一种ha/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法
专利名称：一种ha/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及人工骨修复材料技术领域，具体是指一种HA(纳米羟基磷灰 石)/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法。技术背景临床上每年由有大量的病人因外伤、肿瘤以及其他疾病所造成的硬组织 缺损，因此，硬组织修复材料是国内外临床需求最大的修复材料之一。近几 年，由于传统骨修复材料存在着一些问题，骨组织工程支架成为了研究的一 个热点，其原理是以支架材料为载体结合有成骨潜力的种子细胞、生长因子， 通过体内或体外继续培养，构建有生命活力的仿生骨。胶原、壳聚糖及羟基磷灰石由于其良好的生物相容性等特点而广泛应用 于骨组织工程支架材料。基于天然骨的主要成分是胶原和羟基磷灰石，胶原/ 羟基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石复合支架成为研究的两个热点。目前胶原/ 羟基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石复合支架主要是通过羟基磷灰石粉体和胶原 或壳聚糖进行机械混合方式制备的。韩长菊，叶金凤，陈庆华，等.物理发泡 法制备羟基磷灰石/胶原蛋白多孔支架材料.佛山陶瓷，2006， 11 (119): 8-10，该文以氢氧化钙悬浮液和磷酸为主要实验原料用共滴定的方法合成羟 基磷灰石，然后把羟基磷灰石粉与一定量的胶原蛋白溶液混合，经过物理发 泡、冷冻、微波干燥的过程，得到气孔率为79% 89%的羟基磷灰石/胶原 蛋白多孔支架材料。赵峰，尹玉姬，宋雪峰，等.壳聚糖-明胶网络/羟基磷灰 石复合材料支架的研究一制备及形貌.中国修复重建外科杂志，2001， 15(5): 276-279，该文将平均粒度为2. 8 u m的羟基磷灰石粉体加入一定量去离子水 后搅拌并超声波处理，在处理后的乳液状混合物中加入CS和Gel (50 : 50 w/w )和适量乙酸后于4(TC水浴中搅拌，待有机物全部溶解后加入一定量戊 二醛溶液后冷冻干燥得到支架，结果显示，通过控制组分配比和预冷冻温度 可制备不同密度和孔隙率的CS-Gel/HA多孔支架。上述方法虽然在一定程度上得到了满足一定性能要求的复合支架，但是由于羟基磷灰石是以粉末形式 与胶原或壳聚糖基体复合的，因而实际上很难均匀分散并且和基体之间无法 形成有效键合。此外，胶原和壳聚糖还存在着一些缺点，胶原的力学强度较差，降解速 度过快，而壳聚糖缺乏骨键合生物活性，脆性大，且降解慢、亲水性差。因 而，改进胶原和壳聚糖本身的一些缺点也是胶原和壳聚糖基体复合支架需要 解决的问题，而将胶原和壳聚糖共混物同时作为复合支架的基体或者将两者 形成新的结构，则有望在一定程度上改善单纯胶原或壳聚糖做基体时力学强 度的问题，同时获得合适的降解速度。近年来，互穿网络聚合物发展十分迅 速，有望很好地解决上述问题。互穿网络聚合物是用化学方法将两种以上的 聚合物互相贯穿成交织网络状的一类新型复相聚合物材料，是聚合物共混改 性技术发展的新领域，为制造特殊性能的材料开拓了崭新的途径。然而；目 前互穿网络技术用于HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络骨组织工程支架的制备没有先例，如果能成功应用该技术，将实现在HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网 络骨组织工程支架中羟基磷灰石均匀分散，并在此基体中呈现羟基磷灰石颗 粒的定向排列以及与基体形成有效键合，则可望在解决现有胶原/羟基磷灰石 及壳聚糖/羟基磷灰石复合支架现有问题的基础上实现支架材料的稳定性、力 学性能的改善，也有望从结构和功能上实现纳米羟基磷灰石与基体的有效复合。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，通过研发一种结晶程度可 控、分散性好，能与高分子材料具有稳定键合的颗粒定向排列的纳米羟基磷 灰石溶胶，将溶胶均匀分散于胶原/壳聚糖的互穿聚合物网络基体中并与基体形成有效键合，从而提供一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方 法。实现本发明目的是通过如下措施来实现的。一种HA(纳米羟基磷灰石)/胶原/壳聚糖互穿 合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其工艺条件-步骤一HA溶胶的制备(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)同时为模板剂、分散剂和改性剂；(2) 配制0. 01 3mol/L的钙盐和0. 006 1. 8mol/L的磷酸盐溶液或配 制0。 01 3mol/L的钙盐溶液和0. 006 1. 8mol/L的磷酸；(3) 采用高速分散机，在碱液控制体系中，将上述(1) 、 (2)的物料 充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶；该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙 磷摩尔比达1.6 1.7:1，按质量百分比计聚乙烯吡咯垸酮含量为0.01 50Zo ;步骤二 HA溶胶的陈化上述溶胶在20 10(TC的温度下陈化至少24小时，然后用去离子水充分 洗涤溶胶得到颗粒定向排列的HA溶胶；步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型(1) 用醋酸溶液配制3mg/ml 10mg/ml的胶原溶液；(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 1 9:1的比例将壳聚糖加入到上 述(1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；(3) 将步骤二的HA溶胶与上述(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采 用高速分散机分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液,其中上述(2)的胶原/壳 聚糖共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0. 1 9:1;(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计含 量为0.01 1%的混合交联剂，所述混合交联剂是指1 —乙基一3— (3 — 二甲 基氨丙基)碳二亚胺和N—羟基琥珀酰亚胺在常温下搅拌交联至少12h的混 合溶液，其中l一乙基一3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟 基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为1 4:1;(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为0.01 1%的壳聚糖交联剂，并在常温下 搅拌交联至少12h;(6) 将上述(5)的经混合交联剂以及壳聚糖交联剂交联的HA/胶原/壳 聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于超低温冰箱中冷冻至少24小 时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，即得到HA/胶原/壳聚糖 互穿聚合物网络支架；步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用氨水或缓冲溶液浸 泡1 3小时，然后再用去离子水浸泡至少6小时，并至少每半小时换一次水；(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入超低温冰箱中冷冻至少 24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，最后得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架。为了更好地实现本发明；步骤一 (3)所述物料混合，聚乙烯吡咯垸酮的 加入有以下两种方式，择一使用-(1) 将聚乙烯吡咯烷酮加入到钙盐或磷酸盐溶液或磷酸中，或加入到钙 盐和磷酸盐或磷酸的混合溶液中；(2) 先配制聚乙烯吡咯烷酮水溶液，再用聚乙烯吡咯烷酮水溶液配制钙 盐和磷酸盐或磷酸溶液。所述钙盐为硝酸钙或氢氧化钙；磷酸盐采用磷酸氢二铵、磷酸氢二钠或 磷酸氢二钾。步骤二所述陈化有以下两种方式，择一使用-(1) 将纳米羟基磷灰石溶胶自然放置陈化；(2) 将纳米羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置陈化。 所述碱液控制体系pH值大于10. 5;所述碱液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。所述缓冲溶液为磷酸氢二钠、碳酸氢钠溶液。 所述高速分散机的速度范围为100 8000转/分。所述所采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的类型为K15、 K30、 K60或K90;所 述胶原为I型胶原。所述超低温冰箱中冷冻的温度范围为_5 °C _80°C 。所述壳聚糖交联剂为戊二醛或聚縮水甘油醚，其中聚縮水甘油醚是指聚 乙二醇双縮水甘油醚或聚丙三醇三縮水甘油醚。本发明与现有技术相比具有如下突出的优点1、本发明首次将互穿聚合物网络支架的制备技术成功应用到HA/胶原/ 壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备中，通过PVP的桥梁作用，使得羟基磷灰 石颗粒在胶原/壳聚糖互穿聚合物网络基体中分散良好且与基体之间形成有 效、稳定的键合，且羟基磷灰石在基体中颗粒呈现定向排列，从而在结构和功能上实现纳米羟基磷灰石与胶原/壳聚糖基体的有效复合。2、 本发明采用以羟基磷灰石溶胶的形式与胶原基体复合，解决了现有技 术中以羟基磷灰石粉末形式，采用普通机械搅拌混合制备的纳米羟基磷灰石/ 胶原支架中存在着羟基磷灰石与胶原基体之间无法形成有效键合，以及羟基 磷灰石颗粒只能松散的分布于胶原框架内，并不能有效地实现纳米羟基磷灰 石与胶原的有效复合的问题。3、 由于将互穿聚合物网络支架的制备技术应用到HA/胶原/壳聚糖互穿 聚合物网络支架的制备中，互穿聚合物网络是用化学方法将两种以上的聚合 物互相贯穿成交织网络状的一类新型复相聚合物材料，因而本发明制备的HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络骨组织工程支架解决了胶原及壳聚糖复合支架 力学性能不佳的问题，同时获得了合适的降解速度。4、 本发明采用具有优良的分散稳定性，良好的生物相容性和生理安全性 的聚乙烯吡咯烷酮作为模板剂、分散剂和改性剂，在改善材料性能的同时不 至于引起的生理毒性的问题。5、 本发明制备工艺简单，操作简捷，易于推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但实施方式并不仅限 于此。实施例1一种HA (纳米羟基磷灰石)/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方 法包括以下步骤及其工艺条件 步骤一HA溶胶的制备(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K15)同时为模板剂、分散剂、改性剂；(2) 使用去离子水配制含硝酸钙0.01mol/L，磷酸氢二铵0.006mol/L 的溶液，然后将O. lg PVP K15加入到上述硝酸钙溶液中充分溶解；(3) 采用100转/分的高速分散机，在氨水控制体系pH值为10.6条件 下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶， 使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.6:1，按质量百分比计聚乙 烯吡咯烷酮含量为0.01%;步骤二 HA溶胶的陈化上述纳米羟基磷灰石溶胶在2(TC的温度下，自然放置陈化24小时，然 后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石溶胶； 步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制3mg/ml的 胶原溶液；(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 1:1的比例将壳聚糖加入到上述(1) 的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液;(3) 将步骤二的HA与上述(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采用高 速分散机以100转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其中上述(2) 的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0. 1:1;(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0.01%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙 基—3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为1:1;(5) 在上述(4)经EDC+NHS交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液中再加入 按质量百分比计含量为0。01%的戊二醛溶液并在常温下搅拌交联12h;(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及戊二醛溶液交联的HA/ 胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-5'C的超低温冰箱中 冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，即得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用质量百分比浓度为 0.5%的氨水浸泡1小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少每半小时换一 次水；(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-5"C的超低温冰箱中冷冻 24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，最后得到HA/胶原/壳聚 糖互穿聚合物网络支架。实施例2--种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其工艺条件-
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用质量百分比0.5X的PVP K30水溶液配制含硝酸钙0. lmol/L， 磷酸氢二钠0. 06mol/L的溶液；
(3) 采用1000转/分的高速分散机，在氢氧化钠控制体系pH值为11的 条件下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶 胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.65:1，按质量百分比计 聚乙烯吡咯烷酮含量为0. 5°%;
步骤二 HA溶胶的陈化
将上述羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置，在5(TC蒸发回流36小 时陈化；然后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰 石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制4mg/ml的 胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 25:1的比例将壳聚糖加入到上述 (1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并 采用高速分散机以1000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0。25:l;
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0.05%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙 基一3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为2:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为O. 05%的聚乙二醇双縮水甘油醚并在常温 下搅拌交联12h;
(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚乙二醇双縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-l(TC的超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用浓度为0.05mol/L 的磷酸氢二钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少每半小 时换一次水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-l(TC的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，最后得到HA/胶原/壳 聚糖互穿聚合物网络支架。
实施例3
一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其 工艺条件
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K60)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用质量百分比5X的PVPK60水溶液配制含硝酸钙0.5mol/L，磷 酸氢二钾0. 3mol/L的溶液；
(3) 采用2000转/分的高速分散机，在氢氧化钾控制体系pH值为11. 5 条件下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶 胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.67:1，按质量百分比计 聚乙烯吡咯垸酮含量为5%;
步骤二 HA溶胶的陈化
将上述羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置，在7(TC蒸发回流48小 时陈化，然后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰 石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制5mg/ml的 胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 65:1的比例将壳聚糖加入到上述 (1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采用高速分散机以2000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0,65:1;
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0.1%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙基 —3— (3 —二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为4:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为0. 1%的聚乙二醇双縮水甘油醚并在常温 下搅拌交联12h;
(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚乙二醇双縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-2(TC的 超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用0. lmol/L的磷酸氢 二钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少每半小时换一次 水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-2CTC的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后得到HA/胶原/壳
聚糖互穿聚合物网络支架。 实施例4
一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其 工艺条件
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用去离子水配制含氢氧化钙lmol/L，磷酸0。6mol/L的溶液，然 后分别将5g PVP K90加入到上述氢氧化钙和磷酸溶液中充分溶解；
(3) 采用5000转/分的高速分散机，在氢氧化钾控制体系pH值为12的 条件下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶 胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.67:1，按质量百分比计聚乙烯吡咯烷酮含量为10%; 步骤二 HA溶胶的陈化
将上述羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置，在9CTC蒸发回流60小
时陈化，然后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰
石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制7mg/ml的 胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为1:1的比例将壳聚糖加入到上述(l) 的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并 采用高速分散机以5000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为1:1;
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0。5%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙基 一3_ (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为4:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为0. 5%的聚丙三醇三縮水甘油醚并在常温 下搅拌交联12h，；
(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚丙三醇三縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-65X:的 超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用用质量百分比浓度 为0. 5mol/L的碳酸氢钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至 少每半小时换一次水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-65。C的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架。
实施例5
一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其 工艺条件-
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用去离子水配制含氢氧化钙3mol/L，磷酸氢二钾1. 8mol/L的溶 液，然后将50g PVP K90加入到上述磷酸氢二钾中充分溶解；
(3) 采用8000转/分的高速分散机，在氨水控制体系pH值为12条件下， 将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶，使该 纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.7:1，按质量百分比计聚乙烯吡 咯垸酮含量为50%;
步骤二 HA溶胶的陈化
上述溶胶在10(TC的温度下放置，陈化48小时，然后再用去离子水充分 洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制10mg/ml 的胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为9:1的比例将壳聚糖加入到上述(l) 的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并 采用高速分散机以8000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为9";
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为1%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙基一 3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS)的 质量比为4:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为1%的聚丙三醇三縮水甘油醚并在常温下 搅拌交联12h;(6)将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚丙三醇三縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-8(TC的 超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用用质量百分比浓度
为lmol/L的碳酸氢钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少 每半小时换一次水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-8(TC的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后得到HA/胶原/壳 聚糖互穿聚合物网络支架。
权利要求
1、一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤及其工艺条件步骤一HA即纳米羟基磷灰石溶胶的制备(1)以PVP即聚乙烯吡咯烷酮同时为模板剂、分散剂和改性剂；(2)配制0.01～3mol/L的钙盐和0.006～1.8mol/L的磷酸盐溶液或配制0.01～3mol/L的钙盐溶液和0.006～1.8mol/L的磷酸；(3)采用高速分散机，在碱液控制体系中，将上述(1)、(2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶；该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.6～1.7∶1，按质量百分比计聚乙烯吡咯烷酮含量为0.01～50％；步骤二HA溶胶的陈化上述溶胶在20～100℃的温度下陈化至少24小时，然后用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的HA溶胶；步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型(1)用醋酸溶液配制3mg/ml～10mg/ml的胶原溶液；(2)按壳聚糖∶胶原溶质的质量比为0.1～9∶1的比例将壳聚糖加入到上述(1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；(3)将步骤二的HA溶胶与上述(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采用高速分散机分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其中上述(2)的胶原/壳聚糖共混液的溶质∶HA溶胶的质量比为0.1～9∶1；(4)在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计含量为0.01～1％的混合交联剂，所述混合交联剂是指1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在常温下搅拌交联至少12h的混合溶液，其中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1～4∶1；(5)在上述(4)经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液中再加入按质量百分比计含量为0.01～1％的壳聚糖交联剂，并在常温下搅拌交联至少12h；(6)将上述(5)的经混合交联剂以及壳聚糖交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于超低温冰箱中冷冻至少24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，即得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理(1)首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用氨水或缓冲溶液浸泡1～3小时，然后再用去离子水浸泡至少6小时，并至少每半小时换一次水；(2)将清洗后的支架材料放回模型，再次放入超低温冰箱中冷冻至少24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，最后得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架。
2、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于步骤一 (3)所述物料混合，聚乙烯吡咯垸酮的加入 有以下两种方式，择一使用(1) 将聚乙烯吡咯垸酮加入到钙盐溶液或磷酸盐溶液或磷酸中，或加入 到钙盐和磷酸盐或磷酸的混合溶液中；(2) 先配制聚乙烯吡咯垸酮水溶液，再用聚乙烯吡咯烷酮水溶液配制钙 盐和磷酸盐或磷酸溶液。
3、 根据权利要求1或2所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支 架的制备方法，其特征在于所述钙盐为硝酸钙或氢氧化钙；磷酸盐采用磷 酸氢二铵、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
4、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于步骤二所述陈化有以下两种方式，择一使用-(1) 将纳米羟基磷灰石溶胶自然放置陈化；(2) 将纳米羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置陈化。
5、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述碱液控制体系pH值大于10.5。
6、 根据权利要求5所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于；所述碱液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
7、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法，其特征在于所述缓冲溶液为磷酸氢二钠或碳酸氢钠溶液。
8、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述高速分散机的速度范围为100 8000转/分。
9、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述所采用聚乙烯吡咯烷酮的类型为PVP K15、 PVP PVP K30、 PVP K60或PVP K90;所述胶原为I型胶原。
10、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述超低温冰箱中冷冻的温度范围为-5'C -80°C。
11、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述壳聚糖交联剂为戊二醛或聚縮水甘油醚。
12、 根据权利要求11所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架 的制备方法，其特征在于所述聚縮水甘油醚是指聚乙二醇双縮水甘油醚或 聚丙三醇三縮水甘油醚。
全文摘要
本发明公开了一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法。该法首先在碱液控制体系中形成含聚乙烯吡咯烷酮的HA溶胶体系，经陈化洗涤得到颗粒定向排列的HA溶胶，再与胶原和壳聚糖共混液混合，采用高速分散机分散得HA/胶原/壳聚糖的混合液，将经混合交联剂以及壳聚糖交联剂交联的混合液减压、除气泡后注入模型，经后处理得支架。本发明以HA溶胶的形式与基体复合，呈现颗粒定向排列的HA在胶原/壳聚糖互穿聚合物网络基体中分散良好，与基体之间形成有效、稳定的键合，从而在结构和功能上实现HA与胶原/壳聚糖基体的有效复合。同时也有效地解决了胶原及壳聚糖材料本身存在的问题。本法工艺简单，操作简捷，易于推广应用。
文档编号A61L27/40GK101590293SQ200910149959
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月17日 优先权日2008年7月31日
发明者宁成云, 尹兆益, 张德贵, 王迎军, 坤 魏 申请人:华南理工大学;广州南枫生物科技有限公司
技术领域：
本发明涉及人工骨修复材料技术领域，具体是指一种HA(纳米羟基磷灰 石)/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法。技术背景临床上每年由有大量的病人因外伤、肿瘤以及其他疾病所造成的硬组织 缺损，因此，硬组织修复材料是国内外临床需求最大的修复材料之一。近几 年，由于传统骨修复材料存在着一些问题，骨组织工程支架成为了研究的一 个热点，其原理是以支架材料为载体结合有成骨潜力的种子细胞、生长因子， 通过体内或体外继续培养，构建有生命活力的仿生骨。胶原、壳聚糖及羟基磷灰石由于其良好的生物相容性等特点而广泛应用 于骨组织工程支架材料。基于天然骨的主要成分是胶原和羟基磷灰石，胶原/ 羟基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石复合支架成为研究的两个热点。目前胶原/ 羟基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石复合支架主要是通过羟基磷灰石粉体和胶原 或壳聚糖进行机械混合方式制备的。韩长菊，叶金凤，陈庆华，等.物理发泡 法制备羟基磷灰石/胶原蛋白多孔支架材料.佛山陶瓷，2006， 11 (119): 8-10，该文以氢氧化钙悬浮液和磷酸为主要实验原料用共滴定的方法合成羟 基磷灰石，然后把羟基磷灰石粉与一定量的胶原蛋白溶液混合，经过物理发 泡、冷冻、微波干燥的过程，得到气孔率为79% 89%的羟基磷灰石/胶原 蛋白多孔支架材料。赵峰，尹玉姬，宋雪峰，等.壳聚糖-明胶网络/羟基磷灰 石复合材料支架的研究一制备及形貌.中国修复重建外科杂志，2001， 15(5): 276-279，该文将平均粒度为2. 8 u m的羟基磷灰石粉体加入一定量去离子水 后搅拌并超声波处理，在处理后的乳液状混合物中加入CS和Gel (50 : 50 w/w )和适量乙酸后于4(TC水浴中搅拌，待有机物全部溶解后加入一定量戊 二醛溶液后冷冻干燥得到支架，结果显示，通过控制组分配比和预冷冻温度 可制备不同密度和孔隙率的CS-Gel/HA多孔支架。上述方法虽然在一定程度上得到了满足一定性能要求的复合支架，但是由于羟基磷灰石是以粉末形式 与胶原或壳聚糖基体复合的，因而实际上很难均匀分散并且和基体之间无法 形成有效键合。此外，胶原和壳聚糖还存在着一些缺点，胶原的力学强度较差，降解速 度过快，而壳聚糖缺乏骨键合生物活性，脆性大，且降解慢、亲水性差。因 而，改进胶原和壳聚糖本身的一些缺点也是胶原和壳聚糖基体复合支架需要 解决的问题，而将胶原和壳聚糖共混物同时作为复合支架的基体或者将两者 形成新的结构，则有望在一定程度上改善单纯胶原或壳聚糖做基体时力学强 度的问题，同时获得合适的降解速度。近年来，互穿网络聚合物发展十分迅 速，有望很好地解决上述问题。互穿网络聚合物是用化学方法将两种以上的 聚合物互相贯穿成交织网络状的一类新型复相聚合物材料，是聚合物共混改 性技术发展的新领域，为制造特殊性能的材料开拓了崭新的途径。然而；目 前互穿网络技术用于HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络骨组织工程支架的制备没有先例，如果能成功应用该技术，将实现在HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网 络骨组织工程支架中羟基磷灰石均匀分散，并在此基体中呈现羟基磷灰石颗 粒的定向排列以及与基体形成有效键合，则可望在解决现有胶原/羟基磷灰石 及壳聚糖/羟基磷灰石复合支架现有问题的基础上实现支架材料的稳定性、力 学性能的改善，也有望从结构和功能上实现纳米羟基磷灰石与基体的有效复合。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，通过研发一种结晶程度可 控、分散性好，能与高分子材料具有稳定键合的颗粒定向排列的纳米羟基磷 灰石溶胶，将溶胶均匀分散于胶原/壳聚糖的互穿聚合物网络基体中并与基体形成有效键合，从而提供一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方 法。实现本发明目的是通过如下措施来实现的。一种HA(纳米羟基磷灰石)/胶原/壳聚糖互穿 合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其工艺条件-步骤一HA溶胶的制备(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)同时为模板剂、分散剂和改性剂；(2) 配制0. 01 3mol/L的钙盐和0. 006 1. 8mol/L的磷酸盐溶液或配 制0。 01 3mol/L的钙盐溶液和0. 006 1. 8mol/L的磷酸；(3) 采用高速分散机，在碱液控制体系中，将上述(1) 、 (2)的物料 充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶；该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙 磷摩尔比达1.6 1.7:1，按质量百分比计聚乙烯吡咯垸酮含量为0.01 50Zo ;步骤二 HA溶胶的陈化上述溶胶在20 10(TC的温度下陈化至少24小时，然后用去离子水充分 洗涤溶胶得到颗粒定向排列的HA溶胶；步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型(1) 用醋酸溶液配制3mg/ml 10mg/ml的胶原溶液；(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 1 9:1的比例将壳聚糖加入到上 述(1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；(3) 将步骤二的HA溶胶与上述(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采 用高速分散机分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液,其中上述(2)的胶原/壳 聚糖共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0. 1 9:1;(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计含 量为0.01 1%的混合交联剂，所述混合交联剂是指1 —乙基一3— (3 — 二甲 基氨丙基)碳二亚胺和N—羟基琥珀酰亚胺在常温下搅拌交联至少12h的混 合溶液，其中l一乙基一3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟 基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为1 4:1;(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为0.01 1%的壳聚糖交联剂，并在常温下 搅拌交联至少12h;(6) 将上述(5)的经混合交联剂以及壳聚糖交联剂交联的HA/胶原/壳 聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于超低温冰箱中冷冻至少24小 时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，即得到HA/胶原/壳聚糖 互穿聚合物网络支架；步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用氨水或缓冲溶液浸 泡1 3小时，然后再用去离子水浸泡至少6小时，并至少每半小时换一次水；(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入超低温冰箱中冷冻至少 24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，最后得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架。为了更好地实现本发明；步骤一 (3)所述物料混合，聚乙烯吡咯垸酮的 加入有以下两种方式，择一使用-(1) 将聚乙烯吡咯烷酮加入到钙盐或磷酸盐溶液或磷酸中，或加入到钙 盐和磷酸盐或磷酸的混合溶液中；(2) 先配制聚乙烯吡咯烷酮水溶液，再用聚乙烯吡咯烷酮水溶液配制钙 盐和磷酸盐或磷酸溶液。所述钙盐为硝酸钙或氢氧化钙；磷酸盐采用磷酸氢二铵、磷酸氢二钠或 磷酸氢二钾。步骤二所述陈化有以下两种方式，择一使用-(1) 将纳米羟基磷灰石溶胶自然放置陈化；(2) 将纳米羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置陈化。 所述碱液控制体系pH值大于10. 5;所述碱液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。所述缓冲溶液为磷酸氢二钠、碳酸氢钠溶液。 所述高速分散机的速度范围为100 8000转/分。所述所采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的类型为K15、 K30、 K60或K90;所 述胶原为I型胶原。所述超低温冰箱中冷冻的温度范围为_5 °C _80°C 。所述壳聚糖交联剂为戊二醛或聚縮水甘油醚，其中聚縮水甘油醚是指聚 乙二醇双縮水甘油醚或聚丙三醇三縮水甘油醚。本发明与现有技术相比具有如下突出的优点1、本发明首次将互穿聚合物网络支架的制备技术成功应用到HA/胶原/ 壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备中，通过PVP的桥梁作用，使得羟基磷灰 石颗粒在胶原/壳聚糖互穿聚合物网络基体中分散良好且与基体之间形成有 效、稳定的键合，且羟基磷灰石在基体中颗粒呈现定向排列，从而在结构和功能上实现纳米羟基磷灰石与胶原/壳聚糖基体的有效复合。2、 本发明采用以羟基磷灰石溶胶的形式与胶原基体复合，解决了现有技 术中以羟基磷灰石粉末形式，采用普通机械搅拌混合制备的纳米羟基磷灰石/ 胶原支架中存在着羟基磷灰石与胶原基体之间无法形成有效键合，以及羟基 磷灰石颗粒只能松散的分布于胶原框架内，并不能有效地实现纳米羟基磷灰 石与胶原的有效复合的问题。3、 由于将互穿聚合物网络支架的制备技术应用到HA/胶原/壳聚糖互穿 聚合物网络支架的制备中，互穿聚合物网络是用化学方法将两种以上的聚合 物互相贯穿成交织网络状的一类新型复相聚合物材料，因而本发明制备的HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络骨组织工程支架解决了胶原及壳聚糖复合支架 力学性能不佳的问题，同时获得了合适的降解速度。4、 本发明采用具有优良的分散稳定性，良好的生物相容性和生理安全性 的聚乙烯吡咯烷酮作为模板剂、分散剂和改性剂，在改善材料性能的同时不 至于引起的生理毒性的问题。5、 本发明制备工艺简单，操作简捷，易于推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但实施方式并不仅限 于此。实施例1一种HA (纳米羟基磷灰石)/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方 法包括以下步骤及其工艺条件 步骤一HA溶胶的制备(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K15)同时为模板剂、分散剂、改性剂；(2) 使用去离子水配制含硝酸钙0.01mol/L，磷酸氢二铵0.006mol/L 的溶液，然后将O. lg PVP K15加入到上述硝酸钙溶液中充分溶解；(3) 采用100转/分的高速分散机，在氨水控制体系pH值为10.6条件 下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶， 使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.6:1，按质量百分比计聚乙 烯吡咯烷酮含量为0.01%;步骤二 HA溶胶的陈化上述纳米羟基磷灰石溶胶在2(TC的温度下，自然放置陈化24小时，然 后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石溶胶； 步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制3mg/ml的 胶原溶液；(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 1:1的比例将壳聚糖加入到上述(1) 的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液;(3) 将步骤二的HA与上述(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采用高 速分散机以100转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其中上述(2) 的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0. 1:1;(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0.01%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙 基—3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为1:1;(5) 在上述(4)经EDC+NHS交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液中再加入 按质量百分比计含量为0。01%的戊二醛溶液并在常温下搅拌交联12h;(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及戊二醛溶液交联的HA/ 胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-5'C的超低温冰箱中 冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，即得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用质量百分比浓度为 0.5%的氨水浸泡1小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少每半小时换一 次水；(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-5"C的超低温冰箱中冷冻 24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，最后得到HA/胶原/壳聚 糖互穿聚合物网络支架。实施例2--种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其工艺条件-
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用质量百分比0.5X的PVP K30水溶液配制含硝酸钙0. lmol/L， 磷酸氢二钠0. 06mol/L的溶液；
(3) 采用1000转/分的高速分散机，在氢氧化钠控制体系pH值为11的 条件下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶 胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.65:1，按质量百分比计 聚乙烯吡咯烷酮含量为0. 5°%;
步骤二 HA溶胶的陈化
将上述羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置，在5(TC蒸发回流36小 时陈化；然后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰 石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制4mg/ml的 胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 25:1的比例将壳聚糖加入到上述 (1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并 采用高速分散机以1000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0。25:l;
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0.05%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙 基一3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为2:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为O. 05%的聚乙二醇双縮水甘油醚并在常温 下搅拌交联12h;
(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚乙二醇双縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-l(TC的超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用浓度为0.05mol/L 的磷酸氢二钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少每半小 时换一次水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-l(TC的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，最后得到HA/胶原/壳 聚糖互穿聚合物网络支架。
实施例3
一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其 工艺条件
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K60)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用质量百分比5X的PVPK60水溶液配制含硝酸钙0.5mol/L，磷 酸氢二钾0. 3mol/L的溶液；
(3) 采用2000转/分的高速分散机，在氢氧化钾控制体系pH值为11. 5 条件下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶 胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.67:1，按质量百分比计 聚乙烯吡咯垸酮含量为5%;
步骤二 HA溶胶的陈化
将上述羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置，在7(TC蒸发回流48小 时陈化，然后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰 石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制5mg/ml的 胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为0. 65:1的比例将壳聚糖加入到上述 (1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采用高速分散机以2000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为0,65:1;
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0.1%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙基 —3— (3 —二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为4:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为0. 1%的聚乙二醇双縮水甘油醚并在常温 下搅拌交联12h;
(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚乙二醇双縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-2(TC的 超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用0. lmol/L的磷酸氢 二钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少每半小时换一次 水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-2CTC的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后得到HA/胶原/壳
聚糖互穿聚合物网络支架。 实施例4
一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其 工艺条件
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用去离子水配制含氢氧化钙lmol/L，磷酸0。6mol/L的溶液，然 后分别将5g PVP K90加入到上述氢氧化钙和磷酸溶液中充分溶解；
(3) 采用5000转/分的高速分散机，在氢氧化钾控制体系pH值为12的 条件下，将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶 胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.67:1，按质量百分比计聚乙烯吡咯烷酮含量为10%; 步骤二 HA溶胶的陈化
将上述羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置，在9CTC蒸发回流60小
时陈化，然后再用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰
石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制7mg/ml的 胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为1:1的比例将壳聚糖加入到上述(l) 的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并 采用高速分散机以5000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为1:1;
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为0。5%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙基 一3_ (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的质量比为4:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为0. 5%的聚丙三醇三縮水甘油醚并在常温 下搅拌交联12h，；
(6) 将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚丙三醇三縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-65X:的 超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用用质量百分比浓度 为0. 5mol/L的碳酸氢钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至 少每半小时换一次水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-65。C的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架。
实施例5
一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法包括以下步骤及其 工艺条件-
步骤一HA溶胶的制备
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)同时为模板剂、分散剂、改性剂；
(2) 使用去离子水配制含氢氧化钙3mol/L，磷酸氢二钾1. 8mol/L的溶 液，然后将50g PVP K90加入到上述磷酸氢二钾中充分溶解；
(3) 采用8000转/分的高速分散机，在氨水控制体系pH值为12条件下， 将上述(1) 、 (2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶，使该 纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.7:1，按质量百分比计聚乙烯吡 咯垸酮含量为50%;
步骤二 HA溶胶的陈化
上述溶胶在10(TC的温度下放置，陈化48小时，然后再用去离子水充分 洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石溶胶；
步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型
(1) 采用I型胶原，用质量百分比浓度为2%的醋酸溶液配制10mg/ml 的胶原溶液；
(2) 按壳聚糖:胶原溶质的质量比为9:1的比例将壳聚糖加入到上述(l) 的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；
(3) 将步骤二的HA与上述步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并 采用高速分散机以8000转/分的速度分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其 中步骤三(2)的胶原/壳聚糖的共混液的溶质:HA溶胶的质量比为9";
(4) 在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计总 含量为1%的混合交联剂，在常温下搅拌交联12h，混合交联剂中l一乙基一 3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS)的 质量比为4:1;
(5) 在上述(4)经EDC+NHS混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合 液中再加入按质量百分比计含量为1%的聚丙三醇三縮水甘油醚并在常温下 搅拌交联12h;(6)将上述(5)的经EDC+NHS混合交联剂以及聚丙三醇三縮水甘油醚 交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于-8(TC的 超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得 到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；
步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理
(1) 首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用用质量百分比浓度
为lmol/L的碳酸氢钠溶液浸泡2小时，然后再用去离子水浸泡6小时，至少 每半小时换一次水；
(2) 将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-8(TC的超低温冰箱中冷 冻24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后得到HA/胶原/壳 聚糖互穿聚合物网络支架。
权利要求
1、一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤及其工艺条件步骤一HA即纳米羟基磷灰石溶胶的制备(1)以PVP即聚乙烯吡咯烷酮同时为模板剂、分散剂和改性剂；(2)配制0.01～3mol/L的钙盐和0.006～1.8mol/L的磷酸盐溶液或配制0.01～3mol/L的钙盐溶液和0.006～1.8mol/L的磷酸；(3)采用高速分散机，在碱液控制体系中，将上述(1)、(2)的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石溶胶；该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.6～1.7∶1，按质量百分比计聚乙烯吡咯烷酮含量为0.01～50％；步骤二HA溶胶的陈化上述溶胶在20～100℃的温度下陈化至少24小时，然后用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的HA溶胶；步骤三HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的成型(1)用醋酸溶液配制3mg/ml～10mg/ml的胶原溶液；(2)按壳聚糖∶胶原溶质的质量比为0.1～9∶1的比例将壳聚糖加入到上述(1)的胶原溶液中，充分混合后得到胶原/壳聚糖的共混液；(3)将步骤二的HA溶胶与上述(2)的胶原/壳聚糖的共混液混合并采用高速分散机分散得到HA/胶原/壳聚糖的混合液，其中上述(2)的胶原/壳聚糖共混液的溶质∶HA溶胶的质量比为0.1～9∶1；(4)在上述(3)的HA/胶原/壳聚糖的混合液中加入按质量百分比计含量为0.01～1％的混合交联剂，所述混合交联剂是指1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在常温下搅拌交联至少12h的混合溶液，其中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1～4∶1；(5)在上述(4)经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液中再加入按质量百分比计含量为0.01～1％的壳聚糖交联剂，并在常温下搅拌交联至少12h；(6)将上述(5)的经混合交联剂以及壳聚糖交联剂交联的HA/胶原/壳聚糖的混合液减压、除气泡后注入模型，再置于超低温冰箱中冷冻至少24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，即得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架；步骤四HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的后处理(1)首先将HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架用氨水或缓冲溶液浸泡1～3小时，然后再用去离子水浸泡至少6小时，并至少每半小时换一次水；(2)将清洗后的支架材料放回模型，再次放入超低温冰箱中冷冻至少24小时后，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥至少24小时，最后得到HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架。
2、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于步骤一 (3)所述物料混合，聚乙烯吡咯垸酮的加入 有以下两种方式，择一使用(1) 将聚乙烯吡咯垸酮加入到钙盐溶液或磷酸盐溶液或磷酸中，或加入 到钙盐和磷酸盐或磷酸的混合溶液中；(2) 先配制聚乙烯吡咯垸酮水溶液，再用聚乙烯吡咯烷酮水溶液配制钙 盐和磷酸盐或磷酸溶液。
3、 根据权利要求1或2所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支 架的制备方法，其特征在于所述钙盐为硝酸钙或氢氧化钙；磷酸盐采用磷 酸氢二铵、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
4、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于步骤二所述陈化有以下两种方式，择一使用-(1) 将纳米羟基磷灰石溶胶自然放置陈化；(2) 将纳米羟基磷灰石溶胶移入加热蒸发回流装置陈化。
5、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述碱液控制体系pH值大于10.5。
6、 根据权利要求5所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于；所述碱液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
7、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法，其特征在于所述缓冲溶液为磷酸氢二钠或碳酸氢钠溶液。
8、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述高速分散机的速度范围为100 8000转/分。
9、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述所采用聚乙烯吡咯烷酮的类型为PVP K15、 PVP PVP K30、 PVP K60或PVP K90;所述胶原为I型胶原。
10、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述超低温冰箱中冷冻的温度范围为-5'C -80°C。
11、 根据权利要求1所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的 制备方法，其特征在于所述壳聚糖交联剂为戊二醛或聚縮水甘油醚。
12、 根据权利要求11所述的一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架 的制备方法，其特征在于所述聚縮水甘油醚是指聚乙二醇双縮水甘油醚或 聚丙三醇三縮水甘油醚。
全文摘要
本发明公开了一种HA/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法。该法首先在碱液控制体系中形成含聚乙烯吡咯烷酮的HA溶胶体系，经陈化洗涤得到颗粒定向排列的HA溶胶，再与胶原和壳聚糖共混液混合，采用高速分散机分散得HA/胶原/壳聚糖的混合液，将经混合交联剂以及壳聚糖交联剂交联的混合液减压、除气泡后注入模型，经后处理得支架。本发明以HA溶胶的形式与基体复合，呈现颗粒定向排列的HA在胶原/壳聚糖互穿聚合物网络基体中分散良好，与基体之间形成有效、稳定的键合，从而在结构和功能上实现HA与胶原/壳聚糖基体的有效复合。同时也有效地解决了胶原及壳聚糖材料本身存在的问题。本法工艺简单，操作简捷，易于推广应用。
文档编号A61L27/40GK101590293SQ200910149959
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月17日 优先权日2008年7月31日
发明者宁成云, 尹兆益, 张德贵, 王迎军, 坤 魏 申请人:华南理工大学;广州南枫生物科技有限公司
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