一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法
专利名称：一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫
司的分离纯化方法。
背景技术：
他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984年从土壤放 线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介 素-2(IL-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较常用的环孢素(CsA)强100倍，因此大
大降低了临床使用剂量和原治疗费用。近年来，作为肝、肾等移植的一线用药，已在日本、美 国等14个国家上市。 此外用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢菌素治疗者低，尤其是该药品有 较强的亲肝性。FK-506和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可 用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器 官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。 目前，他克莫司的主要生产方法是发酵。从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，主 要是专利U. S. 6， 576， 135， U. S. 7， 220， 357，和W0/2006/031664，这些专利报道了用不同方 法分离纯化他克莫司，但提取收率不是很高，导致工业化生产成本很高，产品的价格昂贵。
本发明的目的就是提供一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法。主要涉及有机 溶剂浸提、大孔吸附树脂和硅胶层析、重结晶等技术从链霉菌(CGMCC No. 2919)发酵液中分 离纯化他克莫司的方法。 —般在他克莫司的初始分离阶段并不提倡使用如硅胶、氧化铝及C18等为填料 的柱层析。主要是因为样品成分复杂，杂质含量高，部分吸附性很强的杂质会造成填料的不 可逆吸附，再生相当困难，导致填料报废，从成本上分析并不经济。C18柱价格昂贵，处理量 相对较小，若直接分离他克莫司并不实际。但大孔树脂与硅胶、氧化铝等填料相比，其特点 表现在处理量大、再生容易、价格便宜。他克莫司具有多环结构，理论上易被带苯环的吸附 剂吸附，而以苯乙烯_二乙烯苯为载体的大孔吸附树脂可成为他克莫司的良好吸附剂。
权利要求
一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，其特征在于，包括如下步骤1)在发酵液中加入助滤剂进行搅拌，过滤收集菌体；2)用有机溶剂浸提菌体，合并滤液减压浓缩得浓缩物；3)步骤2)浓缩物进行大孔吸附树脂层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；4)步骤3)浓缩物加入有机溶剂萃取，萃取液抽滤，减压浓缩至油状物；5)步骤4)油状物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；6)步骤5)浓缩物经有机溶剂溶解，重结晶，即得产品。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤l)所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混 合物。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述搅拌时间为15-30分钟。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述有机溶剂为甲醇、氯仿、乙酸丙 酯、二氯甲烷、乙酸丁酯、乙醇、正己烷、乙腈、丙酮或石油醚中的一种或多种的混合物溶剂。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)室温浸提菌体3-4次，每次浸提时间 1-4小时。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)在减压条件下，浓縮回收有机溶剂， 得到浓縮物。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的大孔吸附树脂为非极性大孔 吸附树脂X-5、 D4020、 HZ801、 HZ803或HZ818。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的洗脱剂为以下任一溶液 20% _80%甲醇的水溶液；含有20% _75%丙酮的水溶液；含有25% _75%乙醇的水溶液。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯 或氯仿。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的硅胶为200 300目的层析 硅胶。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的洗脱剂为以下任一溶液含 35% _70%乙酸乙酯的正己烷混合液；含15% _50%丙酮的正己烷混合液；含15% -70%乙 醇的正己烷混合液；含35% _70%乙酸乙酯的环己烷混合液；含15% _50%丙酮的环己烷 混合液；含15% _70%乙醇的环己烷混合液。
12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述有机溶剂为乙酸乙酯。
13. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)重结晶时在浓縮后的萃取液中缓慢加入正己烷或环己烷至有少量晶体析出，然后将溶液置于4t:继续析晶。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的分离纯化方法。本发明将链霉菌发酵液用板框压滤得到菌体，用有机溶剂多次室温浸提菌体，得到浸提液，将浸提液浓缩后进行大孔树脂和硅胶柱层析，柱层析所得他克莫司用混合溶剂进行浓缩结晶，他克莫司的纯度达96.5％。该方法通用性强，易推广，可以进行工业化生产。
文档编号A61P31/00GK101712686SQ20091014638
公开日2010年5月26日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者刘忠 申请人:鲁南制药集团股份有限公司
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫
司的分离纯化方法。
背景技术：
他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984年从土壤放 线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介 素-2(IL-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较常用的环孢素(CsA)强100倍，因此大
大降低了临床使用剂量和原治疗费用。近年来，作为肝、肾等移植的一线用药，已在日本、美 国等14个国家上市。 此外用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢菌素治疗者低，尤其是该药品有 较强的亲肝性。FK-506和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可 用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器 官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。 目前，他克莫司的主要生产方法是发酵。从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，主 要是专利U. S. 6， 576， 135， U. S. 7， 220， 357，和W0/2006/031664，这些专利报道了用不同方 法分离纯化他克莫司，但提取收率不是很高，导致工业化生产成本很高，产品的价格昂贵。
本发明的目的就是提供一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法。主要涉及有机 溶剂浸提、大孔吸附树脂和硅胶层析、重结晶等技术从链霉菌(CGMCC No. 2919)发酵液中分 离纯化他克莫司的方法。 —般在他克莫司的初始分离阶段并不提倡使用如硅胶、氧化铝及C18等为填料 的柱层析。主要是因为样品成分复杂，杂质含量高，部分吸附性很强的杂质会造成填料的不 可逆吸附，再生相当困难，导致填料报废，从成本上分析并不经济。C18柱价格昂贵，处理量 相对较小，若直接分离他克莫司并不实际。但大孔树脂与硅胶、氧化铝等填料相比，其特点 表现在处理量大、再生容易、价格便宜。他克莫司具有多环结构，理论上易被带苯环的吸附 剂吸附，而以苯乙烯_二乙烯苯为载体的大孔吸附树脂可成为他克莫司的良好吸附剂。
权利要求
一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，其特征在于，包括如下步骤1)在发酵液中加入助滤剂进行搅拌，过滤收集菌体；2)用有机溶剂浸提菌体，合并滤液减压浓缩得浓缩物；3)步骤2)浓缩物进行大孔吸附树脂层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；4)步骤3)浓缩物加入有机溶剂萃取，萃取液抽滤，减压浓缩至油状物；5)步骤4)油状物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；6)步骤5)浓缩物经有机溶剂溶解，重结晶，即得产品。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤l)所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混 合物。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述搅拌时间为15-30分钟。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述有机溶剂为甲醇、氯仿、乙酸丙 酯、二氯甲烷、乙酸丁酯、乙醇、正己烷、乙腈、丙酮或石油醚中的一种或多种的混合物溶剂。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)室温浸提菌体3-4次，每次浸提时间 1-4小时。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)在减压条件下，浓縮回收有机溶剂， 得到浓縮物。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的大孔吸附树脂为非极性大孔 吸附树脂X-5、 D4020、 HZ801、 HZ803或HZ818。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的洗脱剂为以下任一溶液 20% _80%甲醇的水溶液；含有20% _75%丙酮的水溶液；含有25% _75%乙醇的水溶液。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯 或氯仿。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的硅胶为200 300目的层析 硅胶。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的洗脱剂为以下任一溶液含 35% _70%乙酸乙酯的正己烷混合液；含15% _50%丙酮的正己烷混合液；含15% -70%乙 醇的正己烷混合液；含35% _70%乙酸乙酯的环己烷混合液；含15% _50%丙酮的环己烷 混合液；含15% _70%乙醇的环己烷混合液。
12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述有机溶剂为乙酸乙酯。
13. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)重结晶时在浓縮后的萃取液中缓慢加入正己烷或环己烷至有少量晶体析出，然后将溶液置于4t:继续析晶。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的分离纯化方法。本发明将链霉菌发酵液用板框压滤得到菌体，用有机溶剂多次室温浸提菌体，得到浸提液，将浸提液浓缩后进行大孔树脂和硅胶柱层析，柱层析所得他克莫司用混合溶剂进行浓缩结晶，他克莫司的纯度达96.5％。该方法通用性强，易推广，可以进行工业化生产。
文档编号A61P31/00GK101712686SQ20091014638
公开日2010年5月26日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者刘忠 申请人:鲁南制药集团股份有限公司
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