一种提取银杏总萜内酯的方法及含有银杏总萜内酯的注射剂的制作方法
专利名称：一种提取银杏总萜内酯的方法及含有银杏总萜内酯的注射剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提取银杏总萜内酯的方法及含有银杏总萜内酯的注射剂，属于中 药技术领域。
背景技术：
银杏叶提取物具有治疗和保健的双重作用，它可以改善心脑血管循环，治疗心脑 血管疾病，提高记忆力，清除氧自由基，延缓衰老。银杏提取物中主要活性成分为黄酮类和 萜内酯类，萜内酯主要包括白果内酯和银杏内酯A、B、C、M、J等，其中白果内酯属于倍半萜 类化合物，银杏内酯A、B、C、M、J属于二萜类化合物。白果内酯为神经系统、精神病的药物， 对因年老而出现的呆傻现象有奇异的疗效，也用于治疗神经病、脑病和脊髓病等；银杏内酯 作为一种活性较高的血小板拮抗因子，在血栓形成、器官移植排异、老年痴呆、心脏过敏、内 毒素导致的休克等病理过程中有重要的药理作用，开发和应用前景广阔。银杏内酯和白果内酯是目前唯一的从银杏中发现的特殊物质，由于空间结构复 杂，手性多变，合成非常麻烦，目前只能从银杏叶中提取。自上世纪60年代初科学家对银杏 内酯开始研究包括分离纯化、定出结构等基础研究。70年代中期银杏提取物(GBE)上市，世 界各国食品及健康食品厂商都以极大的热情投入到银杏叶的开发中来。目前国外采用有机 溶剂多级萃取与硅藻土、硅胶吸附_洗脱或活性炭吸附_洗脱与醋酸铅沉淀发结合的提取 方法，步骤繁杂、成品率低、纯度也较低。国内也有采用浸提、柱纯化、萃取、分离、结晶方法 制备银杏内酯，但纯度仍然较低。溶剂萃取方法是具有代表性的制备银杏提取物的方法，如德国的Schwabe， Flaschman药厂，主要为银杏干叶粗粉，其制备工艺为60%丙酮抽取、压滤，滤液以四氯化 碳洗脱，丙酮水层用硫酸铵饱和，用甲乙酮提取，提取液减压浓缩后配成一定浓度的乙醇溶 液，加适量的PB (OH) 2过滤，滤液浓缩后在一硫酸铵饱和，甲乙酮提取，提取液干燥浓缩后 以乙醇精制再浓缩干燥得GBE (德国专利ED2117429、1767098)。银杏内酯类物质在银杏叶中含量很低，一般只有0.3%左右，而且随着季节的变 化而变化，因此，要尽量提高银杏物提取物中银杏总萜内酯的含量，并且在此基础上，要尽 可能多地除去杂质。由于银杏萜内酯微溶于水，所以，根据其理化性质，选用适合的途径增 强它的溶解性也是注射剂工艺成型的关键，并且这一过程还不能破坏银杏总内酯的手性结 构。对于银杏萜内酯的提取方法，国内已有详细的文献报道，例如，李新岗等人介绍了 银杏内酯的实验提取方法(参照李新岗等，银杏叶中银杏内酯的实验室提取方法研究，中 国医药工业杂1998第1期)，中国专利文献CN1195665A介绍了银杏内酯的提取方法和含有 银杏内酯的制剂，该方法是将银杏叶用水煮沸提取，用吸附剂对提取滤液吸附，再用乙醇洗 脱，回收乙醇，将析出的结晶溶解，重结晶，干燥制得银杏萜内酯。中国专利文献CN1313287A 也公开了一种银杏内酯的生产工艺。从银杏内酯的总提取物当中分离银杏内酯单体的方法，也有文献报道，例如，游松等人介绍了银杏内酯的分离与结构测定方法(参见游松等， 银杏叶中银杏内酯的分离与结构测定，中国药物化学杂志1995年第4期)。中国专利文献 CN1287121A公开了由银杏叶或银杏叶浸膏制备银杏内酯A、B的方法。将银杏内酯制成注 射剂，非常重要的一项技术问题是如何解决其难溶性，到目前为止，银杏内酯注射剂制备过 程当中，对于助溶剂的选择也非常重要，这直接影响到产品的稳定性和临床疗效。根据银杏内酯的内酯环结构，一般很容易想到用酸或碱使其开环，或者用有机溶 剂溶解，但是它在一般的有机溶剂中溶解性也很差，如在聚乙二醇400，甘油，乙醇，丙二醇 中的溶解度都很小。所以，目前银杏内酯制备注射剂的方法有通过使用碱溶液增加银杏内 酯的溶解性而制得，例如CN200510040497. 0，CN02134223. 7，CN02134223. 7 ；在加入葡甲胺 的情况下，银杏内酯的溶解性也能得到很好的增加，例如CN02128962.X;对银杏内酯采用 羟丙基_ β _环糊精增溶也可制得其水溶液，例如CN200510072466. 3，CN200410013937. 9， CN200410041120. 2 ；另外，CN0310034. 6公开针剂中含有5-99%银杏叶提取物、1-95%泊洛 沙姆188和PH值调节剂以及其它赋形剂；CN03137720. 3 一种银杏内酯B针剂的制备方法， 将银杏内酯B原料溶解于注射用水溶剂聚乙二醇中，聚乙二醇可单独使用或与无水乙醇配 成混合溶剂，按体积计，聚乙二醇乙醇=0. 5 0. 5 0. 9。但是，加碱或加葡甲胺都属于让内酯环开环成盐，在中性或酸性条件下，很难再形 成有效形势的内酯原形，甚至没有白果内酯。并且，在银杏叶提取过程中，白果内酯极易水 解或氧化。而白果内酯是目前最受关注的化学成分，动物试验报导，白果内酯具有促进神经 生长的作用，以及防止脑、脊髓神经脱髓鞘的作用，其神经营养、神经保护作用比银杏内酯 强，目前国际上对银杏提取物的要求是，白果内酯含量为2. 6-3.2%。国内外上市的银杏叶 提取物注射剂，主要有国产舒血宁注射液与德国威玛舒培大药厂生产的金纳多注射液。由于 注射液生产过程中需要高温灭菌，其中银杏内酯中白果内酯及银杏内酯B等活性成分大部分 被破坏，制剂中含量很低。对于银杏叶提取物活性成分萜类内酯类，金纳多注射液因制剂工艺 不过关，银杏内酯大部分被破坏，成品质量标准中不检测其总萜内酯；国产舒血宁注射液仅 要求检测银杏内酯A的含量。经检测，以上两种产品白果内酯及银杏内酯B的含量都很低。为了解决纯度问题和有效性问题，本发明公开了一种银杏总萜内酯的精制方法， 以及用该总萜内酯制成稳定的注射剂，而且，其成分与银杏叶中各组分比例非常接近。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是克服现有提取分离技术中纯度不高、有效成 分容易被破坏以及注射剂不稳定等的不足，提供一种综合运用多种技术手段提取、分离银 杏总萜内酯的方法。本发明所涉及的提取分离银杏总萜内酯的方法，包括如下步骤1)取银杏叶，加乙醇和枸橼酸或酒石酸，回流提取，浓缩醇提液；2)步骤1)浓缩物上大孔树脂柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；3)步骤2)浓缩物上硅胶柱，乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，干燥；4)步骤3)干燥物经乙醇溶解，加水，放置，得第一次结晶产物；母液回收乙醇，水 液冷沉，得第二次结晶产物；合并两次结晶产物即得银杏总萜内酯。优选地，步骤1)所述乙醇的浓度为60% 80%，所述枸橼酸或酒石酸的加入量为0. ；优选地，步骤1)浓缩醇提液的比例为与药材比为1 0. 8 1 ；优选地，步骤2)洗脱时用水洗3 5倍柱体积，再以20%的乙醇洗脱3 5倍柱 体积，除杂，弃去，然后用75%的乙醇洗脱3 6倍的柱体积；优选地，步骤3)所述样品上硅胶柱前，将步骤2)所得提取物加适量的水，以适量 的硅胶充分拌勻，真空干燥后上硅胶柱；本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种含有上述银杏总萜内酯的注射剂。 由于银杏萜内酯微溶于水，所以怎样增加其在注射溶剂中的溶解度是制备注射剂的关键。本发明所涉及的含有银杏总萜内酯的注射剂，它由以下成分组成
银杏总萜内酯0. 8% 1. 2%
赋形剂10% 60%
PH调节剂适量
抗氧化剂0. 02% 0. 04%
注射用水40% 89%
其中，所述赋形剂包括乙二醇、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇中的-
PH调节剂为以下缓冲液的一种磷酸氢钠-磷酸二氢纳、枸橼酸_枸橼酸钠或醋酸_醋酸 钠，PH调节剂的用量为使得注射液的PH调至3. 5 5.0即可；所述抗氧化剂为亚硫酸氢钠、 乙二胺四乙酸二钠中的一种。优选地，所述PH调节剂为以下缓冲液的一种PH3. 2 4. 8的磷酸氢钠-磷酸二 氢纳、PH4. 4 4. 8的枸橼酸-枸橼酸钠、PH3. 8 5. 2的醋酸-醋酸钠。与现有技术比较，本发明方法具有以下的显著的进步1)白果内酯和银杏内酯分子结构中有很多手性碳，内酯环的断裂或是构象改变都 可能影响到其药理、药效，本发明创造性地使用缓冲溶液调PH值至3. 5 5. 5，能有效地避 免内酯环的断裂，从而使所得注射剂疗效更佳；2)采用大孔树脂和硅胶柱两种柱层析方法组合进行除杂，能最大程度地除去杂 质；大孔树脂柱能有效地吸附内酯和黄酮类等极性相对较小的物质，能除去糖类和氨基酸 等极性比较大的杂质；硅胶柱能有效地除去银杏黄酮苷类杂质；3)采用分步结晶的方式使内酯类成分逐个析出，使得内酯类成分纯度更高，杂质 更少；4)与现有的银杏注射剂相比较，用本发明所得到的总萜内酯含量高，成分全，经测 定，其总萜内酯含量达到85%以上，其中，不仅含有白果内酯，也含有银杏内酯A、B、C等，与 银杏叶各组分比例最为接近。5)因萜内酯难溶于水，且不稳定，本发明采用了复合溶媒制成注射液，从而有效地 提高了萜内酯的溶解度和注射剂的稳定性；6)在提取前，在乙醇中添加了适量的枸橼酸、酒石酸，可以有效地阻止白果内酯的 水解，使内酯的比例与叶中天然比例基本一致。
具体实施例方式实施例1银杏总萜内酯的制备
1)取干燥银杏叶10千克，加60%的乙醇回流提取两次，每次回流提取1小时，第 一次加醇量为50千克(其中加枸橼酸50克，即0. 1 %的枸橼酸)，第二次加醇量为40千克 (其中加入枸橼酸40克，即0. 1 %的枸橼酸)，合并两次醇提取液，以200目的滤布滤过，在 0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至8千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(AB-8型)10千克，湿法装柱，上样，流速为120ml/min，然 后，先后以水洗脱30千克，流速为250ml/min，以20%的乙醇洗脱30千克，流速为280ml/ min，弃去，然后以70 %的乙醇洗脱30千克，流速为260ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5公斤的样品，调整 流速为ISOml/min，上样完毕，以30千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液，在 0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真空 干燥，得干燥物385克，待用。4)将上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入360克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. O克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为95.6%。实施例2银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加80%的乙醇回流提取两次，每次回流提取2小时，第 一次加醇量为90千克(其中加枸橼酸900克，即的枸橼酸)，第二次加醇量为70千克 (其中加入枸橼酸700克，S卩1 %的枸橼酸)，合并两次醇提取液，以200目的滤布滤过，在 0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至10千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(D-101型)10千克，湿法装柱，上样，流速为120ml/ min,然后，先后以水洗脱50千克，流速为250ml/min，以20 %的乙醇洗脱50千克，流速为 280ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱60千克，流速为260ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5公斤的样品，调整 流速为ISOml/min，上样完毕，以60千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液，在 0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真空 干燥，得干燥物412克，待用。4)将上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入360克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯58. 5克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为95. 1%。实施例3银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加70%的乙醇回流提取两次，每次回流提取1. 5小时，第一次加醇量为70千克(其中加枸橼酸350克，即0. 5%的枸橼酸)，第二次加醇量为60 千克(其中加入枸橼酸300克，即0. 5%的枸橼酸)，合并两次醇提取液，以200目的滤布滤 过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至9千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(HPD-100型)10千克，湿法装柱，上样，流速为120ml/ min，然后，先后以水洗脱40千克，流速为260ml/min，以20 %的乙醇洗脱40千克，流速为 280ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱40千克，流速为260ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5. 2公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5. 2公斤的样品，调 整流速为ISOml/min，上样完毕，以40千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真 空干燥，得干燥物395克，待用。4)将上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入365克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. 6克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为96.5%。实施例4银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加75%的乙醇回流提取两次，第一次回流提取2小时， 第二次每次回流提取1. 5小时，第一次加醇量为80千克(其中加酒石酸480克，即0. 6%的 枸橼酸)，第二次加醇量为60千克(其中加入酒石酸360克，即0. 6%的枸橼酸)，合并两次 醇提取液，以200目的滤布滤过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩 至8. 6千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(HPD-100型)10千克，湿法装柱，上样，流速为115ml/ min，然后，先后以水洗脱30千克，流速为260ml/min，以20 %的乙醇洗脱60千克，流速为 290ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱50千克，流速为275ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至4. 9公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述4. 9公斤的样品，调 整流速为175ml/min，上样完毕，以50千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真 空干燥，得干燥物398克，待用。4)将上述干燥物以1150克乙醇溶解，加入365克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯61. 6克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为94. 1%。实施例5银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加85%的乙醇回流提取两次，第一次回流提取1. 5小
7时，第二次每次回流提取2小时，第一次加醇量为90千克(其中加酒石酸720克，即0. 8% 的酒石酸，第二次加醇量为50千克(其中加入酒石酸400克，即0. 8%的酒石酸)，合并两 次醇提取液，以200目的滤布滤过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓 缩至9. 15千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(HPD-100型)10千克，湿法装柱，上样，流速为125ml/ min，然后，先后以水洗脱40千克，流速为260ml/min，以20 %的乙醇洗脱40千克，流速为 290ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱60千克，流速为275ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5. 05公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5. 05公斤的样品，调 整流速为185ml/min，上样完毕，以55千克乙酸乙酯洗脱，流速为2650ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C 80°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压， 95°C真空干燥，得干燥物402. 5克，待用。4)将上述干燥物以1180克乙醇溶解，加入375克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. 8克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为94.7%。实施例6银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加80%的乙醇回流提取两次，第一次回流提取1. 5小 时，第二次每次回流提取1小时，第一次加醇量为80千克(其中加酒石酸720克，即0. 9% 的酒石酸，第二次加醇量为80千克(其中加入酒石酸720克，即0. 9 %的酒石酸)，合并两 次醇提取液，以200目的滤布滤过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓 缩至9. 26千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(AB-8型)10千克，湿法装柱，上样，流速为135ml/min，然 后，先后以水洗脱50千克，流速为260ml/min，以20%的乙醇洗脱50千克，流速为290ml/ min，弃去，然后以70 %的乙醇洗脱60千克，流速为275ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至4. 98公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述4. 98公斤的样品，调 整流速为195ml/min，上样完毕，以60千克乙酸乙酯洗脱，流速为255ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C 80°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压， 95°C真空干燥，得干燥物399. 5克，待用。4)将上述干燥物以1180克乙醇溶解，加入375克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. 2克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为94. 1%。实施例7银杏总萜内酯注射液的制备
处方银杏萜内酯60. 0克1，2_ 丙二醇2500 毫升95%的乙醇500毫升磷酸氢钠_磷酸二氢纳缓冲溶液适量注射用水2000毫升_制成500支(10毫升/支)取上述实施例1制备的总萜内酯提取物60. 0克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加 入1，2-丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、1，2-丙二醇和乙醇的用量比例混为，注 射用水乙醇(95%) 1，2_丙二醇=5 1 4，即在60克总萜内酯提取物中加入2500 毫升的注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。加入亚硫酸氢钠1克， 即0. 02%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为3. 2的磷酸氢钠-磷酸二氢纳缓冲溶液，调PH至 3.5，以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装， 灭菌(105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定， 每支含银杏总萜内酯约58. 15毫克。实施例8银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯58. 5克1，2_ 丙二醇2000 毫升95%的乙醇500毫升枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液适量注射用水2500毫升_制成500支(10毫升/支)取实施例2制备的总萜内酯提取物58. 5克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入1， 2丙二醇，最后加如注射用水，其中注射用水、1，2丙二醇和乙醇用量比例为，注射用水乙 醇(95%) 1，2丙二醇=6 1 3，即在60克总萜内酯提取物中加入2500毫升的注射用 水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。并加入亚硫酸氢钠1. 75克，即0.025% 的比例，搅拌，并缓缓加入PH为4. 8的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，调PH至5. 0，以0. 22微 米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装，灭菌(105°C下 30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定(参考中国药典 2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，每支含银杏总萜内酯约56. 03毫克。实施例9银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯60. 6克1，2_ 丙二醇2000 毫升醋酸-醋酸钠缓冲溶液适量注射用水3000毫升_制成500支(10毫升/支) 取实施例3制备的总萜内酯提取物60. 6克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入1，2丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、1，2丙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用 水乙醇(95%) 1，2丙二醇=6 1 3，即在60克总萜内酯提取物中加入3000毫 升的注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1800毫升。加入亚硫酸氢钠1. 5克， 即0. 03%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为4. 4的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，调PH至4. 5， 以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装，灭菌 (105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定，每支含 银杏总萜内酯约58. 12毫克。实施例10银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯61. 6克聚乙二醇1500毫升醋酸-醋酸钠缓冲溶液适量注射用水3500毫升_制成500支(10毫升/支)取实施例4制备的总萜内酯提取物61. 6克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入1， 2丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用水乙 醇(95%)乙二醇=6 1 3，即在60克总萜内酯提取物中加入3000毫升的注射用水， 95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1500毫升。加入EDTA_Na2(乙二胺四乙酸二钠)1.5 克，即0. 03%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为3. 8醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调PH至4. 0，以 0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装，灭菌 (105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定，每支含 银杏总萜内酯约58. 35毫克。实施例11银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯60. 8克95%的乙醇500毫升枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液适量注射用水4500毫升_制成 500支(10毫升/支)取实施例5制备的总萜内酯提取物60. 8克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入聚 乙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用水乙 醇(95%)乙二醇=5.5 1 3. 5，即在60克总萜内酯提取物中加入2750毫升的注 射用水，95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1750毫升。加入EDTA_Na2 (乙二胺四乙酸二 钠)2. 0克，即0. 04%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为4. 8枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，调 PH至5.0，以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过， 灌装，灭菌(105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法 测定，每支含银杏总萜内酯约60. 80毫克。实施例12银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯60. 2克
10
1，2_ 丙二醇1500 毫升95%的乙醇500毫升磷酸氢钠-磷酸二氢纳缓冲溶液 适量注射用水3000毫升_制成500支(10毫升/支)取实施例6制备的总萜内酯提取物60. 2克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入聚 乙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用水乙 醇(95%) 1，2_丙二醇=5 1 4，即在60. 2克总萜内酯提取物中加入2500毫升的 注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。加入EDTA_Na2(乙二胺四乙酸 二钠)1. 75克，即0. 035 %的比例，搅拌，并缓缓加入PH为5. 2醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调 PH至5.3，以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过， 灌装，灭菌(105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法 测定，每支含银杏总萜内酯约57. 93毫克。实施例13银杏总萜内酯注射液的稳定性考察室温留样考察将灌封好的样品置于公司实验室室温留样室(温度25°C 士2°C， 60士 10%RH)，分别于第3、6、9、12、18个月定期取样检测，并与0月结果比较，见表1。由稳 定性试验结果可知，以本方法制成的银杏萜内酯注射剂，其在PH值为4. 5左右时，稳定性良 好。第0、3、6、9、12、18个月的样品取样时间分别为2007年3月20日、2007年6月20 日、2007年9月20日、2007年12月20日、2008年6月20日。样品为鲁南厚普制药有限公 司厚普实验室自制，处方、工艺见实施例9。表1、银杏总萜内酯注射液稳定性试验分析(室温)
权利要求
一种提取银杏总萜内酯的方法，其特征在于，包括如下步骤1)取银杏叶，加乙醇和枸橼酸或酒石酸，回流提取，浓缩醇提液；2)步骤1)浓缩物上大孔树脂柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；3)步骤2)浓缩物上硅胶柱，乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，干燥；4)步骤3)干燥物经乙醇溶解，加水，放置，得一次结晶产物；母液回收乙醇，水液冷沉，得第二次结晶产物；合并两次结晶产物即得银杏总萜内酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述乙醇的浓度为60% 80%，所 述枸橼酸或酒石酸的加入量为0. (重量/体积百分比)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)醇提浓缩液的重量与药材的重量比 为 1 0. 8 1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)洗脱时先用水洗3 5倍柱体积，除 杂，弃去；再以20%的乙醇洗脱3 5倍柱体积，除杂，弃去。然后用75%的乙醇洗脱3 6倍的柱体积，收集醇洗脱液，浓缩，待用。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述样品上硅胶柱前，将步骤2)所 得提取物加适量的水，以适量的硅胶充分拌勻，真空干燥后上硅胶柱。
6.一种含有银杏总萜内酯的注射剂，其特征在于，它由以下组分组成银杏总萜内酯0.8% 1.2%赋形剂10% 60%PH调节剂适量抗氧化剂0.02% 0.04%注射用水40% 89%其中，所述赋形剂包括乙二醇、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇中的一种或两种，所述PH 调节剂为以下缓冲液的一种磷酸氢钠_磷酸二氢纳、枸橼酸_枸橼酸钠或醋酸_醋酸钠， PH调节剂的用量为使得注射液的PH调至3. 5 5. 0即可；所述抗氧化剂为亚硫酸氢钠、乙 二胺四乙酸二钠中的一种。
7.如权利要求6所述的注射剂，其特征在于，所述PH调节剂为以下缓冲液的一种 PH3. 2 4. 8的磷酸氢钠-磷酸二氢纳、PH4. 4 4. 8的枸橼酸-枸橼酸钠和PH3. 8 5. 2 的醋酸-醋酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种提取银杏总萜内酯的方法及含有该银杏总萜内酯的注射剂，属于中药技术领域。本发明克服了现有提取分离技术中纯度不高、有效成分容易被破坏以及注射剂不稳定等的不足，提供了一种综合运用多种技术手段提取、分离银杏总萜内酯的方法。另外，本发明公开了用该方法制备的一种含有银杏总萜内酯的注射剂。与现有的银杏注射剂相比较，用本发明所得到的注射剂，具有总萜内酯含量高、成分全的优点，经测定，其总萜内酯的含量能达到85％以上。
文档编号A61P25/28GK101926835SQ20091014947
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者李守信, 苏瑞强, 赵志全 申请人:山东新时代药业有限公司
技术领域：
本发明涉及一种提取银杏总萜内酯的方法及含有银杏总萜内酯的注射剂，属于中 药技术领域。
背景技术：
银杏叶提取物具有治疗和保健的双重作用，它可以改善心脑血管循环，治疗心脑 血管疾病，提高记忆力，清除氧自由基，延缓衰老。银杏提取物中主要活性成分为黄酮类和 萜内酯类，萜内酯主要包括白果内酯和银杏内酯A、B、C、M、J等，其中白果内酯属于倍半萜 类化合物，银杏内酯A、B、C、M、J属于二萜类化合物。白果内酯为神经系统、精神病的药物， 对因年老而出现的呆傻现象有奇异的疗效，也用于治疗神经病、脑病和脊髓病等；银杏内酯 作为一种活性较高的血小板拮抗因子，在血栓形成、器官移植排异、老年痴呆、心脏过敏、内 毒素导致的休克等病理过程中有重要的药理作用，开发和应用前景广阔。银杏内酯和白果内酯是目前唯一的从银杏中发现的特殊物质，由于空间结构复 杂，手性多变，合成非常麻烦，目前只能从银杏叶中提取。自上世纪60年代初科学家对银杏 内酯开始研究包括分离纯化、定出结构等基础研究。70年代中期银杏提取物(GBE)上市，世 界各国食品及健康食品厂商都以极大的热情投入到银杏叶的开发中来。目前国外采用有机 溶剂多级萃取与硅藻土、硅胶吸附_洗脱或活性炭吸附_洗脱与醋酸铅沉淀发结合的提取 方法，步骤繁杂、成品率低、纯度也较低。国内也有采用浸提、柱纯化、萃取、分离、结晶方法 制备银杏内酯，但纯度仍然较低。溶剂萃取方法是具有代表性的制备银杏提取物的方法，如德国的Schwabe， Flaschman药厂，主要为银杏干叶粗粉，其制备工艺为60%丙酮抽取、压滤，滤液以四氯化 碳洗脱，丙酮水层用硫酸铵饱和，用甲乙酮提取，提取液减压浓缩后配成一定浓度的乙醇溶 液，加适量的PB (OH) 2过滤，滤液浓缩后在一硫酸铵饱和，甲乙酮提取，提取液干燥浓缩后 以乙醇精制再浓缩干燥得GBE (德国专利ED2117429、1767098)。银杏内酯类物质在银杏叶中含量很低，一般只有0.3%左右，而且随着季节的变 化而变化，因此，要尽量提高银杏物提取物中银杏总萜内酯的含量，并且在此基础上，要尽 可能多地除去杂质。由于银杏萜内酯微溶于水，所以，根据其理化性质，选用适合的途径增 强它的溶解性也是注射剂工艺成型的关键，并且这一过程还不能破坏银杏总内酯的手性结 构。对于银杏萜内酯的提取方法，国内已有详细的文献报道，例如，李新岗等人介绍了 银杏内酯的实验提取方法(参照李新岗等，银杏叶中银杏内酯的实验室提取方法研究，中 国医药工业杂1998第1期)，中国专利文献CN1195665A介绍了银杏内酯的提取方法和含有 银杏内酯的制剂，该方法是将银杏叶用水煮沸提取，用吸附剂对提取滤液吸附，再用乙醇洗 脱，回收乙醇，将析出的结晶溶解，重结晶，干燥制得银杏萜内酯。中国专利文献CN1313287A 也公开了一种银杏内酯的生产工艺。从银杏内酯的总提取物当中分离银杏内酯单体的方法，也有文献报道，例如，游松等人介绍了银杏内酯的分离与结构测定方法(参见游松等， 银杏叶中银杏内酯的分离与结构测定，中国药物化学杂志1995年第4期)。中国专利文献 CN1287121A公开了由银杏叶或银杏叶浸膏制备银杏内酯A、B的方法。将银杏内酯制成注 射剂，非常重要的一项技术问题是如何解决其难溶性，到目前为止，银杏内酯注射剂制备过 程当中，对于助溶剂的选择也非常重要，这直接影响到产品的稳定性和临床疗效。根据银杏内酯的内酯环结构，一般很容易想到用酸或碱使其开环，或者用有机溶 剂溶解，但是它在一般的有机溶剂中溶解性也很差，如在聚乙二醇400，甘油，乙醇，丙二醇 中的溶解度都很小。所以，目前银杏内酯制备注射剂的方法有通过使用碱溶液增加银杏内 酯的溶解性而制得，例如CN200510040497. 0，CN02134223. 7，CN02134223. 7 ；在加入葡甲胺 的情况下，银杏内酯的溶解性也能得到很好的增加，例如CN02128962.X;对银杏内酯采用 羟丙基_ β _环糊精增溶也可制得其水溶液，例如CN200510072466. 3，CN200410013937. 9， CN200410041120. 2 ；另外，CN0310034. 6公开针剂中含有5-99%银杏叶提取物、1-95%泊洛 沙姆188和PH值调节剂以及其它赋形剂；CN03137720. 3 一种银杏内酯B针剂的制备方法， 将银杏内酯B原料溶解于注射用水溶剂聚乙二醇中，聚乙二醇可单独使用或与无水乙醇配 成混合溶剂，按体积计，聚乙二醇乙醇=0. 5 0. 5 0. 9。但是，加碱或加葡甲胺都属于让内酯环开环成盐，在中性或酸性条件下，很难再形 成有效形势的内酯原形，甚至没有白果内酯。并且，在银杏叶提取过程中，白果内酯极易水 解或氧化。而白果内酯是目前最受关注的化学成分，动物试验报导，白果内酯具有促进神经 生长的作用，以及防止脑、脊髓神经脱髓鞘的作用，其神经营养、神经保护作用比银杏内酯 强，目前国际上对银杏提取物的要求是，白果内酯含量为2. 6-3.2%。国内外上市的银杏叶 提取物注射剂，主要有国产舒血宁注射液与德国威玛舒培大药厂生产的金纳多注射液。由于 注射液生产过程中需要高温灭菌，其中银杏内酯中白果内酯及银杏内酯B等活性成分大部分 被破坏，制剂中含量很低。对于银杏叶提取物活性成分萜类内酯类，金纳多注射液因制剂工艺 不过关，银杏内酯大部分被破坏，成品质量标准中不检测其总萜内酯；国产舒血宁注射液仅 要求检测银杏内酯A的含量。经检测，以上两种产品白果内酯及银杏内酯B的含量都很低。为了解决纯度问题和有效性问题，本发明公开了一种银杏总萜内酯的精制方法， 以及用该总萜内酯制成稳定的注射剂，而且，其成分与银杏叶中各组分比例非常接近。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是克服现有提取分离技术中纯度不高、有效成 分容易被破坏以及注射剂不稳定等的不足，提供一种综合运用多种技术手段提取、分离银 杏总萜内酯的方法。本发明所涉及的提取分离银杏总萜内酯的方法，包括如下步骤1)取银杏叶，加乙醇和枸橼酸或酒石酸，回流提取，浓缩醇提液；2)步骤1)浓缩物上大孔树脂柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；3)步骤2)浓缩物上硅胶柱，乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，干燥；4)步骤3)干燥物经乙醇溶解，加水，放置，得第一次结晶产物；母液回收乙醇，水 液冷沉，得第二次结晶产物；合并两次结晶产物即得银杏总萜内酯。优选地，步骤1)所述乙醇的浓度为60% 80%，所述枸橼酸或酒石酸的加入量为0. ；优选地，步骤1)浓缩醇提液的比例为与药材比为1 0. 8 1 ；优选地，步骤2)洗脱时用水洗3 5倍柱体积，再以20%的乙醇洗脱3 5倍柱 体积，除杂，弃去，然后用75%的乙醇洗脱3 6倍的柱体积；优选地，步骤3)所述样品上硅胶柱前，将步骤2)所得提取物加适量的水，以适量 的硅胶充分拌勻，真空干燥后上硅胶柱；本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种含有上述银杏总萜内酯的注射剂。 由于银杏萜内酯微溶于水，所以怎样增加其在注射溶剂中的溶解度是制备注射剂的关键。本发明所涉及的含有银杏总萜内酯的注射剂，它由以下成分组成
银杏总萜内酯0. 8% 1. 2%
赋形剂10% 60%
PH调节剂适量
抗氧化剂0. 02% 0. 04%
注射用水40% 89%
其中，所述赋形剂包括乙二醇、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇中的-
PH调节剂为以下缓冲液的一种磷酸氢钠-磷酸二氢纳、枸橼酸_枸橼酸钠或醋酸_醋酸 钠，PH调节剂的用量为使得注射液的PH调至3. 5 5.0即可；所述抗氧化剂为亚硫酸氢钠、 乙二胺四乙酸二钠中的一种。优选地，所述PH调节剂为以下缓冲液的一种PH3. 2 4. 8的磷酸氢钠-磷酸二 氢纳、PH4. 4 4. 8的枸橼酸-枸橼酸钠、PH3. 8 5. 2的醋酸-醋酸钠。与现有技术比较，本发明方法具有以下的显著的进步1)白果内酯和银杏内酯分子结构中有很多手性碳，内酯环的断裂或是构象改变都 可能影响到其药理、药效，本发明创造性地使用缓冲溶液调PH值至3. 5 5. 5，能有效地避 免内酯环的断裂，从而使所得注射剂疗效更佳；2)采用大孔树脂和硅胶柱两种柱层析方法组合进行除杂，能最大程度地除去杂 质；大孔树脂柱能有效地吸附内酯和黄酮类等极性相对较小的物质，能除去糖类和氨基酸 等极性比较大的杂质；硅胶柱能有效地除去银杏黄酮苷类杂质；3)采用分步结晶的方式使内酯类成分逐个析出，使得内酯类成分纯度更高，杂质 更少；4)与现有的银杏注射剂相比较，用本发明所得到的总萜内酯含量高，成分全，经测 定，其总萜内酯含量达到85%以上，其中，不仅含有白果内酯，也含有银杏内酯A、B、C等，与 银杏叶各组分比例最为接近。5)因萜内酯难溶于水，且不稳定，本发明采用了复合溶媒制成注射液，从而有效地 提高了萜内酯的溶解度和注射剂的稳定性；6)在提取前，在乙醇中添加了适量的枸橼酸、酒石酸，可以有效地阻止白果内酯的 水解，使内酯的比例与叶中天然比例基本一致。
具体实施例方式实施例1银杏总萜内酯的制备
1)取干燥银杏叶10千克，加60%的乙醇回流提取两次，每次回流提取1小时，第 一次加醇量为50千克(其中加枸橼酸50克，即0. 1 %的枸橼酸)，第二次加醇量为40千克 (其中加入枸橼酸40克，即0. 1 %的枸橼酸)，合并两次醇提取液，以200目的滤布滤过，在 0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至8千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(AB-8型)10千克，湿法装柱，上样，流速为120ml/min，然 后，先后以水洗脱30千克，流速为250ml/min，以20%的乙醇洗脱30千克，流速为280ml/ min，弃去，然后以70 %的乙醇洗脱30千克，流速为260ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5公斤的样品，调整 流速为ISOml/min，上样完毕，以30千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液，在 0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真空 干燥，得干燥物385克，待用。4)将上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入360克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. O克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为95.6%。实施例2银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加80%的乙醇回流提取两次，每次回流提取2小时，第 一次加醇量为90千克(其中加枸橼酸900克，即的枸橼酸)，第二次加醇量为70千克 (其中加入枸橼酸700克，S卩1 %的枸橼酸)，合并两次醇提取液，以200目的滤布滤过，在 0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至10千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(D-101型)10千克，湿法装柱，上样，流速为120ml/ min,然后，先后以水洗脱50千克，流速为250ml/min，以20 %的乙醇洗脱50千克，流速为 280ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱60千克，流速为260ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5公斤的样品，调整 流速为ISOml/min，上样完毕，以60千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液，在 0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真空 干燥，得干燥物412克，待用。4)将上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入360克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯58. 5克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为95. 1%。实施例3银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加70%的乙醇回流提取两次，每次回流提取1. 5小时，第一次加醇量为70千克(其中加枸橼酸350克，即0. 5%的枸橼酸)，第二次加醇量为60 千克(其中加入枸橼酸300克，即0. 5%的枸橼酸)，合并两次醇提取液，以200目的滤布滤 过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至9千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(HPD-100型)10千克，湿法装柱，上样，流速为120ml/ min，然后，先后以水洗脱40千克，流速为260ml/min，以20 %的乙醇洗脱40千克，流速为 280ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱40千克，流速为260ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5. 2公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5. 2公斤的样品，调 整流速为ISOml/min，上样完毕，以40千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真 空干燥，得干燥物395克，待用。4)将上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入365克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. 6克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为96.5%。实施例4银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加75%的乙醇回流提取两次，第一次回流提取2小时， 第二次每次回流提取1. 5小时，第一次加醇量为80千克(其中加酒石酸480克，即0. 6%的 枸橼酸)，第二次加醇量为60千克(其中加入酒石酸360克，即0. 6%的枸橼酸)，合并两次 醇提取液，以200目的滤布滤过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩 至8. 6千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(HPD-100型)10千克，湿法装柱，上样，流速为115ml/ min，然后，先后以水洗脱30千克，流速为260ml/min，以20 %的乙醇洗脱60千克，流速为 290ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱50千克，流速为275ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至4. 9公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述4. 9公斤的样品，调 整流速为175ml/min，上样完毕，以50千克乙酸乙酯洗脱，流速为250ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压，95°C真 空干燥，得干燥物398克，待用。4)将上述干燥物以1150克乙醇溶解，加入365克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯61. 6克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为94. 1%。实施例5银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加85%的乙醇回流提取两次，第一次回流提取1. 5小
7时，第二次每次回流提取2小时，第一次加醇量为90千克(其中加酒石酸720克，即0. 8% 的酒石酸，第二次加醇量为50千克(其中加入酒石酸400克，即0. 8%的酒石酸)，合并两 次醇提取液，以200目的滤布滤过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓 缩至9. 15千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(HPD-100型)10千克，湿法装柱，上样，流速为125ml/ min，然后，先后以水洗脱40千克，流速为260ml/min，以20 %的乙醇洗脱40千克，流速为 290ml/min,弃去，然后以70%的乙醇洗脱60千克，流速为275ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至5. 05公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述5. 05公斤的样品，调 整流速为185ml/min，上样完毕，以55千克乙酸乙酯洗脱，流速为2650ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C 80°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压， 95°C真空干燥，得干燥物402. 5克，待用。4)将上述干燥物以1180克乙醇溶解，加入375克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. 8克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为94.7%。实施例6银杏总萜内酯的制备1)取干燥银杏叶10千克，加80%的乙醇回流提取两次，第一次回流提取1. 5小 时，第二次每次回流提取1小时，第一次加醇量为80千克(其中加酒石酸720克，即0. 9% 的酒石酸，第二次加醇量为80千克(其中加入酒石酸720克，即0. 9 %的酒石酸)，合并两 次醇提取液，以200目的滤布滤过，在0. 06 0. 08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓 缩至9. 26千克，待用。2)取处理好的大孔树脂(AB-8型)10千克，湿法装柱，上样，流速为135ml/min，然 后，先后以水洗脱50千克，流速为260ml/min，以20%的乙醇洗脱50千克，流速为290ml/ min，弃去，然后以70 %的乙醇洗脱60千克，流速为275ml/min，收集洗脱液，在80°C， 0. 06 0. 08个大气压下减压回收醇洗脱液，浓缩至4. 98公斤，待用。3)准确称量200目的硅胶H 3千克，湿法装柱，缓缓加入上述4. 98公斤的样品，调 整流速为195ml/min，上样完毕，以60千克乙酸乙酯洗脱，流速为255ml/min，收集洗脱液， 在0. 06个大气压、70°C 80°C减压回收乙酸乙酯，将乙酸乙酯洗脱液浓缩，0. 08个大气压， 95°C真空干燥，得干燥物399. 5克，待用。4)将上述干燥物以1180克乙醇溶解，加入375克水，常温下放置20小时，得一次 结晶产物(主要含银杏内酯A、B、C)；母液在旋转挥发仪上减压回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小时，过滤，得第二次结晶产物(含白果内酯，以及少量的银杏内酯A、B、C)，合并上 两次结晶产物，即得干燥的银杏总萜内酯60. 2克，备用。经高效液相测定(参考中国药典2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，其白 果内酯、银杏总内酯A、B、C四种萜内酯总的含量为94. 1%。实施例7银杏总萜内酯注射液的制备
处方银杏萜内酯60. 0克1，2_ 丙二醇2500 毫升95%的乙醇500毫升磷酸氢钠_磷酸二氢纳缓冲溶液适量注射用水2000毫升_制成500支(10毫升/支)取上述实施例1制备的总萜内酯提取物60. 0克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加 入1，2-丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、1，2-丙二醇和乙醇的用量比例混为，注 射用水乙醇(95%) 1，2_丙二醇=5 1 4，即在60克总萜内酯提取物中加入2500 毫升的注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。加入亚硫酸氢钠1克， 即0. 02%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为3. 2的磷酸氢钠-磷酸二氢纳缓冲溶液，调PH至 3.5，以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装， 灭菌(105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定， 每支含银杏总萜内酯约58. 15毫克。实施例8银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯58. 5克1，2_ 丙二醇2000 毫升95%的乙醇500毫升枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液适量注射用水2500毫升_制成500支(10毫升/支)取实施例2制备的总萜内酯提取物58. 5克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入1， 2丙二醇，最后加如注射用水，其中注射用水、1，2丙二醇和乙醇用量比例为，注射用水乙 醇(95%) 1，2丙二醇=6 1 3，即在60克总萜内酯提取物中加入2500毫升的注射用 水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。并加入亚硫酸氢钠1. 75克，即0.025% 的比例，搅拌，并缓缓加入PH为4. 8的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，调PH至5. 0，以0. 22微 米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装，灭菌(105°C下 30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定(参考中国药典 2005版第221页银杏叶萜类内酯的测定)，每支含银杏总萜内酯约56. 03毫克。实施例9银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯60. 6克1，2_ 丙二醇2000 毫升醋酸-醋酸钠缓冲溶液适量注射用水3000毫升_制成500支(10毫升/支) 取实施例3制备的总萜内酯提取物60. 6克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入1，2丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、1，2丙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用 水乙醇(95%) 1，2丙二醇=6 1 3，即在60克总萜内酯提取物中加入3000毫 升的注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1800毫升。加入亚硫酸氢钠1. 5克， 即0. 03%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为4. 4的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，调PH至4. 5， 以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装，灭菌 (105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定，每支含 银杏总萜内酯约58. 12毫克。实施例10银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯61. 6克聚乙二醇1500毫升醋酸-醋酸钠缓冲溶液适量注射用水3500毫升_制成500支(10毫升/支)取实施例4制备的总萜内酯提取物61. 6克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入1， 2丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用水乙 醇(95%)乙二醇=6 1 3，即在60克总萜内酯提取物中加入3000毫升的注射用水， 95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1500毫升。加入EDTA_Na2(乙二胺四乙酸二钠)1.5 克，即0. 03%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为3. 8醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调PH至4. 0，以 0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过，灌装，灭菌 (105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法测定，每支含 银杏总萜内酯约58. 35毫克。实施例11银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯60. 8克95%的乙醇500毫升枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液适量注射用水4500毫升_制成 500支(10毫升/支)取实施例5制备的总萜内酯提取物60. 8克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入聚 乙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用水乙 醇(95%)乙二醇=5.5 1 3. 5，即在60克总萜内酯提取物中加入2750毫升的注 射用水，95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1750毫升。加入EDTA_Na2 (乙二胺四乙酸二 钠)2. 0克，即0. 04%的比例，搅拌，并缓缓加入PH为4. 8枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，调 PH至5.0，以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过， 灌装，灭菌(105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法 测定，每支含银杏总萜内酯约60. 80毫克。实施例12银杏总萜内酯注射液的制备处方银杏萜内酯60. 2克
10
1，2_ 丙二醇1500 毫升95%的乙醇500毫升磷酸氢钠-磷酸二氢纳缓冲溶液 适量注射用水3000毫升_制成500支(10毫升/支)取实施例6制备的总萜内酯提取物60. 2克，先以95%的乙醇溶解，再缓缓加入聚 乙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混为，注射用水乙 醇(95%) 1，2_丙二醇=5 1 4，即在60. 2克总萜内酯提取物中加入2500毫升的 注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。加入EDTA_Na2(乙二胺四乙酸 二钠)1. 75克，即0. 035 %的比例，搅拌，并缓缓加入PH为5. 2醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调 PH至5.3，以0. 22微米的醋酸纤维素钠滤膜滤过，在以超滤膜(截留分子量为一万)滤过， 灌装，灭菌(105°C下30分钟)，即得10毫升银杏总内酯注射液成品500支，经高效液相法 测定，每支含银杏总萜内酯约57. 93毫克。实施例13银杏总萜内酯注射液的稳定性考察室温留样考察将灌封好的样品置于公司实验室室温留样室(温度25°C 士2°C， 60士 10%RH)，分别于第3、6、9、12、18个月定期取样检测，并与0月结果比较，见表1。由稳 定性试验结果可知，以本方法制成的银杏萜内酯注射剂，其在PH值为4. 5左右时，稳定性良 好。第0、3、6、9、12、18个月的样品取样时间分别为2007年3月20日、2007年6月20 日、2007年9月20日、2007年12月20日、2008年6月20日。样品为鲁南厚普制药有限公 司厚普实验室自制，处方、工艺见实施例9。表1、银杏总萜内酯注射液稳定性试验分析(室温)
权利要求
一种提取银杏总萜内酯的方法，其特征在于，包括如下步骤1)取银杏叶，加乙醇和枸橼酸或酒石酸，回流提取，浓缩醇提液；2)步骤1)浓缩物上大孔树脂柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；3)步骤2)浓缩物上硅胶柱，乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，干燥；4)步骤3)干燥物经乙醇溶解，加水，放置，得一次结晶产物；母液回收乙醇，水液冷沉，得第二次结晶产物；合并两次结晶产物即得银杏总萜内酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述乙醇的浓度为60% 80%，所 述枸橼酸或酒石酸的加入量为0. (重量/体积百分比)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)醇提浓缩液的重量与药材的重量比 为 1 0. 8 1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)洗脱时先用水洗3 5倍柱体积，除 杂，弃去；再以20%的乙醇洗脱3 5倍柱体积，除杂，弃去。然后用75%的乙醇洗脱3 6倍的柱体积，收集醇洗脱液，浓缩，待用。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述样品上硅胶柱前，将步骤2)所 得提取物加适量的水，以适量的硅胶充分拌勻，真空干燥后上硅胶柱。
6.一种含有银杏总萜内酯的注射剂，其特征在于，它由以下组分组成银杏总萜内酯0.8% 1.2%赋形剂10% 60%PH调节剂适量抗氧化剂0.02% 0.04%注射用水40% 89%其中，所述赋形剂包括乙二醇、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇中的一种或两种，所述PH 调节剂为以下缓冲液的一种磷酸氢钠_磷酸二氢纳、枸橼酸_枸橼酸钠或醋酸_醋酸钠， PH调节剂的用量为使得注射液的PH调至3. 5 5. 0即可；所述抗氧化剂为亚硫酸氢钠、乙 二胺四乙酸二钠中的一种。
7.如权利要求6所述的注射剂，其特征在于，所述PH调节剂为以下缓冲液的一种 PH3. 2 4. 8的磷酸氢钠-磷酸二氢纳、PH4. 4 4. 8的枸橼酸-枸橼酸钠和PH3. 8 5. 2 的醋酸-醋酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种提取银杏总萜内酯的方法及含有该银杏总萜内酯的注射剂，属于中药技术领域。本发明克服了现有提取分离技术中纯度不高、有效成分容易被破坏以及注射剂不稳定等的不足，提供了一种综合运用多种技术手段提取、分离银杏总萜内酯的方法。另外，本发明公开了用该方法制备的一种含有银杏总萜内酯的注射剂。与现有的银杏注射剂相比较，用本发明所得到的注射剂，具有总萜内酯含量高、成分全的优点，经测定，其总萜内酯的含量能达到85％以上。
文档编号A61P25/28GK101926835SQ20091014947
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者李守信, 苏瑞强, 赵志全 申请人:山东新时代药业有限公司
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