗胃中幽门螺杆菌感染一致的pH、浓度下和时间范围内的有效性。对照组菌株是未经处理的。
实施例19本实施例证实按照实施例10b的步骤制备的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)缩醛衍生物的肠抗微生物活性。
材料和方法16只断奶的猪(年龄18天±2天；而体重为5.5kg±1.0kg)购自商业猪舍。将它们随机分成2组，每组8只猪(性别平均分布)并关在环境受控的分离的动物室内。
使动物在进入动物室时可随意进食和饮水且膳食为不含抗微生物药的商品断奶者用的丸粒[19％粗蛋白]。
通过静脉内注射巴比妥钠对全部断奶的猪实施安乐死且然后进行尸体解剖。使用Qiagen Dneasy组织试剂盒、按照提供的说明从24只断奶猪的胃的胃和食管区中提取DNA。将3uL提取的DNA用于测试活检组织样品中存在螺杆菌属的种类。对每一样品进行两次聚合酶链反应(PCR)，在每一次PCR试验中包括7份对照DNA样品。发现在进行的PCR之间无差异。
结果治疗的编号组1未治疗(阴性对照)组20.1％w/v实施例10b的超活化聚合物抗微生物药；30mg/kg/天。
表23使用预先最优化的属特异性引物对螺杆菌属种类进行的PCR结果，其中+代表对螺杆菌属种类的阳性检测结果，而-代表未检测。
在组1(未治疗)中，对螺杆菌属种类存在5个阳性PCR结果(1-胃；4-食管)，而在组2(0.1％w/v的聚合物抗微生物药)中，无阳性PCR结果。
结论0.1％w/v的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的缩醛衍生物显著(x2P＜0.025)减少了猪螺杆菌属在断奶猪的胃和食管粘膜中的发生率。
实施例20对比实施例20(a)本实施例表示未超活化的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的制备方法。
0.8％w/w氢氧化钠将9.90kg去离子水放入10L不锈钢桶中并向水中加入0.08kg氢氧化钠且搅拌至溶解。
聚合将100.1kg去离子水放入200L不锈钢桶中并向200L桶中加入4.99kg的0.8％w/w氢氧化钠溶液。平衡该溶液至15-20℃。同时加入20kg丙烯醛单体并在1小时内以一定的速率将剩余的0.8％w/w氢氧化钠溶液加入到200L桶中，使得pH保持在10.5-11.0，且温度不超过30℃。再持续聚合90分钟。
洗涤过滤/离心聚合混合物并用去离子水将该聚合物洗涤至洗涤水的pH低于7.0。产量约为8kg。
干燥在空气中干燥所述聚合物，然后使用如下步骤在烘箱内加热。
步骤时间 温度1 2小时25℃2 1小时40℃3 1小时70℃4 1小时75℃5 2小时85℃溶解将400L水放入500L桶并加入4kg碳酸钠且搅拌至溶解。缓慢加入8kg干燥加热的聚合物并搅拌30分钟。
发现所得聚合物在1％w/w碳酸钠中具有约90-95％w/w的溶解度。
实施例20(b)本实施例描述了丙烯醛聚合物的制备方法，其中对比实施例20(a)的聚合物被超活化。
碱的制备在适宜容器中将0.4kg碳酸钠溶于30.6kg水并将64kg聚乙二醇200放入该混合容器。使用机械搅拌器开始搅拌并将PEG200加热至65±3℃。将来自实施例20a的5kg干丙烯醛聚合物加入到PEG-200中并搅拌至得到均匀混合物为止。
注意该固体在这一阶段可能并不完全溶解。
以确保溶液的pH保持在3.5-9.0范围的速率将碳酸钠溶液缓慢加入到乙二醇混合物中。
在65±3℃下将该溶液搅拌45分钟。
注意pH应在7-9的范围。温度应在65±3℃的范围。
超活化覆盖含混合物的容器并加热至100℃下四(4)小时。发现所得超活化聚合物可以以所有比例与水混溶。
实施例21在PCT/AU9600328的实施例14中，证实聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物溶于0.5％w/w碳酸钠溶液所得到的溶液对小鼠模型中的埃利希(Ehrlich)腹水细胞系具有抗癌活性。
聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物[实施例20(a)]的抗癌活性与超活化的聚合物[实施例20(b)]的抗癌活性。对人结肠癌细胞系HT-29建立体外胃肠癌模型。以5％w/w浓缩物的形式使用聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)。所用的试验将癌细胞与不同浓度的聚合物一起保温而得到可以确定IC50的曲线。
方法将HT-29细胞(人结肠癌细胞)接种(以100ul)入96孔培养平板的各孔中并在37℃下和加湿5％CO2、95％空气中保温过夜。将聚合物[对比实施例20(a)中的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物和实施例20(b)中超活化的聚合物]溶于水且然后用介质稀释成4-log范围的10个浓度。随后将100ul的各溶液加入到5个孔中的每一个中。将平板再保温72小时，此后使用sulforhodamine B试验测定存活的细胞(Skehan等，(1990)《国际癌症研究学会》(J.Nat.Cancer Inst.)821107-1112；Monks等，(1991)《国际癌症研究学会》(J.Nat.Cancer Inst，)83757-766。)。然后用10％冷三氟乙酸将细胞在4℃下固定1小时并用蒸馏水冲洗平板，保持风干且然后用0.4％sulforhodamine B(Aldrich)的1％乙酸(v/v)溶液染色30分钟。接着通过用蒸馏水洗涤两次且最终用1％乙酸洗涤除去未结合的染料。随后将蛋白质结合的染料溶于10mM未缓冲的Tris碱并使用自动平板读取器在550nm处读取吸收度。将每一药物剂量的平均吸收表示为占未处理的对照孔中吸收度的百分比。
测试结果如表24中所示。
对比实施例20(a)的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物在两次测试中得到的平均IC50为0.030％；将聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)聚合物定为100％的值。将其转换成0.0015％w/w的活性聚合物。
对比实施例20(b)的超活化的聚合物在四次测试中得到的平均IC50为0.025％。将其转换成0.0015％w/w的超活化聚合物且表明超活化的聚合物具有抗癌活性。
表24CHEMEQRTM聚合物抗微生物药对HT-29人结肠癌细胞的IC50
IC50是抑制细胞生长达50％所需的浓度。
最后，应理解可以进行各种其它修改和/或改变而不会脱离本文概述的本发明的实质。
权利要求
1.治疗或预防动物(包括人)胃肠痰病的方法，该方法包括对所述动物经胃肠给予有效量的聚合物的步骤，所述的聚合物包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物。
2.权利要求1的方法，其中经口服给予所述的聚合物。
3.权利要求1的方法，其中所述的动物患有至少一种选自胃肠炎、溃疡、腹泻和胃肠癌以及痢疾加剧的体重增加不足组成的组的胃肠疾病。
4.权利要求1的方法，其中所述的动物患有腹泻、胃肠炎和痢疾中的至少一种疾病。
5.权利要求1的方法，其中所述的动物选自狗、猪、绵羊、马、牛、猫、家禽、鸭子、火鸡和鹌鹑组成的组。
6.权利要求1的方法，其中所述的动物选自反刍动物且经直肠给予所述的聚合物。
7.权利要求1的方法，其中所述的动物选自家禽和猪。
8.权利要求1的方法，其中所述的动物为部分生长的猪。
9.治疗或预防断奶后猪的大肠杆菌病的方法，该方法包括对断奶后的幼小猪口服给予抗微生物有效量的权利要求1所述的聚合物的步骤。
10.权利要求1的方法，其中给予0.05-5000mg/kg/天剂量的权利要求1的抗微生物药。
11.权利要求1的方法，其中给予0.5-500mg/kg/天剂量的权利要求1的抗微生物药。
12.权利要求1的方法，其中对幼小的猪给予0.05-50mg/kg/天范围剂量的抗微生物药。
13.权利要求1的方法，其中所述的胃肠疾病是因一种或多种微生物导致的，这些微生物选自大肠菌类、沙门氏菌属、铜绿假单胞菌、螺杆菌属、变形菌属、肠杆菌类、酵母、原生动物、梭状芽孢杆菌属、志贺氏菌属和球虫属组成的组。
14.治疗或预防因螺杆菌属感染导致的胃肠道疾病的方法，该方法包括经胃肠给予治疗量的聚合物的步骤，所述的聚合物包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物，所述的含有羟基的有机化合物选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
15.权利要求1的方法，其中所述的胃肠疾病是因肠毒性大肠杆菌和β-溶血大肠杆菌中的至少一种导致的。
16.治疗或预防家禽坏死性肠炎的方法，该方法包括对家禽给予有效量的权利要求1的抗微生物药的步骤。
17.权利要求1的方法，其中将所述的抗微生物药与吸附在其上的另一种化疗药联合给药而由此减少所述另一种化疗药的膜透过。
18.治疗或预防家禽球虫病的方法，该方法包括对家禽给予抗微生物有效量的权利要求1的抗微生物药的步骤。
19.权利要求1的方法，其中所述的衍生物含有多个选自半缩醛基和缩醛基中的至少一种的被护羰基。
20.权利要求20的方法，其中所述的被护羰基包括缩醛基。
21.权利要求1的方法，其中所述的醇选自链烷醇类、酚类、多元醇类及其混合物。
22.权利要求22的方法，其中所述的醇选自至少一种多元醇。
23.权利要求23的方法，其中所述的多元醇包括聚(亚烷基)二醇。
24.权利要求23的方法，其中所述的多元醇包括聚乙二醇。
25.权利要求23的方法，其中所述的多元醇为分子量在200-2000的聚乙二醇。
26.用于通过经胃肠给予下列抗微生物药组合物治疗或预防动物胃肠疾病的抗微生物药，包括通过聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)与含有一个或多个羟基的有机化合物之间的反应生成被护羰基而形成的聚(2-丙烯醛，2-丙烯酸)的衍生物和用于对动物进行胃肠给药的药物或兽药上可接受的惰性载体。
27.权利要求27的用于治疗或预防胃肠疾病的抗微生物药，其中用于胃肠给药的载体选自水、控释聚合物、橄榄油、花生油、芝麻油、向日葵油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇类、甘油三酯类、聚乙烯醇、部分水解的聚乙烯乙酸酯及其混合物组成的组。
28.权利要求27的抗微生物药组合物，为饲料添加剂或饮用水添加剂的形式，包括0.1-70％重量的权利要求1所述的抗微生物药。
29.动物(包括人)饲料或饮用水组合物，包括饲料物质或水和抗微生物有效量的权利要求1的抗微生物药。
30.权利要求30的动物饲料组合物，其中抗微生物药的含量为总饲料或水组合物重量的0.001-25％。
31.抗微生物药组合物，包括权利要求1的抗微生物药和另一种选自抗微生物药和化疗剂组成的组的活性剂。
32.权利要求31的组合物，其中所述的另一种抗微生物药包括下列成分中的至少一种(以该组合物的重量计)(a)0.1-10％用量的酚；(b)0.001-1％用量的异噻唑烷酮；(c)0.02-2％用量的对羟基苯甲酸烷基酯；和(d)20-99.9％用量的低级链烷醇。
全文摘要
本发明公开了通过给予聚合物抗微生物药治疗胃肠疾病的方法，所述的聚合物抗微生物药包括通过聚(2－丙烯醛，2－丙烯酸)与醇或酚之间反应生成被护羰基而形成的聚(2－丙烯醛，2－丙烯酸)的衍生物。本发明还涉及用于治疗胃肠疾病的组合物。
文档编号A61K31/78GK1617733SQ03802387
公开日2005年5月18日 申请日期2003年1月17日 优先权日2002年1月18日
发明者G·J·H·梅尔罗斯, A·J·胡克斯哈姆, D·M·G·缇尔布鲁克, V·L·维柯克 申请人:凯米克有限公司
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