一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途的制作方法
专利名称：一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法和用途，具体涉及一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途，还涉及由该壳聚糖衍生物与核酸所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。
背景技术：
随着生物工程技术的发展，近年来越来越多的生物大分子药物(如蛋白质、多肽和核酸等)都应用于临床。该类药物生物活性强，剂量小，治疗指数高，已经成为临床上十分重要的一类药物。特别是用于基因治疗的核酸类药物，不仅具有高效、长疗、副作用少的特点，而且能使治疗基因在细胞内长期稳定表达治疗蛋白。目前，基因药物载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体(如各种逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等)，虽然转染效率高，但存在着对外源基因的容纳量少(约4. 5-30kbp)、稳定性差、会引起安全性问题等诸多缺点。而非病毒载体因其安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等优势而备受关注。遗憾的是，非病毒载体的转染效率比病毒载体的低得多，而且基因表达时间短。因此，寻找新型的高转染效率的基因非病毒载体已成为基因治疗研究领域最为迫切并具挑战性的课题之一。壳聚糖(化学名β _(1，4)-2-氨基-2-脱氧氨基-D-葡萄糖)是甲壳素的脱乙酰产物，也是目前发现的唯一一种天然碱性多糖。它既可生物合成，又可生物降解，与动物的器官组织及细胞有良好的生物相容性，无毒，降解过程中产生的低分子寡聚糖在体内不积累，几乎无免疫原性。近十多年来，研究表明，壳聚糖具有多种生物活性，在医药领域具有广阔的应用前景，如其能在粘膜表面打开细胞间紧密连接的接口 ；并且由于其本身带有正电，能和带负电的细胞膜发生静电作用，从而增强药物对小肠上皮细胞的渗透性，进而用作多肽和蛋白类药物鼻腔或粘膜给药的渗透促进剂；壳聚糖分子中的氨基、羟基还可与粘液中的糖蛋白形成氢键而产生粘附作用，从而延长药物在体内特定区域的滞留时间，提高药物的生物利用度，因此可用作疫苗给药的粘附剂；此外，壳聚糖还可制备成微粒制剂、混合胶体和包衣制剂或形成自身聚集体，这些形式都能在一定程度上避免胃肠道PH环境和酶对生物大分子药物的降解，提高生物利用度，用作蛋白多肽类药物的载体；特别是由于肿瘤细胞表面带负电，带正电的壳聚糖纳米粒能吸附到肿瘤细胞表面使电荷中和，作为抗肿瘤药物载体则更利于抑制肿瘤细胞的生长。随着对壳聚糖应用研究的不断深入和发展，壳聚糖作为基因载体的有效性逐渐得到了肯定，壳聚糖与DNA形成纳米复合物后容易进入细胞内，且对DNA有保护作用。但用没有任何修饰的壳聚糖，转染效率非常低，而且高分子量的壳聚糖水溶性差，不利于提高转染效率，所以要对其进行一定的化学修饰。在壳聚糖结构的2位上有活泼的氨基，易于化学修饰，因此目前绝大多数文献均采用在壳聚糖2位氨基上引入多功能基团的办法来提高壳聚糖的水溶性，增加其转染效果。但壳聚糖的2位氨基在基因输送过程中发挥着极其重要的作用，因此需要既能保留壳聚糖的2位氨基，又能对壳聚糖进行结构修饰，提高壳聚糖转染效果。 2001年，诺贝尔化学奖获得者Siarpless提出“Click”化学反应。其中最为典型的反应之一就是将末端带有炔基和叠氮基团的单体通过高选择性环合耦联后形成带有三唑环结构的化合物。该反应快速、高效且具有高选择性，已被广泛用于合成各种材料。基于上述研究背景，本发明人利用“Click”反应将N，N, N-三甲基-(1，2，3_三唑-4-)甲基溴化铵基团选择性地引入到壳聚糖(Chitosan，Cs)的6位上，合成N，N, N-三甲基三唑壳聚糖(TCs)。本发明的壳聚糖衍生物既能保留Cs的2位氨基的功能，又能增加 Cs的溶解性，提高Cs的正电性，从而增加Cs的DNA压缩功能，提高Cs转染效率。此外，由 Click反应产生的三唑基团跟DNA具有强结合能力，可提高壳聚糖衍生物/DNA纳米复合物的稳定性。因此，本发明的目的在于提供一种高效低毒的用作非病毒基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供由该壳聚糖衍生物与DNA所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。本发明提供了一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物，其结构式如下
权利要求
1. 一种壳聚糖衍生物，其结构式如下
2.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其中，所述壳聚糖衍生物的重均分子量为 5-1000千道尔顿。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其中，所述N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑_4_)甲基溴化铵基团的取代度为10% 100%。
4.权利要求1所述的壳聚糖衍生物的制备方法，该方法包括以下步骤
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述壳聚糖1的重均分子量为10-1000千道尔顿。
6.一种根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物/核酸的纳米复合物。
7.权利要求6所述的纳米复合物的制备方法，其包括以下步骤将权利要求1中所述的壳聚糖衍生物和质粒DNA分别用去离子水溶解，混合，室温静置，壳聚糖衍生物和质粒 DNA通过静电自组装成纳米复合物。
8.权利要求6所述的纳米复合物用于将核酸递送到细胞中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列， 所述遗传标记为绿色荧光蛋白基因。
10.权利要求1所述的壳聚糖衍生物用于非病毒型基因载体的用途。
全文摘要
本发明公开了一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途。所述壳聚糖衍生物是通过将N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团引入到壳聚糖的6位上而合成，其结构式如下。其中，n为壳聚糖衍生物重复单元的个数。本发明的壳聚糖衍生物既保留了2位氨基在基因输送过程中的功效，保留了壳聚糖无毒、生物相容性高的特性，又大大提高壳聚糖的水溶性，提高壳聚糖的基因转染效率，用该壳聚糖衍生物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。
文档编号A61K48/00GK102260356SQ201010183769
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者张志文, 李亚平, 顾王文, 高瑜 申请人:中国科学院上海药物研究所
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法和用途，具体涉及一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途，还涉及由该壳聚糖衍生物与核酸所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。
背景技术：
随着生物工程技术的发展，近年来越来越多的生物大分子药物(如蛋白质、多肽和核酸等)都应用于临床。该类药物生物活性强，剂量小，治疗指数高，已经成为临床上十分重要的一类药物。特别是用于基因治疗的核酸类药物，不仅具有高效、长疗、副作用少的特点，而且能使治疗基因在细胞内长期稳定表达治疗蛋白。目前，基因药物载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体(如各种逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等)，虽然转染效率高，但存在着对外源基因的容纳量少(约4. 5-30kbp)、稳定性差、会引起安全性问题等诸多缺点。而非病毒载体因其安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等优势而备受关注。遗憾的是，非病毒载体的转染效率比病毒载体的低得多，而且基因表达时间短。因此，寻找新型的高转染效率的基因非病毒载体已成为基因治疗研究领域最为迫切并具挑战性的课题之一。壳聚糖(化学名β _(1，4)-2-氨基-2-脱氧氨基-D-葡萄糖)是甲壳素的脱乙酰产物，也是目前发现的唯一一种天然碱性多糖。它既可生物合成，又可生物降解，与动物的器官组织及细胞有良好的生物相容性，无毒，降解过程中产生的低分子寡聚糖在体内不积累，几乎无免疫原性。近十多年来，研究表明，壳聚糖具有多种生物活性，在医药领域具有广阔的应用前景，如其能在粘膜表面打开细胞间紧密连接的接口 ；并且由于其本身带有正电，能和带负电的细胞膜发生静电作用，从而增强药物对小肠上皮细胞的渗透性，进而用作多肽和蛋白类药物鼻腔或粘膜给药的渗透促进剂；壳聚糖分子中的氨基、羟基还可与粘液中的糖蛋白形成氢键而产生粘附作用，从而延长药物在体内特定区域的滞留时间，提高药物的生物利用度，因此可用作疫苗给药的粘附剂；此外，壳聚糖还可制备成微粒制剂、混合胶体和包衣制剂或形成自身聚集体，这些形式都能在一定程度上避免胃肠道PH环境和酶对生物大分子药物的降解，提高生物利用度，用作蛋白多肽类药物的载体；特别是由于肿瘤细胞表面带负电，带正电的壳聚糖纳米粒能吸附到肿瘤细胞表面使电荷中和，作为抗肿瘤药物载体则更利于抑制肿瘤细胞的生长。随着对壳聚糖应用研究的不断深入和发展，壳聚糖作为基因载体的有效性逐渐得到了肯定，壳聚糖与DNA形成纳米复合物后容易进入细胞内，且对DNA有保护作用。但用没有任何修饰的壳聚糖，转染效率非常低，而且高分子量的壳聚糖水溶性差，不利于提高转染效率，所以要对其进行一定的化学修饰。在壳聚糖结构的2位上有活泼的氨基，易于化学修饰，因此目前绝大多数文献均采用在壳聚糖2位氨基上引入多功能基团的办法来提高壳聚糖的水溶性，增加其转染效果。但壳聚糖的2位氨基在基因输送过程中发挥着极其重要的作用，因此需要既能保留壳聚糖的2位氨基，又能对壳聚糖进行结构修饰，提高壳聚糖转染效果。 2001年，诺贝尔化学奖获得者Siarpless提出“Click”化学反应。其中最为典型的反应之一就是将末端带有炔基和叠氮基团的单体通过高选择性环合耦联后形成带有三唑环结构的化合物。该反应快速、高效且具有高选择性，已被广泛用于合成各种材料。基于上述研究背景，本发明人利用“Click”反应将N，N, N-三甲基-(1，2，3_三唑-4-)甲基溴化铵基团选择性地引入到壳聚糖(Chitosan，Cs)的6位上，合成N，N, N-三甲基三唑壳聚糖(TCs)。本发明的壳聚糖衍生物既能保留Cs的2位氨基的功能，又能增加 Cs的溶解性，提高Cs的正电性，从而增加Cs的DNA压缩功能，提高Cs转染效率。此外，由 Click反应产生的三唑基团跟DNA具有强结合能力，可提高壳聚糖衍生物/DNA纳米复合物的稳定性。因此，本发明的目的在于提供一种高效低毒的用作非病毒基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供由该壳聚糖衍生物与DNA所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。本发明提供了一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物，其结构式如下
权利要求
1. 一种壳聚糖衍生物，其结构式如下
2.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其中，所述壳聚糖衍生物的重均分子量为 5-1000千道尔顿。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其中，所述N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑_4_)甲基溴化铵基团的取代度为10% 100%。
4.权利要求1所述的壳聚糖衍生物的制备方法，该方法包括以下步骤
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述壳聚糖1的重均分子量为10-1000千道尔顿。
6.一种根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物/核酸的纳米复合物。
7.权利要求6所述的纳米复合物的制备方法，其包括以下步骤将权利要求1中所述的壳聚糖衍生物和质粒DNA分别用去离子水溶解，混合，室温静置，壳聚糖衍生物和质粒 DNA通过静电自组装成纳米复合物。
8.权利要求6所述的纳米复合物用于将核酸递送到细胞中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列， 所述遗传标记为绿色荧光蛋白基因。
10.权利要求1所述的壳聚糖衍生物用于非病毒型基因载体的用途。
全文摘要
本发明公开了一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途。所述壳聚糖衍生物是通过将N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团引入到壳聚糖的6位上而合成，其结构式如下。其中，n为壳聚糖衍生物重复单元的个数。本发明的壳聚糖衍生物既保留了2位氨基在基因输送过程中的功效，保留了壳聚糖无毒、生物相容性高的特性，又大大提高壳聚糖的水溶性，提高壳聚糖的基因转染效率，用该壳聚糖衍生物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。
文档编号A61K48/00GK102260356SQ201010183769
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者张志文, 李亚平, 顾王文, 高瑜 申请人:中国科学院上海药物研究所
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