黄酮类化合物或含其的植物提取物的应用的制作方法

专利名称：：黄酮类化合物或含其的植物提取物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类黄酮类化合物或含其的植物提取物在医药领域中的新应用。
背景技术：
：据不完全统计，目前我国丙肝抗体阳性患者有4000万人之多，其中80%会患上慢性丙肝。丙肝是经血液、性接触、母婴及日常生活接触等途径传播的一种肝脏疾病。感染HCV后，和HBV感染一样，易发生慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前，主要使用长效干扰素联合利巴韦林治疗肝功正常的丙肝患者，总体持续病毒学应答率为52%。但干扰素和利巴韦林在治疗过程中，有可能出现骨髓抑制以及情感抑郁、消化道症状等不良反应。并且，长效干扰素价格昂贵，一个疗程48周需花费人民币6万元左右。因此开发抗HCV疗效好、价格低，副作用较小的天然药物是目前医药行业的一个热点。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物(通式如下所示)。黄酮类化合物的主要结构类型有黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、二氢异黄酮、查尔酮、花色素类等14种。(具体请见姚新生主编的《天然药物化学》，第四版，人民卫生出版社)
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一类黄酮类化合物或含其的植物提取物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的新应用。本发明人经研究，发现具有如式I所示的母核结构的一类黄酮类化合物具有较佳的抗丙型肝炎病毒活性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式I其中，R2、R4、R5和R6独立地为H、OH或OMe，R3为H、0H、0Me或P_D_葡萄糖酸基，2位和3位碳之间为单键或双键。较佳的，所述的黄酮类化合物为以下两种化合物中的任一种(1)OH式A其中，R2、R5和R6独立地为H或0H，R3为OH或13_D_葡萄糖酸基，R4为氢；(2)式H其中，&、R2、R3、R4和R5独立地为H、OH或0Me，其为外消旋化合物或手性化合物。本发明中，所述的如式A所示的黄酮类化合物优选下述三种化合物中的任一种(1)如式B所示的芹菜素，即式A化合物，其中R3和R5为0H，R2和R6为H，其分子式为C15H1005;分子量270.25，化学名为5，7，4'-三羟基黄酮，英文名称为Apigenin，CAS编号为520-36-5。6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式B(2)如式C所示的木犀草素，即式A化合物，其中R3、R5和R6为0H，R2为H，其分子式为QA。06;分子量286.09，化学名为5，7，3'，4'_四羟基黄酮，英文名称为Luteolin，CAS编号为491-70-3。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式C(3)如式D所示的黄芩苷，即式A化合物，其中Rs和Re为H;R3为P_D_葡萄糖酸基，R2为0H，其分子式为&凡80n;分子量446.35，化学名为化学名为P-D-葡萄糖酸-5，6_二羟基-4-0-2-苯基-4H-苯并吡喃-7，英文名称为Baicalin，CAS编号为21967-41-9。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式D本发明中，所述的如式H所示的黄酮类化合物优选下述化合物E:式E其中，&、R2、R3、R4和R5独立地为H、OH或OMe。所述的如式E所示的黄酮类化合物优选下述两种化合物中的任一种柚皮素，即式E化合物，其中&、R3和R5为0H，R2和R4为H，其分子式为015111205;分子量272，化学名为(2S)-5，7，4'-三羟基二氢黄酮，英文名称为(2S)-Naringenin。OH0式F(2)如式G所示的6-甲氧基柚皮素，即式E化合物，其中R"R3和R5为0H，R2为0Me，R4为H，其分子式为CwHw06;分子量302，化学名为(2S)-5，7，4'-三羟基-6-甲氧基二氢黄酮，英文名称为(2S)-6-methoxynaringeniruOHO式G本发明中，所述的黄酮类化合物可由天然植物中提取，较佳的为夏枯草或半枝莲。本发明所述的黄酮类化合物不仅包括市售单体纯品，也包括从天然植物中提取的粗品或纯品，还包括以这些黄酮类化合物为有效成份的植物提取物。本发明的积极进步效果在于本发明所述的黄酮类化合物具有较好的抗丙型肝炎病毒的作用，其副作用小，其来源于中药，廉价安全有效。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例中所用的芹菜素、木犀草素、黄芩苷柚皮素和6_甲氧基柚皮素购自上海中药标准化中心。HCV-E2抗体取自美国Scripps研究所。对照药物a干扰素以及其它所用试剂和原料均国内市售可得。效果实施例体外细胞试验1、样品制备用100%DMS0将样品溶解成浓度为20mg/ml的母液，4。C保存。检测时，再用100%DMS0将贮存母液分别稀释为5mg/ml和2mg/ml的溶液。2、细胞、病毒及细胞培养本研究采用Huh7衍生细胞系和HCV病毒株(取自中国科学院上海巴斯德研究8所)，该病毒株能在该细胞中产生高滴度、有感染能力的HCV病毒颗粒。将细胞以1X104个/1001/孔接种于96孔细胞培养板中，培养过夜。用完全培养基(DMEM中含10%胎牛血清，lOOU/ml青霉素，100yg/ml链霉素)将HCV病毒上清稀释到1Xl()3ffu/ml，按50ffu/孔感染细胞。3、HCV病毒集落减少实验。将不同浓度(5mg/ml和2mg/ml)的样品溶液分别以体积比1:50的比例稀释于完全培养基中，使之浓度相应为100g/ml和40g/ml，分别吸取适量样品溶液与等体积病毒稀释液混和均匀，制备成浓度为50g/ml和20g/ml的样品。室温孵育1小时。弃去96孔细胞培养板中的培养基，每孔加入100ill上述混和液，置37°C、5%C02培养箱中培养8小时。弃去上清，用无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)洗1次，每孔加入150新鲜的完全培养基，置371:、5%C0J咅养箱中培养64小时。每孔加入150iU4%多聚甲醛(PFA)，室温固定15分钟。弃去上清，用DPBS洗涤3次，用抗HCV-E2人源单克隆抗体和免疫荧光素标记的抗人二抗(取自中国科学院上海巴斯德研究所)进行免疫荧光染色。荧光显微镜观察记录病毒集落数量。4、阴性对照组设定。阴性对照组以匿SO代替样品溶液，其余同样品检测。5、a干扰素对照组设定。用完全培养基将干扰素溶液分别稀释至5，50，500IU/ml。与细胞孵育1小时，加入病毒稀释液，其余同提取物检测。抑制率=(阴性对照组病毒集落数量_实验组的病毒集落数量)/阴性对照组病毒集落数量X100%实验结果9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，柚皮素即为本发明的式F化合物，e-甲氧基柚皮素即为本发明的式G化合物。细胞毒性说明无细胞毒性=实验组细胞密度/阴性对照组细胞密度^80%有细胞毒性=实验组细胞密度/阴性对照组细胞密度<80%实验结果显示芹菜素、木犀草素、黄芩苷、柚皮素和6-甲氧基柚皮素等黄酮类化合物对丙型肝炎病毒有显著的抑制作用。综上所述，各项实验结果表明芹菜素、木犀草素、黄芩苷、柚皮素和6-甲氧基柚皮素等黄酮类化合物具有抗丙型肝炎病毒活性。权利要求一类如式I所示的黄酮类化合物或含其的植物提取物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用；式I其中，R1、R2、R4、R5和R6独立地为H、OH或OMe，R3为H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之间为单键或双键。F2009101503740C00011.tif2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的黄酮类化合物I为以下两种化合物中的任一种(1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式A其中，R2、R5和R6独立地为H或0H，R3为OH或13_D_葡萄糖酸基，R4为氢；(2)式H<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，R2、R3、R4和R5独立地为H、OH或0Me，其为外消旋化合物或手性化合物。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的如式A所示的黄酮类化合物为下述三种化合物中的任一种(1)如式B所示的芹菜素，即式A化合物，其中R3和R5为0H，R2和R6为H;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式B(2)如式C所示的木犀草素，即式A化合物，其中R3、R5和R6为0H，R2为H;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式C(3)如式D所示的黄芩苷，即式A化合物，其中R5和R6为H;R3为P_D_葡萄糖酸基，R2为OH;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式Dc4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的如式H所示的黄酮类化合物为下述化合物E:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式E其中，R2、R3、R4和R5独立地为H、OH或OMe。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的如式E所示的黄酮类化合物为下述两种化合物中的任一种(1)如式F所示的柚皮素，即式E化合物，其中R!、R3和R5为0H，R2和R4为H;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式F(2)如式G所示的6-甲氧基柚皮素，即式E化合物，其中R3和R5为0H，R2为OMe，尺4为H;OHO式G。6.如权利要求15任一项所述的应用，其特征在于所述的抗丙型肝炎病毒药物为治疗病毒性丙型肝炎的药物。7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的植物提取物为夏枯草或半枝莲提取物。全文摘要本发明公开了一类如式I所示的黄酮类化合物或含其的植物提取物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用；其中，R1、R2、R4、R5和R6独立地为H、OH或OMe，R3为H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之间为单键或双键。本发明所述的黄酮类化合物具有较好的抗丙型肝炎病毒的作用，其副作用小，大多来源于中药，廉价安全有效。式I文档编号A61K31/7048GK101744830SQ20091015037公开日2010年6月23日申请日期2009年6月17日优先权日2009年6月17日发明者孔德云,庄昌龙,李波,王曙光,胡珏,钟劲,高雯申请人:上海医药工业研究院;中国科学院上海巴斯德研究所