rLZ-8在治疗血小板减少症中的应用及其制剂的制作方法

专利名称：：rLZ-8在治疗血小板减少症中的应用及其制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)对血小板减少症的治疗用途。背录技术1989年，由日本Kino等人第一次从赤灵芝菌丝体提取物中分离得到了一种免疫调节蛋白，即灵芝免疫调节蛋白ImmunoregulatoryProteinfromGanodermaLucidum，LZ-8)，命名为LZ-8，并测定了其基因序列、氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明LZ-8由IIO个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化。分子量为12.4kD，等电点为4.4。发明人之一已在另一专利申请中公开了基因重组灵芝免疫调节蛋白的晶体空间结构，其结构的主要特征为包括一个N-端的形成二聚体所需的重要结构域和一个C端的FNIII结构域，N-端结构域由一个a-helix(序列为2-SDTA-LIFRLAWDVK-15,14个氨基酸组成)和P-strand(序列为16-KLSFD-20,5个氨基酸组成)，其中在a-helix上的Ser的残基被乙酰化封闭。LZ-8单体上的N端a-helix和P-strand与另一单体上相同的结构域通过空间交换形成了重要的二聚体结合结构域，呈哑铃状。C-端的FNIII结构域属于免疫球蛋白三文治结构，包含e-sheetIandP-sheetII两个结构，二者分别由P-strandsA-B-Eand0-strandsG-F-C-D形成。研究结果表明基因重组灵芝免疫蛋白的本质作用可能是通过N端a螺旋A形成同源二聚体(研究表明，其N端13个氨基酸残基对FIP形成有功能的同源二聚体十分必要)。血小板减少症可能源于造血干细胞损伤引起的血小板产生不足，血小板减少症通常伴随着贫血和白细胞减少症。血小板减少症也可能是由于使用一些特殊药物引起的，如奎宁、奎尼丁、肝素、非甾类抗炎药物、还有一些化学试剂等，尤其是一些临床使用的化疗药物会抑制巨核细胞的产生。目前，临床上常用的药物以基因工程重组类药物为主，主要为血小板生成素CThrombopoietin,THPO)和白介素-11(IL-ll)。THPO是作用于巨核细胞系分化发育的特异性造血因子，是最早阶段巨核细胞和血小板分化发育最重要的生理性调节因子。THPO长期或大剂量应用存在以下潜在的毒副作用，如刺激肿瘤细胞生长、与其他细胞因子产生竞争性相互作用、骨髓纤维化、肝脾肿大等，故THPO使用的安全性问题仍有待进一步研究，所出现的不良反应为注射部位疼痛、红肿、硬结、结膜充血、水肿、心悸、乏力等。IL-11可用于预防非血液系统恶性肿瘤化疗所致的重度血小板减少症,降低化疗导致的重度血小板减少的发生率,减少血小板成分输血的次数。重组人IL-11最常见的副作用是轻度的可逆性贫血，其发生与液体潴留产生的血液稀释有关，在治疗中水肿约占20%，心律失常约占15%。中医中药在血小板减少症的治疗中也有应用的报道，其中单味中药和复方制剂主要有人参、当归、补骨脂、地黄、白术、黄芪、阿胶、刺五加等，尽管中医药对放化疗所造成的造血及免疫功能抑制有较好的调节作用，但目前疗效评价只停留在有效、无效的水平上,且由于各地疗效标准不一，不少报道未设对照组，疗程长短相差大,影响疗效的说服力。本发明结果表明，基因重组灵芝免疫调节蛋白具有明显的治疗及预防由多种原因导致的血小板减少症，在临床应用剂量、治疗效果及临床不适症等方面均优于现有的临床应用药物。动物实验表明，基因重组灵芝免疫调节蛋白的副作用远低于IL-ll和THPO。综上所述，发明人利用毕赤酵母真核表达系统表达了灵芝免疫调节蛋白；在国际同类研究中，发明人首次实现了工业级30克生产规模的rLZ-8生产，并且建立了完整的生产及纯化工艺方案；完成了rLZ-8空间结构的测定工作。本发明发现了rLZ-8可以提升实验动物血小板低下模型的血小板数量，且药效学作用明显强于THPO;安全性实验表明，rLZ-8对大鼠血细胞无明显毒性；对主动脉、主静脉血管壁未见病理性破坏作用；骨髓涂片结果表明对造血机能也无病变作用。本发明首次公开了LZ-8对预防及治疗多种原因导致的血小板减少症的新用途。
发明内容本发明的内容为重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在血小板减少症的治疗领域中的应用。本发明公开了rLZ-8具有预防和治疗血小板减少症的作用。在环磷酰胺所致小鼠和犬血小板减少症的预防和治疗实验中，将生理盐水配制的rLZ-8对实验动物血小板低下模型进行给药，用THPO和IL-6为阳性药物，连续给药，检测血液中血小板数量，对比治疗前后血小板数变化，分析药物疗效。与模型组比较，在给药初期(第3-5天)rLZ-8药物组已明显刺激小鼠、豚鼠和犬的血小板增生，差异极其显著，在给药中期(第7-10天)时恢复到正常水平，在治疗由注射抗血小板血清导致的血小板减少症豚鼠实验动物模型也取得了很好的效果。具体实施例方式实施例1.rLZ-8预防环砩酰胺引起的犬血小板减少症的药效学试验1.药物配制试验用药重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)无菌生理盐水配制成3.85ng'kg—1、1.925叱kg"剂量组，lml/只。阳性对照药血小板生成素(THPO),沈阳三生制药股份有限公司生产，20ng'kg"/d，lml/只。化疗药物环磷酰胺(Cy)，江苏恒瑞制药有限公司生产，生产批号08112121:200mg/支。用电子秤准确称取7mg'kg"/只。血小板稀释液尿素:1.3g、枸櫞酸钠0.5g、甲醛O.lml，加蒸馏水至100ml混合，过滤备用。2.实验方法实验动物分成5组，分别为正常对照组、模型组(CP)、阳性药物对照组和实验药物组，每组2只犬，雌雄各半。除正常对照组(给予等体积生理盐水)外，每只犬均给予口服环磷酰胺(7mgAg"/只/d)，连续5天。rLZ-8和阳性药物对照组于第一次口服环磷酰胺的同时给药，连续皮下注射11天。按上述分组分别给予rLZ-8(3.85吗-kg4、1.925ng-kg"，lml/只/d)、阳性药(THPO20吗'kg-、lml/只/d)，药后第一天开始隔Fl采集静脉血于显微镜下进行血小板计数。3.实验结果所有实验数据先进行检验方差齐性，再进行独立样本的组间f检验，统计软件采用SPSS16.0。与模型组比较，各药物剂量组每只犬在口服给药环磷酰胺第7天血小板明显下降，第ll天降至最低值；与模型组比较，各药物剂量组血小板数明显高于模型组，具有显著性差异0^0.05)。表l,rLZ-8预防犬白细胞减少症每只犬血小板结果(单位*109/L)分组治疗前3rd大5lh大7lh天9lh天llLh天"正常对照组2652702612622642202"d正常对照组2782612542742492463rdCP2751981635562104thCP1741942049444105山THP021925514015545366thTHPO29524725018635257thrLZ-8283325213208107808thrLZ-8238229313393163789[hrLZ-8222329236317937010thrLZ-831737226130210080表2.rLZ-8预防犬血小板减少症血小板数试验结果(F±S,,n=2)(单位*109/L)分组治疗前3rd天5[h天7th天9th天11th天下降率正常对照组271±2.91265±1.75257±2.52268±2.69256±1.87233±0.76模型组224±0.12196±0.25183±0.4774±0.1453±0.4010±0.1495%THPO257±0.20251±0.53210±0.31170±0.31*40±0.2I30±0.4788%rLZ-8(1.925吗'kg-)260±0.11277±0.11263±0.24300±0.1]'135±0.40*79±0.14*69%rLZ-8(3.85(ig.kg勺269±0.11350±0.18248±0.79309±0.25'96±0.78*75±0.82*72%与模型组比较存在显著性差异，*p<0.05实施例2.rLZ-8治疗环磷酰胺引起的犬血小板减少症的药效学试验1.药物配制试验用药重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)无菌生理盐水配制成3.85ng.kg—、1.925ng'kg—1剂量组，lml/只。阳性对照药血小板生成素(THPO)，沈阳三生制药股份有限公司生产，20吗'kg—Vd，lml/只。化疗药物环磷酰胺(Cy)，江苏恒瑞制药有限公司生产，生产批号08112121;200mg/支。用电子秤准确称取7mg-kg—V只。血小板稀释液尿素:1.3g、枸橼酸钠0.5g、甲醛O.lml，加蒸馏水至100ml混合，过滤备用。2.实验方法实验动物分成5组，分别为正常对照组、模型组(CP)、阳性药物对照组和实验组，每组2只犬，雌雄各半。除正常对照组(给予等体积生理盐水)外，每只犬均给予口服环磷酰胺(7mg.kg1/只/d),连续5天。于第11天，血小板下降至最低值时，按上述分组分别皮下注射给予rLZ-8(3.85ng.kg1、1.925ng.kg",lml/只/d)、阳性药(THPO20吗'kg—1、lml/只/d)治疗，连续给药7天，并于造模前、造模后、给药第3天、7天、14天采集静脉血于显微镜下进行血小板计数。3.实验结果所有实验数据先进行检验方差齐性，再进行独立样本的组间f检验，统计软件采用SPSS16.0。与模型组比较，各药物剂量组每只犬给药第3天血小板数已明显升高,在给药第7天基木达到正常，且有显著性差异(^<0.05)。表3.rLZ-8治疗犬白细胞减少症每只犬血小拔结果(单位*109/L)分组造模前造模后3rd天7th天14lh天Ist正常对照组2452312542382282"d正常对照组251240228246239dCP265416174804thCP248316877855thTHPO26190921762456thTHPO25145951622397thrLZ-8217351012142678thrLZ-8245401062232759thrLZ-82383511021128910thrLZ-824140186187252表4.rLZ-8治疗犬血小板减少症血小板数试验结果(F"±S，n=2)(单位::*109/L)分组造模前造模后3rd天7th天14[h天下降率Normalcontrolgroup248±0.15235±0.28241±0.1S242±0.19233±0.54CPcontrolgroup256±0.4536±0.7464.5±0.4775.5±0.]882.5±CU256%THPO256±03467±0.2493.5±0.54*169±0.39*242±0.65*72%rLZ-8(9.625吗.kg-1)231±0.5437.5±0.41103.5±0.78*271±0，86%rLZ-8(19.25iig.kg1)239±0.4137.5±0.94148土0,89^199土0,43^270±0.4"72%与模型组比较存在显著性差异，*p<0.05实施例3.rLZ-8预防环碟酰胺引起的小鼠血小板减少症的药效学试验1.药物配制试验用药重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)无菌注射用水配制成19.25吗-kg4、9.625吗.kg—1剂量组，0.2ml/只。阳性对照药血小板生成素(THPO),沈阳三生制药股份有限公司生产，770吗.kg-Vd，0.2ml/只。化疗药物环磷酰胺(Cy),江苏恒瑞制药有限公司生产，生产批号08112121;200mg/支。无菌注射用水配制成lOOmg.kg-1,0.2ml/只。血小板稀释液尿素:1.3g、枸橼酸钠0.5g、甲醛O.lml，加蒸馏水至100ml混合，过滤备用。2.实验方法实验动物分成5组，每组10只小鼠，雌雄各半。除正常对照组(给予等体积生理盐水)外，每组小鼠均腹腔注射环磷酰胺，100mg-kg—1，0.2ml/只/d，连续3天。rLZ-8和阳性药物对照组于第一次注射环磷酰胺的同时给药，连续11天。按上述分组分别皮下给予11^-8(19.25吗']^-1、9.625吗.]^10,2ml/只/d)、阳性药(THPOTTOng-kg^0.2ml/只/d)，药后第一天开始隔日采集静脉血于显微镜下进行血小板计数。3.实验结果所有实验数据先进行检验方差齐性，再进行独立样本的组间f检验，统计软件釆用SPSS16.0。与模型组比较，各药物剂量组每组鼠在给药环磷酰胺第7天血小板明显下降，第ll天降至最低值；与模型组比较，各药物剂量组血小板数明显高于模型组，具有显著性差异(<0.05)。表5.rLZ-8预防小鼠血小板减少症血小板数试验结果(ir±S,n=10)(单位*109/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例4.rLZ-8治疗环雜酰胺引起的小鼠血小板减少症的药效学试验1.药物配制试验用药重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)无菌注射用水配制成19.25ng.kg—1、9.625ng.kg"剂量组，0.2ml/只。阳性对照药血小板生成素(THPO)，沈阳三生制药股份有限公司生产，770ng.kg々d,0.2ml/只。化疗药物环磷酰胺(Cy),江苏恒瑞制药有限公司生产，生产批号08112121;200mg/支。无菌注射用水配制成100mg'kg-1，0.2ml/只。血小板稀释液尿素:1.3g、枸橼酸钠0.5g、甲醛O.lml，加蒸馏水至100ml混合，过滤备用。2.实验方法实验动物分成5组，每组10只小鼠，雌雄各半。除正常对照组(给予等体积生理盐水)外，每组小鼠均腹腔注射环磷酰胺，lOOmg'kg.1，0.2ml/只/d,连续3天。血小板数降到300X109/L以下时，按上述分组分别皮下给予相应剂量rLZ-8(19.25ng'kg-1、9,625ng'kg"0.2ml/只/d)及阳性药(THPO770吗.kg-'、0.2ml/只/d)治疗，正常对照组和模型组(CP)组给予等体积生理盐水，于治疗第3d和第7d、14d分别小鼠尾静脉取血，高倍镜下血小板't卜数。3.实验结果所有实验数据先进行检验方差齐性，再进行独立样本的组间f检验，统计软件采用SPSS16.0。与模型组比较，各药物剂量组每只小鼠给药第3天血小板数已明显升高，在给药第7天基本込到正常，且有显著性差异(p<0.05)。表6.rLZ-8治疗小鼠血小板减少症血小板数试验结果(]T土S,n=10)(单位*109/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>与模型组比较存在显著性差异，*p<0.05实施例5.rLZ-8治疗豚鼠血小板减少症的药效学试验1.药物配制试验用药重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)无菌注射用水配制成40吗'kg—、2f^g'kg—i剂量组，0.2ml/只。阳性对照药重组白介素6(rhIL-6)，40wkg々d，0.2ml/只。造模药物豚鼠血小板抗血清，lmhkg-1。血小板稀释液尿素:L3g、枸橼酸钠0.5g、甲醛O.lml,加蒸馏水至100ml混合，过滤备用。2.实验方法实验动物分成5组，每组10只豚鼠，雌雄各半。除止常对照组(给予等体积生理盐水)外，每组豚鼠均注射血小板抗血清(lmHig—1),24h后，各组血小板均降至最低值。于给药4h后，按上述分组分别肌注给予相应剂量rLZ-8WOng'kg-1,20ug'kg—10.2ml/只/d)及阳性药(rhIL-6^ng'kg-1,0.2ml/只/d)治疗，正常对照组和模型组给予等体积生理盐水，于治疗第3d和第7d、14d分别豚鼠足垫采血，高倍镜下血小板计数。3.实验结果所有实验数据先进行检验方差齐性，再进行独立样本的组间f检验，统计软件采用SPSS16.0。与模型组比较，各药物剂量组豚鼠在给药第3天血小板数已明显升高,在给药第7天基本达到正常，且有显著性差异(p〈0.05)。表7.rLZ-8治疗豚鼠血小板减少症血小板数试验结果(F土S，n-lO)(单位*109/L)分组造模前造模后3rd天7th天14'h天正常对照组728±031740±0.13760±0.73861±0.41867±0.71模型组751±0.39217±0.19269±0.92379±0.70387±0.66THPO842±0.14244±0.39295±0.37582±0.41*639士0.23'rLZ-8(20吸kg-1)831±0.50237±0.21420±0.25'712土0.74'881土0.63'rLZ-8(40吸kg-1)843±0.41243±0.28414±0.38*790土0.18'845±0.11'与模型组比较存在显著性差异，*;<0.05实施例6.rLZ-8治疗环磷酰胺引起的小鼠血小板减少症的药效学试验(鼻腔给药途径)1.药物配制试验用药重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)无菌注射用水配制成9,625吗'kg"、4.81吗'kg入2.40吗'kg—1剂量组，10ul/只。阳性对照药血小板生成素(THPO)，沈阳三生制药股份有限公司生产，770吗'kg—Vd，10ul/只。化疗药物环磷酰胺(Cy)，江苏恒瑞制药有限公司生产，生产批号08112121;200mg/支。无菌注射用水配制成100mgkg—、0.2ml/只。血小板稀释液尿素1.3g、枸橼酸钠0.5g、甲醛0.lml，加蒸馏水至100ml混合，过滤备用。2.实验方法实验动物分成6组，每组10只小鼠，雌雄各半。除正常对照组(给予等体积生理盐水)外，每组小鼠均腹腔注射环磷酰胺，100mg'kg—、0.2ml/只/d，连续3天。血小板数降到300X109/L以下时，按上述分组分别鼻腔途径给予相应剂量rLZ-8(9.eSSng'kg-1,4.81吗4^、2.40吗'kg"、10ul/只/d)及阳性药(THPO770吗'kg-Vd，10ul/只/天)治疗，正常对照组和模型组(CP)组给予等体积生理盐水，于治疗第3d和第7d、14d分别小鼠尾静脉取血，高倍镜下血小板计数。3.实验结果所有实验数据先进行检验方差齐性，再进行独立样本的组间f检验，统计软件采用SPSS16.0。进行比较与模型组比较，各药物剂量每组小鼠给药第3天血小板数已明显升高，在给药第7天基本达到正常，且有显著性差异(p〈0.05)。表8.rLZ-8治疗小鼠血小板减少症血小板数试验结果(F±S,n=10)(单位*109/L)分组造模前造模后3rd天7th天14th天正常对照组838±0.11946±0.18870±0.23760±0.31965±0.70模型组850±0.34239±0.12256±0.93301±0.30323±0.67THPO851±0.34284±0.19360±0.38401±0.32689±0.65*rLZ-8(2.40吗'kg—1)839±0.40251±0.41683±0.45'785±0.78*998士0.61'rLZ-8(4.81吗'kg—1)946±0.45296±0.78541±0.48*870土0.28'1021±0.31*rLZ-8(9.625吗'kg.1)916±0.45246±0.45520土0.45'906土0.45'992土0.45'与模型组比较存在显著性差异，=><0.0权利要求本发明的权利要求如下1.一种重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)，该蛋白被用于治疗血小板减少症。1.一种重组灵芝免疫调节蛋白GLZ-8)，该蛋白被用于治疗血小板减少症。2.根据权利要求l所述，重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)治疗血小板减少症的有效剂量为10,10mg/m1.3.根据权利要求l所述，一种灵芝免疫调节蛋白药物制剂可选用任何的药学可接受的辅剂。4.根据权利要求1所述重组灵芝免疫调节蛋白药物制剂可以通过口服和非肠道给药，口服药包括口服液、片剂、丸剂和胶囊；非肠道用包括外用药、吸入制剂、栓剂和注射剂。全文摘要本发明提供了重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)用于治疗血小板减少症的一种新用途。在环磷酰胺所致小鼠和犬血小板减少症的预防和治疗实验中，将生理盐水配制的rLZ-8对血小板低下的实验动物模型进行给药，用THPO和IL-6为阳性药物，连续给药，检测血液中血小板数量，对比治疗前后血小板数变化，分析药效。与模型组比较，在给药初期(第3-5天)rLZ-8药物组已明显刺激小鼠、豚鼠和犬的血小板增生，差异极其显著，在给药中期(第7-10天)时恢复到正常水平，在治疗由注射抗血小板血清导致的血小板减少症豚鼠实验动物模型也取得了很好的效果。文档编号A61K38/16GK101612385SQ20091014342公开日2009年12月30日申请日期2009年5月25日优先权日2009年5月25日发明者非孙,张喜田,梁重阳申请人:张喜田