作为ⅱ型糖尿病靶标的pim－3激酶的制作方法
专利名称：作为ⅱ型糖尿病靶标的pim－3激酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及PIM-3激酶的新用途，涉及PIM-3激酶新亚型及它们的用途。
已知在体外磷酸化作用测定中，大鼠PIM-3(最初命名为KID-1，KID“去极化作用诱导的激酶”)、蛙PIM-1和人与鼠PIM-1都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。人、鼠和大鼠PIM-3、蛙PIM-1以及人和鼠PIM-1之间具有高的多肽序列相似性，表明人和大鼠PIM-3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
大鼠PIM-3由Feldman，J.D.等人(J.Biol.Chem.(1998)273，16535-16543)进行了描述。大鼠PIM-3在海马和脑皮层的特殊区域由红藻氨酸和电惊厥休克诱导产生，表明PIM-3除了参与红藻氨酸抽搐和一些神经系统相关疾病，如抽搐和癫痫外，还参与神经元功能、突触的可塑性、学习和记忆。
专利US 6,143,540中，Konietzko，U等人(EMBO(1999)18，3359-3369)和Eichmann，A.(Oncogene(2000)19，1215-1224)也提到了PIM-3激酶。
本发明提供了PIM-3的新编码序列和PIM-3的新用途。
本发明提供了新的人和鼠PIM-3序列。SEQ ID NO.1描述了DNA序列而SEQ ID NO.2是所预测的人PIM-3的氨基酸序列。SEQ ID NO1的开放读码框涵盖了从核苷酸17到核苷酸995(SEQ ID NO.3)的区域。
SEQ ID NO.5描述了鼠PIM-3的DNA序列而SEQ ID NO.6是所预测的鼠PIM-3的氨基酸序列。SEQ ID NO 5的开放读码框涵盖了从核苷酸199到核苷酸1177(SEQ ID NO.7)区域。
本发明证明了在两组独立的胰岛素抗性模型的脂肪细胞中，大鼠PIM-3基因的表达是降低的。用胰岛素激活剂处理可引起鼠3T3-L1细胞中PIM-3基因表达增加。因为人和鼠PIM-3是大鼠PIM-3的物种直向同源物，人和鼠PIM-3参与大鼠PIM-3所参与的部分或全部过程和疾病。PIM-3，特别是人和鼠PIM-3参与胰岛素抗性的形成。此外，PIM-3，特别是人和鼠PIM-3参与II型糖尿病的形成。此外，人和鼠PIM-3平行进化同源物，PIM-1蛋白质，是原癌基因。因此，PIM-3，特别是人和鼠PIM-3参与细胞生长调控、癌以及相关的通路与疾病。
本发明涉及编码PIM-3的核酸分子、PIM-3蛋白质和蛋白质同源物在下述情况中的用途，a)筛选鉴定调节胰岛素抗性或II型糖尿病的化合物；b)检测分析胰岛素抗性或II型糖尿病(如染色体制图、组织分型、法医生物学)；c)预测医学(通过诸如诊断检测、预后分析、监测临床实验和药物基因组学预测胰岛素抗性或II型糖尿病)。
本发明尤其涉及分离的包含核苷酸序列SEQ ID.NO.1的核酸分子。此外，本发明还涉及分离的包含核苷酸序列SEQ ID.NO.3的核酸分子。
本发明涉及分离的核酸分子，其包含选自如下序列的核苷酸序列a)SEQ ID NO.5，b)SEQ ID NO.7，c)与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7杂交的DNA序列，和d)由a)、b)和c)中的序列经遗传密码简并而得到的并且能够编码PIM-3型多肽的DNA序列。
此外本发明还涉及包含各种DNA序列或其部分序列的载体和宿主细胞。
本发明涉及具有PIM-3活性的多肽，所述的多肽选自a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.6的多肽，b)与a)相比缺失一个或多个氨基酸的多肽，c)a)中一个或多个氨基酸由不同的氨基酸替换所产生的多肽，d)a)中多肽增加了一个或多个氨基酸后的多肽，e)氨基酸序列中含有序列SEQ LD NO.6的全部或部分氨基酸的融合多肽。
优选地是c)中不多于10个氨基酸被替换。
本发明涉及PIM-3作为鉴定抗-糖尿病药物的筛选剂的用途，例如用于此类目的的PIM-3编码DNA或具有PIM-3活性的多肽的用途。
此外本发明还涉及PIM-3用于制备治疗胰岛素抗性或II型糖尿病的药物的用途和PIM-3用于预测胰岛素抗性或II型糖尿病的用途。
由于PIM-3可与其他细胞蛋白质相互作用，因此可用作靶标来研发在PIM-3蛋白质表达细胞或参与PIM-3通路的细胞例如脂肪细胞内调节PIM-3蛋白质的治疗分子。本发明的核酸分子可用于表达PIM-3蛋白质(例如通过重组表达载体在基因治疗所施用的宿主细胞中表达)、用于检测PIM-3 mRNA(例如在生物学样本中)或PIM-3基因中的遗传病变，并且还可用于调节PIM-3活性。PIM-3蛋白质能用于筛选调节PIM-3活性或表达的药物或化合物，除此之外还可用于治疗以PIM-3蛋白质产物缺乏或过量或产生与PIM-3野生型蛋白质相比活性降低或异常的PIM-3蛋白质形式为特点的疾病。
本发明提供了鉴定调节剂的方法(此处亦称为“筛选测定法”)，调节剂是指能结合PIM-3蛋白质或对诸如PIM-3表达或PIM-3活性具有刺激或抑制作用的候选或测试化合物或制剂(例如肽、肽模拟物、小分子或其他药物)。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选能与PIM-3蛋白质或多肽或其生物学活性部分结合或能调节其活性的候选或测试化合物的测定法。利用本领域公知的众多重组文库方法中的任一方法可以获得本发明的测试化合物，这些方法包括生物学文库、可空间寻址的平行固相或液相文库、需要重叠合法(deconvolution)的合成文库法、“一珠一化合物”文库方法和利用亲和层析法选择的合成文库法。
在一个实施方案中，本发明的测定方法是无细胞测定法，其包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与测试化合物接触和测定测试化合物结合PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的能力。可以直接或间接测定测试化合物与PIM-3蛋白质的结合。
在另一个实施方案中，测定法包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与已知的能结合PIM-3的化合物接触形成测定混合物、将测定混合物与测试化合物接触和测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力，其中测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力包括测定与已知化合物相比，测试化合物优选地结合PIM-3或其生物学活性部分的能力。
在另一个实施方案中，测定法是无细胞测定法，其包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与测试化合物接触和测定测试化合物调节(例如刺激或抑制)PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的活性的能力。通过诸如测定PIM-3蛋白质结合PIM-3靶分子的能力，这意味着测定直接结合可以确定测试化合物调节PIM-3活性的能力。在另一个可选择的实施方案中，测定测试化合物调节PIM-3活性的能力可以通过测定PIM-3蛋白质进一步调节PIM-3靶分子的能力而完成。例如，能够测定靶分子对适当底物的催化/酶促活性。
在另一个实施方案中，无细胞测定法包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与已知的能结合PIM-3的化合物接触形成测定混合物、将测定混合物与测试化合物接触和测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力，其中测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力包括测定PIM-3蛋白质优选地结合或调节PIM-3靶分子活性的能力。
为了测定PIM-3底物中磷酸化的残基，可以进行磷酸化底物的磷酸氨基酸分析。简而言之，可从SDS凝胶上切取放射性磷酸化的蛋白质条带并部分酸水解。然后通过一维电泳可以分离产物并在如磷光影像分析仪上进行分析，并且与茚三酮染色的磷酸氨基酸标准品进行比较。
在本发明的另一个实施方案中，无细胞测定法通过例如体外激酶测定法可以测定PIM-3蛋白质磷酸化PIM-3靶分子的能力。简而言之，PIM-3靶分子，例如从表达此分子的细胞系中免疫沉淀出的PIM-3靶分子，可与PIM-3蛋白质和放射性ATP共同孵育。
在另一个实施方案中，测定法是基于细胞的测定法，其中将表达可溶性PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的细胞与测试化合物接触并测定测试化合物结合PIM-3蛋白质的能力。细胞可以是诸如酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。能够测定测试化合物结合PIM-3蛋白质的能力，例如通过将测试化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，从而通过检测复合体中具有如125I、35S、14C或3H标记的化合物或用如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶促或荧光素酶标记的化合物来测定测试化合物与PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的结合。
在另一个实施方案中，测定法是基于细胞的测定方法，其包括将表达可溶性PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的细胞与测试化合物接触并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的活性的能力。例如，测定测试化合物调节PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的能力可以通过测定PIM-3蛋白质与PIM-3靶分子结合或相互作用的能力来实现。
用于此处的“靶分子”是指实质上与PIM-3蛋白质结合或相互作用的分子，例如在表达PIM-3蛋白质的细胞内被PIM-3蛋白质磷酸化的底物分子、跨膜受体的胞内结构域、与细胞膜内表面或细胞质分子相关的分子。PIM-3靶分子可以是本发明的非-PIM-3分子或PIM-3蛋白质或多肽。在一个实施方案中，PIM-3靶分子是介导信号转导的信号转导途径中的成分。
在一个实施方案中，对PIM-3蛋白质与PIM-3靶分子结合或相互作用的测定是通过测定靶分子的活性完成的。例如靶分子的活性可以通过如下方法测定，即检测所述靶对细胞第二信使的诱导(例如细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、检测所述靶对适当底物的催化/酶促活性、检测对报告基因的诱导(例如PIM-3-应答调控元件可操作地连接有编码可检测标记物如萤光素酶的核酸)，或检测细胞反应，如细胞分化，或细胞增殖。
在本发明多种形式的测定方法中，都希望能固定PIM-3或者它的靶分子使得易于从一种或两种蛋白质的非复合形式中分离出复合形式，并适于自动化测定。在存在或缺乏候选化合物时测试化合物与PIM-3的结合，或PIM-3与靶分子的相互作用能够在任何适于容纳反应物的容器中进行。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供加入了使得一种或两种蛋白质能够结合到基质上的结构域的融合蛋白质。例如谷胱甘肽-S-转移酶/PIM-3融合蛋白质或者谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白质能够被吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠子上或谷胱甘肽衍生的微量滴定板，随后将融合蛋白质与测试化合物结合或者将测试化合物与未被吸附的靶蛋白质或PIM-3蛋白质结合，并且将混合物在易于形成复合体的条件下(如生理条件下的盐浓度和pH值)进行孵育。孵育后，将珠子或微量滴定板进行洗涤以去除任何未结合的成分并且对形成的复合体进行直接或间接地测定。或者，将复合体从基质上分离出来，并用标准技术测定PIM-3结合水平或活性。其他用于将蛋白质固定于基质上的技术也可以用于本发明的筛选测定。例如，利用生物素和链亲和素结合的方法将PIM-3或它的靶分子进行固定。应用本领域公知的技术可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的PIM-3或靶分子。或者，将能够与PIM-3或靶分子反应且不干扰PIM-3蛋白质与其靶分子结合的抗体包被到板子的孔内，并且游离的靶分子或PIM-3通过抗体结合反应被捕获。用于检测这类复合体的方法除了上述的检测GST-固化复合体的方法外，还包括使用能与PIM-3或靶分子反应的抗体对复合体进行的免疫检测，此外还包括依赖于检测与PIM-3或靶分子相关酶活性的酶联测定法。
在另一个实施方案中，用下述方法鉴定出PIM-3表达的调节剂，该方法是将细胞与一种候选化合物相接触并对细胞中PIM-3 mRNA或蛋白质的表达进行测定。将候选化合物存在情况下的PIM-3 mRNA或蛋白质表达水平与不存在候选化合物情况下的PIM-3 mRNA或蛋白质表达水平相比较。然后基于这种比较，可以将作为PIM-3表达调节剂的候选化合物鉴定出来。例如，当PIM-3 mRNA或蛋白质的表达在存在候选化合物时比不存在时更多(统计学意义上的更多)，候选化合物被鉴定为PIM-3 mRNA或蛋白质表达的刺激剂。或者，当PIM-3 mRNA或蛋白质的表达在存在候选化合物时比不存在时更少(统计学意义上的更少)，候选化合物被鉴定为PIM-3 mRNA或蛋白质表达抑制剂。细胞内PIM-3 mRNA或蛋白质表达水平可以通过此处叙述的用于检测PIM-3 mRNA或蛋白质的方法进行测定。
在本发明的另一方面，PIM-3蛋白质或其多肽可以在双杂交或三杂交分析中作为“诱饵蛋白质”，以鉴定能与PIM-3结合或相互作用并调节PIM-3活性的其他蛋白质(“PIM-3-结合蛋白质”或“PIM-3-BP”)。此类PIM-3-结合蛋白质也可能作为诸如PIM-3通路的上游或下游元件参与PIM-3蛋白质的信号传递。本发明还提供了与PIM-3相互作用的蛋白质的用途，这些蛋白质例如与PIM-3双杂交相互作用蛋白质、在双杂交筛选中作为诱饵的蛋白质和鉴定出的PIM-3相互作用蛋白质。PIM-3相互作用蛋白质可能参与PIM-3信号转导途径。
本发明还提供预测医学领域，其中诊断分析、预后分析、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的以预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及到用于测定生物样品(例如来源于个体的血液、血清、细胞、组织，优选地是来源于人的)中PIM-3蛋白质和/或核酸表达及PIM-3活性的诊断分析以决定是否该个体患有与异常PIM-3表达或异常活性相关的疾病或功能失调，或处于发展为功能失调的危险之中。本发明还提供了用于测定是否某个个体正处于发展成为与PIM-3蛋白质、核酸表达或活性相关的功能失调的危险之中的预后(预测)分析。例如，在生物学样本中可分析PIM-3基因的突变。此类分析可以用于预后或预测目的以在以PIM-3蛋白质、核酸表达或活性为特征的失调或与之相关的失调发生之前预防性地治疗个体。
本发明的另一个方面提供了用于测定个体生物样本中PIM-3蛋白质、核酸表达或PIM-3活性的方法从而为该个体选择适当的治疗或预防试剂(此处指“药物基因组学”)。药物基因组学允许根据个体的基因型(例如，检查出的个体基因型以决定该个体对特定试剂的反应能力)选择试剂(例如药物)以治疗性地或预防性地处理个体。
本发明的另一个方面提供了监测在临床试验中试剂(例如药物或其他化合物)对PIM-3表达或活性的影响。
一个用于检测在生物样本中存在或缺乏PIM-3的范例方法包括从受试者中获得生物样本和将生物样本与能够检测PIM-3蛋白质或编码PIM-3蛋白质的核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触以至于能够检测到生物样本中PIM-3的存在。能够用于检测PIM-3 mRNA或基因组DNA的试剂可以是能够与PIM-3 mRNA或基因组DNA进行杂交的经标记核酸探针。
用于检测PIM-3蛋白质的试剂可以是能够与PIM-3蛋白质结合的抗体，优选地是带有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或更加优选地是单克隆抗体。可以使用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。
术语“生物样本”用于包括从个体分离到的组织、细胞和生物液体，还包括存在于个体内的组织、细胞和液体。也就是说本发明中的检测方法可以用于如体外和体内检测生物样本中的PIM-3 mRNA、蛋白质或基因组DNA。在一个实施方案中，生物样本包含来自受试者的蛋白质分子。此外，生物样本可包含来源于受试者的mRNA分子或基因组DNA分子。生物样本为如脂肪组织的活检组织，是用传统方法从受试者分离得到的。
在另一个实施方案中，该类方法还涉及从对照受试者获得对照生物样本、将对照生物样本与能够检测PIM-3蛋白质、mRNA、或基因组DNA的化合物或试剂接触以至于能够检测到生物样本中PIM-3蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在，并将对照样本中PIM-3蛋白质、mRNA、或基因组DNA的存在与测试样本中PIM-3蛋白质、mRNA、或基因组DNA的存在进行比较。
本发明还包括用于检测生物样本(测试样本)中PIM-3存在的试剂盒。此类试剂盒可以用于确定是否该个体正在遭受或即将处于形成胰岛素抗性或II型糖尿病相关失调的危险之中。例如，试剂盒可包含能够检测生物样本中PIM-3蛋白质或mRNA的经标记化合物或试剂和用于确定样本中PIM-3量的工具(例如，抗PIM-3的抗体或能够结合编码PIM-3的DNA，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，的寡核苷酸探针)。
此处所述的方法可进一步被用来作为诊断或预后分析以鉴定受试者已发生或将处于形成异常PIM-3表达或活性相关的疾病或失调之中。例如，此处所述的测定法，正如之前的诊断分析和随后的分析，可以用于鉴定已患有或即将处于形成胰岛素抗性或II型糖尿病的受试者。因此，本发明提供了这样的方法，其中检测了来源于个体的测试样本中的PIM-3蛋白质或核酸(例如mRNA、基因组DNA)，其中PIM-3蛋白质或核酸的存在是用于诊断那些处于或将处于与异常PIM-3表达或活性相关的疾病或失调的个体的。正如此处所使用的，“测试样本”是指从目的受试者获得的生物样本。例如，测试样本可以是生物液(例如血清)、细胞样本或组织。
此外，预后分析可以用于确定是否能够将一种试剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他候选药物)施用于受试者以治疗胰岛素抗性或II型糖尿病。例如，此类方法可以用于确定是否能够用某种特殊试剂或一类试剂(例如降低PIM-3活性型试剂)对受试者进行有效地治疗。
通过筛选测定法鉴定出来的对PIM-3活性(例如PIM-3基因表达)具有刺激或抑制作用的试剂或调节剂可以用于制备治疗(预防性地或治疗性地)与PIM-3活性异常相关的失调(例如涉及表达PIM-3的细胞或组织例如脂肪细胞的失调)的药物。与此类治疗相关，还可考虑到个体的药物基因组学(即研究个体的基因型和该个体对外源性化合物或药物的反应间的关系)。治疗的新陈代谢的不同可能由于改变剂量与药理活性药物在血中的浓度之间的关系从而导致严重的毒性或治疗失败。因此，基于对个体基因型的考虑，个体的药物基因组学允许对预防性或治疗性治疗有效的试剂(例如药物)进行选择。此类药物基因组学能够进一步应用于确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以测定个体的PIM-3蛋白质活性、PIM-3核酸表达或PIM-3基因的突变含量，从而选择适当的用于个体治疗性或预防性治疗的试剂。
监测试剂(例如药物、化合物)对PIM-3活性或表达的影响(例如调节异常细胞增殖和/或分化的能力)不仅能够用于基本药物筛选，还能够用于临床试验。
调节PIM-3蛋白质活性的抗II型糖尿病剂可以是下述试剂，例如小分子(例如调节PIM-3的蛋白激酶活性的小分子)、核酸或蛋白质、天然存在的PIM-3蛋白质的同源配基、肽、或PIM-3肽模拟物。在一个实施方案中，试剂刺激PIM-3蛋白质一种以上生物学活性。此类刺激剂的实例包括刺激一种以上PIM-3活性(例如PIM-3蛋白激酶活性)的小分子、活性PIM-3蛋白质和已经导入细胞内的编码PIM-3的核酸分子。在另一个实施方案中，试剂可抑制PIM-3蛋白质一种以上生物学活性。此类抑制剂的实例包括抑制一种以上PIM-3活性(例如PIM-3蛋白激酶活性)的小分子、反义PIM-3核酸分子和抗PIM-3抗体。
通过以下非限制性解释的实施例对本发明进行进一步阐述。因此本申请中各处引用的全部参考文献、专利和已公布的专利申请的内容在此引用作用参考。
实施例实施例1人和鼠PIM-3核苷酸序列的测定使用BLASTN程序BLOSUM62矩阵，将大鼠PIM-3核苷酸序列(AF057026、NM_022602、SEQUENCE ID NO9)用于查询专有数据库。专有数据库基于构建到标准克隆载体中的专有cDNA文库。将通过BLASTN鉴定出来的最接近的相关cDNA克隆进行测序。这些cDNA序列被组合成为一个重叠群。从这个重叠群的共有序列中鉴定得到人PIM-3序列，对该重叠群的进一步分析揭示其cDNA长度为1977bp。人PIM-3cDNA含有一个978个碱基对的开放阅读框，预测可编码一个新的326个氨基酸的蛋白质。使用BLASTN程序BLOSUM62矩阵，将大鼠PIM-3核苷酸序列也用于查询公开的UNIGENE小鼠数据库。通过BLASTN鉴定出一些密切相关的EST序列。将该EST的序列信息用于筛选利用GeneTrapper II技术构建的小鼠胚胎cDNA文库(Life Technologies，Karlsruhe，德国)。将cDNA克隆进行测序并将cDNA序列组合成为一个重叠群。从这个重叠群的共有序列中鉴定得到鼠PIM-3序列，对该重叠群进一步分析并去除内含子序列后揭示其cDNA序列长度为2236bp。鼠PIM-3 cDNA含有一个978个碱基对的开放阅读框，预测可编码一个新的326个氨基酸的蛋白质。
实施例2人和鼠PIM-3蛋白质的特性在本实施例中，将预测的人PIM-3和鼠PIM-3蛋白质的氨基酸序列与已知的蛋白质中存在的基序和/或结构域相比较并且与已知蛋白质的多肽序列相比较。存在于人PIM-3和鼠PIM-3的多肽结构域和/或基序被鉴定出来表明是与人PIM-3和鼠PIM-3具有显著氨基酸相似性的蛋白质。此外，还预测了人PIM-3和鼠PIM-3蛋白质的分子量。
如上述所鉴定的，人和鼠核苷酸序列(SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.5)编码含326个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6)。人和鼠PIM-3预测的分子量分别约为35.9kDa，不包括翻译后修饰。为了检验预测的激酶活性的证据和可能的翻译后修饰位点，利用蛋白质模式PROSITE数据库，以及IMPALA和PFAM，分别分析了SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的人和鼠的多肽序列。
搜索PROSITE数据库发现序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6氨基酸260-263位置存在一个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点；SEQID NO.2的氨基酸202-205、211-214和321-324位置存在三个酪蛋白激酶II磷酸化位点，而SEQ ID NO.6的氨基酸202-205、211-214、299-302和321-324位置存在四个酪蛋白激酶II磷酸化位点；SEQ ID NO.2和SEQ IDNO6的氨基酸43-48、49-54、52-57、57-62、63-68、80-85、98-103、101-106、295-300和316-321位置存在十个N-十四烷酰化位点；SEQ ID NO.2和SEQID NO.6的氨基酸137-139、275-277和279-281位置存在三个蛋白激酶C磷酸化位点；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸33-40位置存在一个酪氨酸激酶磷酸化位点；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸46-69位置存在一个蛋白激酶特征和构造(ATP结合位点)；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸166-178位置存在一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性部位特征。利用IMPALA搜索发现SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸40-293位置(分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8)存在一个真核的蛋白激酶结构域；分别为分值186比特和期望值8e-49以及分值184比特和期望值4e-48。利用PFAM搜索也发现SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸40-293位置存在一个真核的蛋白激酶结构域；分别为分值262，5和E-值5.7e-75以及分值261，1和E-值1.5e-74。
利用blosum作为蛋白质权重矩阵，将人、鼠和大鼠PIM-3多肽序列(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10)排列于成对CLUSTALW排列分析。因此，发现人PIM-3与鼠和大鼠PIM-3(AF057026、NM_022602、SEQ ID NO.10)95％相同，分值为2011，鼠PIM-3和大鼠PIM-3(AF057026、NM_022602、SEQ ID NO.10)99％相同，分值为2074。使用BLASTP程序BLOSUM62矩阵，同样将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的人和鼠PIM-3多肽序列用于查询Swissprot蛋白质序列数据库。此处列出了BLASTP分析鉴定出的四个与人和鼠PIM-3最密切相关的蛋白质发现人和鼠PIM-3与非洲爪蟾(Xenopus laevis)(蛙)PIM-1(Q91822；SEQ ID NO.11)同源性为76％，分值为518，与大鼠PIM-1(P26794；SEQ ID NO.12)同源性为72％，分值为442，与人PIM-1(P11309；SEQID NO.13)同源性为71％，分值为441，与鼠PIM-1(P06803；SEQ ID NO.14)同源性为71％，分值分别为436和438。
实施例3胰岛素抗性和II型糖尿病体内模型中PIM-3基因表达Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠是众所周知的瘦素(leptin)受体fa基因纯合缺陷的动物模型。该大鼠品系产生年龄依赖性胰岛素抗性/高胰岛素血症状态并将发展成典型的II型糖尿病/高血糖症状态。为了鉴定表达受诱导或抑制的基因从而有助于或标记胰岛素抗性或II型糖尿病的形成，利用基于表达谱技术的寡核苷酸阵列对ZDF大鼠和其瘦的杂合对照同窝大鼠的基因表达谱进行收集。
材料和方法6、8和10周龄Zucker糖尿病肥胖(ZDF/Gmi.TM.-fa/fa)雄性大鼠和用作健康对照的瘦雄性fa+/fa-同窝鼠购自Genetic Models有限公司(Indianapolis，IND.，US)。
这些动物用于研究之前，首先在标准动物房环境中饲养一周。引颈法处死动物以采集附睾脂肪组织和血液样本。每一年龄组将6只ZDF大鼠和6只瘦的fa+/fa-同窝鼠用于下面所描述的基因表达分析。
组织采集和分离RNA引颈处死动物后，外科剥离附睾脂肪垫，将其分割成小块并迅速转移至适当的含有足量RNA later(Ambion，TX，US)的管中。分别贮存从每个动物获得的样本。长期贮存的样本优选地置于-80℃。利用Rneasy小量试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，依照制造商推荐的从脂肪组织中分离RNA的方法从脂肪组织中提取细胞总RNA。将RNA分两次洗脱于50μl无RNA酶水中，分光光度法(A260)测定RNA浓度。为了进一步纯化，用无RNA酶水将RNA溶液补足至总体积100μl。根据制造商的指导利用Qiagen公司的Rneasy小量试剂盒对RNA进行纯化。将RNA分两次洗脱于50μl无RNA酶水中，分光光度法(A260)测定RNA浓度。为了浓缩RNA洗脱液，加入醋酸铵和乙醇，将其在乙醇干冰浴中沉淀过夜。4℃最大速度离心收集RNA。用80％乙醇将RNA沉淀洗涤两次，空气干燥并溶于小体积的无RNA酶水中。用分光光度法(A260)测定RNA浓度。
基因表达谱在专利US 6,177,248中已经描述了寡核苷酸阵列在基因表达监测方面的一般用途。在我们实际的应用中，所使用的微点阵含有代表大约8000个已知基因或EST簇的脱氧核苷酸序列。每个基因或EST序列均由不多于20对的寡核苷酸表示，每对包括一个与转录本片段相匹配的寡聚体，和一个含有中央定位的1bp错配的对照寡聚体。Affymetrix，，Santa Clara，CA，US提供了针对大鼠的3个阵列(RG U34A、RG U34B和RG U34C)，代表了来源于已知基因或EST序列数据库的总共大约24000个基因和EST序列。
用于杂交的cRNA制备RNA取自上述的附睾脂肪组织。向细胞总RNA(10μg)+-中加入含有T7启动子位点的oligo dT引物。引物复性后，应用Superscript选择逆转录酶按照制造商的说明书使RNA进行逆转录。利用分相栓凝胶管(Eppendorf，Hamburg，德国)将RNA进行酚∶氯仿∶异戊醇提取和乙醇沉淀后，通过离心收集cDNA并用80％乙醇洗涤两次。将沉淀物溶于无RNA酶的水中，并使用Enzo高效标记转录试剂盒(Enzo Diagnostics，Farmingdale NY，US)或MEGAscript T7高效转录试剂盒(Ambion，Austin，TX，US)，根据制造商的说明书将RNA转录成生物素标记的cRNA。对于以后的应用，生物素标记的UTP和CTP(Sigma，Munich，德国)加上未标记的ATP和GTP以1∶3(标记的∶未标记的)的摩尔比率使用。然后按上述方法沉淀并洗涤cRNA。最后，将沉淀的并经空气干燥的cRNA溶于小体积无RNA酶水中。用分光光度法(A260)测定RNA浓度，大小分布通过琼脂糖凝胶电泳检测。接下来，将cRNA在40mM Tris-醋酸pH8.1、100mM醋酸钾、30mM醋酸镁中94℃孵育25分钟，水解成平均长度为50个核苷酸的片段。按照Affymetrix说明书将20μg片段化cRNA用于制备杂交混合物。杂交前，将RNA样品在杂交混合物中加热至99℃10分钟，置于冰上5分钟，并使其平衡至室温后放于杂交流动池中。然后将杂交混合物与微点阵在杂交炉中45℃60转/分杂交过夜。杂交后，取出杂交混合物并将其贮存于-80℃备用。洗涤微点阵并在Affymetrix射流台利用藻红蛋白-链亲和素-抗体扩增法EukWS2根据制造商说明书将微点阵进行染色。利用由Hewlett Packard为Affymetrix制造的扫描共聚焦显微镜(Affymetrix，Santa Clara，CA，US.出售)收集数据。扫描仪利用氩离子激光器作为激发光源，利用光电倍增管于530nm波长通过的滤光片(荧光素)或560nm长波长通过的滤光片(藻红蛋白)检测发射光。
杂交模式和强度的定量分析阵列定量扫描之后，利用已知的阵列大小将栅格调整至图像并以角点对照区作为标志。利用Affymetrix研发的软件(可与共聚焦扫描仪一起得到)将图像压缩为含有位置和强度信息的简单文本文件。将信息与另一个文本文件合并，该文件中含有与微点阵上探针序列的物理位置以及为其设计寡核苷酸探针的RNA(和RNA的特异部分)的鉴定相关的信息。杂交结果的定量分析包括基于以下假说的模式识别的一种简单形式，即当存在特异RNA时，PM(在专利US 6,177,248中PM指“完全匹配”)探针的杂交平均强于它们的MM(在专利US 6,177,248中MM指“错配”)探针。与每套探针PM/MM比率的对数值的平均值一起计算PM杂交信号大于MM信号的例子的数目。这些数值可用于决定(利用预先定义的决定矩阵)有关RNA的存在或缺乏。为了测定定量RNA的丰度，计算每族探针差异(PM-MM)的平均值。差异法的优点在于来自随机交叉杂交的信号对于PM和MM探针作用通常是相等的，而特异的杂交更有助于PM探针。通过平均成对差异，组成性加入了真实的信号，而去除了交叉杂交的影响。当估计两不同RNA样本之间的差异时，将来自同样合成的微点阵上的平行实验的杂交信号直接进行比较。通过比较掺入试验的结果以及所观察到的以已知的量掺入到每个样本中的内标细菌和噬菌体RNA的信号来解释差异(PM-MM)值的平均值所变化的倍数。由Affymetrix研发的数据分析程序自动执行这些操作。
1.BR2222是溴化丁基橡胶(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)2.EXACTTM4033是含有24wt％1-丁烯衍生单元的乙烯-丁烯共聚物(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)3.EXACTTM8201是含有28wt％1-辛烯衍生单元的乙烯-辛烯共聚物(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)4.FLEXONTM876是链烷油(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)5.树脂SP1068是树脂(酚醛树脂)(Schenectady ChemicalCompany，Schenectady NY)6.MBTS是二硫化2，2’-苯并噻唑(Bayer AG，以商品名VULKACITDM/CTM)表2.本发明SCC实施方案的性能
1.根据聚乙烯晶体的熔融焓计算结晶度。
2.Tm是由DSC得到的峰值熔融温度。
3.熔融指数根据ASTM D1238测量。
这种衍生材料(17)以各种浓度分散于高抗冲聚苯乙烯(HIPS)中。对形成的复合物材料的拉伸强度，拉伸模量以及百分断裂应变数据进行收集。表3是这些实施例的结果。
表3
*3重量％，未官能化的纳米管(SWNT-p)，作比较用。
带有官能化纳米管的聚合物/复合材料的拉伸性能总的来说有明显提高。对于pristine与HIPS聚合物，和对于HPIS与未官能化纳米管的复合材料都有所提高。
聚合再有，包含碳纳米管的聚合物可由能发生聚合或引发聚合的官能团与碳纳米管进行衍生反应而形成。一旦官能团连接上去，就可使用标准聚合技术从官能团原位增长聚合物，即连接到纳米管的官能团可以用作聚合物增长的发生剂。所谓标准聚合技术可以是任何一种已知的标准技术，如自由基、阳离子、阴离子、缩聚作用、开环、易位或开环易位(ROMP)聚合，如果合适的官能团键合到纳米管上。例如，图23就是碳纳米管已+与4-氨基苯基官能团进行衍生反应，随后与苯乙烯进行聚合，从官能团增长聚合物的例子。因此，连至纳米管的官能团成为聚合的化学活性部分，由此产生化学包含纳米管的复合材料。
这里所有公开的组份与方法以及权利要求均根据本发明内容提出，并且无需过分实验就可实施。本文根据较佳实施方式描述了本发明的组份与方法。本领域的技术人员很清楚在不背离本发明的原理、精神和范围条件下，可以对这<p>表5探针号 化合物*浓度处理时间罗格列酮1 1μM6小时(Rosiglitazone)2罗格列酮 5μM6小时曲格列酮3曲格列酮 1μM6小时(troglitazone)4曲格列酮 5μM6小时5DMSO对照 0.02％(v/v) 6小时6罗格列酮 1μM24小时7罗格列酮 5μM24小时8曲格列酮 1μM24小时9曲格列酮 5μM24小时10 DMSO对照 0.02％(v/v) 24小时11 罗格列酮 1μM48小时12 罗格列酮 5μM48小时13 曲格列酮 1μM48小时14 曲格列酮 5μM48小时15 DMSO对照 0.02％(v/v) 48小时*罗格列酮和曲格列酮溶于DMSO配制成5mM和25mM的贮存液并用培养基稀释5000倍至终浓度(1μM/5μM)。作为对照，不含化合物的DMSO也同样稀释5000倍至终浓度0.02％(v/v)。
利用TRIzoL试剂(Life Technologies，Karlsruhe，德国)分离RNA并应用无DNA试剂盒(Ambion，Austin，TX，US)用DNA酶I处理RNA。利用RNeasy小量试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进一步纯化RNA并用2100生物分析器(Agilent，Bblingen，德国)进行质量/数量控制。按照GeneChip表达分析技术手册(Affymetrix，Santa Clara，CA，US)将10μg总RNA转换成生物素标记的cRNA。简而言之，应用SuperScript双链cDNA合成试剂盒(Life Technologies，Karlsruhe，德国)进行第一链和第二链的合成，并且用BioArray RNA转录标记试剂盒(EnzoDiagnostics，Framingdale，NY，US)制备生物素标记的cRNA。加热使10μg cRNA片段化，加入到GeneChip真核杂交对照溶液(Affymetrix)中并于45℃旋转16小时与GeneChip MG-U74Av2阵列杂交。使用Affymetrix提供的硬件按标准操作对阵列进行洗涤、染色和扫描。应用微点阵配套的版本4.0.1软件(Affymetrix，见上)分析原始数据。全部实验重复两次以提供三个生物学复制本。
数据分析按如上所述的方法进行数据分析，包括估价变化倍数在内。通过比较每个时间点化合物处理的样本及未处理的对照可以得到PIM-3倍数变化值。使用了Affymetrix定量器96841 AT。结果归纳于表6a)-c)。
表6a)
表b)
表c)
“Rosi”代表“罗格列酮”，“Tro”代表“曲格列酮”。
实施例6用抗糖尿病药物(PPARγ激动剂)处理的ZDF大鼠Pim-3基因表达雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF/Gmi.TM.-fa/fa)大鼠和它们fa+/fa-瘦的相应大鼠，5周龄(对照1-5，ZDF 1-10)购自Genetic Models有限公司(Indian apolis，Ind.)。大鼠自由摄取食物和水。将ZDF大鼠分成两组组1(动物ZDF 1-5)不用任何试剂处理，而第二组用抗糖尿病药物罗格列酮(3mg/kg/天，动物6-10，Rosi 1-5)处理14周。为了收集附睾脂肪垫和血液样本，用引颈法处死各种实验条件下5只动物。为了监测抗糖尿病处理是否成功，试验完成之后按标准方法测定HbA1c，HbA1c可作为长期血糖水平的标志。这些测定的结果归纳于表7表7
按试验1中所述的方法进行附睾脂肪组织收集、RNA分离和Affymetrix实验。数据分析包括来源于瘦的对照动物样本与未处理ZDF大鼠的表达数据的比较以及来源于罗格列酮处理动物与非处理ZDF动物的表达数据的比较。使用由Aventis制药公司研发的有专利权的软件进行数据分析，包括变化倍数的估计和这些变化倍数统计学意义的衡量。使用Affime trix定量器AF086624_S_AT分析PIM-3基因表达的变化倍数。那些分析结果归纳于下面的表8a和8b表8a
表8b
序列表<110>安万特医药德国有限公司<120>作为II型糖尿病靶标的PIM-3激酶<130>DEAV2002/0004<140>02001401.5<141>2002-01-19<160>14<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1973<212>DNA<213>人<400>1gagggccgtc gcccgcgatg ctgctctcca agttcggctc cctggcgcac ctctgcgggc60ccggcggcgt ggaccacctc ccggtgaaga tcctgcagcc agccaaggcg gacaaggaga120gcttcgagaa ggcgtaccag gtgggcgccg tgctgggtag cggcggcttc ggcacggtct180acgcgggtag ccgcatcgcc gacgggctcc cggtggctgt gaagcacgtg gtgaaggagc240gggtgaccga gtggggcagc ctgggcggcg cgaccgtgcc cctggaggtg gtgctgctgc300gcaaggtggg cgcggcgggc ggcgcgcgcg gcgtcatccg cctgctggac tggttcgagc360ggcccgacgg cttcctgctg gtgctggagc ggcccgagcc ggcgcaggac ctcttcgact420ttatcacgga gcgcggcgcc ctggacgagc cgctggcgcg ccgcttcttc gcgcaggtgc480tggccgccgt gcgccactgc cacagctgcg gggtcgtgca ccgcgacatt aaggacgaaa540atctgcttgt ggacctgcgc tccggagagc tcaagctcat cgacttcggt tcgggtgcgc600tgctcaagga cacggtctac accgacttcg acggcacccg agtgtacagc cccccggagt660ggatccgcta ccaccgctac cacgggcgct cggccaccgt gtggtcgctg ggcgtgcttc720tctacgatat ggtgtgtggg gacatcccct tcgagcagga cgaggagatc ctccgaggcc780gcctgctctt ccggaggagg gtctctccag agtgccagca gctgatccgg tggtgcctgt840ccctgcggcc ctcagagcgg ccgtcgctgg atcagattgc ggcccatccc tggatgctgg900gggctgacgg gggcgccccg gagagctgtg acctgcggct gtgcaccctc gaccctgatg960acgtggccag caccacgtcc agcagcgaga gcttgtgagg agctgcacct gactgggagc1020taggggacca cctgccttgg ccagacctgg gacgccccca gaccctgact ttttcctgcg1080tgggccgtct cctcctgcgg aagcagtgac ctctgacccc tggtgacctt cgctttgagt1140gccttttgaa cgctggtccc gcgggacttg gttttctcaa gctctgtctg tccaaagacg1200ctccggtcga ggtcccgcct gccctgggtg gatacttgaa ccccagacgc ccctctgtgc1260tgctgtgtcc ggaggcggcc ttcccatctg cctgcccacc cggagctctt tccgccggcg1320
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130 135 140Pro Leu Ala Arg Arg Phe Phe Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His145 150 155 160Cys His Ser Cys Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu165 170 175Leu Val Asp Leu Arg Ser Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser180 185 190Gly Ala Leu Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg195 200 205Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg210 215 220Ser Ala Thr Val Trp Ser Leu Gly Val Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys225 230 235 240Gly Asp Ile Pro Phe Glu Gln Asp Glu Glu Ile Leu Arg Gly Arg Leu245 250 255Leu Phe Arg Arg Arg Val Ser Pro Glu Cys Gln Gln Leu Ile Arg Trp260 265 270Cys Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Arg Pro Ser Leu Asp Gln Ile Ala275 280 285Ala His Pro Trp Met Leu Gly Ala Asp Gly Gly Ala Pro Glu Ser Cys290 295 300Asp Leu Arg Leu Cys Thr Leu Asp Pro Asp Asp Val Ala Ser Thr Thr305 310 315 320Ser Ser Ser Glu Ser Leu325<210>3<211>978<212>DNA<213>人
<400>3atgctgctct ccaagttcgg ctccctggcg cacctctgcg ggcccggcgg cgtggaccac60ctcccggtga agatcctgca gccagccaag gcggacaagg agagcttcga gaaggcgtac120caggtgggcg ccgtgctggg tagcggcggc ttcggcacgg tctacgcggg tagccgcatc180gccgacgggc tcccggtggc tgtgaagcac gtggtgaagg agcgggtgac cgagtggggc240agcctgggcg gcgcgaccgt gcccctggag gtggtgctgc tgcgcaaggt gggcgcggcg300ggcggcgcgc gcggcgtcat ccgcctgctg gactggttcg agcggcccga cggcttcctg360ctggtgctgg agcggcccga gccggcgcag gacctcttcg actttatcac ggagcgcggc420gccctggacg agccgctggc gcgccgcttc ttcgcgcagg tgctggccgc cgtgcgccac480tgccacagct gcggggtcgt gcaccgcgac attaaggacg aaaatctgct tgtggacctg540cgctccggag agctcaagct catcgacttc ggttcgggtg cgctgctcaa ggacacggtc600tacaccgact tcgacggcac ccgagtgtac agccccccgg agtggatccg ctaccaccgc660taccacgggc gctcggccac cgtgtggtcg ctgggcgtgc ttctctacga tatggtgtgt720ggggacatcc ccttcgagca ggacgaggag atcctccgag gccgcctgct cttccggagg780agggtctctc cagagtgcca gcagctgatc cggtggtgcc tgtccctgcg gccctcagag840cggccgtcgc tggatcagat tgcggcccat ccctggatgc tgggggctga cgggggcgcc900ccggagagct gtgacctgcg gctgtgcacc ctcgaccctg atgacgtggc cagcaccacg960tccagcagcg agagcttg 978<210>4<211>254<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述真核生物的蛋白激酶结构域<400>4Tyr Gln Val Gly Ala Val Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr1 5 10 15Ala Gly Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu Pro Val Ala Val Lys His Val20 25 30Val Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly Ser Leu Gly Gly Ala Thr Val35 40 45Pro Leu Glu Val Val Leu Leu Arg Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala50 55 60Arg Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe65 70 75 80
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Met Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ser Leu Ala His Leu Cys Gly Pro Gly1 5 10 15Gly Val Asp His Leu Pro Val Lys Ile Leu Gln Pro Ala Lys Ala Asp20 25 30Lys Glu Ser Phe Glu Lys Val Tyr Gln Val Gly Ala Val Leu Gly Ser35 40 45Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr Ala Gly Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu50 55 60Pro Val Ala Val Lys His Val Val Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly65 70 75 80Ser Leu Gly Gly Val Ala Val Pro Leu Glu Val Val Leu Leu Arg Lys85 90 95Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp100 105 110Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe Leu Leu Val Leu Glu Arg Pro Glu Pro115 120 125Ala Gln Asp Leu Phe Asp Phe Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Asp Glu130 135 140Pro Leu Ala Arg Arg Phe Phe Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His145 150 155 160Cys His Ash Cys Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu165 170 175Leu Val Asp Leu Arg Ser Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser180 185 190Gly Ala Val Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg195 200 205Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg210 215 220Ser Ala Thr Val Trp Ser Leu Gly Val Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys225 230 235 240
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<210>8<211>254<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述真核生物的蛋白激酶结构域<400>8Tyr Gln Val Gly Ala Val Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr1 5 10 15Ala Gly Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu Pro Val Ala Val Lys His Val20 25 30Val Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly Ser Leu Gly Gly Val Ala Val35 40 45Pro Leu Glu Val Val Leu Leu Arg Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala50 55 60Arg Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe65 70 75 80Leu Leu Val Leu Glu Arg Pro Glu Pro Ala Gln Asp Leu Phe Asp Phe85 90 95Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Asp Glu Pro Leu Ala Arg Arg Phe Phe100 105 110Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His Cys His Asn Cys Gly Val Val115 120 125His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu Leu Val Asp Leu Arg Ser Gly130 135 140Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Val Leu Lys Asp Thr145 150 155 160Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp165 170 175
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Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe Leu Leu Val Leu Glu Arg Pro Glu Pro115 120 125Ala Gln Asp Leu Phe Asp Phe Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Asp Glu130 135 140Pro Leu Ala Arg Arg Phe Phe Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His145 150 155 160Cys His Asn Cys Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu165 170 175Leu Val Asp Leu Arg Ser Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser180 185 190Gly Ala Val Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg195 200 205Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg210 215 220Ser Ala Thr Val Trp Ser Leu Gly Val Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys225 230 235 240Gly Asp Ile Pro Phe Glu Gln Asp Glu Glu Ile Leu Arg Gly Arg Leu245 250 255Phe Phe Arg Arg Arg Val Ser Pro Glu Cys Gln Gln Leu Ile Glu Trp260 265 270Cys Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Arg Pro Ser Leu Asp Gln Ile Ala275 280 285Ala His Pro Trp Met Leu Gly Thr Glu Gly Ser Val Pro Glu Asn Cys290 295 300Asp Leu Arg Leu Cys Ala Leu Asp Thr Asp Asp Gly Ala Ser Thr Thr305 310 315 320Ser Ser Ser Glu Ser Leu325
<210>11<211>323<212>PRT<213>非洲爪蟾(Xenopus laevis)<400>11Met Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ser Leu Ala His Ile Cys Asn Pro Ser1 5 10 15Asn Met Glu His Leu Pro Val Lys Ile Leu Gln Pro Val Lys Val Asp20 25 30Lys Glu Pro Phe Glu Lys Val Tyr Gln Val Gly Ser Val Val Ala Ser35 40 45Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr Ser Asp Ser Arg Ile Ala Asp Gly Gln50 55 60Pro Val Ala Val Lys His Val Ala Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly65 70 75 80Thr Leu Asn Gly Val Met Val Pro Leu Glu Ile Val Leu Leu Lys Lys85 90 95Val Pro Thr Ala Phe Arg Gly Val Ile Asn Leu Leu Asp Trp Tyr Glu100 105 110Arg Pro Asp Ala Phe Leu Ile Val Met Glu Arg Pro Glu Pro Val Lys115 120 125Asp Leu Phe Asp Tyr Ile Thr Glu Lys Gly Pro Leu Asp Glu Asp Thr130 135 140Ala Arg Gly Phe Phe Arg Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys Tyr145 150 155 160Asn Cys Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Ash Leu Leu Val165 170 175Asp Thr Arg Asn Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala180 185 190Leu Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr195 200 205
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Ala Ile Lys His Val Glu Lys Asp Arg Ile Ser Asp Trp Gly Glu Leu65 70 75 80Pro Asn Gly Thr Arg Val Pro Met Glu Val Val Leu Leu Lys Lys Val85 90 95Ser Ser Gly Phe Ser Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg100 105 110Pro Asp Ser Phe Val Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Pro Val Gln Asp115 120 125Leu Phe Asp Phe Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala130 135 140Arg Ser Phe Phe Trp Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys His Asn145 150 155 160Cys Gly Val Leu His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Ile Leu Ile Asp165 170 175Leu Asn Arg Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Leu180 185 190Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr Ser195 200 205Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg Ser Ala Ala210 215 220Val Trp Ser Leu Gly Ile Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys Gly Asp Ile225 230 235 240Pro Phe Glu His Asp Glu Glu Ile Val Lys Gly Gln Val Tyr Phe Arg245 250 255Gln Arg Val Ser Ser Glu Cys Gln His Leu Ile Arg Trp Cys Leu Ser260 265 270Leu Arg Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Glu Glu Ile Gln Asn His Pro275 280 285Trp Met Gln Asp Val Leu Leu Pro Gln Ala Thr Ala Glu Ile His Leu
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权利要求
1.包含核苷酸序列SEQ ID.NO.1的分离的核酸分子。
2.包含核苷酸序列SEQ ID.NO.3的分离的核酸分子。
3.分离的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列a)SEQ ID NO.5，b)SEQ ID NO.7，c)与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7杂交的DNA序列，以及d)由a)、b)和c)中定义序列的遗传密码简并产生的并编码PIM-3型多肽的DNA序列。
4.宿主细胞，其包含上述权利要求之一中所述的核酸分子。
5.具有PIM-3活性的多肽，所述多肽选自a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.6的多肽，b)a)中缺失一个或多个氨基酸而产生的多肽，c)a)中的一个或多个氨基酸被不同氨基酸替换而产生的多肽，d)a)的序列中添加了一个或多个氨基酸而产生的多肽，e)包含的氨基酸序列含有序列SEQ ID NO.6的全部或部分氨基酸的融合多肽。
6.PIM-3的用途，用作鉴定抗II型糖尿病药物的筛选剂。
7.如权利要求6所述的用途，其中使用了编码PIM-3的DNA。
8.如权利要求6所述的用途，其中使用了具有PIM-3活性的多肽。
9.PIM-3的用途，用于制备治疗胰岛素抗性或II型糖尿病的药物。
10.鉴定抗糖尿病化合物的方法，其中将PIM-3与待测试的化合物孵育并测定PIM-3活性的改变。
全文摘要
本发明涉及分离的核酸分子和包含此类核酸分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及具有PIM－3活性和确定氨基酸序列的多肽，以及PIM－3作为鉴定抗II型糖尿病药物的筛选剂的用途和用于制备治疗胰岛素抗性或II型糖尿病的药物的用途。
文档编号A61P5/00GK1620505SQ03802433
公开日2005年5月25日 申请日期2003年1月20日 优先权日2002年1月19日
发明者M·科恩, G·米勒, R·施奈德, G·钱克 申请人:安万特医药德国有限公司
技术领域：
本发明涉及PIM-3激酶的新用途，涉及PIM-3激酶新亚型及它们的用途。
已知在体外磷酸化作用测定中，大鼠PIM-3(最初命名为KID-1，KID“去极化作用诱导的激酶”)、蛙PIM-1和人与鼠PIM-1都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。人、鼠和大鼠PIM-3、蛙PIM-1以及人和鼠PIM-1之间具有高的多肽序列相似性，表明人和大鼠PIM-3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
大鼠PIM-3由Feldman，J.D.等人(J.Biol.Chem.(1998)273，16535-16543)进行了描述。大鼠PIM-3在海马和脑皮层的特殊区域由红藻氨酸和电惊厥休克诱导产生，表明PIM-3除了参与红藻氨酸抽搐和一些神经系统相关疾病，如抽搐和癫痫外，还参与神经元功能、突触的可塑性、学习和记忆。
专利US 6,143,540中，Konietzko，U等人(EMBO(1999)18，3359-3369)和Eichmann，A.(Oncogene(2000)19，1215-1224)也提到了PIM-3激酶。
本发明提供了PIM-3的新编码序列和PIM-3的新用途。
本发明提供了新的人和鼠PIM-3序列。SEQ ID NO.1描述了DNA序列而SEQ ID NO.2是所预测的人PIM-3的氨基酸序列。SEQ ID NO1的开放读码框涵盖了从核苷酸17到核苷酸995(SEQ ID NO.3)的区域。
SEQ ID NO.5描述了鼠PIM-3的DNA序列而SEQ ID NO.6是所预测的鼠PIM-3的氨基酸序列。SEQ ID NO 5的开放读码框涵盖了从核苷酸199到核苷酸1177(SEQ ID NO.7)区域。
本发明证明了在两组独立的胰岛素抗性模型的脂肪细胞中，大鼠PIM-3基因的表达是降低的。用胰岛素激活剂处理可引起鼠3T3-L1细胞中PIM-3基因表达增加。因为人和鼠PIM-3是大鼠PIM-3的物种直向同源物，人和鼠PIM-3参与大鼠PIM-3所参与的部分或全部过程和疾病。PIM-3，特别是人和鼠PIM-3参与胰岛素抗性的形成。此外，PIM-3，特别是人和鼠PIM-3参与II型糖尿病的形成。此外，人和鼠PIM-3平行进化同源物，PIM-1蛋白质，是原癌基因。因此，PIM-3，特别是人和鼠PIM-3参与细胞生长调控、癌以及相关的通路与疾病。
本发明涉及编码PIM-3的核酸分子、PIM-3蛋白质和蛋白质同源物在下述情况中的用途，a)筛选鉴定调节胰岛素抗性或II型糖尿病的化合物；b)检测分析胰岛素抗性或II型糖尿病(如染色体制图、组织分型、法医生物学)；c)预测医学(通过诸如诊断检测、预后分析、监测临床实验和药物基因组学预测胰岛素抗性或II型糖尿病)。
本发明尤其涉及分离的包含核苷酸序列SEQ ID.NO.1的核酸分子。此外，本发明还涉及分离的包含核苷酸序列SEQ ID.NO.3的核酸分子。
本发明涉及分离的核酸分子，其包含选自如下序列的核苷酸序列a)SEQ ID NO.5，b)SEQ ID NO.7，c)与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7杂交的DNA序列，和d)由a)、b)和c)中的序列经遗传密码简并而得到的并且能够编码PIM-3型多肽的DNA序列。
此外本发明还涉及包含各种DNA序列或其部分序列的载体和宿主细胞。
本发明涉及具有PIM-3活性的多肽，所述的多肽选自a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.6的多肽，b)与a)相比缺失一个或多个氨基酸的多肽，c)a)中一个或多个氨基酸由不同的氨基酸替换所产生的多肽，d)a)中多肽增加了一个或多个氨基酸后的多肽，e)氨基酸序列中含有序列SEQ LD NO.6的全部或部分氨基酸的融合多肽。
优选地是c)中不多于10个氨基酸被替换。
本发明涉及PIM-3作为鉴定抗-糖尿病药物的筛选剂的用途，例如用于此类目的的PIM-3编码DNA或具有PIM-3活性的多肽的用途。
此外本发明还涉及PIM-3用于制备治疗胰岛素抗性或II型糖尿病的药物的用途和PIM-3用于预测胰岛素抗性或II型糖尿病的用途。
由于PIM-3可与其他细胞蛋白质相互作用，因此可用作靶标来研发在PIM-3蛋白质表达细胞或参与PIM-3通路的细胞例如脂肪细胞内调节PIM-3蛋白质的治疗分子。本发明的核酸分子可用于表达PIM-3蛋白质(例如通过重组表达载体在基因治疗所施用的宿主细胞中表达)、用于检测PIM-3 mRNA(例如在生物学样本中)或PIM-3基因中的遗传病变，并且还可用于调节PIM-3活性。PIM-3蛋白质能用于筛选调节PIM-3活性或表达的药物或化合物，除此之外还可用于治疗以PIM-3蛋白质产物缺乏或过量或产生与PIM-3野生型蛋白质相比活性降低或异常的PIM-3蛋白质形式为特点的疾病。
本发明提供了鉴定调节剂的方法(此处亦称为“筛选测定法”)，调节剂是指能结合PIM-3蛋白质或对诸如PIM-3表达或PIM-3活性具有刺激或抑制作用的候选或测试化合物或制剂(例如肽、肽模拟物、小分子或其他药物)。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选能与PIM-3蛋白质或多肽或其生物学活性部分结合或能调节其活性的候选或测试化合物的测定法。利用本领域公知的众多重组文库方法中的任一方法可以获得本发明的测试化合物，这些方法包括生物学文库、可空间寻址的平行固相或液相文库、需要重叠合法(deconvolution)的合成文库法、“一珠一化合物”文库方法和利用亲和层析法选择的合成文库法。
在一个实施方案中，本发明的测定方法是无细胞测定法，其包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与测试化合物接触和测定测试化合物结合PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的能力。可以直接或间接测定测试化合物与PIM-3蛋白质的结合。
在另一个实施方案中，测定法包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与已知的能结合PIM-3的化合物接触形成测定混合物、将测定混合物与测试化合物接触和测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力，其中测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力包括测定与已知化合物相比，测试化合物优选地结合PIM-3或其生物学活性部分的能力。
在另一个实施方案中，测定法是无细胞测定法，其包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与测试化合物接触和测定测试化合物调节(例如刺激或抑制)PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的活性的能力。通过诸如测定PIM-3蛋白质结合PIM-3靶分子的能力，这意味着测定直接结合可以确定测试化合物调节PIM-3活性的能力。在另一个可选择的实施方案中，测定测试化合物调节PIM-3活性的能力可以通过测定PIM-3蛋白质进一步调节PIM-3靶分子的能力而完成。例如，能够测定靶分子对适当底物的催化/酶促活性。
在另一个实施方案中，无细胞测定法包括将PIM-3蛋白质或其生物学活性部分与已知的能结合PIM-3的化合物接触形成测定混合物、将测定混合物与测试化合物接触和测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力，其中测定测试化合物与PIM-3蛋白质相互作用的能力包括测定PIM-3蛋白质优选地结合或调节PIM-3靶分子活性的能力。
为了测定PIM-3底物中磷酸化的残基，可以进行磷酸化底物的磷酸氨基酸分析。简而言之，可从SDS凝胶上切取放射性磷酸化的蛋白质条带并部分酸水解。然后通过一维电泳可以分离产物并在如磷光影像分析仪上进行分析，并且与茚三酮染色的磷酸氨基酸标准品进行比较。
在本发明的另一个实施方案中，无细胞测定法通过例如体外激酶测定法可以测定PIM-3蛋白质磷酸化PIM-3靶分子的能力。简而言之，PIM-3靶分子，例如从表达此分子的细胞系中免疫沉淀出的PIM-3靶分子，可与PIM-3蛋白质和放射性ATP共同孵育。
在另一个实施方案中，测定法是基于细胞的测定法，其中将表达可溶性PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的细胞与测试化合物接触并测定测试化合物结合PIM-3蛋白质的能力。细胞可以是诸如酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。能够测定测试化合物结合PIM-3蛋白质的能力，例如通过将测试化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，从而通过检测复合体中具有如125I、35S、14C或3H标记的化合物或用如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶促或荧光素酶标记的化合物来测定测试化合物与PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的结合。
在另一个实施方案中，测定法是基于细胞的测定方法，其包括将表达可溶性PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的细胞与测试化合物接触并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的活性的能力。例如，测定测试化合物调节PIM-3蛋白质或其生物学活性部分的能力可以通过测定PIM-3蛋白质与PIM-3靶分子结合或相互作用的能力来实现。
用于此处的“靶分子”是指实质上与PIM-3蛋白质结合或相互作用的分子，例如在表达PIM-3蛋白质的细胞内被PIM-3蛋白质磷酸化的底物分子、跨膜受体的胞内结构域、与细胞膜内表面或细胞质分子相关的分子。PIM-3靶分子可以是本发明的非-PIM-3分子或PIM-3蛋白质或多肽。在一个实施方案中，PIM-3靶分子是介导信号转导的信号转导途径中的成分。
在一个实施方案中，对PIM-3蛋白质与PIM-3靶分子结合或相互作用的测定是通过测定靶分子的活性完成的。例如靶分子的活性可以通过如下方法测定，即检测所述靶对细胞第二信使的诱导(例如细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、检测所述靶对适当底物的催化/酶促活性、检测对报告基因的诱导(例如PIM-3-应答调控元件可操作地连接有编码可检测标记物如萤光素酶的核酸)，或检测细胞反应，如细胞分化，或细胞增殖。
在本发明多种形式的测定方法中，都希望能固定PIM-3或者它的靶分子使得易于从一种或两种蛋白质的非复合形式中分离出复合形式，并适于自动化测定。在存在或缺乏候选化合物时测试化合物与PIM-3的结合，或PIM-3与靶分子的相互作用能够在任何适于容纳反应物的容器中进行。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供加入了使得一种或两种蛋白质能够结合到基质上的结构域的融合蛋白质。例如谷胱甘肽-S-转移酶/PIM-3融合蛋白质或者谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白质能够被吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠子上或谷胱甘肽衍生的微量滴定板，随后将融合蛋白质与测试化合物结合或者将测试化合物与未被吸附的靶蛋白质或PIM-3蛋白质结合，并且将混合物在易于形成复合体的条件下(如生理条件下的盐浓度和pH值)进行孵育。孵育后，将珠子或微量滴定板进行洗涤以去除任何未结合的成分并且对形成的复合体进行直接或间接地测定。或者，将复合体从基质上分离出来，并用标准技术测定PIM-3结合水平或活性。其他用于将蛋白质固定于基质上的技术也可以用于本发明的筛选测定。例如，利用生物素和链亲和素结合的方法将PIM-3或它的靶分子进行固定。应用本领域公知的技术可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的PIM-3或靶分子。或者，将能够与PIM-3或靶分子反应且不干扰PIM-3蛋白质与其靶分子结合的抗体包被到板子的孔内，并且游离的靶分子或PIM-3通过抗体结合反应被捕获。用于检测这类复合体的方法除了上述的检测GST-固化复合体的方法外，还包括使用能与PIM-3或靶分子反应的抗体对复合体进行的免疫检测，此外还包括依赖于检测与PIM-3或靶分子相关酶活性的酶联测定法。
在另一个实施方案中，用下述方法鉴定出PIM-3表达的调节剂，该方法是将细胞与一种候选化合物相接触并对细胞中PIM-3 mRNA或蛋白质的表达进行测定。将候选化合物存在情况下的PIM-3 mRNA或蛋白质表达水平与不存在候选化合物情况下的PIM-3 mRNA或蛋白质表达水平相比较。然后基于这种比较，可以将作为PIM-3表达调节剂的候选化合物鉴定出来。例如，当PIM-3 mRNA或蛋白质的表达在存在候选化合物时比不存在时更多(统计学意义上的更多)，候选化合物被鉴定为PIM-3 mRNA或蛋白质表达的刺激剂。或者，当PIM-3 mRNA或蛋白质的表达在存在候选化合物时比不存在时更少(统计学意义上的更少)，候选化合物被鉴定为PIM-3 mRNA或蛋白质表达抑制剂。细胞内PIM-3 mRNA或蛋白质表达水平可以通过此处叙述的用于检测PIM-3 mRNA或蛋白质的方法进行测定。
在本发明的另一方面，PIM-3蛋白质或其多肽可以在双杂交或三杂交分析中作为“诱饵蛋白质”，以鉴定能与PIM-3结合或相互作用并调节PIM-3活性的其他蛋白质(“PIM-3-结合蛋白质”或“PIM-3-BP”)。此类PIM-3-结合蛋白质也可能作为诸如PIM-3通路的上游或下游元件参与PIM-3蛋白质的信号传递。本发明还提供了与PIM-3相互作用的蛋白质的用途，这些蛋白质例如与PIM-3双杂交相互作用蛋白质、在双杂交筛选中作为诱饵的蛋白质和鉴定出的PIM-3相互作用蛋白质。PIM-3相互作用蛋白质可能参与PIM-3信号转导途径。
本发明还提供预测医学领域，其中诊断分析、预后分析、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的以预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及到用于测定生物样品(例如来源于个体的血液、血清、细胞、组织，优选地是来源于人的)中PIM-3蛋白质和/或核酸表达及PIM-3活性的诊断分析以决定是否该个体患有与异常PIM-3表达或异常活性相关的疾病或功能失调，或处于发展为功能失调的危险之中。本发明还提供了用于测定是否某个个体正处于发展成为与PIM-3蛋白质、核酸表达或活性相关的功能失调的危险之中的预后(预测)分析。例如，在生物学样本中可分析PIM-3基因的突变。此类分析可以用于预后或预测目的以在以PIM-3蛋白质、核酸表达或活性为特征的失调或与之相关的失调发生之前预防性地治疗个体。
本发明的另一个方面提供了用于测定个体生物样本中PIM-3蛋白质、核酸表达或PIM-3活性的方法从而为该个体选择适当的治疗或预防试剂(此处指“药物基因组学”)。药物基因组学允许根据个体的基因型(例如，检查出的个体基因型以决定该个体对特定试剂的反应能力)选择试剂(例如药物)以治疗性地或预防性地处理个体。
本发明的另一个方面提供了监测在临床试验中试剂(例如药物或其他化合物)对PIM-3表达或活性的影响。
一个用于检测在生物样本中存在或缺乏PIM-3的范例方法包括从受试者中获得生物样本和将生物样本与能够检测PIM-3蛋白质或编码PIM-3蛋白质的核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触以至于能够检测到生物样本中PIM-3的存在。能够用于检测PIM-3 mRNA或基因组DNA的试剂可以是能够与PIM-3 mRNA或基因组DNA进行杂交的经标记核酸探针。
用于检测PIM-3蛋白质的试剂可以是能够与PIM-3蛋白质结合的抗体，优选地是带有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或更加优选地是单克隆抗体。可以使用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。
术语“生物样本”用于包括从个体分离到的组织、细胞和生物液体，还包括存在于个体内的组织、细胞和液体。也就是说本发明中的检测方法可以用于如体外和体内检测生物样本中的PIM-3 mRNA、蛋白质或基因组DNA。在一个实施方案中，生物样本包含来自受试者的蛋白质分子。此外，生物样本可包含来源于受试者的mRNA分子或基因组DNA分子。生物样本为如脂肪组织的活检组织，是用传统方法从受试者分离得到的。
在另一个实施方案中，该类方法还涉及从对照受试者获得对照生物样本、将对照生物样本与能够检测PIM-3蛋白质、mRNA、或基因组DNA的化合物或试剂接触以至于能够检测到生物样本中PIM-3蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在，并将对照样本中PIM-3蛋白质、mRNA、或基因组DNA的存在与测试样本中PIM-3蛋白质、mRNA、或基因组DNA的存在进行比较。
本发明还包括用于检测生物样本(测试样本)中PIM-3存在的试剂盒。此类试剂盒可以用于确定是否该个体正在遭受或即将处于形成胰岛素抗性或II型糖尿病相关失调的危险之中。例如，试剂盒可包含能够检测生物样本中PIM-3蛋白质或mRNA的经标记化合物或试剂和用于确定样本中PIM-3量的工具(例如，抗PIM-3的抗体或能够结合编码PIM-3的DNA，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，的寡核苷酸探针)。
此处所述的方法可进一步被用来作为诊断或预后分析以鉴定受试者已发生或将处于形成异常PIM-3表达或活性相关的疾病或失调之中。例如，此处所述的测定法，正如之前的诊断分析和随后的分析，可以用于鉴定已患有或即将处于形成胰岛素抗性或II型糖尿病的受试者。因此，本发明提供了这样的方法，其中检测了来源于个体的测试样本中的PIM-3蛋白质或核酸(例如mRNA、基因组DNA)，其中PIM-3蛋白质或核酸的存在是用于诊断那些处于或将处于与异常PIM-3表达或活性相关的疾病或失调的个体的。正如此处所使用的，“测试样本”是指从目的受试者获得的生物样本。例如，测试样本可以是生物液(例如血清)、细胞样本或组织。
此外，预后分析可以用于确定是否能够将一种试剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他候选药物)施用于受试者以治疗胰岛素抗性或II型糖尿病。例如，此类方法可以用于确定是否能够用某种特殊试剂或一类试剂(例如降低PIM-3活性型试剂)对受试者进行有效地治疗。
通过筛选测定法鉴定出来的对PIM-3活性(例如PIM-3基因表达)具有刺激或抑制作用的试剂或调节剂可以用于制备治疗(预防性地或治疗性地)与PIM-3活性异常相关的失调(例如涉及表达PIM-3的细胞或组织例如脂肪细胞的失调)的药物。与此类治疗相关，还可考虑到个体的药物基因组学(即研究个体的基因型和该个体对外源性化合物或药物的反应间的关系)。治疗的新陈代谢的不同可能由于改变剂量与药理活性药物在血中的浓度之间的关系从而导致严重的毒性或治疗失败。因此，基于对个体基因型的考虑，个体的药物基因组学允许对预防性或治疗性治疗有效的试剂(例如药物)进行选择。此类药物基因组学能够进一步应用于确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以测定个体的PIM-3蛋白质活性、PIM-3核酸表达或PIM-3基因的突变含量，从而选择适当的用于个体治疗性或预防性治疗的试剂。
监测试剂(例如药物、化合物)对PIM-3活性或表达的影响(例如调节异常细胞增殖和/或分化的能力)不仅能够用于基本药物筛选，还能够用于临床试验。
调节PIM-3蛋白质活性的抗II型糖尿病剂可以是下述试剂，例如小分子(例如调节PIM-3的蛋白激酶活性的小分子)、核酸或蛋白质、天然存在的PIM-3蛋白质的同源配基、肽、或PIM-3肽模拟物。在一个实施方案中，试剂刺激PIM-3蛋白质一种以上生物学活性。此类刺激剂的实例包括刺激一种以上PIM-3活性(例如PIM-3蛋白激酶活性)的小分子、活性PIM-3蛋白质和已经导入细胞内的编码PIM-3的核酸分子。在另一个实施方案中，试剂可抑制PIM-3蛋白质一种以上生物学活性。此类抑制剂的实例包括抑制一种以上PIM-3活性(例如PIM-3蛋白激酶活性)的小分子、反义PIM-3核酸分子和抗PIM-3抗体。
通过以下非限制性解释的实施例对本发明进行进一步阐述。因此本申请中各处引用的全部参考文献、专利和已公布的专利申请的内容在此引用作用参考。
实施例实施例1人和鼠PIM-3核苷酸序列的测定使用BLASTN程序BLOSUM62矩阵，将大鼠PIM-3核苷酸序列(AF057026、NM_022602、SEQUENCE ID NO9)用于查询专有数据库。专有数据库基于构建到标准克隆载体中的专有cDNA文库。将通过BLASTN鉴定出来的最接近的相关cDNA克隆进行测序。这些cDNA序列被组合成为一个重叠群。从这个重叠群的共有序列中鉴定得到人PIM-3序列，对该重叠群的进一步分析揭示其cDNA长度为1977bp。人PIM-3cDNA含有一个978个碱基对的开放阅读框，预测可编码一个新的326个氨基酸的蛋白质。使用BLASTN程序BLOSUM62矩阵，将大鼠PIM-3核苷酸序列也用于查询公开的UNIGENE小鼠数据库。通过BLASTN鉴定出一些密切相关的EST序列。将该EST的序列信息用于筛选利用GeneTrapper II技术构建的小鼠胚胎cDNA文库(Life Technologies，Karlsruhe，德国)。将cDNA克隆进行测序并将cDNA序列组合成为一个重叠群。从这个重叠群的共有序列中鉴定得到鼠PIM-3序列，对该重叠群进一步分析并去除内含子序列后揭示其cDNA序列长度为2236bp。鼠PIM-3 cDNA含有一个978个碱基对的开放阅读框，预测可编码一个新的326个氨基酸的蛋白质。
实施例2人和鼠PIM-3蛋白质的特性在本实施例中，将预测的人PIM-3和鼠PIM-3蛋白质的氨基酸序列与已知的蛋白质中存在的基序和/或结构域相比较并且与已知蛋白质的多肽序列相比较。存在于人PIM-3和鼠PIM-3的多肽结构域和/或基序被鉴定出来表明是与人PIM-3和鼠PIM-3具有显著氨基酸相似性的蛋白质。此外，还预测了人PIM-3和鼠PIM-3蛋白质的分子量。
如上述所鉴定的，人和鼠核苷酸序列(SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.5)编码含326个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6)。人和鼠PIM-3预测的分子量分别约为35.9kDa，不包括翻译后修饰。为了检验预测的激酶活性的证据和可能的翻译后修饰位点，利用蛋白质模式PROSITE数据库，以及IMPALA和PFAM，分别分析了SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的人和鼠的多肽序列。
搜索PROSITE数据库发现序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6氨基酸260-263位置存在一个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点；SEQID NO.2的氨基酸202-205、211-214和321-324位置存在三个酪蛋白激酶II磷酸化位点，而SEQ ID NO.6的氨基酸202-205、211-214、299-302和321-324位置存在四个酪蛋白激酶II磷酸化位点；SEQ ID NO.2和SEQ IDNO6的氨基酸43-48、49-54、52-57、57-62、63-68、80-85、98-103、101-106、295-300和316-321位置存在十个N-十四烷酰化位点；SEQ ID NO.2和SEQID NO.6的氨基酸137-139、275-277和279-281位置存在三个蛋白激酶C磷酸化位点；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸33-40位置存在一个酪氨酸激酶磷酸化位点；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸46-69位置存在一个蛋白激酶特征和构造(ATP结合位点)；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸166-178位置存在一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性部位特征。利用IMPALA搜索发现SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸40-293位置(分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8)存在一个真核的蛋白激酶结构域；分别为分值186比特和期望值8e-49以及分值184比特和期望值4e-48。利用PFAM搜索也发现SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的氨基酸40-293位置存在一个真核的蛋白激酶结构域；分别为分值262，5和E-值5.7e-75以及分值261，1和E-值1.5e-74。
利用blosum作为蛋白质权重矩阵，将人、鼠和大鼠PIM-3多肽序列(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10)排列于成对CLUSTALW排列分析。因此，发现人PIM-3与鼠和大鼠PIM-3(AF057026、NM_022602、SEQ ID NO.10)95％相同，分值为2011，鼠PIM-3和大鼠PIM-3(AF057026、NM_022602、SEQ ID NO.10)99％相同，分值为2074。使用BLASTP程序BLOSUM62矩阵，同样将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的人和鼠PIM-3多肽序列用于查询Swissprot蛋白质序列数据库。此处列出了BLASTP分析鉴定出的四个与人和鼠PIM-3最密切相关的蛋白质发现人和鼠PIM-3与非洲爪蟾(Xenopus laevis)(蛙)PIM-1(Q91822；SEQ ID NO.11)同源性为76％，分值为518，与大鼠PIM-1(P26794；SEQ ID NO.12)同源性为72％，分值为442，与人PIM-1(P11309；SEQID NO.13)同源性为71％，分值为441，与鼠PIM-1(P06803；SEQ ID NO.14)同源性为71％，分值分别为436和438。
实施例3胰岛素抗性和II型糖尿病体内模型中PIM-3基因表达Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠是众所周知的瘦素(leptin)受体fa基因纯合缺陷的动物模型。该大鼠品系产生年龄依赖性胰岛素抗性/高胰岛素血症状态并将发展成典型的II型糖尿病/高血糖症状态。为了鉴定表达受诱导或抑制的基因从而有助于或标记胰岛素抗性或II型糖尿病的形成，利用基于表达谱技术的寡核苷酸阵列对ZDF大鼠和其瘦的杂合对照同窝大鼠的基因表达谱进行收集。
材料和方法6、8和10周龄Zucker糖尿病肥胖(ZDF/Gmi.TM.-fa/fa)雄性大鼠和用作健康对照的瘦雄性fa+/fa-同窝鼠购自Genetic Models有限公司(Indianapolis，IND.，US)。
这些动物用于研究之前，首先在标准动物房环境中饲养一周。引颈法处死动物以采集附睾脂肪组织和血液样本。每一年龄组将6只ZDF大鼠和6只瘦的fa+/fa-同窝鼠用于下面所描述的基因表达分析。
组织采集和分离RNA引颈处死动物后，外科剥离附睾脂肪垫，将其分割成小块并迅速转移至适当的含有足量RNA later(Ambion，TX，US)的管中。分别贮存从每个动物获得的样本。长期贮存的样本优选地置于-80℃。利用Rneasy小量试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，依照制造商推荐的从脂肪组织中分离RNA的方法从脂肪组织中提取细胞总RNA。将RNA分两次洗脱于50μl无RNA酶水中，分光光度法(A260)测定RNA浓度。为了进一步纯化，用无RNA酶水将RNA溶液补足至总体积100μl。根据制造商的指导利用Qiagen公司的Rneasy小量试剂盒对RNA进行纯化。将RNA分两次洗脱于50μl无RNA酶水中，分光光度法(A260)测定RNA浓度。为了浓缩RNA洗脱液，加入醋酸铵和乙醇，将其在乙醇干冰浴中沉淀过夜。4℃最大速度离心收集RNA。用80％乙醇将RNA沉淀洗涤两次，空气干燥并溶于小体积的无RNA酶水中。用分光光度法(A260)测定RNA浓度。
基因表达谱在专利US 6,177,248中已经描述了寡核苷酸阵列在基因表达监测方面的一般用途。在我们实际的应用中，所使用的微点阵含有代表大约8000个已知基因或EST簇的脱氧核苷酸序列。每个基因或EST序列均由不多于20对的寡核苷酸表示，每对包括一个与转录本片段相匹配的寡聚体，和一个含有中央定位的1bp错配的对照寡聚体。Affymetrix，，Santa Clara，CA，US提供了针对大鼠的3个阵列(RG U34A、RG U34B和RG U34C)，代表了来源于已知基因或EST序列数据库的总共大约24000个基因和EST序列。
用于杂交的cRNA制备RNA取自上述的附睾脂肪组织。向细胞总RNA(10μg)+-中加入含有T7启动子位点的oligo dT引物。引物复性后，应用Superscript选择逆转录酶按照制造商的说明书使RNA进行逆转录。利用分相栓凝胶管(Eppendorf，Hamburg，德国)将RNA进行酚∶氯仿∶异戊醇提取和乙醇沉淀后，通过离心收集cDNA并用80％乙醇洗涤两次。将沉淀物溶于无RNA酶的水中，并使用Enzo高效标记转录试剂盒(Enzo Diagnostics，Farmingdale NY，US)或MEGAscript T7高效转录试剂盒(Ambion，Austin，TX，US)，根据制造商的说明书将RNA转录成生物素标记的cRNA。对于以后的应用，生物素标记的UTP和CTP(Sigma，Munich，德国)加上未标记的ATP和GTP以1∶3(标记的∶未标记的)的摩尔比率使用。然后按上述方法沉淀并洗涤cRNA。最后，将沉淀的并经空气干燥的cRNA溶于小体积无RNA酶水中。用分光光度法(A260)测定RNA浓度，大小分布通过琼脂糖凝胶电泳检测。接下来，将cRNA在40mM Tris-醋酸pH8.1、100mM醋酸钾、30mM醋酸镁中94℃孵育25分钟，水解成平均长度为50个核苷酸的片段。按照Affymetrix说明书将20μg片段化cRNA用于制备杂交混合物。杂交前，将RNA样品在杂交混合物中加热至99℃10分钟，置于冰上5分钟，并使其平衡至室温后放于杂交流动池中。然后将杂交混合物与微点阵在杂交炉中45℃60转/分杂交过夜。杂交后，取出杂交混合物并将其贮存于-80℃备用。洗涤微点阵并在Affymetrix射流台利用藻红蛋白-链亲和素-抗体扩增法EukWS2根据制造商说明书将微点阵进行染色。利用由Hewlett Packard为Affymetrix制造的扫描共聚焦显微镜(Affymetrix，Santa Clara，CA，US.出售)收集数据。扫描仪利用氩离子激光器作为激发光源，利用光电倍增管于530nm波长通过的滤光片(荧光素)或560nm长波长通过的滤光片(藻红蛋白)检测发射光。
杂交模式和强度的定量分析阵列定量扫描之后，利用已知的阵列大小将栅格调整至图像并以角点对照区作为标志。利用Affymetrix研发的软件(可与共聚焦扫描仪一起得到)将图像压缩为含有位置和强度信息的简单文本文件。将信息与另一个文本文件合并，该文件中含有与微点阵上探针序列的物理位置以及为其设计寡核苷酸探针的RNA(和RNA的特异部分)的鉴定相关的信息。杂交结果的定量分析包括基于以下假说的模式识别的一种简单形式，即当存在特异RNA时，PM(在专利US 6,177,248中PM指“完全匹配”)探针的杂交平均强于它们的MM(在专利US 6,177,248中MM指“错配”)探针。与每套探针PM/MM比率的对数值的平均值一起计算PM杂交信号大于MM信号的例子的数目。这些数值可用于决定(利用预先定义的决定矩阵)有关RNA的存在或缺乏。为了测定定量RNA的丰度，计算每族探针差异(PM-MM)的平均值。差异法的优点在于来自随机交叉杂交的信号对于PM和MM探针作用通常是相等的，而特异的杂交更有助于PM探针。通过平均成对差异，组成性加入了真实的信号，而去除了交叉杂交的影响。当估计两不同RNA样本之间的差异时，将来自同样合成的微点阵上的平行实验的杂交信号直接进行比较。通过比较掺入试验的结果以及所观察到的以已知的量掺入到每个样本中的内标细菌和噬菌体RNA的信号来解释差异(PM-MM)值的平均值所变化的倍数。由Affymetrix研发的数据分析程序自动执行这些操作。
1.BR2222是溴化丁基橡胶(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)2.EXACTTM4033是含有24wt％1-丁烯衍生单元的乙烯-丁烯共聚物(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)3.EXACTTM8201是含有28wt％1-辛烯衍生单元的乙烯-辛烯共聚物(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)4.FLEXONTM876是链烷油(ExxonMobil Chemical Company，休斯敦，TX)5.树脂SP1068是树脂(酚醛树脂)(Schenectady ChemicalCompany，Schenectady NY)6.MBTS是二硫化2，2’-苯并噻唑(Bayer AG，以商品名VULKACITDM/CTM)表2.本发明SCC实施方案的性能
1.根据聚乙烯晶体的熔融焓计算结晶度。
2.Tm是由DSC得到的峰值熔融温度。
3.熔融指数根据ASTM D1238测量。
这种衍生材料(17)以各种浓度分散于高抗冲聚苯乙烯(HIPS)中。对形成的复合物材料的拉伸强度，拉伸模量以及百分断裂应变数据进行收集。表3是这些实施例的结果。
表3
*3重量％，未官能化的纳米管(SWNT-p)，作比较用。
带有官能化纳米管的聚合物/复合材料的拉伸性能总的来说有明显提高。对于pristine与HIPS聚合物，和对于HPIS与未官能化纳米管的复合材料都有所提高。
聚合再有，包含碳纳米管的聚合物可由能发生聚合或引发聚合的官能团与碳纳米管进行衍生反应而形成。一旦官能团连接上去，就可使用标准聚合技术从官能团原位增长聚合物，即连接到纳米管的官能团可以用作聚合物增长的发生剂。所谓标准聚合技术可以是任何一种已知的标准技术，如自由基、阳离子、阴离子、缩聚作用、开环、易位或开环易位(ROMP)聚合，如果合适的官能团键合到纳米管上。例如，图23就是碳纳米管已+与4-氨基苯基官能团进行衍生反应，随后与苯乙烯进行聚合，从官能团增长聚合物的例子。因此，连至纳米管的官能团成为聚合的化学活性部分，由此产生化学包含纳米管的复合材料。
这里所有公开的组份与方法以及权利要求均根据本发明内容提出，并且无需过分实验就可实施。本文根据较佳实施方式描述了本发明的组份与方法。本领域的技术人员很清楚在不背离本发明的原理、精神和范围条件下，可以对这<p>表5探针号 化合物*浓度处理时间罗格列酮1 1μM6小时(Rosiglitazone)2罗格列酮 5μM6小时曲格列酮3曲格列酮 1μM6小时(troglitazone)4曲格列酮 5μM6小时5DMSO对照 0.02％(v/v) 6小时6罗格列酮 1μM24小时7罗格列酮 5μM24小时8曲格列酮 1μM24小时9曲格列酮 5μM24小时10 DMSO对照 0.02％(v/v) 24小时11 罗格列酮 1μM48小时12 罗格列酮 5μM48小时13 曲格列酮 1μM48小时14 曲格列酮 5μM48小时15 DMSO对照 0.02％(v/v) 48小时*罗格列酮和曲格列酮溶于DMSO配制成5mM和25mM的贮存液并用培养基稀释5000倍至终浓度(1μM/5μM)。作为对照，不含化合物的DMSO也同样稀释5000倍至终浓度0.02％(v/v)。
利用TRIzoL试剂(Life Technologies，Karlsruhe，德国)分离RNA并应用无DNA试剂盒(Ambion，Austin，TX，US)用DNA酶I处理RNA。利用RNeasy小量试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进一步纯化RNA并用2100生物分析器(Agilent，Bblingen，德国)进行质量/数量控制。按照GeneChip表达分析技术手册(Affymetrix，Santa Clara，CA，US)将10μg总RNA转换成生物素标记的cRNA。简而言之，应用SuperScript双链cDNA合成试剂盒(Life Technologies，Karlsruhe，德国)进行第一链和第二链的合成，并且用BioArray RNA转录标记试剂盒(EnzoDiagnostics，Framingdale，NY，US)制备生物素标记的cRNA。加热使10μg cRNA片段化，加入到GeneChip真核杂交对照溶液(Affymetrix)中并于45℃旋转16小时与GeneChip MG-U74Av2阵列杂交。使用Affymetrix提供的硬件按标准操作对阵列进行洗涤、染色和扫描。应用微点阵配套的版本4.0.1软件(Affymetrix，见上)分析原始数据。全部实验重复两次以提供三个生物学复制本。
数据分析按如上所述的方法进行数据分析，包括估价变化倍数在内。通过比较每个时间点化合物处理的样本及未处理的对照可以得到PIM-3倍数变化值。使用了Affymetrix定量器96841 AT。结果归纳于表6a)-c)。
表6a)
表b)
表c)
“Rosi”代表“罗格列酮”，“Tro”代表“曲格列酮”。
实施例6用抗糖尿病药物(PPARγ激动剂)处理的ZDF大鼠Pim-3基因表达雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF/Gmi.TM.-fa/fa)大鼠和它们fa+/fa-瘦的相应大鼠，5周龄(对照1-5，ZDF 1-10)购自Genetic Models有限公司(Indian apolis，Ind.)。大鼠自由摄取食物和水。将ZDF大鼠分成两组组1(动物ZDF 1-5)不用任何试剂处理，而第二组用抗糖尿病药物罗格列酮(3mg/kg/天，动物6-10，Rosi 1-5)处理14周。为了收集附睾脂肪垫和血液样本，用引颈法处死各种实验条件下5只动物。为了监测抗糖尿病处理是否成功，试验完成之后按标准方法测定HbA1c，HbA1c可作为长期血糖水平的标志。这些测定的结果归纳于表7表7
按试验1中所述的方法进行附睾脂肪组织收集、RNA分离和Affymetrix实验。数据分析包括来源于瘦的对照动物样本与未处理ZDF大鼠的表达数据的比较以及来源于罗格列酮处理动物与非处理ZDF动物的表达数据的比较。使用由Aventis制药公司研发的有专利权的软件进行数据分析，包括变化倍数的估计和这些变化倍数统计学意义的衡量。使用Affime trix定量器AF086624_S_AT分析PIM-3基因表达的变化倍数。那些分析结果归纳于下面的表8a和8b表8a
表8b
序列表<110>安万特医药德国有限公司<120>作为II型糖尿病靶标的PIM-3激酶<130>DEAV2002/0004<140>02001401.5<141>2002-01-19<160>14<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1973<212>DNA<213>人<400>1gagggccgtc gcccgcgatg ctgctctcca agttcggctc cctggcgcac ctctgcgggc60ccggcggcgt ggaccacctc ccggtgaaga tcctgcagcc agccaaggcg gacaaggaga120gcttcgagaa ggcgtaccag gtgggcgccg tgctgggtag cggcggcttc ggcacggtct180acgcgggtag ccgcatcgcc gacgggctcc cggtggctgt gaagcacgtg gtgaaggagc240gggtgaccga gtggggcagc ctgggcggcg cgaccgtgcc cctggaggtg gtgctgctgc300gcaaggtggg cgcggcgggc ggcgcgcgcg gcgtcatccg cctgctggac tggttcgagc360ggcccgacgg cttcctgctg gtgctggagc ggcccgagcc ggcgcaggac ctcttcgact420ttatcacgga gcgcggcgcc ctggacgagc cgctggcgcg ccgcttcttc gcgcaggtgc480tggccgccgt gcgccactgc cacagctgcg gggtcgtgca ccgcgacatt aaggacgaaa540atctgcttgt ggacctgcgc tccggagagc tcaagctcat cgacttcggt tcgggtgcgc600tgctcaagga cacggtctac accgacttcg acggcacccg agtgtacagc cccccggagt660ggatccgcta ccaccgctac cacgggcgct cggccaccgt gtggtcgctg ggcgtgcttc720tctacgatat ggtgtgtggg gacatcccct tcgagcagga cgaggagatc ctccgaggcc780gcctgctctt ccggaggagg gtctctccag agtgccagca gctgatccgg tggtgcctgt840ccctgcggcc ctcagagcgg ccgtcgctgg atcagattgc ggcccatccc tggatgctgg900gggctgacgg gggcgccccg gagagctgtg acctgcggct gtgcaccctc gaccctgatg960acgtggccag caccacgtcc agcagcgaga gcttgtgagg agctgcacct gactgggagc1020taggggacca cctgccttgg ccagacctgg gacgccccca gaccctgact ttttcctgcg1080tgggccgtct cctcctgcgg aagcagtgac ctctgacccc tggtgacctt cgctttgagt1140gccttttgaa cgctggtccc gcgggacttg gttttctcaa gctctgtctg tccaaagacg1200ctccggtcga ggtcccgcct gccctgggtg gatacttgaa ccccagacgc ccctctgtgc1260tgctgtgtcc ggaggcggcc ttcccatctg cctgcccacc cggagctctt tccgccggcg1320
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130 135 140Pro Leu Ala Arg Arg Phe Phe Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His145 150 155 160Cys His Ser Cys Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu165 170 175Leu Val Asp Leu Arg Ser Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser180 185 190Gly Ala Leu Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg195 200 205Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg210 215 220Ser Ala Thr Val Trp Ser Leu Gly Val Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys225 230 235 240Gly Asp Ile Pro Phe Glu Gln Asp Glu Glu Ile Leu Arg Gly Arg Leu245 250 255Leu Phe Arg Arg Arg Val Ser Pro Glu Cys Gln Gln Leu Ile Arg Trp260 265 270Cys Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Arg Pro Ser Leu Asp Gln Ile Ala275 280 285Ala His Pro Trp Met Leu Gly Ala Asp Gly Gly Ala Pro Glu Ser Cys290 295 300Asp Leu Arg Leu Cys Thr Leu Asp Pro Asp Asp Val Ala Ser Thr Thr305 310 315 320Ser Ser Ser Glu Ser Leu325<210>3<211>978<212>DNA<213>人
<400>3atgctgctct ccaagttcgg ctccctggcg cacctctgcg ggcccggcgg cgtggaccac60ctcccggtga agatcctgca gccagccaag gcggacaagg agagcttcga gaaggcgtac120caggtgggcg ccgtgctggg tagcggcggc ttcggcacgg tctacgcggg tagccgcatc180gccgacgggc tcccggtggc tgtgaagcac gtggtgaagg agcgggtgac cgagtggggc240agcctgggcg gcgcgaccgt gcccctggag gtggtgctgc tgcgcaaggt gggcgcggcg300ggcggcgcgc gcggcgtcat ccgcctgctg gactggttcg agcggcccga cggcttcctg360ctggtgctgg agcggcccga gccggcgcag gacctcttcg actttatcac ggagcgcggc420gccctggacg agccgctggc gcgccgcttc ttcgcgcagg tgctggccgc cgtgcgccac480tgccacagct gcggggtcgt gcaccgcgac attaaggacg aaaatctgct tgtggacctg540cgctccggag agctcaagct catcgacttc ggttcgggtg cgctgctcaa ggacacggtc600tacaccgact tcgacggcac ccgagtgtac agccccccgg agtggatccg ctaccaccgc660taccacgggc gctcggccac cgtgtggtcg ctgggcgtgc ttctctacga tatggtgtgt720ggggacatcc ccttcgagca ggacgaggag atcctccgag gccgcctgct cttccggagg780agggtctctc cagagtgcca gcagctgatc cggtggtgcc tgtccctgcg gccctcagag840cggccgtcgc tggatcagat tgcggcccat ccctggatgc tgggggctga cgggggcgcc900ccggagagct gtgacctgcg gctgtgcacc ctcgaccctg atgacgtggc cagcaccacg960tccagcagcg agagcttg 978<210>4<211>254<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述真核生物的蛋白激酶结构域<400>4Tyr Gln Val Gly Ala Val Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr1 5 10 15Ala Gly Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu Pro Val Ala Val Lys His Val20 25 30Val Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly Ser Leu Gly Gly Ala Thr Val35 40 45Pro Leu Glu Val Val Leu Leu Arg Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala50 55 60Arg Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe65 70 75 80
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<210>8<211>254<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述真核生物的蛋白激酶结构域<400>8Tyr Gln Val Gly Ala Val Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr1 5 10 15Ala Gly Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu Pro Val Ala Val Lys His Val20 25 30Val Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly Ser Leu Gly Gly Val Ala Val35 40 45Pro Leu Glu Val Val Leu Leu Arg Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala50 55 60Arg Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe65 70 75 80Leu Leu Val Leu Glu Arg Pro Glu Pro Ala Gln Asp Leu Phe Asp Phe85 90 95Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Asp Glu Pro Leu Ala Arg Arg Phe Phe100 105 110Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His Cys His Asn Cys Gly Val Val115 120 125His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu Leu Val Asp Leu Arg Ser Gly130 135 140Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Val Leu Lys Asp Thr145 150 155 160Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp165 170 175
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<210>11<211>323<212>PRT<213>非洲爪蟾(Xenopus laevis)<400>11Met Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ser Leu Ala His Ile Cys Asn Pro Ser1 5 10 15Asn Met Glu His Leu Pro Val Lys Ile Leu Gln Pro Val Lys Val Asp20 25 30Lys Glu Pro Phe Glu Lys Val Tyr Gln Val Gly Ser Val Val Ala Ser35 40 45Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr Ser Asp Ser Arg Ile Ala Asp Gly Gln50 55 60Pro Val Ala Val Lys His Val Ala Lys Glu Arg Val Thr Glu Trp Gly65 70 75 80Thr Leu Asn Gly Val Met Val Pro Leu Glu Ile Val Leu Leu Lys Lys85 90 95Val Pro Thr Ala Phe Arg Gly Val Ile Asn Leu Leu Asp Trp Tyr Glu100 105 110Arg Pro Asp Ala Phe Leu Ile Val Met Glu Arg Pro Glu Pro Val Lys115 120 125Asp Leu Phe Asp Tyr Ile Thr Glu Lys Gly Pro Leu Asp Glu Asp Thr130 135 140Ala Arg Gly Phe Phe Arg Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys Tyr145 150 155 160Asn Cys Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Ash Leu Leu Val165 170 175Asp Thr Arg Asn Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala180 185 190Leu Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr195 200 205
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Leu Arg Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Glu Glu Ile Arg Asn His Pro275 280 285Trp Met Gln Gly Asp Leu Leu Pro Gln Ala Ala Ser Glu Ile His Leu290 295 300His Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Lys305 310
权利要求
1.包含核苷酸序列SEQ ID.NO.1的分离的核酸分子。
2.包含核苷酸序列SEQ ID.NO.3的分离的核酸分子。
3.分离的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列a)SEQ ID NO.5，b)SEQ ID NO.7，c)与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7杂交的DNA序列，以及d)由a)、b)和c)中定义序列的遗传密码简并产生的并编码PIM-3型多肽的DNA序列。
4.宿主细胞，其包含上述权利要求之一中所述的核酸分子。
5.具有PIM-3活性的多肽，所述多肽选自a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.6的多肽，b)a)中缺失一个或多个氨基酸而产生的多肽，c)a)中的一个或多个氨基酸被不同氨基酸替换而产生的多肽，d)a)的序列中添加了一个或多个氨基酸而产生的多肽，e)包含的氨基酸序列含有序列SEQ ID NO.6的全部或部分氨基酸的融合多肽。
6.PIM-3的用途，用作鉴定抗II型糖尿病药物的筛选剂。
7.如权利要求6所述的用途，其中使用了编码PIM-3的DNA。
8.如权利要求6所述的用途，其中使用了具有PIM-3活性的多肽。
9.PIM-3的用途，用于制备治疗胰岛素抗性或II型糖尿病的药物。
10.鉴定抗糖尿病化合物的方法，其中将PIM-3与待测试的化合物孵育并测定PIM-3活性的改变。
全文摘要
本发明涉及分离的核酸分子和包含此类核酸分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及具有PIM－3活性和确定氨基酸序列的多肽，以及PIM－3作为鉴定抗II型糖尿病药物的筛选剂的用途和用于制备治疗胰岛素抗性或II型糖尿病的药物的用途。
文档编号A61P5/00GK1620505SQ03802433
公开日2005年5月25日 申请日期2003年1月20日 优先权日2002年1月19日
发明者M·科恩, G·米勒, R·施奈德, G·钱克 申请人:安万特医药德国有限公司
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