芝麻油在制备改善骨力学性能预防骨折的药物制剂中的应用的制作方法

专利名称：：芝麻油在制备改善骨力学性能预防骨折的药物制剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉芝麻油在制备改善骨力学性能预防骨折的药物制剂中的应用。
背景技术：
：糖皮质激素是临床常用的药物，长期应用可导致药物性骨质疏松，易引起病理性骨折，致残率极高，目前还没有理想的防治药物，芝麻油俗称香油，是以芝麻为原料加工制成的食用植物油。艺麻油中含有芝麻素(sesamin)、芝麻林素(sesamolin)、芝麻酚(sesamol)等木酚素类物质。研究表明，芝麻素具有降低胆固醇、抗高血压、抗菌及抗氧化、保护肝脏、抑制乳癌以及免疫激活等生理作用，对高血压、高血脂、动脉硬化、动脉钙化等症都有一定疗效。近年来研究发现高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病与骨质疏松有密切的联系。本项目研究人员用糖皮质激素建立大鼠骨质疏松动物模型，探讨芝麻油对大鼠糖皮质激素性骨质疏松的防治作用，发现芝麻油对糖皮质激素导致的大鼠生长发育延缓，体重减轻有明显的保护作用，可使应用糖皮质激素的大鼠体重明显增长，联合应用皮质激素和芝麻油后大鼠单位骨中钙含量高于单独应用激素组，同时骨中的羟脯氨酸含量明显高于单独应用激素组和正常对照组。联合应用皮质激素和芝麻油组与单独激素组对比各部位骨密度增加，以股骨近端2cm骨密度增加最明显。联合应用皮质激素和芝麻油组与单独应用激素组相比骨生物力学指标中最大载荷增大，弹力载荷增大，刚度系数增大。研究结果表明，芝麻油具有预防糖皮质激素对骨的损害，改善骨力学性能，并可预防骨折致大鼠骨质疏松的作用。由于糖皮质激素可以溶解于芝麻油中，芝麻油可以作为糖皮质激素药物注射剂的辅料，制备成能改善骨力学性能预防骨折的皮质激素类注射剂，同时，也可以制备成其他药物制剂，以达到保护骨骼不受损害的目的
发明内容发现芝麻油具有改善骨力学性能预防骨折的作用。芝麻油可以通过下述方法制备方法l:取成熟芝麻，17(TC烘烤20分钟至香熟，粉碎后芝麻酱按总重量85%分两次加水，并在80'C水浴中保温搅至油出，离心，取上油层，作为实验用芝麻油。方法2:取成熟芝麻粉碎，80'C干燥20min，取石油醚按料液比h12加入，静置，超声45min，抽滤，减压挥尽溶剂，即得芝麻油，作为实验用的芝麻油。方法3:取成熟芝麻，170'C烘烤20分钟至香熟，粉碎，10倍70。/。乙醇浸泡24小时，加热回流提取2次，过滤，保留滤液。滤渣按总重量85%分两次加水，并在80。C水浴中保温搅至油出，离心，取上油层，与第一次乙醇提取的滤液混合，得实验用的芝麻油。本项目组通过糖皮质激素建立大鼠骨损害的模型，应用糖皮质激素导致大鼠出现生长抑制，骨钙和骨羟脯氨酸大量丢失，骨的生物力学性能严重受损的状态，然后，按照我们前面芝麻油制备方法制备出供实验用的芝麻油，在给予糖皮质激素的同时，给予芝麻油进行预防，结果表明芝麻油对糖皮质激素导致的大鼠生长发育延缓，体重减轻有明显的保护作用，可以增加糖皮质激素大鼠单位骨中f丐和羟脯氨酸的含量，增加骨密度，改善骨生物力学功能，是骨的最大载荷，弹力载荷，刚度系数均能得到明显的改善和恢复，从而达到预防骨折的目的。本发明提出了芝麻油可用于制备改善骨力学性能预防骨折的药物，可用于防治药物性骨质疏松症，特别是制备防治糖皮质激素导致的骨质疏松，股骨头坏死，骨折等方面的药物制剂，芝麻油作为药物或保健食品时，可制成临床其他可接受的药物制剂，如滴丸、胶囊剂、注射剂、片剂、丸剂、冲剂、颗粒剂、皮肤外用制剂中的任何一种，供临床应用。也可以作为糖皮质激素药物制剂的辅料，添加进糖皮质激素的药物制剂中，组成新型的糖皮质激素制剂，供临床应用。具体实施例方式实施例一-1材料与方法1.1实验动物与饲养条件SPF级^SD大鼠32只，3月龄(由广东医学院实验动物中心提供)。分笼饲养，每笼八只，隔日更换垫料，自由摄水、摄食。1.2芝麻油的制备方法参照本专利申请提出的芝麻油的生产方法生产出供实验应用的芝麻油。1.3实验方法1.3.1分组与给药32只SPF级雄性SD大鼠，随机分为正常对照组(NS)、醋酸泼尼松组(GC)、芝麻油组(GC+ZMY)、辛伐他汀组(GC+ST)，每组8只。每周称体重一次，NS组按体重上午给予蒸馏水5ml/kg,d灌胃，GC组按体重给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/.kg.d灌胃。用药组先给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/kg.d灌胃后3小时，分别给芝麻油5ml/.kg.d，或辛伐他汀制剂按5mg/kg.d灌胃。1.3.2单位骨中骨矿及羟脯氨酸含量的测定方法88天后心脏抽血处死大鼠，取左尺骨精密称取湿重，记录，8(TC烘烤72h至恒重，再次精密称取恒重并记录，置10ml安瓿瓶中加6mo1/1盐酸5ml，密封，108'C烤箱恒温消化24h后取出过2(^1玻璃纤维滤膜。滤液分成两份，一份以1:200稀释后用ICP仪测定Ca、P元素的含量，再依据标准品含量及样品稀释倍数计算Ca、P元素的含量；另一份滤液以1:10稀释，按照试剂盒说明书操作，计算骨中羟脯氨酸含量。1.3.3骨密度检测方法取大鼠左股骨用生理盐水湿纱布包裹，锡纸包裹，保存于-7(^C,测试时常温解冻，用生理盐水复湿，于骨密度仪上检测，选取股骨全段、股骨近端2cm及远端lcm作为平均骨矿物质密度值测量点。1.3.4骨生物力学测定方法取大鼠右股骨用生理盐水湿纱布包裹，锡纸包裹，保存于-70Gc,测试时常温解冻，去除肌肉、韧带，生理盐水复湿。用858MiniBionix型材料测试系统检测和分析右股骨的生物力学性能。测试采用三点弯曲法，将大鼠右股骨置于MTS试验机上，用lmm直径的压头，加载速度为0.01mm/s，跨距(L)为15mm。仪器自动记录每个时刻点的载荷(F)和桡度(d)变化值。通过测力盘及计算机采集、输出的载荷-位移曲线读取、记录弹性载荷、断裂载荷、最大载荷及位移，并计算弯曲能量和刚度系数值。1.3.5统计学处理计量资料数据结果用均数±标准差(；±》表示，数据分析用SPSS12.0软件进行检验，尸<0.05，尸<0.01表示具有统计学意义。2实验结果2.1醋酸泼尼松及药物对大鼠体重的影响醋酸泼尼松及药物对大鼠体重的影响结果见表1:表l醋酸泼尼松及药物对大鼠体重的影响(;c士"组别n实验前体重(g)实验终体重(g)体重变化率(％)NS8253±14.6320±14.620.7GC8259±17.4279±41.7**6.63GC+ZMY8257±26.3367±14.7**"29.2GC+ST8254±16.9288±32.7**11.0注*户<0.05，*氺尸O.Olw.NS;AP<0.05，'"f<0.01GC(下同)由表1可见，到实验结束前所有组体重比实验开始时均上升，但GC体重变化率比NS及用药组小，且糖皮质激素组体重显著低于对照组及用药组(尸O.Ol)。GC+ZMY、GC+ST体重上升，GC+ZMY组远高于NS(PO.Ol)。2.2醋酸泼尼松及药物对大鼠单位骨中骨矿及骨羟脯氨酸的影响醋酸泼尼松及药物对大鼠单位骨中骨矿及骨羟脯氨酸的影响结果见表2:表2醋酸泼尼松及药物对大鼠单位骨中骨矿及骨羟脯氨酸的影响(5i5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2可见，GC组单位骨中钙含量明显低于NS组(尸O.Ol)，骨磷含量与NS组差异无统计学意义。GC+ZMY，GC+ST组中单位骨中钙含量高于GC，但未具有统计学意义，骨磷含量低于GC组和NS组(尸<0.01)，GC+ZMY组羟脯氨酸含量明显高于正常NS组和GC组(PO.Ol)，GC+ST组Hyp含量变化不明显。表3醋酸泼尼松及药物对大鼠单位骨中骨鈣磷比例及无机质与有机质比例的影响(Si^<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表3可见，GC组单位骨中Ca/P降低(PO.Ol),无机质与有机质Ca/Hyp比例变化不明显。GC+ZMY组Ca/P明显升高(PO.Ol)，Ca/Hyp明显降低(P<0.05)。GC+ST组Ca/P明显升高(P<0.01)，Ca/Hyp比例变化不明显。2.3醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨各部位密度的影响醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨各部位密度的影响结果见表4:表4醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨各部位密度的影响(S士"<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表3可见，与NS比较，GC股骨全段、近端2cm及远端1cm所测得的骨密度有不同程度的降低。GC股骨全段骨密度减小5.18%(P<0.05)，股骨远端1cm处骨密度减小7.86%(户O.OO，而股骨近端2cm处骨密度有所下降，但差异无统计学意义；GC+ZMY各部位骨密度有所增加，股骨近端2cm处增加明显(户O.01);GC+ST以股骨远端lcm及股骨近端2cm骨密度增加明显(尸<0.05，尸O.Ol)。2.4醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨生物力学的影响醋酸泼尼松对大鼠股骨生物力学的影响结果见表5:表5醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨生物力学的影响O士s)组别n最大载荷(N)断裂载荷(N)弹性载荷(N)弯曲能量(N承mm)刚度系数(N/mm)NS8159±17,2136±12.6107±10.011.8±2.08528±82.9GC8141±12.8*129±22.183±14.5**8.9±3.65*433±92.2*GC+ZMY8173±5.5"*135±23.1105土10.7"11.7±2.13520±55.6AGC+ST8148±12.1127±18.292.7±8.3**11.2±1.65420±62.9**由表4可见，与NS相比，GC股骨的最大载荷减小10.78%(P<0.05)，弹性载荷减小22.53%(PO.01),弯曲能量减小24.94%(P<0.05)，断裂载荷较NS虽有减小，但差异无统计学意义，刚度系数减小18.03%(P<0.05)。GC+ZMY与GC相比最大载荷增大22.34%(P<0.01)，弹力载荷增大27.10%(P<0.01),刚度系数增大20.12%(P<0.05)，断裂载荷、弯曲能量虽有增大的趋势，但差异无统计学意义。GC+ST各项指标比GC组有增长的趋势，但差异无统计学意义。3讨论3.1长期应用醋酸泼尼松对大鼠体重及骨质量的影响在本次实验中，我们观察到，醋酸泼尼松模型组大鼠在用药期间，生长受到抑制，体重呈现明显的下降趋势。在实验用药结束前，模型组大鼠体重明显低于对照组及其余各组大鼠。以往研究认为长期应用糖皮质激素会抑制下丘脑-垂体生长激素的分泌，从而影响生长发育，导致生长延迟。本次实验结果显示与正常对照组比较，GC组大鼠单位骨中钙(P<0.01)及羟脯氨酸(P<0.05)含量减少，显示骨的矿物质与胶原成分减少，骨质明显下降，单位骨中钙/磷比值降低(PO.Ol)。骨主要由无机成分和有机成分及少量水分子构成。无机成分约占70%,主要为羟磷灰石结晶和少许无机离子。有机成分约占30%，其中98%为1型胶原纤维和非胶原蛋白。骨的矿化实际上就是以Ca，P等无机物以晶体形式沉积在骨基质的过程，骨盐沉积的增加会导致骨重的增加。因此股骨干重和骨含量是可以间接反映骨量变化及骨矿化程度的指标。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组成部分，因此骨中的羟脯氨酸含量变化就直接反映了骨有机质的代谢情况，并间接反映了成骨细胞的功能活动变化。骨中的微量元素与骨的矿化、骨基质形成甚至骨的吸收都有着密切的联系。上述结果显示，长期超生理剂量的使用糖皮质激素，使大鼠骨有机成分和无机成分均降低，引起骨质量下降，容易导致骨折及骨损害。本次实验结果显示GC组股骨全段骨密度减小5.18%(尸<0.05)，股骨远端lcm处骨密度减小7.86%(PO,OI)，而股骨近端2cm处骨密度减小的差异无统计学意义，证实糖皮质激素性骨质疏松患者骨的总量明显减少，但各部位骨丢失率并不相同，松质骨的骨量丢失早于皮质骨[131。使用糖皮质激素后，大鼠的骨密度降低可能是由于糖皮质激素增加了破骨细胞的活性，导致骨吸收超过骨形成的骨转换速率，使溶骨过程加速和骨吸收增加，进而使骨髂系统释放碱性骨盐增加，钙磷代谢异常，尿中排出增加而出现骨矿含量减少。本次实验观察到，与正常对照组相比GC组股骨结构性能指标中的最大载荷减小10.78%(尸<0.05)，弹性载荷减小22.53%(户<0.01)，弯曲能量减小24.94%(尸<0.05)，GC组大鼠股骨材料力学刚度系数减小18.03%(P<0.05)，说明长期应用糖皮质激素降低骨的力学特性。骨生物力学研究骨组织在外界作用力下的力学特性和骨受力后的生物学效应，是对骨质量进行评价的一种可靠方法。近年来有不少学者提出骨质疏松发生时有骨量的减少与骨结构的改变均可直接影响骨的生物力学性能使骨的力学强度降低。GC组大鼠骨生物力学降低，有力的说明了长期超生理剂量的使用糖皮质激素显著影响了大鼠的生物力学特性，使其在遭受外力的情况下本身的抵抗性减弱，容易发生骨折。3.2芝麻油具有预防醋酸泼尼松致大鼠骨质疏松的作用应用糖皮质激素后，同时应用芝麻油，可以观察到大鼠体重在芝麻油所用剂量下明显增长(尸<0.01)，芝麻油组单位骨中钙含量高于激素组，但不具有统计学意义，骨磷含量较低(尸O.Ol)，羟脯氨酸含量明显高于正常对照组和激素组(尸O.Ol)，Ca/P升高(尸O.Ol),Ca/Hyp降低(尸O.Ol)。芝麻油组与激素组对比各部位骨密度增加，以股骨近端2cm骨密度增加最明显(尸O.Ol)。芝麻油组与激素组相比最大载荷增大22.34%(PO.Ol)，弹力载荷增大27.10%(PO.Ol)，刚度系数增大20.12%(P<0.05)。由实验结果可见，芝麻油具有预防醋酸泼尼松致大鼠骨质量受损的作用。在本次实验中，我们观察到芝麻油组大鼠的体重明显高于激素组大鼠，甚至高于正常对照组大鼠(PO.01)。因此我们可以推论芝麻油可部分抵抗大剂量糖皮质激素的抑制生长的作用。钙、磷等无机矿物质主要通过骨矿化作用储存沉积于骨骼中，而成骨细胞分泌I型胶原相互交联形成间隙为0.5nm的骨基质框架是骨矿化发生的特定环境。芝麻油组的骨有机质和骨矿物质较激素组有明显增加，其原因可能由于芝麻中富含亚油酸、维生素E、维生素A、维生素B1、维生素B2和钙、磷、镁等矿物质，增加了肠道对钙、磷的吸收，以及促进骨胶原的形成矿化作用有关。骨密度因此也得到了加强。人们在研究糖皮质激素引起的骨质疏松的发生机制中发现，超生理剂量应用糖皮质激素在体内可以促进脂肪动员和脂肪分解，脂肪经脂肪酶作用分解成甘油和脂肪酸，为甘油三酯和胆固醇合成提供原料，脂肪酸增多，胆固醇合成增多，形成高胆固醇血症，引起体内脂肪沉积。同时糖皮质激素诱导骨髓基质细胞向脂肪分化，其机制也与PPARY2基因转录有关。在对骨质疏松发生机制的研究过程中，人们发现增龄、去卵巢及其他原因造成的骨质疏松都存在骨量减少和骨髓脂肪增加的现象。高脂血症患者体内骨髓基质细胞的成脂增多，成骨减少。从而引起骨量减少的主要原因。研究发现芝麻富含不饱和脂肪酸-油酸和亚油酸，另外还含有芝麻素、芝麻林素、芝麻酚、维生素E等抗氧化成份。亚油酸通过对LDL的修饰作用降低血脂，而芝麻素和芝麻酚具有降低TC，提高免疫功能和抗氧化功能。芝麻素在代谢中能抑制S-不饱和化酶反应促进一系列二十碳烯酸的生成，多不饱和脂肪酸具有促进类固醇和胆酸的排泄，防止体内胆固醇的合成和吸收避免因胆固醇的沉积而导致的动脉粥样硬化。另外芝麻木酚素亦具有抑制小肠吸收胆固醇、阻碍肝脏合成胆固醇作用和抗高血压作用。有人证明脂芝麻酚能有效降低高脂血症兔的TC含量，并能有效降低其氧化应激的敏感性。因此我们推测芝麻油预防糖皮质激素性骨损伤的机理可能是，芝麻油能抵抗机体脂质代谢紊乱，从而减少脂质在骨髓中的堆积，并通过对抗脂质过氧化物作用，有效防治骨丢失及骨损伤，改善骨质量，从而提高骨损伤与骨质疏松患者的生存质量。与芝麻油组比较，辛伐他汀组大鼠的骨羟脯氨酸骨Ca及骨生物力学性能无明显差异提示辛伐他汀对长期糖皮质激素在本实验中所应用的药物剂量灌胃造成的大鼠骨损伤和骨质疏松未发现有明显治疗作用。3-羟-3-甲戌二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是合成胆固醇的限速酶，抑制其活性可阻抑肝细胞合成胆固醇使胆固醇含量减少，他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂，本类药物是非常有效的降低血浆胆固醇的药物，是目前治疗高胆固醇血症的新型药物。近年来研究发现，他汀类药物在治疗骨质疏松症中也起到明显作用。他汀类药物具有刺激骨形成、恢复骨骼细微结构、增加骨强度及降低骨折风险等作用是一类新兴的极有潜力的促进骨形成药物。因此在本实验中我们选取了他汀类药物辛伐他汀作为阳性对照药物，研究结果表明，芝麻油保护糖皮质激素对骨的损伤作用比辛伐他汀的作用更好。研究表明，芝麻油可制成改善骨力学性能预防骨折的药物制剂，如滴丸、胶囊剂、注射剂、片剂、丸剂、冲剂、颗粒剂、皮肤外用制剂中的任何一种，供临床应用。也可以作为糖皮质激素药物制剂的辅料，添加进糖皮质激素的药物制剂中，组成新型的糖皮质激素制剂，供临床应用。权利要求1.芝麻油在制备改善骨力学性能预防骨折的药物制剂中的应用。2.如权利要求1所述的芝麻油，其特征是可以通过下述生产方法获得方法l:取成熟芝麻，17(TC烘烤20分钟至香熟，粉碎后芝麻酱按总重量85%分两次加水，并在8(TC水浴中保温搅至油出，离心，得芝麻油。方法2:取成熟芝麻粉碎，80'C干燥20min，取石油醚按料液比l:12加入，静置，超声45min，抽滤，减压挥尽溶剂，即得芝麻油。方法3:取成熟芝麻，170。C烘烤20分钟至香熟，粉碎，加10倍70%乙醇浸泡24小时，加热回流提取2次，过滤，保留滤液。滤渣按总重量85%分两次加水，并在8(TC水浴中保温搅至油出，离心，取上油层，与第一次乙醇提取的滤液混合，得芝麻油。3.如权利要求l所述的芝麻油可制成临床其他可接受的药物制剂，如滴丸、胶囊剂、注射剂、片剂、丸剂、冲剂、颗粒剂、皮肤外用制剂中的任何一种，供临床应用。4.如权利要求l所述的芝麻油可以作为糖皮质激素药物制剂的辅料，添加进糖皮质激素的药物制剂中，组成新型的糖皮质激素制剂，供临床应用。全文摘要本发明涉及芝麻油在制备改善骨力学性能预防骨折的药物制剂中的应用，研究发现芝麻油对糖皮质激素导致的大鼠生长发育延缓，体重减轻有明显的保护作用，可以增加糖皮质激素大鼠单位骨中钙和羟脯氨酸的含量，增加骨密度，改善骨生物力学功能，是骨的最大载荷，弹力载荷，刚度系数均能得到明显的改善和恢复，从而达到预防骨折的目的。本发明提出了芝麻油可用于制备改善骨力学性能预防骨折的药物，可用于防治药物性骨质疏松症，特别是制备防治糖皮质激素导致的骨质疏松，股骨头坏死，骨折等方面的药物制剂。芝麻油作为药物或保健食品时，可制成临床其他可接受的药物制剂，如滴丸、胶囊剂、注射剂、片剂、丸剂、冲剂、颗粒剂、皮肤外用制剂中的任何一种，供临床应用。也可以作为糖皮质激素药物制剂的辅料，添加进糖皮质激素的药物制剂中，组成新型的糖皮质激素制剂，供临床应用。文档编号A61K36/185GK101632694SQ200910149888公开日2010年1月27日申请日期2009年6月29日优先权日2009年6月29日发明者怡吴,铁吴,燎崔,张益嘉,琴李,华苏,华赵申请人:广东医学院