新的血红蛋白聚合剂的制作方法
专利名称：新的血红蛋白聚合剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及血红蛋白聚合剂、它们的应用以及用聚合血红蛋白制造血液替代品。
由于外科和野战外科学的发展，输血医学已成为综合性学科，但血液的质和量已不能满足需要。输血主要存在的问题是1．血液的安全性由于目前的检测技术仍不能完全检出血液中的病毒，因此不能避免丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)、庚肝病毒(HGV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、单纯疱疹病毒(CMV,EB)、细小病毒B19等所致的血源性疾病的感染和传播；2．血型不合的风险；3．血源紧张；4．目前血液消毒、保存和运输不能满足野战输血的需要。战时输血要求急、数量大，往往难以找到合适的血液配型，以至于失血性休克成为战场死亡的主要原因。在现代战争中，伤后4小时失血致死的人数占伤员死亡总数的50％。因此，安全有效的血液替代品研究已成为当今世界的热门课题之一。血液替代品研究的目标是获得具有携氧、释氧、维持血容量及电解质平衡能力，无病原微生物污染、无致热原、无免疫原性、贮存期长、来源充足的血容量扩充剂，作以下几方面的应用1．出血性休克的复苏；2．特定的围手术期血液稀释；3．在红细胞血型不合时替代输血；4．冠脉成形术中的灌注液；5．离体器官的保存；5．增强肿瘤放疗的疗效。
血液替代品研究迄今已有近百年的历史，目前世界各国的政府、军方及大型医药公司竞相增加此项目的投资，取得了大量有价值的研究成果。其研究方向主要有两个氟碳化合物和血红蛋白(Hb)制品。氟碳化合物通过对氧的高溶解度而发挥作用，能有效地携氧释氧、维持血容量和电解质平衡。氟碳化合物的保存条件特殊、在使用前必须乳化、在空气中溶氧量不足和要求吸入高浓度的氧等，是其在应用中的不便利之处。单核巨噬细胞系统吞噬大量的乳化颗粒引起功能阻断等毒副作用是目前难以克服的困难，阻碍了其进一步应用。目前国外正开发新一代的氟碳化合物。
由于Hb具有独特的氧结合特性和正常的生理代谢途径，因此Hb类血液替代品比氟碳化合物更符合人体生理需要。而且Hb来源广泛，可以从过期的库血和牛血中提取。但是，天然的无红细胞基质的人Hb(SFHb)溶液不能直接作为血液替代品使用，这是因为1．失去红细胞内2,3-DPG调节，Hb氧亲和力升高，不能向组织有效供氧。2．Hb在血浆中胶体渗透压高，并迅速从其在红细胞内的α2β2四聚体形式解聚为αβ二聚体，从肾滤过而产生强烈肾毒性，在循环中的半寿期仅为2-4小时。3．失去胞内还原酶系统调节，Hb易氧化成高铁血红蛋白(MetHb)，失去携氧能力并产生自由基。所有以Hb为基础的血液替代品的研究都集中于降低Hb的氧亲和力、稳定α2β2四聚体结构和延长其循环半寿期，通常采用化学修饰、交联、聚合和脂质体包封等方法来达到此目的。
虽然人们通常采用人Hb作为血液替代品的原料，但人Hb有来源有限及病原体污染等缺点。1983年，Feola等发现牛Hb在输入其它种属的动物体内后不会导致抗体的迅速产生，随后一些研究者探讨了用牛Hb作为人血液替代品的原料的可能性。
牛Hb的基本结构也是α2β2四聚体，但由于其NA1(1)β缺失，NA2(2)β为Met〖人的NA1(1)β为Val,NA2(2)β为His〗，不能与2,3-DPG形成盐桥，故不受2,3-DPG调节。β亚基的亲水性N端趋向分子内亲水区，带动A螺旋向分子内移动，从而使牛Hb趋向于紧张态(T态)。另一方面，在从松弛态(R态)向T态的构象转变中，由于R态结合O2导致牛Hb中央裂隙变宽，有利于Cl-内流，中和了裂隙中的正电荷，使裂隙变窄，促进O2的释放从而转变为T态。牛Hb在生理条件的Cl-浓度下，具有比人Hb(P50=26mmHg)更低的氧亲和力(P50=31.6mmHg)，因而更容易向组织供氧。另一方面，由于牛Hb的氧亲和力受Cl-调节，故在对牛Hb进行化学修饰后即可保持较正常的氧亲和力，而不用象人Hb一样需再加入共价调节剂，所以，用牛Hb作为血液替代品的原料可简化制备工艺。
将Hb聚合是血液替代品研究的重要途径之一。长期以来，人们一直在寻找合适的聚合剂，以便能稳定α2β2(64KD)四聚体并产生α2β2的寡聚体(∠500KD)。稳定四聚体结构可阻止Hb裂解为αβ二聚体从而防止肾损伤。α2β2的血浆半寿期只有2-4h，形成寡聚体则可将半寿期延长至25-46h并可降低胶体渗透压和粘度。通常使用的聚合剂是戊二醛，已有数种聚合的Hb产品进入了临床试验，其中包括Biopure公司制备的polyHb。但在对戊二醛聚合的Hb进行大量研究后发现1．聚合反应不易控制；2．性质不稳定，保存两个月后，凝胶过滤的洗脱曲线即发生变化；3．进入体内后会发生逆反应，由此生成的醛基有很大的毒性等。因此，需要研究新的聚合剂。
1983年，Acharya报道用乙醇醛成功聚合了RNase，随后又有报道用乙醇醛可聚合羟甲基Hb和天然人Hb。乙醇醛聚合的人Hb比戊二醛聚合的稳定，在动物体内不会发生逆反应。但未见有关乙醇醛聚合的人Hb的进一步研究报道。
研究还发现，对现有的戊二醛和乙醇醛等聚合剂而言，它们的聚合反应程度是很难控制的，在反应时间延长和/或聚合剂量增加的时候，聚合程度会持续增加，从而形成聚合程度很大的聚合Hb，最终使Hb的聚合反应体系凝胶化。
多年以来，血液替代品研究者们在如何才能恰当地、更好地对Hb进行修饰这条路上艰难跋涉。若聚合反应进行得不充分，就意味着原材料的浪费和成本过高；若聚合程度过高，则不仅引起Hb结构和功能改变，还可由于这些改变在体内引起复杂的病理生理过程。要将聚合控制在一定程度是非常困难的，因为聚合必然要用双功能或多功能交联剂，这些交联剂的活性基团随机地与Hb表面的氨基发生亲核加成反应，使聚合持续进行。在目前已知的交联剂中，最成功的是BAXTER公司的双阿斯匹林，由于它是聚阴离子，可特异地与Hb亚基界面之间的正电荷区域结合，因此成功实现了定位交联，但此反应只发生在分子内。这种只有分子内交联的Hb分子虽然不再从肾滤出，但其血浆半寿期只为4h左右，不足以持续地向机体供氧。增加Hb的分子量可有效延长其循环半寿期，但聚合反应的难以控制使人们在这一方向的研究进展缓慢。
对血液替代品的基本要求是应该具有与血液相类似的携氧供氧能力，这需要polyHb具有适当的氧亲和力。聚合反应往往导致Hb氧亲和力的升高，使其失去在组织中的氧分压下释氧的能力，因此对聚合产物的氧亲和力的评价是血液替代品研究中首要而又关键的一个环节。
为了探索新的聚合途径，本发明从聚合反应动力学和热力学入手，在降低双功能交联剂单基团亲电性的同时，引入空间位阻，从而显著提高了聚合反应的能垒、降低了聚合反应的速度，反应体系的凝胶化被完全抑制，大分子聚合物的形成被降到很低的水平，产物以低聚态的Hb为主，基本实现了Hb聚合反应的可控制。同时，反应产物的氧亲和力保持在与血液接近的很合适的水平。丙酮醛及其结构类似物这一类新聚合剂的提出，在国际上处于领先水平。
本发明的化合物作为血红蛋白聚合剂具有如下结构。 其中R’代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基。
R代表 或 或 A代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基，n为1至7的阿拉伯数字。
这些化合物包括丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羟基-2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
用本发明的化合物将天然牛或人血红蛋白进行适当化学修饰后，即可制成有适当氧亲和力(P50为28-34mmHg)的大分子聚合血红蛋白，将其溶于溶液中(此溶液所含的电解质和pH值与血浆近似)即可制成血液替代品。
本发明的化合物作为血红蛋白聚合剂制备聚合血红蛋白的方法，包括用式(Ⅰ)化合物与人或牛的血红蛋白反应。
本发明化合物可聚合血红蛋白以用来制备血液替代品。
本发明的血液替代品的制备方法，包括将聚合血红蛋白溶解于电解质和pH值与血浆近似的溶液，此溶液含有还原型谷胱甘肽(GSH)或其他巯基(-SH)供体。
通过下面的反应可将牛或人的血红蛋白进行化学修饰。化学修饰包括在牛或人血红蛋白分子内的不同亚基间形成分子内交联，同时也在不同的血红蛋白分子间形成分子间聚合。1)反应类型之一 R、R″可为H或烷基，R′可为-(CH2)n-，或可缺省。2)反应类型之二 R、R’可为H或烷基上述两类反应所用的聚合剂为反应类型1为在烷链上有两个羰基(-CO-)的本发明化合物。
反应类型2为在烷链上有一个羰基(-CO-)，在其邻位的碳原子上有一个羟基的化合物本发明化合物。
本发明通过以下实施例来描述本发明的化合物，应用，制备以及血液替代品的制备、组成。
实施例1用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入36ml脱气的10％丙酮醛(Pyruvic aldehyde)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例2用2,3-丁二酮(2,3-Butanecdione,CH3COCOCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入43ml脱气的10％2,3-Butanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实旄例3用1-羟基-2-T酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％1-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例4用3-羟基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％3-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例5用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,3-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实旋例6用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,4-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例7用2,5-己二酮(2,5-Hexanedione,CH3COCH2CH2COCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,5-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例8用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入64ml脱气的10％3-ethyl-2,4-pentanedion贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例9用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入71ml脱气的10％6-methyl-2,4-heptanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例10用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入37ml脱气的10％丙酮醇(Aceto1)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实旌例11用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入36ml脱气的10％丙酮醛(Pymvic aldehyde)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例12用2,3-丁二酮(2,3-Butanedione,CH3COCOCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入43ml脱气的10％2,3-Butanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例13用1-羟基-2-丁酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％1-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例14用3-羟基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％3-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例15用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,3-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例16用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,4-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例17用2,5-己二酮(2,5-Hexanedi one,CH3COCH2CH2COCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,5-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例18用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入64ml脱气的10％3-ethyl-2,4-pentanedion贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例19用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入71ml脱气的10％6-methyl-2,4-heptanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例20用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入37ml脱气的10％丙酮醇(Acetol)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
上述各实施例中，聚合剂与人或牛血红蛋白的分子数之比为21.3∶1，此比例变化时聚合反应仍可进行。
保护上述各聚合剂与人血红蛋白和牛血红蛋白的聚合反应。
这些聚合反应的产物可作以下几方面的应用1．出血性休克的复苏；2．特定的围手术期血液稀释；3．在红细胞血型不合时替代输血；4．冠脉成形术中的灌注液；5．离体器官的保存；5．增强肿瘤放疗的疗效。
本发明的血液替代品的实例如下(注PolyHb为聚合牛Hb或聚合人Hb)
权利要求
1．式(Ⅰ)化合物作为血红蛋白聚合剂的应用。 其中R’代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基。R代表 或 或 A代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基，n为1至7的阿拉伯数字。
2．权利要求1中的化合物是丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羟基-2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
3．用权利要求1中的化合物作为血红蛋白聚合剂制备聚合血红蛋白的方法，其特征是用式(Ⅰ)化合物与人或牛的血红蛋白反应。
4．用权利要求3中的聚合血红蛋白制备血液替代品。
5．权利要求4中用聚合血红蛋白制备出的血液替代品。
6．权利要求5中的血液替代品的制备方法，其特征在于将聚合血红蛋白溶解于电解质和pH值与血浆近似的溶液，此溶液含有还原型谷胱甘肽(GSH)或其他巯基(-SH)供体。
全文摘要
本发明公开了新的血红蛋白(Hb)聚合剂,他们的制备及应用,本发明的Hb聚合剂显著提高了聚合反应的能垒、降低了聚合反应的速度,反应体系的凝胶化基本被完全抑制,大分子聚合物的形成被降到很低的水平,产物以低聚态的聚合Hb为主,基本实现了Hb聚合反应的可控制。
文档编号A61K38/42GK1306858SQ0010064
公开日2001年8月8日 申请日期2000年1月25日 优先权日2000年1月25日
发明者王鹤尧 申请人:王鹤尧
技术领域：
本发明涉及血红蛋白聚合剂、它们的应用以及用聚合血红蛋白制造血液替代品。
由于外科和野战外科学的发展，输血医学已成为综合性学科，但血液的质和量已不能满足需要。输血主要存在的问题是1．血液的安全性由于目前的检测技术仍不能完全检出血液中的病毒，因此不能避免丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)、庚肝病毒(HGV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、单纯疱疹病毒(CMV,EB)、细小病毒B19等所致的血源性疾病的感染和传播；2．血型不合的风险；3．血源紧张；4．目前血液消毒、保存和运输不能满足野战输血的需要。战时输血要求急、数量大，往往难以找到合适的血液配型，以至于失血性休克成为战场死亡的主要原因。在现代战争中，伤后4小时失血致死的人数占伤员死亡总数的50％。因此，安全有效的血液替代品研究已成为当今世界的热门课题之一。血液替代品研究的目标是获得具有携氧、释氧、维持血容量及电解质平衡能力，无病原微生物污染、无致热原、无免疫原性、贮存期长、来源充足的血容量扩充剂，作以下几方面的应用1．出血性休克的复苏；2．特定的围手术期血液稀释；3．在红细胞血型不合时替代输血；4．冠脉成形术中的灌注液；5．离体器官的保存；5．增强肿瘤放疗的疗效。
血液替代品研究迄今已有近百年的历史，目前世界各国的政府、军方及大型医药公司竞相增加此项目的投资，取得了大量有价值的研究成果。其研究方向主要有两个氟碳化合物和血红蛋白(Hb)制品。氟碳化合物通过对氧的高溶解度而发挥作用，能有效地携氧释氧、维持血容量和电解质平衡。氟碳化合物的保存条件特殊、在使用前必须乳化、在空气中溶氧量不足和要求吸入高浓度的氧等，是其在应用中的不便利之处。单核巨噬细胞系统吞噬大量的乳化颗粒引起功能阻断等毒副作用是目前难以克服的困难，阻碍了其进一步应用。目前国外正开发新一代的氟碳化合物。
由于Hb具有独特的氧结合特性和正常的生理代谢途径，因此Hb类血液替代品比氟碳化合物更符合人体生理需要。而且Hb来源广泛，可以从过期的库血和牛血中提取。但是，天然的无红细胞基质的人Hb(SFHb)溶液不能直接作为血液替代品使用，这是因为1．失去红细胞内2,3-DPG调节，Hb氧亲和力升高，不能向组织有效供氧。2．Hb在血浆中胶体渗透压高，并迅速从其在红细胞内的α2β2四聚体形式解聚为αβ二聚体，从肾滤过而产生强烈肾毒性，在循环中的半寿期仅为2-4小时。3．失去胞内还原酶系统调节，Hb易氧化成高铁血红蛋白(MetHb)，失去携氧能力并产生自由基。所有以Hb为基础的血液替代品的研究都集中于降低Hb的氧亲和力、稳定α2β2四聚体结构和延长其循环半寿期，通常采用化学修饰、交联、聚合和脂质体包封等方法来达到此目的。
虽然人们通常采用人Hb作为血液替代品的原料，但人Hb有来源有限及病原体污染等缺点。1983年，Feola等发现牛Hb在输入其它种属的动物体内后不会导致抗体的迅速产生，随后一些研究者探讨了用牛Hb作为人血液替代品的原料的可能性。
牛Hb的基本结构也是α2β2四聚体，但由于其NA1(1)β缺失，NA2(2)β为Met〖人的NA1(1)β为Val,NA2(2)β为His〗，不能与2,3-DPG形成盐桥，故不受2,3-DPG调节。β亚基的亲水性N端趋向分子内亲水区，带动A螺旋向分子内移动，从而使牛Hb趋向于紧张态(T态)。另一方面，在从松弛态(R态)向T态的构象转变中，由于R态结合O2导致牛Hb中央裂隙变宽，有利于Cl-内流，中和了裂隙中的正电荷，使裂隙变窄，促进O2的释放从而转变为T态。牛Hb在生理条件的Cl-浓度下，具有比人Hb(P50=26mmHg)更低的氧亲和力(P50=31.6mmHg)，因而更容易向组织供氧。另一方面，由于牛Hb的氧亲和力受Cl-调节，故在对牛Hb进行化学修饰后即可保持较正常的氧亲和力，而不用象人Hb一样需再加入共价调节剂，所以，用牛Hb作为血液替代品的原料可简化制备工艺。
将Hb聚合是血液替代品研究的重要途径之一。长期以来，人们一直在寻找合适的聚合剂，以便能稳定α2β2(64KD)四聚体并产生α2β2的寡聚体(∠500KD)。稳定四聚体结构可阻止Hb裂解为αβ二聚体从而防止肾损伤。α2β2的血浆半寿期只有2-4h，形成寡聚体则可将半寿期延长至25-46h并可降低胶体渗透压和粘度。通常使用的聚合剂是戊二醛，已有数种聚合的Hb产品进入了临床试验，其中包括Biopure公司制备的polyHb。但在对戊二醛聚合的Hb进行大量研究后发现1．聚合反应不易控制；2．性质不稳定，保存两个月后，凝胶过滤的洗脱曲线即发生变化；3．进入体内后会发生逆反应，由此生成的醛基有很大的毒性等。因此，需要研究新的聚合剂。
1983年，Acharya报道用乙醇醛成功聚合了RNase，随后又有报道用乙醇醛可聚合羟甲基Hb和天然人Hb。乙醇醛聚合的人Hb比戊二醛聚合的稳定，在动物体内不会发生逆反应。但未见有关乙醇醛聚合的人Hb的进一步研究报道。
研究还发现，对现有的戊二醛和乙醇醛等聚合剂而言，它们的聚合反应程度是很难控制的，在反应时间延长和/或聚合剂量增加的时候，聚合程度会持续增加，从而形成聚合程度很大的聚合Hb，最终使Hb的聚合反应体系凝胶化。
多年以来，血液替代品研究者们在如何才能恰当地、更好地对Hb进行修饰这条路上艰难跋涉。若聚合反应进行得不充分，就意味着原材料的浪费和成本过高；若聚合程度过高，则不仅引起Hb结构和功能改变，还可由于这些改变在体内引起复杂的病理生理过程。要将聚合控制在一定程度是非常困难的，因为聚合必然要用双功能或多功能交联剂，这些交联剂的活性基团随机地与Hb表面的氨基发生亲核加成反应，使聚合持续进行。在目前已知的交联剂中，最成功的是BAXTER公司的双阿斯匹林，由于它是聚阴离子，可特异地与Hb亚基界面之间的正电荷区域结合，因此成功实现了定位交联，但此反应只发生在分子内。这种只有分子内交联的Hb分子虽然不再从肾滤出，但其血浆半寿期只为4h左右，不足以持续地向机体供氧。增加Hb的分子量可有效延长其循环半寿期，但聚合反应的难以控制使人们在这一方向的研究进展缓慢。
对血液替代品的基本要求是应该具有与血液相类似的携氧供氧能力，这需要polyHb具有适当的氧亲和力。聚合反应往往导致Hb氧亲和力的升高，使其失去在组织中的氧分压下释氧的能力，因此对聚合产物的氧亲和力的评价是血液替代品研究中首要而又关键的一个环节。
为了探索新的聚合途径，本发明从聚合反应动力学和热力学入手，在降低双功能交联剂单基团亲电性的同时，引入空间位阻，从而显著提高了聚合反应的能垒、降低了聚合反应的速度，反应体系的凝胶化被完全抑制，大分子聚合物的形成被降到很低的水平，产物以低聚态的Hb为主，基本实现了Hb聚合反应的可控制。同时，反应产物的氧亲和力保持在与血液接近的很合适的水平。丙酮醛及其结构类似物这一类新聚合剂的提出，在国际上处于领先水平。
本发明的化合物作为血红蛋白聚合剂具有如下结构。 其中R’代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基。
R代表 或 或 A代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基，n为1至7的阿拉伯数字。
这些化合物包括丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羟基-2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
用本发明的化合物将天然牛或人血红蛋白进行适当化学修饰后，即可制成有适当氧亲和力(P50为28-34mmHg)的大分子聚合血红蛋白，将其溶于溶液中(此溶液所含的电解质和pH值与血浆近似)即可制成血液替代品。
本发明的化合物作为血红蛋白聚合剂制备聚合血红蛋白的方法，包括用式(Ⅰ)化合物与人或牛的血红蛋白反应。
本发明化合物可聚合血红蛋白以用来制备血液替代品。
本发明的血液替代品的制备方法，包括将聚合血红蛋白溶解于电解质和pH值与血浆近似的溶液，此溶液含有还原型谷胱甘肽(GSH)或其他巯基(-SH)供体。
通过下面的反应可将牛或人的血红蛋白进行化学修饰。化学修饰包括在牛或人血红蛋白分子内的不同亚基间形成分子内交联，同时也在不同的血红蛋白分子间形成分子间聚合。1)反应类型之一 R、R″可为H或烷基，R′可为-(CH2)n-，或可缺省。2)反应类型之二 R、R’可为H或烷基上述两类反应所用的聚合剂为反应类型1为在烷链上有两个羰基(-CO-)的本发明化合物。
反应类型2为在烷链上有一个羰基(-CO-)，在其邻位的碳原子上有一个羟基的化合物本发明化合物。
本发明通过以下实施例来描述本发明的化合物，应用，制备以及血液替代品的制备、组成。
实施例1用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入36ml脱气的10％丙酮醛(Pyruvic aldehyde)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例2用2,3-丁二酮(2,3-Butanecdione,CH3COCOCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入43ml脱气的10％2,3-Butanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实旄例3用1-羟基-2-T酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％1-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例4用3-羟基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％3-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例5用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,3-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实旋例6用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,4-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例7用2,5-己二酮(2,5-Hexanedione,CH3COCH2CH2COCH3)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,5-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例8用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入64ml脱气的10％3-ethyl-2,4-pentanedion贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例9用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入71ml脱气的10％6-methyl-2,4-heptanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实施例10用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合牛血红蛋白将1L 15％的纯净牛血红蛋白(牛Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入37ml脱气的10％丙酮醇(Aceto1)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的混合物，最后调pH至7.4。用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合牛Hb的50％氧饱和度(P50)为29mmHg。
实旌例11用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入36ml脱气的10％丙酮醛(Pymvic aldehyde)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例12用2,3-丁二酮(2,3-Butanedione,CH3COCOCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入43ml脱气的10％2,3-Butanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例13用1-羟基-2-丁酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％1-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例14用3-羟基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入44ml脱气的10％3-Hydroxy-2-butanone贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例15用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,3-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例16用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,4-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例17用2,5-己二酮(2,5-Hexanedi one,CH3COCH2CH2COCH3)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入57ml脱气的10％2,5-Hexanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例18用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入64ml脱气的10％3-ethyl-2,4-pentanedion贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例19用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入71ml脱气的10％6-methyl-2,4-heptanedione贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
实施例20用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合人血红蛋白将1L 15％的纯净人血红蛋白(人Hb，溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口圆底烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2后，监测Hb溶液中O2Hb的浓度降到2％以下。加入脱气的30ml 1M NaCO3将Hb溶液的pH值调至8.5，再加入37ml脱气的10％丙酮醇(Acetol)贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以终止聚合反应。反应终止后保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并用500KD和100KD的中空纤维柱去除聚合产物中大于500KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的混合物，最后调pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等调节人Hb氧亲和力的共价调节剂后，用ABL520血气分析仪(Radiometer)检测，此分子量分布在100KD至500KD之间的聚合人Hb的50％氧饱和度(P50)为26mmHg。
上述各实施例中，聚合剂与人或牛血红蛋白的分子数之比为21.3∶1，此比例变化时聚合反应仍可进行。
保护上述各聚合剂与人血红蛋白和牛血红蛋白的聚合反应。
这些聚合反应的产物可作以下几方面的应用1．出血性休克的复苏；2．特定的围手术期血液稀释；3．在红细胞血型不合时替代输血；4．冠脉成形术中的灌注液；5．离体器官的保存；5．增强肿瘤放疗的疗效。
本发明的血液替代品的实例如下(注PolyHb为聚合牛Hb或聚合人Hb)
权利要求
1．式(Ⅰ)化合物作为血红蛋白聚合剂的应用。 其中R’代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基。R代表 或 或 A代表H-或1-10个碳的支链或支链烷基，n为1至7的阿拉伯数字。
2．权利要求1中的化合物是丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羟基-2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
3．用权利要求1中的化合物作为血红蛋白聚合剂制备聚合血红蛋白的方法，其特征是用式(Ⅰ)化合物与人或牛的血红蛋白反应。
4．用权利要求3中的聚合血红蛋白制备血液替代品。
5．权利要求4中用聚合血红蛋白制备出的血液替代品。
6．权利要求5中的血液替代品的制备方法，其特征在于将聚合血红蛋白溶解于电解质和pH值与血浆近似的溶液，此溶液含有还原型谷胱甘肽(GSH)或其他巯基(-SH)供体。
全文摘要
本发明公开了新的血红蛋白(Hb)聚合剂,他们的制备及应用,本发明的Hb聚合剂显著提高了聚合反应的能垒、降低了聚合反应的速度,反应体系的凝胶化基本被完全抑制,大分子聚合物的形成被降到很低的水平,产物以低聚态的聚合Hb为主,基本实现了Hb聚合反应的可控制。
文档编号A61K38/42GK1306858SQ0010064
公开日2001年8月8日 申请日期2000年1月25日 优先权日2000年1月25日
发明者王鹤尧 申请人:王鹤尧
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