一种治疗运动失调的方法
专利名称：一种治疗运动失调的方法
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本发明涉及治疗运动失调的方法。尤其是本发明涉及通过在颅内施用神经毒素治疗运动失调的方法。
运动失调运动失调是神经性的障碍疾病，它涉及一块或多块肌肉或者是肌肉组。运动失调包括帕金森氏综合征、亨廷顿舞蹈病、进行性核上性麻痹、威尔逊病、图雷特氏综合征、癫痫病、以及各种慢性震颤、抽搐和张力障碍。不同的临床观察表明，运动失调可以归结为相同或相似的大脑区域失常。例如，大脑基底神经结(一种在大脑根部深处的神经细胞束)失常，通常被认为是多种运动失调的根源。
震颤表现为不正常、无意识的动作。当使用遭受颤抖疾病折磨的身体部位(通常是手臂或手掌)时，例如试图书写或做出需要协调手臂的动作，震颤就会表现得最严重。通常的化学疗法是使用心得安进行药物治疗，但是心得安具有降低血压和改变心率的副作用。在帕金森氏病和具有帕金森氏病特征的综合征中，通常会发生静止时的震颤。当四肢处于静止状态时，休息性震颤表现得最为严重。通常当病人尝试复杂运动时，例如去够一个茶杯，震颤会平息下来。采用系统的抗胆碱药物疗法曾经取得了一些成功。
张力障碍是一种无意识的运动失调，表现为持续的肌肉收缩，导致身体或四肢的扭曲。导致张力障碍的原因包括生化反应异常、变性性疾病、精神机能障碍、毒素、毒品及中枢创伤。丘脑切开术和(或)下丘脑切开手术或者福雷尔区切开术是目前优选的治疗张力障碍的神经外科手术方法，并且与外科手术治疗帕金森氏病采用类似的技术和脑靶进行。见Tasker R.《张力障碍外科治手术疗法》第105章，1015-1032页，载于Gildenberg P.L.等，《接触性和功能性神经外科教科书》，McGraw-Hill出版社(1998)。
某些张力障碍可能包括痉挛性斜颈、眼睑痉挛以及书写者痉挛。痉挛性斜颈通常发生在成年人身上，使得病人的脖子无意识的歪向一边。在开始的时候，某些病人甚至有可能没有注意到自己的脖子和头歪向了一边。眼睑痉挛表现为眼睑的间歇性受迫闭合，是一种无意识的动作。书写者痉挛是一种当患者书写或者用手实施其他动作时，发生的痉挛异常姿势。这些综合征可能会发展到影响手臂和肩膀。
抽搐(包括图雷特氏症)通常是一种快速、短时的刻板的重复运动。常见的抽搐发生在运动系统中；或者是在自然情况下嘴皮不断蠕动。运动系统的抽搐通常发生在眼睑、眉毛或者其他面部肌肉上，同样也会发生在上肢。嘴皮上的抽搐可能会表现为咕哝、清嗓、咳嗽或者发咒骂声等。抽搐的患者通常非常渴望进行某种特定的抽搐，如果其愿望不能得到满足，确实会在其内心产生非常强的压力。例如，一只胳膊突发性动作的运动抽搐，如果患者坐在其手上来控制其胳膊的话，那么患者的胳膊能够短时得到控制；但是，患者心中会有一种不可抗拒的愿望去运动其胳膊，并最后导致该动作的发生。
图雷特氏综合征是一种通常起始于童年或青春期的抽搐疾病，通常多见于男性。嘴皮上的抽搐和运动系统的抽搐通常同时发生。抽搐通常从身体的某部位转向另外一个部位，并且该疾病通常时好时坏，某个时期机几乎不发作，而有时又使得患者的机能发生困难。其他神经行为困难通常伴随着该种综合征。这包括注意力集中障碍(ADHD)和强制性障碍。治疗多数抽搐的方法是使用药物来减少脑中多巴胺的含量，例如使用多巴胺拮抗剂。不幸的是，这些药物具有副作用，会导致其他种类的运动失调等，包括帕金森氏病(僵硬、运动徐缓以及震颤)。除了图雷特氏综合征之外，抽搐可能与头部受伤、一氧化碳中毒、中风、使用毒品和智力低下有关。
进行性核上性麻痹是一种运动失调，该病患者起初眼睛的垂直运动(上下运动)明显困难，接着任何眼睛动作都受到限制(眼肌瘫痪)。病人同样会发展到痴呆、强直、行动迟缓(动作缓慢)、并且容易摔跤。
亨廷顿舞蹈病是一种基因遗传性疾病，同时具有神经和精神病学特征。大多数的病例是发生在病人的四十或五十岁时，也有可能发生在这之前或之后。这种疾病可能始于患者神经或者心理状态的变化。神经病学的症状可能会不同，但是包括舞蹈症。舞蹈症(起源于一个希腊单词，其含义为“跳舞”)是一系列类似跳舞、短时的抽筋以及将身体的一边扭向另一边的运动。同时也会发生笨拙、烦躁和跳动等。面部动作尤其是颌周围的面部动作也可能发生，舞蹈症的患者通常有行走和固定姿势上的困难。精神病学上的症状则可能出现偏执狂、混乱或者人格上的变化。随着病情的发展，会产生严重的痴呆症。脑部的核磁共振图像可以显示一部分大脑基底神经结(与运动有关)发生了萎缩(收缩)，该神经结被称为尾状核。
威尔逊病是一种涉及神经系统和肝脏功能的疾病。神经病学上的问题包括震颤、动作失调、坠落、言语不清、强直以及癫痫发作。也会产生精神病学上的问题，并且如果该痛苦未能得到治疗，会导致病人严重的肝脏损伤。通常由升高的铜含量和血浆铜蓝蛋白含量进行诊断。
不幸的是，包括上述病症在内的运动失调都对药物治疗产生抗药性。抗药性震颤包括休息性震颤，就像在帕金森氏病中所发生的，以及动作性震颤，例如特发性震颤、多发性硬化震颤、创伤后震颤、偏瘫后震颤(中风后震颤)、与精神病有关的震颤、书写震颤以及癫痫病。帕金森氏病帕金森氏病是一种在老年人群中发病率逐渐增高的运动失调。帕金森氏病是一种常见的老龄致残疾病，在美国它折磨着大约1％左右的60岁以上的老年人。帕金森氏病随着年龄的增加，患病的可能性增大，一般人的年龄每增加40岁，患病的可能性增加1％。其症状包括明显的四肢震颤、运动徐缓、强直以及姿势发生变化。目前认为帕金森氏病的病理生理学原因是，大脑基底神经结中产多巴胺细胞的进行性破坏，该神经结包含着被分开的几部分黑质黑质(pars compartum of thesubstantia nigra)，一种位于脑干的基底核。多巴胺能(dopamineric)神经元的缺乏，导致乙酰胆碱的相对过量。见Jellinger，K.A.，“PostMortem Studies in Parkinson′s Disease--Is It Possible toDetect Brain Areas For Specific Symptoms？”，J Neural Transm(如上)；1-291999。
帕金森氏病是一种进行性疾病，最初可能是轻微的肢体僵硬和偶尔的震颤，经过十年或更多的时间，可能导致经常性的震颤以及记忆缺陷，最后导致无法控制的震颤和痴呆。
用于治疗帕金森氏病的药物包括L-多巴、塞利吉林、阿朴吗啡和抗胆碱药。L-多巴(左旋-二羟基-苯丙氨酸)(灭吐灵)是多巴胺的前体，它能够透过血脑障碍，并在脑中转化为多巴胺。不幸的是，L-多巴在体内的半衰期非常短，而且在长期服用之后(如服用4、5年之后)，L-多巴的效果通常变得零星并且不可预知，从而导致运动功能的波动、运动障碍以及精神病学副作用。除此之外，L-多巴还会导致B族维生素的缺失。
塞利吉林(苄甲炔胺，Eldepryl)被用作L-多巴的替代物，其通过减少脑中多巴胺的崩溃而发生作用。但不幸的是，在使用约九个月之后，其变得无效。阿朴吗啡，一种多巴胺受体兴奋剂，也被用于治疗帕金森氏病，然而在使用这种药物的时候，会引起严重的呕吐，同时会引起皮肤反应、感染、倦睡以及一些精神病学副作用。
系统施用抗胆碱药物(例如苯海索和邻甲苯海拉明)也用于治疗帕金森氏病，其通过减少脑中产生的乙酰胆碱的含量起作用，从而调整帕金森氏病患者的多巴胺/乙酰胆碱的不平衡。但是，有大约70％系统施用抗胆碱药物的病人出现了严重的神经精神病学副作用，包括幻觉，同时还有运动障碍，以及其他因为抗胆碱药的广泛分布引起的其他后果，包括幻视、吞因困难、口干以及尿潴留。见例如Playfer，J.R.，Parkinso’s Disease，Postgrad Med J，73；257-2641997和Nadeau，S.E.，Parkinson’s Disease，J Am Ger Soc，45；233-2401997。
在采用L-多巴之前的1969年，使用立体定位手术方法曾给帕金森氏病的治疗带来了一定的效果。与治疗帕金森氏病的治疗药物有关的严重已知的缺乏和缺陷，例如L-多巴长期治疗受到限制，导致了人们对神经外科疗法重新发生了兴趣。曾经证实单侧立体定位丘脑切开术对控制对侧震颤和强直有效果，但是存在导致轻偏瘫的危险。而双侧丘脑切开术则会增加导致口齿障碍和吞咽障碍的危险。采用立体定位苍白球切开术，一种部分苍白球(基底神经结)的外科部分切除术，同样也取得了一些成功。除了采用外科切除术之外，在某些病例中，还发现将高频刺激电极放置在腹中间核能抑制异常运动。已经有多种技术可以保证探针的精确定位，包括X射线计算机断层摄影术和核磁共振成象。不幸的是，这些手术方法对帕金森氏病的运动不能、言语障碍以及步态障碍等症状没有什么帮助，并且所有这些方法均导致脑损伤。癫痫癫痫发作是一种阵发性的事件，疾病的发作原因是中心神经系统神经元的聚集异常、过量、超同步释放。癫痫是一种由慢性基础性病变引起的复发性癫痫发作。在癫痫的诸种原因中，有各种癫痫症状，它们的临床和病理特征都不同，并且提出了特定的基础性病因。癫痫的发病率为每1000人中大约有5到10名患者。严重的头部创伤会使患癫痫病的可能性增加达50％。癫痫的其他原因还包括中风、感染以及遗传等。
抗癫痫药物治疗是目前对患癫痫病患者的主要治疗方法，目前有许多不同种类的药物得到应用。参见，例如Fuci，A.S.等，Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，14th Edition(1998)，page 2321。尽管人们在寻找更有效的组合抗癫痫药物，但是仍然有20％癫痫患者对药物治疗有抗药性。于是外科手术就可能成为一种选择。视频-EEC监视系统可被用于确定癫痫发作病灶的解剖学位置，以及将癫痫发作的异常电生理活动与行为表现联系起来。使用常规头皮或蝶骨头皮记录仪对这种定位通常是足够的。高分辨率MRI扫描通常用来确定结构损伤。功能性的图象研究，例如SPECT和PET是附加的试验，来帮助确定解剖上异常的明显致癫痫区的位置。一旦癫痫发作起始的假定位置得到确定，则可以用附加的研究，包括神经精神测试及颈动脉内异戊巴比妥试验(瓦德氏试验)评估语言和记忆区域，并确定手术切除致癫痫区后可能的功能性后果。在某些情况下，在实施手术的同时可以通过进行皮质成象的方法，来精确地确定手术切除的程度。这涉及清醒患者的电生理学记录和皮质刺激，以确定癫痫样障碍的程度和所涉及的皮质区的功能。
对颞叶癫痫患者最普通的外科手术方法涉及前正中(anteromedial)颞叶的切除(颞叶切除术)或者对基础海马回及扁桃体有限切除。颞区外引起的局灶性癫痫发作可以通过对病灶的新皮质切除得到抑制。但是，大约有5％的癫痫患者在实施手术后，会在临床上出现明显的并发症，还有大约30％的病人在实施颞叶切除术之后仍然会有癫痫发作。
局灶性癫痫可能会涉及脑的几乎所有部分，并且通常是由定域损害的功能异常导致的。局灶性癫痫的一种是精神性运动癫痫发作。目前的治疗方法包括使用EEG来确定预先倾向于局灶性癫痫发作的器质性脑病区的异常尖峰波，然后采用外科手术切除该病灶，以防止未来的发作。脑运动系统大脑的许多区域影响着运动效能。这样，可能因中风造成的大脑运动皮质的损伤，能够使前庭和网状脑干核去除抑制，从而产生自发性活动，并且使受目前抑制解除的下脑区影响的肌肉产生痉挛。
大脑的一个附属运动系统是基底神经节。基底神经节接受大多数来自大脑皮层的信号，并将其大多数信号传输给大脑皮层。基底神经节包括尾状核、壳、苍白球、黑质(它包括pars compacta)以及丘脑下部核。因为从基底神经节向运动皮质发出的异常信号引起大多数帕金森氏病中的异常，所以已经试图通过阻断这些信号治疗帕金森氏病。这样，就有了损害丘脑的腹外侧及前侧核，以阻断从基底神经节向皮质反馈回路的治疗方法。另外，苍白球切开术，即用外科手术方法使苍白球的一部分部分切除，也已用来有效地治疗帕金森氏病的运动失调。
据信，通过将缺乏多巴胺而病理学抑制的丘脑的运动路径中断，能够对外科手术介入有帮助。受抑制的丘脑依次对负责产生运动的皮质神经元网络进行不足的刺激。因此，手术去除对丘脑的抑制曾经用于治疗产生抗药性的运动失调。Speelman，J.D.等，ThalamicSurgery and Tremor，Mov Dis 13(3)；103-1061998。
治疗震颤以及其他帕金森氏病的颅内损害方法已经针对苍白球和豆状核袢进行。但是苍白球切开术的长期效果有时是令人失望的。通过损害下述丘脑核能对手术阻止震颤产生积极效果(1)中腹侧(Vim)或者是腹后侧(VLp)核；(2)腹前(ventrooralis anterior，Voa)核(VOA)，(Voa以及Vop已经统称为腹前核(Vla))；(3)腹后(Vop)核；(4)下丘脑核(福雷尔区切开术)，和；(5)CM-Pf丘脑核。总的来说，在治疗帕金森氏病以及其他系统用药产生抗药性的震颤时，腹外侧丘脑是选择手术的目标。Brophy，B.P.等，Thalamotomy forParkinsonian Tremor，Sterertact Funct Neurosurg，69；1-41997。丘脑对大脑皮质的刺激对几乎所有皮质的活性都是必须的。
立体定位手术(借助于神经成象和电生理学记录)曾被用来治疗晚期产生了抗药性的帕金森氏病，手术的靶是极度活跃的苍白球和下丘脑核。使用脑图谱将电极或者探针放入患者的脑中，该脑图谱象参考了计算机X射线断层造影或者磁共振成象的脑成象图。使苍白球(即腹后侧苍白球)的不同部分、基底神经节、丘脑以及下丘脑核损害，曾经被用来治疗帕金森氏病中的运动障碍。不幸的是，手术损害脑会产生对脑的语言、视觉以及认知区域损害的危险。除此之外，通过使用电极刺激大脑深处来抑制震颤可能会因为金属丝的腐蚀、铅摩擦、植入的脉冲发生器的感染、植入的脉冲发生器的故障、电振荡和铅迁移，而产生某些问题。电极刺激引起的其他并发症包括构音障碍、平衡不稳、轻瘫和步态障碍。参见例如Koller，W.C.等，《帕金森氏病的手术治疗》，J Neurol Sci 167；1-101999和Schuurman P.R.等，《抑制严重震颤的持续丘脑刺激以及丘脑切开术比较》，NEJM342(7)；461-4682000。
除了手术切除或者是刺激之外，外部放射治疗(伽马刀方式外科手术)同样也在有限的程度上被用于治疗抗药性的帕金森氏患者震颤。该方法的缺点是震颤减轻的效果在放射外科手术之后一个星期到八个月才出现，并且其长期有益效果和放射副作用在目前还是未知的。
如上所述，已经通过下丘脑切开术和/或阻断下丘脑区域中的离苍白球纤维对帕金森氏患者震颤以及其他运动失调进行治疗，也采用苍白球切开术。目前有关基底神经节线路(circuitry)的概念，提示了帕金森氏病中纹状体中多巴胺的缺失导致了苍白球外侧部分纹状体突出过度活跃。苍白球外侧活动的下降导致了下丘脑核(其主要投射(projection)位置)的抑制得到解除。增加的下丘脑活动随后使得苍白球内部过度活跃，这投射在脑桥茎核(PPN)以及腹外侧(VL)丘脑上。这样，通过投射于PPN和VL丘脑，下丘脑核中以及苍白球内部的过度活跃产生了帕金森氏患者震颤综合征、运动徐缓以及运动功能减退。使下丘脑核损害以及苍白球切开术、特别是腹后侧苍白球切开术也可以有效地治疗帕金森氏患者。肉毒杆菌毒素梭状芽胞杆菌属的种类超过127种，按照它们的形态和功能进行分组。这种厌氧性、革兰氏阳性杆菌属肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)产生有效的多肽神经毒素，即肉毒杆菌毒素，它能导致人类和动物的被称作肉毒中毒的神经性麻痹疾病。肉毒杆菌的孢子发现于土壤中，并且能在家藏的不正确消毒并且密封的罐头食品容器中生长，这是导致许多肉毒中毒的原因。肉毒中毒通常是在食用被肉毒杆菌培养物或其孢子感染的食物之后18-36小时发生作用。肉毒杆菌毒素能够不减毒地穿过肠道内层并攻击外周运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状从行走、吞咽和讲话艰难发展到呼吸肌瘫痪并死亡。
A型肉毒杆菌毒素是人类所知最致命的天然生物药物。约50皮克市售A型肉毒杆菌毒素(纯化了的神经毒素复合体)(由Allergan，Inc.，of Irvine提供，加利福尼亚，商标为BOTOX，每瓶100单元)是小鼠的LD50值(即，一个单元)。一单元BOTOX含约50皮克(约56attomole)A型肉毒杆菌毒素复合体。有趣的是，以1摩尔为基础，A型肉毒杆菌毒素是白喉致死的约18亿倍、是氰化钠致死的约6亿倍、是眼镜蛇毒素致死的约3千万倍、是霍乱致死的约1千2百万倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，pages 63-84(chapter 4)of Natural Toxins II，edited by B.R.Singh et al.，Plenum Press，New York(1976)(在这里所述的A型肉毒杆菌毒素的LD50值0.3ng等于1单元，修正为BOTOX0.05ng等于1单元)。一单元肉毒杆菌毒素定义为将该毒素腹膜内注射到重18-20克雌性Swiss Webster鼠中的LD50值。1Available from Allergan，Inc.，of Irvine，Califomia under the tradename BOTOXin 100 unit vials)已经对7种免疫学不同的肉毒杆菌神经毒素进行了特征分析，它们分别是血清型A、B、C1、D、E、F和G的肉毒杆菌神经毒素，通过用特定类型的抗体中和来区分每种毒素。不同肉毒杆菌血清型在它们所感染的动物种类方面有所不同，并且在它们所引起的瘫痪的严重性及持续时间也不同。例如，通过对在大鼠中引起瘫痪的比例进行测定，A型肉毒杆菌毒素的效力比B型肉毒杆菌的效力大500倍。此外，已经证实480U/Kg剂量的B型肉毒杆菌毒素对灵长类动物无毒，这个剂量是A型肉毒杆菌毒素灵长类LD50值的约12倍。A.Moyer E等，《B型肉毒杆菌毒素实验和临床经验》，第六章，71-85页“用肉毒杆菌毒素治疗”，Jankovic，J.等主编，(1994)，Marcel Dekker，Inc。肉毒杆菌毒素明显地与胆碱能运动神经元高度亲合性地结合，易位进入神经元并阻断乙酰胆碱的释放。
不管血清型如何，毒素中毒的分子机理相似，并且涉及至少三个步骤或者阶段。在该方法的第一步中，通过与重链H链与细胞表面受体的相互反应，毒素与靶神经元突触前膜结合；对于不同类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素来说，受体被认为是不同的。H链的羧基末端链节Hc对毒素确定细胞表面的靶向来说显得非常重要。
在第二步中，毒素透过受中毒细胞的血浆膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用被吞进细胞中，并形成了包含毒素的内体。然后，毒素逃离内涵体进入到细胞质中。该步骤被认为是通过H链氨基末端链节HN介导的，5.5或更低的pH值引发毒素在构象上的变化。已知，内体拥有一个质子泵，该质子泵的存在能够降低内体的pH值。构象上的转变暴露出毒素的疏水残基，这使得毒素能将其自身包埋在内体的膜上。然后毒素(或者是最少的轻链)通过内体膜易未进入细胞质中。
肉毒杆菌毒素活性机理的最后一步显然涉及连接重链H链以及轻链L链的二硫键的还原。在海参毒素的L链中包含了肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的全部毒性活性；L链是一种锌(Zn++)肽链内切酶，该内切酶选择性地裂解蛋白，这是识别和停靠具有浆膜胞质表面的含神经递质的泡、并融合具有浆膜的泡所必需的。破伤风神经毒素、B、D、F和G型肉毒杆菌毒素能引起一种被称为泡联合膜蛋白(VAMP)的小突触泡蛋白(一种突触膜蛋白)的降解。大多数VAMP存在于突触泡的细胞质表面，其通过这些裂解中的任何一种而被除去。血清型A和E的肉毒杆菌毒素裂解SNAP-25。血清型C1的肉毒杆菌毒素起先被认为裂解突触融合蛋白，但是后来发现它能裂解突触融合蛋白和SNAP-25。除了B型肉毒杆菌毒素(和破伤风毒素)只能裂开相同的键之外，每一种肉毒杆菌毒素能特定地裂解不同的键。
肉毒杆菌曾被用于特征为骨骼肌极度活跃的神经肌肉失调的临床治疗。A型肉毒杆菌毒素复合体已经得到美国食品与药物管理委员会(FDA)的批准，用于治疗睑痉挛、斜视和半面痉挛。非A血清型的肉毒杆菌毒素与A型肉毒杆菌毒素相比，明显具有较低的效力和(或)较短的活性持续时间。A型肉毒杆菌毒素外周肌内注射的临床效果一般在注射后的一个星期内能看到。通常，单次A型肉毒杆菌毒素肌内注射减缓症状的持续时间约为3个月。
虽然所有血清型的肉毒杆菌毒素都能在神经肌肉接点明显地抑制神经递质递乙酰胆碱的释放，但是它们通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点裂解这些蛋白质来实现这一作用。例如，A型和E型肉毒杆菌都能裂解25千道尔顿突触联合蛋白(SNAP-25)，但是它们把该蛋白不同的氨基酸序列作为靶。B、D、F和G型肉毒杆菌毒素作用于泡联合蛋白(VAMP，也被称作小突触泡蛋白)，不同血清型在不同的位点裂解蛋白。最后，C1型肉毒杆菌毒素裂解突触融合蛋白和SNAP-25。这些不同的作用机理可能影响到不同血清型肉毒杆菌毒素的相对效力和/或作用持续时间。很明显，可以在不同种类的细胞中发现肉毒杆菌毒素的底物。参见例如Biochem J.1；339(pt 1)159-651999，以及Mov Disord，10(3)3761995(胰岛B细胞至少包含SNAP-25和突触融合蛋白)。
对于所有已知的七种血清型肉毒杆菌毒素来说，其肉毒杆菌毒素蛋白质分子的分子重量是约150kD。有趣的是，肉毒杆菌毒素被肉毒杆菌以复合体的形式释放出来，该复合体包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子以及联合的非毒素蛋白质。这样，肉毒杆菌可以产生900kD、500kD和300kD的A型肉毒杆菌毒素复合体。产生的B型和C1型肉毒杆菌毒素则显然只有700kD或500kD的复合体。产生的D型肉毒杆菌毒素则同时有300kD和500kD两种类型的复合体。最后，产生的E型和F型肉毒杆菌毒素则仅有约30kD的一种复合体。据信这些复合体(即，分子重量超过约150kD)含有非毒素红细胞凝集素蛋白以及非毒素和无毒的非红细胞凝集素蛋白。这两种非毒素蛋白(与肉毒杆菌毒素分子一起包含相应的神经毒素复合体)，可以使肉毒杆菌毒素分子稳定以防止其变性，并且当毒素被消化时保护其免受酸的消化。除此之外，可能的情况是肉毒杆菌毒素复合体越大(分子重量超过约150kD)，则肉毒杆菌毒素从肉毒杆菌毒素复合体肌肉注射的部位扩散的速度就越慢。
体外研究表明，肉毒杆菌毒素抑制钾阳离子诱导的从脑干组织的初始细胞培养物中释放乙酰胆碱和去甲肾上腺素。除此之外，有报导表明肉毒杆菌毒素抑制诱导脊髓神经元初始培养物中甘氨酸和谷氨酸盐的释放，并且在脑突触体标本中肉毒杆菌毒素抑制各种神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素(Habermann E.等，“破伤风病毒和A型与C型神经毒素抑制从小鼠脑培养物中释放去甲肾上腺素”，神经化学杂志51(2)；522-5271988)、CGRP，P物质和谷氨酸盐(Aanchez-Preeto，J.等，“A型肉毒杆菌毒素阻断豚鼠大脑皮层突触谷氨酸盐的胞吐作用”，Eur J.Biochem 165；675-6811897)的释放。这样当采用适当的浓度时，大多数刺激引发的神经递质释放就被肉毒杆菌毒素所阻断。参见例如Pearce，L.B.，“肉毒杆菌毒素在基础科学和医学方面的药学特征”，Toxicon 35(9)；1373-1412，1393；Bigalke H.等，“A型肉毒杆菌神经毒素抑制培养物中小鼠脊髓神经元中非胆碱能突触的传递”，Brain Research 360；318-3241985；Habernann E.，“破伤风毒素和A型肉毒杆菌毒素对[3H]去甲肾上腺素和[3H]GABA从大鼠脑组织匀浆中的释放”，Experientia 44；224-2261988，Bigalke H.等，“破伤风毒素和A型肉毒杆菌毒素抑制各种传送子的释放和吸收，对大鼠脑和脊髓的微粒子标本的研究”，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch Pharmacol 316；244-2511981，以及；Jankovic J.等，“用肉毒杆菌毒素治疗”，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，第5页。
可以通过在发酵罐中建立和生长肉毒杆菌培养物、然后按照已知方法收集和纯化发酵的混合物来获得A型肉毒杆菌毒素。所有血清型的肉毒杆菌毒素在起始阶段都是以非活性单链蛋白形式合成的，这些单链蛋白必须被蛋白酶裂解或切口才能具有神经活性。这种细菌菌株使血清型A和G肉毒杆菌毒素具有内原性蛋白酶，并且因此使得血清型A和G以其主要活性形式从细菌培养物中回收。相反，C1、D和E型肉毒杆菌毒素是由非蛋白水解菌株合成的，因此当它们从培养物中回收时通常是无活性的。血清型B和F则可以通过蛋白水解和非蛋白水解菌株产生，因而它们可以以活性和非活性两种形式回收。但是，即使是产生例如血清型B型肉毒杆菌毒素的蛋白水解菌株也仅仅裂解所产生毒素的一部分。切口与未切口分子的准确比例取决于培养时间的长短和培养物的温度。因此，一定百分数的任何例如B型肉毒杆菌毒素的制剂可能是失活的，这可能用来解释已知的B型肉毒杆菌毒素的效力明显比A型肉毒杆菌毒素低。在临床制剂中存在一定比例的失活肉毒杆菌毒素分子将有助于制剂的整体蛋白负荷，这与对临床功效没有贡献的抗原性的增加关联。另外，与A型肉毒杆菌毒素相比，以相同的剂量水平肌肉注射B型肉毒杆菌毒素，其活性持续时间要短，并且效力也低。
高质量的A型肉毒杆菌毒素结晶可以由肉毒杆菌的霍尔A菌株获得，其特征为≥3×107U/mg，低于0.60的A260/A278，以及具有独特型式的凝胶电泳模式带。采用已知的Shantz方法能够获得A型肉毒杆菌毒素晶体，如下列文献所述Shantz E.J.等，“肉毒杆菌毒素和其他微生物神经毒素在医学上的性质与应用”，Microbiol Rev.56；80-991992。通常来说，A型肉毒杆菌毒素复合体可以通过在合适的培养基中培养A型肉毒杆菌，从厌氧性发酵物中分离和纯化而获得。一旦分离出非毒素蛋白，可以使用已知方法获得纯净的肉毒杆菌毒素，例如比效能为1-2×108LD50U/mg或更高、分子量约为150kD的纯化的A型肉毒杆菌毒素；比效能为1-2×108LD50U/mg或更高、分子量约为156kD的纯化的B型肉毒杆菌毒素；和比效能为1-2×107LD50U/mg或更高、分子量约为155kD的纯化的F型肉毒杆菌毒素。
肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合体可以从List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，Calif.；the Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)，Metabiologics(Madison，Wis.)以及Sigma Chemicals ofSt Louis，Missouri获得。
纯的肉毒杆菌毒素非常不稳定，以至于一般不用来制备药物组合物。再者，肉毒杆菌毒素复合体，例如A型毒素复合体同样也因为表面变性、受热和碱性条件极易变性。失活毒素形成致免疫的类毒素蛋白。所产生的抗体能使得毒素注射对病人不起作用。
与酶一样，肉毒杆菌毒素(它们是细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于这些毒素的三维构象。A型肉毒杆菌毒素因受热、不同的化学表面伸展以及表面干燥而脱毒。此外，已知将由已知的培养、发酵和提纯获得的毒素复合体稀释到非常非常低的、用于制备药物组合物制剂的浓度，导致毒素快速脱毒，除非存在合适的稳定剂。将毫克量的毒素稀释成为每毫升含几纳克的溶液困难非常大，因为这么大程度的稀释会导致比毒性的快速失去。由于包含有毒素的药物组合物可能会在配制后的数月或者数年使用，这些毒素可以用稳定剂例如白蛋白和明胶来保持稳定。
市售的含有肉毒杆菌毒素的药物组合物以商标BOTOX由Allergan Inc.，Irvine，Colifornia出售。BOTOX由包装在无菌真空干燥形式中的纯化的A型肉毒杆菌毒素复合体、白蛋白和氯化钠组成。A型肉毒杆菌毒素由生长在含N-Z胺和酵母提取物的培养基中的肉毒杆菌霍尔A菌株培养物制得。A型肉毒杆菌毒素复合体是通过将培养物溶液经一系列酸沉淀得到结晶复合体纯化的，结晶复合体由活性高分子量毒素蛋白和相关的红细胞凝集素蛋白组成。然后将结晶复合体再溶解于含盐水和白蛋白的溶液中，并在真空干燥之前无菌过滤(0.2微米)。真空干燥后的产品在-5℃度或更低温度的冰箱中保存。BOTOX可以在肌内注射前用新鲜的生理盐水重新配制。每一瓶BOTOX含有大约100个单位(U)纯化的A型肉毒杆菌神经毒素复合体、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，为无菌、无防腐剂的真空干燥形式。
在适当规格的注射器中，通过吸取适当量的稀释剂，使用无防腐剂的无菌标准盐水(0.9％氯化钠注射液)重新配制真空干燥的BOTOX。因为BOTOX可能因为鼓泡或者相似的剧烈搅动而变性，所以应该轻柔地将稀释液注射进小瓶。为了灭菌，BOTOX优选在将小瓶从冰箱中取出并重新配制后四个小时内施用。在这四个小时内，可以将重新配制的BOTOX储存在约2℃至约8℃的冰箱中。据报道，重新配制后存放在冰箱中的BOTOX可以将其效力至少保持约两个星期。Neurology，48249-531997。
有报道表明，A型肉毒杆菌毒素以下列临床设置使用(1)每次肌内注射(多次肌肉注射)约75-125单位BOTOX，以治疗子宫颈张力障碍。
(2)每次肌内注射5-10单位BOTOX，以治疗眉间横线(额沟browfurrows)(将5单位肌内注射到降眉间肌并将10单位肌内注射到每道皱眉肌中)。
(3)通过在耻骨直肠肌的括约肌内注射约30-80单位BOTOX来治疗便秘。
(4)通过向上眼睑跗骨前侧眼轮匝肌和下眼睑跗骨前侧眼轮匝肌每次肌内注射1-5单位BOTOX，以治疗睑痉挛。
(5)外眼肌肌内注射约1-5单位BOTOX治疗斜视，注射量取决于注射的肌肉的大小，以及所需的肌肉麻痹程度(即需要矫正的屈光度)。
(6)通过将BOTOX如下肌内注射到上肢的五块屈肌中治疗中风后的上肢痉挛状态(a)深指屈肌(flexor digitorum profundus)7.5U-30U(b)浅指屈肌(flexor digitorum sublimus)7.5U-30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris)10U-40U(d)腕桡骨屈肌(flexor carpi radialis)15U-60U(e)臂头肌(biceps brachii)50U-200U。在相同的治疗期中，上述五块肌肉都必须注射，因此在每一治疗期中，患者接受90U-360U上肢屈肌BOTOX的肌肉注射。
(7)治疗偏头痛，与赋型剂相比，以注射25 U BOTOX之后三个月内减少偏头痛的发作频率、严重程度、有关的呕吐和急性药物治疗为标准，颅骨膜注射(对称注射到眉肌、额肌和颞肌)25 U BOTOX注射液对预防性治疗偏头痛显示出了明显的效果。
除此之外，肌内注射肉毒杆菌毒素曾被用于治疗帕金森氏病患者的震颤，虽然有报导认为其效果并不可观。Marjama-Jyons，J.等，Tremor-Predominant Parkinson′s Disease，Drugs & Aging 16(4)；273-2782000。
已知，A型肉毒杆菌毒素的功效可以维持12个月(European J.Neurology 6(Supp 4)S111-S11501999)，并且在有些情况下，其功效可以长大27个月。Laryngoscope 1091344-13461999。但是，肌内注射BOTOX的持续时间通常为3到4个月。
A型肉毒杆菌毒素治疗各种临床疾病所取得的成功导致了人们对其他血清型肉毒杆菌毒素的兴趣。对市售A型肉毒杆菌制剂(BOTOX和Dysport)以及B和F型肉毒杆菌毒素(均从Wako Chemicals，Japan获得)等的研究已经展开，以确定其对局部肌肉疲软的功效、安全性以及抗原潜能。将肉毒杆菌毒素制剂注射到右腓肠肌头(0.5-200.0单位/千克)，并用小鼠趾外展评分分析(DAS)来评估肌肉的虚弱程度。由剂量反应曲线计算ED50值。对其他小鼠进行肌内注射以确定其LD50值。治疗指标可以通过LD50/ED50值来计算。将后肢接受BOTOX(5.0-10.0单位/千克)或B型肉毒杆菌(50.0-400.0单位/千克)注射液的小鼠分组，测试肌肉无力以及增加的水消耗，后者被公认为口干模型。通过对兔子每月一次肌内注射(1.5或者6.5ng/kg B型肉毒杆菌毒素或者0.15ng/kg BOTOX)来评估抗原潜能。肌肉无力峰值以及持续时间对于所有血清型均是剂量相关的。DASED50值(单位/千克)如下BOTOX6.7，Dysport24.7，B型肉毒杆菌毒素27.0-244.0，F型肉毒杆菌毒素4.3。BOTOX与B型肉毒杆菌毒素或F型肉毒杆菌毒素相比，具有更长的作用持续时间。治疗指数值如下BOTOX10.5，Dysport6.3，B型肉毒杆菌毒素3.2。注射了B型肉毒杆菌毒素的小鼠比注射BOTOX的小鼠消耗更多的水，虽然B型肉毒杆菌毒素在疲软肌肉方面具有较差的效果。注射四个月后，接受1.5ng/kg注射的4只兔子中有2只、接受6.5ng/kg注射的所有4只兔子产生了对抗B型肉毒杆菌毒素的抗体。另外的研究显示，接受BOTOX治疗的9只兔子中没有一只产生对抗A型肉毒杆菌毒素的抗体。DAS结果表明A型肉毒杆菌毒素相对效力峰值与F型肉毒杆菌毒素相等，而F型肉毒杆菌毒素则要大于B型肉毒杆菌毒素。对于作用持续时间来说，A型肉毒杆菌毒素要长于B型肉毒杆菌毒素，B型肉毒杆菌毒素作用持续时间长于F型肉毒杆菌毒素。如治疗指数值所显示，两种市售A型肉毒杆菌毒素制剂(BOTOX和Dysport)是不同的。由后肢注射B型肉毒杆菌毒素所观察到的增加的水消耗行为显示，临床显著量的这种血清型进入了鼠的全身循环。该结构同样还显示，为了达到与A型肉毒杆菌毒素相同的效果，需要提高所检测的其他血清型的剂量。增加的剂量可能会有安全问题。更进一步来说，在兔子中，B型肉毒杆菌毒素比BOTOX具有更强的抗原性，可能是因为为了达到有效剂量的B型肉毒杆菌毒素注射了更高的蛋白质负荷。Eur J Neurol1999 Nov；6(Suppl 4)S3-S10。
除了在外周区域具有药学作用以外，肉毒杆菌毒素对中央神经系统也具有抑制作用。Weigand等，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165，和Habernann，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56的工作显示肉毒杆菌毒素可以通过逆向运输进入脊柱区。这样，在外周区域注射、例如肌肉注射的肉毒杆菌毒素就可以逆向运输进入脊髓。
美国专利US 5,989,545公开了一种改性的梭状芽胞杆菌神经毒素或其片段、优选肉毒杆菌毒素，化学共轭或者是重组融合成特定的靶部分可通过对脊髓给药用于治疗疼痛。乙酰胆碱通常哺乳动物神经系统的每种神经元只能释放出单一类型的小分子神经递质。神经递质乙酰胆碱由脑中许多区域的神经元所分泌，但特别是由运动皮质的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、使骨骼肌受神经支配的运动神经元、自主神经系统(包括交感神经和副交感神经系统)神经节前神经元、副交感神经系统节后神经元和某些交感神经系统节后神经元分泌。本质上，只有神经节后交感神经纤维到汗腺、竖毛肌以及一些血管与大多数交感神经系统的神经节后神经元一样是胆碱能的，分泌神经递质去甲肾上素。在大多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。但是已知在某些外周副交感神经末梢，乙酰胆碱具有抑制效果，例如通过迷走神经抑制心率。
自主神经系统输出的信号通过交感神经系统或者副交感神经系统传送到身体各处。交感神经系统的神经节前神经元，从位于脊髓中间外侧角中的神经节前交感神经元细胞体伸出。从细胞体中伸出的神经节前交感神经纤维，与位于脊柱旁交感神经节或者脊柱旁神经节的神经节后神经元，通过神经键相连。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能的，因此向神经节施用乙酰胆碱将会使交感神经系统和副交感神经的神经节后神经元兴奋。
乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。在所有受副交感神经系统的神经节后神经元刺激的效应器细胞中、以及在受交感神经系统的神经节后胆碱能神经元刺激的效应器细胞都可以发现毒蕈碱受体。烟碱受体可以在肾上腺髓质中发现。也可以在自主神经节中发现，烟碱受体位于交感神经以及副交感神经系统的神经节前和神经节后神经元之间的突触部位的神经节后神经元的细胞表面。也可以在许多非自主神经末梢发现烟碱受体，例如在神经肌肉接点的骨骼肌纤维膜中也发现有烟碱受体。
当细胞内小而透明的泡与突触前神经元细胞膜融合时，从胆碱能神经元中释放出乙酰胆碱。各种各样非神经元分泌细胞，例如肾上腺髓质(也称为PC12细胞系)和胰岛细胞分别从它们的大致密核心小泡中释放出儿茶酚胺和甲状旁腺激素。PC12细胞系是纯系大鼠嗜铬细胞瘤细胞，广泛用作研究肾上腺交感神经发展的组织培养模型。在体外渗透(例如电穿孔)或者是将毒素直接注射进去除神经的细胞，肉毒杆菌毒素抑制从这两种细胞中释放出的以上两种物质。还已知肉毒杆菌毒素阻止从皮质突触体细胞培养物中释放神经递质谷氨酸盐。
神经肌肉接点由轴突近端与肌细胞形成于骨骼肌肉中。通过神经系统传递的信号导致在末端轴突的动作电位，同时活化离子通道，并导致从神经元内突触泡中释放神经递质乙酰胆碱(例如在神经肌肉接点的运动终板(endplate)上)。乙酰胆碱穿过细胞外间隙与肌肉终板表面上的乙酰胆碱受体蛋白结合。当产生了足够的结合时，肌细胞的动作电位引起特定的膜离子通道变化，导致了肌细胞的收缩。然后乙酰胆碱从肌细胞中释放出来，在细胞外间隙中被胆碱酯酶代谢。代谢物循环进入末端轴突，再生成乙酰胆碱。胆碱能脑系统运动和视觉丘脑的胆碱能影响都产生于脑干与基底前脑。参见例如Billet S.等，Cholinergic Projections to the Visual Thalamusand Superior Colliculus，Brain Res.，847；121-1231999和Oakman，S.A.等，the Extent of Pontomesencephalic CholinergicNeurons′Projections to the ThalamusComparison withProjections to Midbrain Dopaminergic Groups，Neurosci 94(2)；529-547；1999。这样，基于使用乙酰胆碱酯酶(AchE)染色的组织化学研究以及胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫化学逆向示踪研究，已知丘脑神经元的脑干胆碱能刺激在上升。Steriade M.等，“脑胆碱能系统“，牛津大学出版社(1990)，第一章。实际上，许多丘脑核从脑干的网状结构中获得密集的胆碱能神经分布。如上第167页。已知的脑干胆碱能细胞组存在于(1)在被称为Ch5位置的喙状桥，其位于小脑上脚周围的被盖中央区域，形成了脚桥被盖网状核，以及；(2)中脑的尾部，位于称为Ch6的区域，背外侧被盖核，它包埋在导水管周围灰质和脑室周围灰质中。Ch5以及Ch6细胞组可能几乎仅仅包含胆碱能神经元，它们一起形成了脑桥胆碱能系统。Ch5-Ch6胆碱能细胞组提供了直接上升的投射，该投射终止于许多中脑靶结构，间脑和端脑，包括上丘、顶盖前区，后连合的间质大细胞核，缰外侧核，丘脑，大细胞视叶前核，乳头体外侧核，基底前脑，嗅球，额叶前中侧皮质以及脑桥核。Stone T.W.，CNS Neurotransmitters andNeuromodulatorsAcetyicholine，CRC Press(1995)，第16页。还参见Schafer M.K.-H.等，“Cholinergic Neurons and TerminalFields Revealed by Immunochemistry for the VesicularAcetylcholine Transproter.I.Central Nervous System”，Neuroscience，84(2)；331-3591998。人Ch1-8胆碱能核的三维定位已经绘出。参见例如Tracey D.J.等，Neurotransmitters in theHuman Brain，Plenum Press(1995)，136-139页。
此外，基底前脑(前脑)与新皮质、海马状突起、扁桃体和嗅球一起提供背侧丘脑的胆碱能的神经分布。参见例如Steridae，第136页。基底前脑区，其大部分神经元是胆碱能的，包括内侧间隔核(Ch1)、斜带核的垂直分支(Ch2)、斜带核的水平分支(Ch3)，以及大细胞核基底核(Ch4)，其位于Ch3细胞组的背外侧。Ch1和Ch2提供了对海马回的胆碱能投射的主要组分。而Ch3中的细胞扇面投射到嗅球上。
再者，在丘脑中存在胆碱能神经元。参见Rico，B.等，A Populationof Cholinergic Neurons is Present in the Macaque MonkeyThalamus，Eur J Neurosci，10；2346-23521998。
脑胆碱能系统的异常，已经在许多神经精神病中被一致地确认，包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病以及具有Lewy体的痴呆。因此，在阿耳茨海默氏病中存在着对海马回和皮质过度活跃的胆碱能投射。据信在具有Lewy体的痴呆患者中，存在着广泛的新皮质胆碱能的短缺，并且据信在帕金森氏病中，存在着脑桥脚胆碱能神经元的缺失。特别是，在人脑中的体内胆碱能活动的图象已经被报导出来。Perry等，Acetylcholine in Minda Neurotransmitter Correlate ofConsciousness？，TINS 22(6)；273-2801999。
因此需要通过给药有效治疗运动失调的方法，该药物具有活性持续时间长、从选择的给药颅内靶组织扩散出来的速度低以及在治疗剂量水平有名无实的系统作用的特征。
发明概述本发明满足了该需要，并提供了通过颅内施用神经毒素有效治疗运动失调的方法，神经毒素具有活性持续时间长、从给药的颅内部位扩散出来的速度低以及在治疗剂量水平无关紧要的系统作用的特征。
下列定义适用于本发明″约″是指大约或几乎，并且在本发明所列的数值或范围中是指所述或所要求数值或范围的±10％。
对于神经毒素，″生物活性″包括分别影响合成、胞吐作用、受体结合和/或神经递质如乙酰胆碱的摄取、或者内分泌或外分泌分泌产物如胰岛素或胰液的摄取。
″局部给药″是指将药物直接施用在或施用到动物体上或动物体内的部位邻近，在该部位需要药物的生物作用。局部给药排除了系统给药途径，例如静脉内或口服给药。
″神经毒素″是指对神经元细胞表面受体具有特定亲合力的生物活性分子。神经毒素包括梭状芽胞杆菌毒素，它可以是醇的毒素，也可以是与一种至多种非毒素、毒素有关蛋白的复合物。
″颅内″是指在颅内或者在靠近脊髓背侧端，并且包括脊髓、脑干、脑桥、小脑和大脑。
本发明范围内运动失调的治疗方法可以通过向患者颅内施用神经毒素进行，从而缓解运动失调的症状。神经毒素是由选自肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、酪酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumbutyricum)和Clostridium beratti的细菌制备的，或者可以由合适的宿主(即重组改变的大肠杆菌(E.Coli))表达，该宿主编码由肉毒梭状芽胞杆菌、酪酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti制备的神经毒素。优选地，神经毒素是肉毒素，例如A、B、C1、D、E、F和G型肉毒素。
神经毒素可以对不同的脑区给药以治疗性地治疗运动失调，包括向下脑区、脑桥区、中脑桥区(mesopontine region)、苍白球和/或脑的丘脑区给药。
神经毒素可以是经改性的神经毒素，即是与天然的神经毒素相比其至少一个氨基酸缺失、被修饰或被替换的神经毒素，或者改性的神经毒素可以是重组产生的神经毒素或其衍生物或其片段。
本发明神经毒素的颅内给药可以包括将控释的肉毒素系统植入的步骤。本发明详细的具体实施方案可以是通过给患者颅内施用治疗有效量的肉毒素治疗运动失调、从而治疗运动失调症状的方法。所治疗的运动失调可以包括帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、进行性核上性麻痹、Wilson病、图雷特氏综合征、癫痫、慢性震颤、抽搐、张力障碍和痉挛状态。
本发明范围的其他具体实施方案可以是治疗运动失调的方法，该方法包括以下步骤选择具有震颤抑制剂活性的神经毒素；选择影响运动失调的颅内靶组织；和向靶组织颅内施用治疗有效量的所选神经毒素，由此治疗运动失调。
因此，本发明治疗运动失调的方法可以具有给哺乳动物颅内施用神经毒素的步骤，从而缓解哺乳动物所体验的运动失调症状。更优选的是，所用肉毒素是A型肉毒素，因为A型肉毒素具有高效能、易利用并且在治疗各种病症上有很长的临床使用历史。
出人意料地发现，肉毒素例如A型肉毒素可以以约10-3U/kg至约10U/kg的量颅内给药，以缓解人类患者所体验的运动失调。优选地，所用肉毒素以约10-2U/kg至约1U/kg的量颅内给药。更优选的是，肉毒素以约10-1U/kg至约1U/kg的量给药。最优选的是，肉毒素以约0.1单位至约5单位的量给药。重要的是，当以神经毒素水溶液的形式给药时，本发明公开的方法的运动失调缓解作用可以持续约2个月至约6个月，并且当以控释植入物的形式施用神经毒素时，运动失调缓解作用可以持续约5年。
本发明进一步优选的方法是通过选择具有震颤抑制剂活性的神经毒素、选择影响运动失调的颅内靶组织和向靶组织颅内施用治疗有效量的所选神经毒素治疗运动失调的方法。
本发明另一优选的方法是改善患者功能的方法，该方法包括给患者颅内施用神经毒素的步骤，从而改善患者的功能，这些功能的改善可以通过减少疼痛、减少卧床时间、增加步行、健康的体态和更多各式各样的生活方式中一种或多种因素的改善而确定。
描述本发明是以如下发现为基础的，即通过颅内施用神经毒素可以显著和长期持久地减轻各种不同的运动失调。颅内给药使得血脑屏障得以被绕过，并且与系统给药相比，可以将更多的毒素递送到脑。此外，神经毒素例如肉毒素系统给药是被禁忌的，因为肉毒素进入全身循环会导致严重的并发症(即肉毒中毒)。此外，既然肉毒素不能以任何有效量穿透血脑屏障，因此肉毒素的系统给药对于治疗颅内靶组织没有实用性。
本发明包括任何适宜的将神经毒素颅内施用给选择的靶组织的方法，包括在选择的靶组织中注射神经毒素水溶液和植入控释系统、例如掺有神经毒素的聚合植入物。控释植入物的应用减少了重复注射的需要。
颅内植入物是已知的。例如恶性神经胶质瘤的近程治疗可以包括定向(stereotactically)植入的、临时的碘-125间质导管。Scharfen.C.O.等，High Activity Iodine-125 Interstitial Implant ForGliomas，Int.J.Radiation Oncology Biol Phys 24(4)；583-5911992。此外，永久的、颅内低剂量125I种子导管植入物已经被用于治疗脑瘤。Gaspar等，Permanent125I Implants for RecurrentMalignant Gliomas，Int J Radiation Oneology Biol Phys43(5)；977-9821999。还参见第66章，第577-580页，Bellezza D.等，Stereotactic Interstitial Brachytherapy，Gildenberg P.L.等，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill(1998)。
再者，使用外科手术植入的、能进行生物降解的植入物，通过间质化疗，局部施用抗癌药物以治疗恶性神经胶质瘤是已知的。例如，已经发现了颅内施用含有3-二(氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)(卡莫司汀)的聚酐糯米纸囊剂的治疗应用。Brem，H.等，The Safety ofInterstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followedby Radiation Therapy in the Treatment of Newly DiagnosedMalignant GliomasPhase I Trial，J Neuro-Oncology 26111-1231995。
聚酐聚合物，Gliadel(Stolle R & D，Inc.，Cincinnati，OH)，一种聚羧基苯氧基丙烷与癸二酸的20∶80共聚物已经用于制备植入物，该植入物颅内植入以治疗恶性神经胶质瘤。可以将聚合物和BCNU一同溶解在二氯甲烷中，并喷雾干燥在微球体中。然后可以通过压缩模塑法将微球体压制成直径1.4cm、厚1.0mm的圆片，在氮气氛下包装在铝箔袋中，并通过2.2megaRads γ照射灭菌。该聚合物使得卡莫司汀在2-3周内释放，当然，聚合物的大量降解需要花费一年以上的时间。Brem，H.等，Placebo-Controlled Trial of Safety andEfficacy of Intraoperative Controlled Delivery byBiodegradable Polymers of Chemotherapy for Recurrent Gliomas，Lancet 345；1008-10121995。
在室温，通过将所需量的稳定的神经毒素(例如非重构的BOTOX)与溶解在二氯甲烷中的合适的聚合物溶液混合，可以制备植入物。然后将该溶液转入陪替氏培养皿中，并在真空干燥器中使二氯甲烷蒸发。根据所需植入物的大小，并因此根据所掺入神经毒素的量，将掺有适宜量的干燥神经毒素的植入物在模子中在约8000p.s.i.压制5秒或者在3000p.s.i.压制17秒，形成将神经毒素封进内部的植入物片。参见例如Fung L.K.等，Pharmacokinetics of InterstitialDelivery of Carmustine 4-Hydroperoxycyclophosphamide andPaclitaxel From a Biodegradable Polymer Implant in the MonkeyBrain，Cancer Research 58；672-6841998。
肉毒素在组织中的生物活性的扩散表现为剂量的函数，并且可以分等级。Jankovic J.，et al Therapy With Botulinum Toxin，MarcelDekker，Inc.，(1994)，第150页。
神经毒素例如肉毒素的局部颅内递送可以提供高的毒素局部治疗水平，并且可以显著预防任何系统毒性(许多神经毒素、例如肉毒素过多透过血脑屏障所引起的)的发生。控释聚合物长期、局部递送神经毒素到颅内部位的能力可以避开系统毒性和血脑屏障产生的限制，并使得可以对颅内靶组织有效给药。适宜的植入物，例如在题为″神经毒素植入物″的共同未决美国专利申请09/587250中所述的，使得将化疗药物通过控释聚合物直接引入脑的靶组织。所用植入物聚合物优选为疏水的，以保护掺入聚合物中的神经毒素不被水分解，直至毒素释放到靶组织环境中。
按照本发明，肉毒素通过注射或植入到例如胆碱能丘脑中局部颅内给药，对于特别是与帕金森氏病有关的震颤的治疗的丘脑切开术是高级的供选择的方案。
本发明范围内的方法包括使用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多功能定位装置，定向放置含神经毒素的植入物。注射120ml碘苯六醇、350mg碘/ml，使用2mm厚的切片进行的造影加强的计算机X射线断层造影(CT)扫描使得可以进行三维多层面采集处理计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该装置允许以磁共振成像研究为基础进行设计、将CT和MRI靶信息合并以清楚地进行靶确认。
经修改以与GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，Wis.)一起使用的Leksell定向系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，Ga.)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)定向系统(Radionics，Burlington，Mass.)可用于该目的。因此，在植入的早上，将BRW定向支架的环状基托环系在患者的头颅上。可以以3mm的间隔得到连续的CT切片，尽管具有石墨棒定位器支架的该(靶组织)区夹在托板上。计算机处理设计程序可以使用石墨棒图象CT坐标、在VAX11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行，以在CT间隙和BRW间隙之间绘图。
不受理论约束，可以对本发明所用方法的治疗作用提出机理。因此，神经毒素，例如肉毒素可以抑制集中不同CNS神经递质、特别是乙酰胆碱的神经元的胞吐作用。已知胆碱能神经元存在于丘脑中。此外，胆碱能核存在于基底核或者基底前脑中，对运动原和感觉小脑区具有保护作用。因此，本发明范围内方法的靶组织可以包括神经毒素诱导、可逆的颅内运动原去神经区(例如丘脑)以及脑胆碱能系统本身(例如基底核)，这些系统发射到颅内运动区。例如，向使胆碱能受神经支配的丘脑核(例如Vim)中注射或植入神经毒素可以导致(1)下调Vim活性，因为毒素作用于从基底核伸到丘脑中的胆碱能末端，和；(2)减弱丘脑输出量，因为毒素作用于丘脑somata(包括胆碱能的和非胆碱能的)，因而生产化学品丘脑切开术。
优选地，用于实施本发明范围方法的神经毒素是肉毒素，例如A、B、C、D、E、F或G血清型肉毒素之一。优选地，所用肉毒素是A型肉毒素，因为其在人体内具有高效能、易利用，并且已知通过肌内注射局部时，用于治疗骨骼和平滑肌病症。B型肉毒素是实施所公开方法的最不优选的神经毒素，因为与A型肉毒素相比，B型肉毒素已知具有明显低的效能和功效，不易被利用，并且人类临床应用史有限。再者，B型肉毒素载负高级蛋白会引起致免疫反应发生，并伴有B型神经毒素抗体的形成。
选择用于对本发明靶组织颅内给药的神经毒素的用量可以根据一些条件变化，例如所治疗的运动失调病症、其严重性、所涉及或者治疗的脑组织的程度、所选择神经毒素的溶解特征以及患者的年龄、性别、体重和健康状况。例如，据信，脑组织区受影响的程度是与所注射的神经毒素体积成比例的，而据信对于多数剂量范围，震颤抑制剂作用的量与所注射的神经毒素的浓度成比例。通常，确定适当的给药途径和剂量的方法由主治医师根据具体病例确定。这样的测定对于本领域普通技术人员来说是常规的(参见例如Harrison′s Principlesof Internal Medicine(1998)，edited by Anthony Fauci et al.，14th edition，published by McGraw Hill)。
已经发现，神经毒素、例如肉毒素可以按照本发明公开的方法，以约10-3U/kg至约10U/kg的量颅内给药。如果递送到小颅内核中，约10-3U/kg的剂量可以产生震颤抑制剂作用。少于约10-3U/kg剂量的颅内给药不会产生显著的或持久的治疗效果。大于10U/kg神经毒素例如肉毒素的颅内剂量则造成显著的感觉去神经危险或可取的与靶相邻神经元的运动原功能。
优选的肉毒素例如A型肉毒素颅内给药、以在接受治疗的患者中产生震颤抑制剂效应的范围是约10-2/kg至约1U/kg。少于约10-2U/kg会导致较小的、然而仍然可观察到的震颤抑制剂效应。肉毒素例如A型肉毒素颅内给药、以在接受治疗的患者中产生抗伤害感受效应的更优选的范围是约10-1U/kg至约1U/kg。少于约10-1U/kg会产生小于最佳或最长可能的持续期间的所需的治疗效应。最优选的肉毒素例如A型肉毒素颅内给药、以在接受治疗的患者中产生震颤抑制剂效应的范围是约0.1单位至约100单位。在其优选范围内，肉毒素例如A型肉毒素颅内给药可以提供戏剧性的治疗成功。
本发明的范围包括使用任何局部颅内各患者施用时震颤抑制剂效应持续期间长的神经毒素。例如由任何一种产生毒素的梭状芽胞杆菌制造的神经毒素，例如肉毒梭状芽胞杆菌、酪酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti可用于或适用于本发明方法。此外，所有的肉毒血清型A、B、C1、D、E、F和G均可有利地用于实施本发明，当然如上所述，A型是最优选的、而B型是最不优选的血清型。通过注射实施本发明可以为人提供3个月或者更长时间的震颤抑制剂效应。
重要的是，本发明方法可以提供改善的患者功能。″改善的患者功能″可以定义为通过以下因素测量的改善，例如减少疼痛、减少卧床时间、增加步行、健康的体态、更多各式各样的生活方式和/或正常肌肉张力所允许的愈合。改善的患者功能是改善生活质量(QOL)的同义词。QOL可以采用例如已知的SF-12或SF-36健康调查评分方法评定。SF-36分身体功能的八个范畴评定患者的身体和精神健康，即由于身体问题引起的作用限制、社会功能、身体疼痛、总体精神健康状况、由于情绪问题引起的作用限制、活力和总体健康知觉。可以将所得评分与对各种一般人群和患者群有效的公布的值比较。
如上所述，已经发现，通过给受折磨的患者颅内施用神经毒素，可以出人意外地有效和持久地治疗运动失调。在最优选的实施方案中，本发明是通过颅内注射或植入A型肉毒素实施的。
在本发明范围内，包括(a)通过细菌培养、毒素提取、浓缩、防腐、冻干和/或重新配制获得神经毒素；和(b)修饰或重组神经毒素，即是这样的神经毒素，它通过已知的化学/生物化学氨基酸修饰方法或者通过使用已知的宿主细胞/重组载体重组技术使一个或多个氨基酸或者氨基酸序列故意缺失、改性或者被替换，以及所制备的神经毒素的衍生物或片段。
本发明所用的肉毒素可以以冻干、在真空压力下于容器中的真空干燥形式或者以稳定的液体形式贮藏。在冻干之前，可以将肉毒素与可药用赋形剂、稳定剂和/或载体例如白蛋白结合。冻干物质可以用盐水或水重新配制。
实施例下面的实施例列出了本发明所包括的治疗运动失调的具体方法，这些实施例不是意在限制本发明的范围。
实施例1颅内靶组织定位与方法学定向方法可用于将神经毒素以含水形式或者以植入物形式精确的颅内施用到所需的靶组织。因此，可以如下进行神经毒素的颅内给药，以治疗耐药性震颤(即休息性震颤，例如可能出现在帕金森氏病中，或者动作性震颤，例如特发性震颤)、多发性硬化震颤、创伤后震颤、偏瘫后震颤(中风后痉挛状态)、与神经病有关的震颤、书写震颤和癫痫。
可以对患者进行初步MRI扫描，以获取前连合-后连合线长度及其外骨界标的定向。然后可以将支架的基托与前连合-后连合线的平面排成一行。采用CT指导，并且可以用脑室造影术作为补充。可以在2-mm CT切片上目测检验后连合，并将其用作参考点。注射的靶位置是腹外侧丘脑的腹中间核基底部分，平均坐标是后连合前的6.5mm，第三室壁外侧11mm以及前连合-后连合线上2mm。该位置预期不会侵犯到感觉丘脑或丘脑下区。
通过用电极并伴随或结合使用长针注射器高度和低频率地刺激，可以对靶组织定位进行生理学确证。可以使用直径1.6mm、并具有2mm暴露的尖的热敏电阻电极(Radionics，Burlington，Mass.)。使用Radionics损害发生器(Radionics Radiofrequency LesionGenerator Model RFG3AV)，以0.5-1.0V进行电极高频刺激(75Hz)，可以引起前臂和手的感觉异常反应。以2-3V进行刺激，会发生受影响肢体的震颤低频(5Hz)活化或崩溃。采用本发明的方法，电极不用于产生损害。在证实了靶组织定位后，可以注射神经毒素，由此引起可逆的、化学的丘脑切开术。通常注射所需单位的量(即在约0.1ml至约0.5ml水或盐水中的约0.1至约5单位A型肉毒素复合物)。可以使用低注射体积，以使毒素从靶中的扩散最小化。通常，可以预期，神经递质释放抑制作用在约2-4个月逐渐减弱。因此，可以使用一种替代的神经毒素形式，即在聚合植入物中掺入的神经毒素，在所需位置和延长的时期(即，约1年至约6年)内提供控制的、连续释放的治疗量的毒素，从而避免了反复注射毒素的需要。
可以使用几种方法对各种颅内靶、例如底丘脑核(STN)进行神经毒素的定向导向注射，以治疗帕金森氏病。因此，可以使用依赖于用于外科手术设计的三维(3D)T1-加权影像和用于直接使STN显形的多层面采集T2-加权影像的定向磁共振(MRI)方法，method relying onthree-dimensional(3D)T1-加权影像的weighted images forsurgical planning and多层面采集T2-加权影像for directvisualization of the STN，结合电生理学记录和单侧或两侧STN注射的注射指导。参见例如Bejjani，B.P.等，Bilateral SubthalamicStimulation for Parkinson′s Disease by Using Three-Dimensional Stereotactic Magnetic Resonance Imaging andElectrophysiological Guidance，J Neurosurg 92(4)；615-252000。STN可以作为上中脑中的3D卵形双凸hypointense结构目测检验。STN的中心坐标可以参照患者的前连合-后连合线、使用红核的前缘作为界标来确定。
可以同时进行通过几个平行径迹的电生理学监控，以正确地确定功能靶。微电极记录可以识别高频、特发的、运动相关的活性以及STN中的与震颤有关的细胞。将神经毒素注射到STN中可以改善对侧的僵化和运动不能，并抑制存在的震颤。可以选择中心径迹进行神经毒素注射，该中心径迹通过使用MRI成像在预定的靶上指示。预期没有外科手术并发症。在“无”和“有”药物治疗状态，患者显示明显改善的帕金森氏病患者运动性残废，并且使用抗震颤麻痹药治疗戏剧性地减少了左旋多巴引起的运动障碍和运动波动的严重性。
以计算机辅助的自动测试和负载分析系统为基础的功能神经外科学方法可用于准确和精确地注射所需的神经毒素或者植入神经毒素控释的植入物。该方法允许三维显示，并实时操作小脑结构。因此借助预先登记的多脑自动测试和负载分析系统进行所有三正交定位的神经外科手术设计是可能的，并且增加了神经毒素注射或植入的靶定界的准确度，通过减少(神经)束的数量减少外科手术过程的时间，并且易于设计更复杂的轨道。参见例如Nowinski W.L.等，Computer-AidedStereotactic Functional Neurosurgery Enhanced by the Use ofthe Multiple Brain Atlas Database，IEEE Trans Med Imaging19(1)；62-692000。
实施例2用A型肉毒素治疗帕金森氏病一名64岁惯用右手的男性表现为明显的肢体震颤、运动徐缓、僵化和姿势改变，结果是他经常跌倒。突出的捻丸样震颤在其右手上是显著的。排除了中风，并且值得注意的是其右侧症状恶化。进行帕金森氏病诊断。如上面实施例1所述，使用CAT扫描或MRI辅助定向，将2单位A型肉毒素(例如BOTOX或者约8单位DYSPORT)注射到苍白球的左侧。使患者排出48小时，并且在几(1-7)天中享受帕金森氏病患者运动症状的明显改善，这种改善在右侧更明显，左侧也是一样。其运动障碍几乎完全消失。帕金森氏病的运动失调症状在约2至约6个月保持明显的缓解。为了延长治疗的减轻作用，可以在靶组织部位放置一个或多个掺有适当量A型肉毒素的聚合植入物。
实施例3用B型肉毒素治疗帕金森氏病一名68岁惯用左手的男性表现为明显的肢体震颤、运动徐缓、僵化和姿势改变，结果是他经常跌倒。突出的捻丸样震颤在其右手上是显著的。排除了中风，并且值得注意的是其左侧症状恶化。进行帕金森氏病诊断。如上面实施例1所述，使用CAT扫描或MRI辅助定向，将10至约50单位B型肉毒素(例如Neurobloc或InnervateTM)注射到苍白球的右侧。使患者排出48小时，并且在几(1-7)天中享受帕金森氏病患者运动症状的明显改善，这种改善在左侧更明显，右侧也是一样。其运动障碍几乎完全消失。帕金森氏病的运动失调症状在约2至约6个月保持明显的缓解。为了延长治疗的减轻作用，可以在靶组织部位放置一个或多个掺有适当量B型肉毒素的聚合植入物。
实施例4用C-1G型肉毒素治疗帕金森氏病一名71岁女性承认有不能控制的和频繁的震颤。将0.1-100单位C1、D、E、F或G型肉毒素单侧注射到腹外侧丘脑以禁止震颤。如上面实施例1所述，使用CAT扫描或MRI辅助定向，用脑室造影术作为补充。使患者排出48小时，并且在几(1-7)天中享受明显的震颤缓解，该震颤在约2至约6个月保持明显的缓解。为了延长治疗的减轻作用，可以在靶组织部位放置一个或多个掺有适当量C1、D、E、F或G型肉毒素的聚合植入物。
实施例5用A型肉毒素治疗张力障碍一名16岁男孩患有严重的无行为能力的张力障碍，继而发生颅外伤，影响到近端肢体肌肉，他是在左侧单侧丘脑切开术的候选人，两侧丘脑切开术有很高的医原性构音障碍和pseudubulbar作用危险。该患者对经皮神经刺激、EMG和抗胆碱能反馈显示没有反应或者变得反应迟钝。张力障碍较稳定，该患者足以适合接受外科手术，并且明显地远侧phasic残废和强直性肢体张力障碍。
可以在局麻和脑室造影术下将合适的定向支架置于头上，并进行定向MRI。前连合(AC)与后连合(PC)的定向坐标可以用扫描仪中的计算机软件确定。基于PC的软件可用于重新绘制Schaltenbrand和Bailey以及Schaltenbrand和Wahren图谱的矢状脑图，根据需要伸长或收缩患者的AC-PC距离，并且控制在实际应用支架于患者头部的定向坐标。选择靶组织，读取其坐标，并划出适当的支架标度。在与靶相同的矢状平面上，在冠状缝处或者冠状缝的吻突处打钻孔或麻花钻孔。这使得容易地标绘用于靶确证的生理学数据，因为电极轨道横穿单一的矢状平面。丘脑的ventrocaudal核(Vc)可以选择作为生理学界标，从中线伸展15mm。Vc可以容易地通过记录个体触细胞(其中有其稀疏的感受场)或者通过在小心计划的区域进行刺激诱导感觉异常进行识别。
微电极记录针(例如用于单一纤维肌动电流描记术记录，具有约25微米直径的记录电极)可以定位于微量调节注射器的孔内，并且有利于预期的Vc中指触觉表达(tactile representation of thefingers)，并进行连续记录以找寻可辨认的神经元。微刺激可以每毫米地进行，从靶上约10mm扩展到靶下可变的距离。如果第一个微电极轨道进入例如上肢张力障碍患者的唇触觉表达，则第二个轨道可以在外侧多进行2mm。一旦遇到下肢反应，下一个轨道可以更靠近中间2mm进行。一旦发现手的触觉表达，下一个轨道可以向嘴侧进行2mm，在那里记录显示出对特定对侧关节的弯曲或特定对侧部位的压迫响应的动觉神经元。如果张力障碍限制在腿上，则上述方法可以瞄准腿的丘脑表达。
一旦定向-MRI指导的记录/刺激针电极的微刺激定位于靶，则可以注射神经毒素植入物。该植入物可以包含神经毒素、例如A型肉毒素，其中掺有可生物降解的聚合微球体或可生物降解的小丸，每种植入物形式均含有约20总单位(约1ng)的毒素，该植入物的特征在于在至少约4年内、在植入物释放位置以及在靶位置的每一侧约2-3mm的半径内连续释放治疗量的毒素。植入物基本上可以立即释放约1单位毒素，并且随后以2-4个月的周期、每周期累积再释放约1单位的量。
患者张力障碍性收缩几乎可以立即平息，并且每注射一次毒素可以在约2个月至约6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例6用B-G型肉毒素治疗张力障碍可以使用相同的针对靶的方案和途径，用约1单位至约1000单位B、C1、D、E、F或G型肉毒素的水溶液或者适当的神经毒素植入物的形式对上述实施例5的患者进行同等的治疗。通过该治疗，张力障碍性收缩在1-7天内平息，并且每注射一次毒素在约2个月至约6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例7用A型肉毒素治疗震颤一名44岁男性三年来表现出严重的丧失劳动力的震颤，这破坏了他日常生活的活动。在机体的两侧还具有不对称的运动症状，并且左旋多巴引起了肢体运动障碍。通过电刺激预定的靶细胞，定向检查对震颤的作用，来识别震颤细胞。刺激作用显著抑制了震颤。可以在动觉和/或随意震颤细胞中线中距中线约14-15mm和AC-PC线上2-3mm的位置定向指导(如实施例1所述)植入物的放置。靶位置可以是VL或Vi。
该植入物可以是其中掺有A型肉毒素的可生物降解聚合微球体的水溶液，或是A型肉毒素的可生物降解小丸，每一植入物形式含有约20总单位(约1ng)的毒素，该植入物的特征在于在至少约4年内、在植入物释放位置以及在靶位置的每一侧约2-3mm的半径内连续释放治疗量的毒素。植入物基本上可以立即释放约1单位毒素，并且随后以2-4个月的周期、每周期累积再释放约1单位的量。
患者的震颤可以在1-7天内平息，并且每注射一次毒素可以在约2个月至约6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内保持缓解。尤其是，可以显著减弱远侧肢体的运动，无论是右侧相位的还是强直的。
实施例8用B-G型肉毒素治疗震颤可以使用相同的针对靶的方案和途径，用约1单位至约1000单位B、C1、D、E、F或G型肉毒素的水溶液或者适当的神经毒素植入物的形式对上述实施例7的患者进行同等的治疗。通过该治疗，震颤可以在1-7天内平息，并且每注射一次毒素在约2-6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例9用A型肉毒素治疗癫痫惯用右手的22岁女性患者表现出癫痫病史。根据MRI和对EEG记录的研究，进行颞叶癫痫诊断。可以在颞叶前部分、沿着靠近非优势左半球一侧的颞中回，在距颞叶尖5-6cm处插入具有约5-50单位神经毒素(例如A型肉毒素)的植入物。癫痫发作基本上可以在约1-7天内减少，并且每注射一次毒素在约2-6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例10用B-G型肉毒素治疗癫痫可以使用相同的针对靶的方案和途径，用约1单位至约1000单位B、C1、D、E、F或G型肉毒素的水溶液或者适当的神经毒素植入物的形式对上述实施例9的患者进行同等的治疗。通过该治疗，癫痫发作可以在1-7天内平息，并且每注射一次毒素在约2-6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
结果是，借助3D MR成像和电生理学指导，按照本发明方法，注射神经毒素或者植入控释的神经毒素植入物可以安全有效地治疗患有各种运动失调的患者，例如严重的进展性左旋多巴-反应性帕金森氏病。合适的患者包括那些在如本发明所述颅内施用神经毒素之前，如果对化疗、通常是口服L-多巴没有完全的不应，则大大改变的患者。
本发明方法还可以用于各种运动失调，包括特发性震颤、与多法性硬化有关的震颤、创伤后震颤、偏瘫后震颤、帕金森氏病患者震颤和癫痫。
本发明治疗运动失调的颅内施用神经毒素的方法具有许多益处和优点，包括下列1.运动失调症状可以戏剧般地减少。
2.每注射一次毒素在约2至约4个月内运动失调症状可以减少，并且一旦使用控释的神经毒素植入物，运动失调症状在约1至约5年内可以减少。
3.注射或植入的神经毒素产生颅内靶组织位置特异性震颤抑制剂作用。
4.注射或植入的神经毒素显示出从颅内注射或植入位置很少或者不趋于扩散或者转运出来。
5.颅内注射或植入神经毒素很少或者没有明显的不受欢迎的副作用出现。
6.为达到可比的震颤抑制剂作用，颅内注射的神经毒素的量可以远低于通过其他给药途径(即肌内、括约肌内、口服或非肠道途径)给药所需的相同神经毒素的量。
7.本发明方法的震颤抑制剂作用可以产生可取的更大的患者移动性的副作用、更积极的态度和改善的生活质量。
8.在延长的时间内可以递送高治疗剂量的神经毒素至颅内靶组织，而没有系统毒性。
尽管结合某些优选的方法对本发明进行了详细描述，在本发明范围内仍然可能有其他具体实施方案、改型和改变。例如各种各样神经毒素可以有效地用于本发明方法。此外，本发明包括颅内费用方法，其中两种或多种神经毒素、例如两种或多种肉毒素同时或连续给药。例如，可以颅内施用A型肉毒素直至失去临床反应或者产生中和抗体，然后施用B型肉毒素。或者，可以颅内施用任何两种或多种肉毒血清型A-G的组合物，以控制所需治疗结果的起始和持续时间。再者，在施用神经毒素之前、同时或者之后，可以颅内施用非神经毒素化合物，以证明在神经毒素、例如肉毒素开始产生其更持久的震颤抑制剂作用之前附加的作用，例如加强震颤抑制或者使震颤抑制更快地开始。
本发明还包括神经毒素例如肉毒素在制备治疗运动失调药物中的应用，所述治疗是通过颅内施用神经毒素进行的。
上面列出的所有参考文献、文章、专利、申请和公布都全文引入本文作为参考。
因此，下列权利要求的精神和范围不应限于上面列出的优选的具体实施方案的描述。
权利要求
1.运动失调的治疗方法，该方法包括向苍白球或腹外侧丘脑中颅内施用肉毒素的步骤，从而减轻帕金森氏病的运动障碍。
2.权利要求1的方法，其中神经毒素是由选自肉毒梭状芽胞杆菌、酪酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti的细菌制备的。
3.权利要求1的方法，其中神经毒素是肉毒素。
4.权利要求3的方法，其中肉毒素选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒素。
5.权利要求3的方法，其中肉毒素是A型肉毒素。
6.权利要求3的方法，其中肉毒素以约10-3U/kg-10U/kg的量给药。
7.权利要求1的方法，其中症状减轻作用持续约1个月至约5年。
8.权利要求1的方法，其中神经毒素对下脑区给药。
9.权利要求1的方法，其中神经毒素对脑桥区给药。
10.权利要求1的方法，其中神经毒素对中脑桥区给药。
11.权利要求1的方法，其中神经毒素对苍白球给药。
12.权利要求1的方法，其中神经毒素对丘脑区给药。
13.权利要求1的方法，其中神经毒素是改性的神经毒素。
14.权利要求13的方法，其中改性的神经毒素与天然的神经毒素相比，其至少一个氨基酸缺失、被修饰或被替换。
15.权利要求13的方法，其中改性的神经毒素是重组产生的神经毒素或其衍生物或其片段。
16.权利要求1的方法，其中颅内施用步骤包括植入控释的肉毒素系统。
17.运动失调的治疗方法，该方法包括给给患者颅内施用治疗有效量的肉毒素的步骤，从而治疗运动失调症状。
18.权利要求17的方法，其中肉毒素是A型肉毒素。
19.权利要求17的方法，其中运动失调选自帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、进行性核上性麻痹、Wilson病、图雷特氏综合征、癫痫、慢性震颤、抽搐、张力障碍和痉挛状态。
20.帕金森氏病的治疗方法，该方法包括给给患者颅内施用治疗有效量的肉毒素的步骤，从而治疗帕金森氏病的运动失调症状。
21.权利要求19的方法，其中肉毒素是A型肉毒素。
22.运动失调的治疗方法，该方法包括以下步骤(a)选择具有震颤抑制剂活性的神经毒素；(b)选择影响运动失调的颅内靶组织；和(c)向靶组织颅内施用治疗有效量的所选神经毒素，由此治疗运动失调。
23.权利要求22的方法，其中神经毒素是肉毒素。
全文摘要
通过给人类患者颅内施用治疗有效量的神经毒素、例如A型肉毒素治疗运动失调的方法。
文档编号A61P25/16GK1446100SQ01814079
公开日2003年10月1日 申请日期2001年5月29日 优先权日2000年6月14日
发明者S·多诺万 申请人:阿勒根公司
背景技术：
本发明涉及治疗运动失调的方法。尤其是本发明涉及通过在颅内施用神经毒素治疗运动失调的方法。
运动失调运动失调是神经性的障碍疾病，它涉及一块或多块肌肉或者是肌肉组。运动失调包括帕金森氏综合征、亨廷顿舞蹈病、进行性核上性麻痹、威尔逊病、图雷特氏综合征、癫痫病、以及各种慢性震颤、抽搐和张力障碍。不同的临床观察表明，运动失调可以归结为相同或相似的大脑区域失常。例如，大脑基底神经结(一种在大脑根部深处的神经细胞束)失常，通常被认为是多种运动失调的根源。
震颤表现为不正常、无意识的动作。当使用遭受颤抖疾病折磨的身体部位(通常是手臂或手掌)时，例如试图书写或做出需要协调手臂的动作，震颤就会表现得最严重。通常的化学疗法是使用心得安进行药物治疗，但是心得安具有降低血压和改变心率的副作用。在帕金森氏病和具有帕金森氏病特征的综合征中，通常会发生静止时的震颤。当四肢处于静止状态时，休息性震颤表现得最为严重。通常当病人尝试复杂运动时，例如去够一个茶杯，震颤会平息下来。采用系统的抗胆碱药物疗法曾经取得了一些成功。
张力障碍是一种无意识的运动失调，表现为持续的肌肉收缩，导致身体或四肢的扭曲。导致张力障碍的原因包括生化反应异常、变性性疾病、精神机能障碍、毒素、毒品及中枢创伤。丘脑切开术和(或)下丘脑切开手术或者福雷尔区切开术是目前优选的治疗张力障碍的神经外科手术方法，并且与外科手术治疗帕金森氏病采用类似的技术和脑靶进行。见Tasker R.《张力障碍外科治手术疗法》第105章，1015-1032页，载于Gildenberg P.L.等，《接触性和功能性神经外科教科书》，McGraw-Hill出版社(1998)。
某些张力障碍可能包括痉挛性斜颈、眼睑痉挛以及书写者痉挛。痉挛性斜颈通常发生在成年人身上，使得病人的脖子无意识的歪向一边。在开始的时候，某些病人甚至有可能没有注意到自己的脖子和头歪向了一边。眼睑痉挛表现为眼睑的间歇性受迫闭合，是一种无意识的动作。书写者痉挛是一种当患者书写或者用手实施其他动作时，发生的痉挛异常姿势。这些综合征可能会发展到影响手臂和肩膀。
抽搐(包括图雷特氏症)通常是一种快速、短时的刻板的重复运动。常见的抽搐发生在运动系统中；或者是在自然情况下嘴皮不断蠕动。运动系统的抽搐通常发生在眼睑、眉毛或者其他面部肌肉上，同样也会发生在上肢。嘴皮上的抽搐可能会表现为咕哝、清嗓、咳嗽或者发咒骂声等。抽搐的患者通常非常渴望进行某种特定的抽搐，如果其愿望不能得到满足，确实会在其内心产生非常强的压力。例如，一只胳膊突发性动作的运动抽搐，如果患者坐在其手上来控制其胳膊的话，那么患者的胳膊能够短时得到控制；但是，患者心中会有一种不可抗拒的愿望去运动其胳膊，并最后导致该动作的发生。
图雷特氏综合征是一种通常起始于童年或青春期的抽搐疾病，通常多见于男性。嘴皮上的抽搐和运动系统的抽搐通常同时发生。抽搐通常从身体的某部位转向另外一个部位，并且该疾病通常时好时坏，某个时期机几乎不发作，而有时又使得患者的机能发生困难。其他神经行为困难通常伴随着该种综合征。这包括注意力集中障碍(ADHD)和强制性障碍。治疗多数抽搐的方法是使用药物来减少脑中多巴胺的含量，例如使用多巴胺拮抗剂。不幸的是，这些药物具有副作用，会导致其他种类的运动失调等，包括帕金森氏病(僵硬、运动徐缓以及震颤)。除了图雷特氏综合征之外，抽搐可能与头部受伤、一氧化碳中毒、中风、使用毒品和智力低下有关。
进行性核上性麻痹是一种运动失调，该病患者起初眼睛的垂直运动(上下运动)明显困难，接着任何眼睛动作都受到限制(眼肌瘫痪)。病人同样会发展到痴呆、强直、行动迟缓(动作缓慢)、并且容易摔跤。
亨廷顿舞蹈病是一种基因遗传性疾病，同时具有神经和精神病学特征。大多数的病例是发生在病人的四十或五十岁时，也有可能发生在这之前或之后。这种疾病可能始于患者神经或者心理状态的变化。神经病学的症状可能会不同，但是包括舞蹈症。舞蹈症(起源于一个希腊单词，其含义为“跳舞”)是一系列类似跳舞、短时的抽筋以及将身体的一边扭向另一边的运动。同时也会发生笨拙、烦躁和跳动等。面部动作尤其是颌周围的面部动作也可能发生，舞蹈症的患者通常有行走和固定姿势上的困难。精神病学上的症状则可能出现偏执狂、混乱或者人格上的变化。随着病情的发展，会产生严重的痴呆症。脑部的核磁共振图像可以显示一部分大脑基底神经结(与运动有关)发生了萎缩(收缩)，该神经结被称为尾状核。
威尔逊病是一种涉及神经系统和肝脏功能的疾病。神经病学上的问题包括震颤、动作失调、坠落、言语不清、强直以及癫痫发作。也会产生精神病学上的问题，并且如果该痛苦未能得到治疗，会导致病人严重的肝脏损伤。通常由升高的铜含量和血浆铜蓝蛋白含量进行诊断。
不幸的是，包括上述病症在内的运动失调都对药物治疗产生抗药性。抗药性震颤包括休息性震颤，就像在帕金森氏病中所发生的，以及动作性震颤，例如特发性震颤、多发性硬化震颤、创伤后震颤、偏瘫后震颤(中风后震颤)、与精神病有关的震颤、书写震颤以及癫痫病。帕金森氏病帕金森氏病是一种在老年人群中发病率逐渐增高的运动失调。帕金森氏病是一种常见的老龄致残疾病，在美国它折磨着大约1％左右的60岁以上的老年人。帕金森氏病随着年龄的增加，患病的可能性增大，一般人的年龄每增加40岁，患病的可能性增加1％。其症状包括明显的四肢震颤、运动徐缓、强直以及姿势发生变化。目前认为帕金森氏病的病理生理学原因是，大脑基底神经结中产多巴胺细胞的进行性破坏，该神经结包含着被分开的几部分黑质黑质(pars compartum of thesubstantia nigra)，一种位于脑干的基底核。多巴胺能(dopamineric)神经元的缺乏，导致乙酰胆碱的相对过量。见Jellinger，K.A.，“PostMortem Studies in Parkinson′s Disease--Is It Possible toDetect Brain Areas For Specific Symptoms？”，J Neural Transm(如上)；1-291999。
帕金森氏病是一种进行性疾病，最初可能是轻微的肢体僵硬和偶尔的震颤，经过十年或更多的时间，可能导致经常性的震颤以及记忆缺陷，最后导致无法控制的震颤和痴呆。
用于治疗帕金森氏病的药物包括L-多巴、塞利吉林、阿朴吗啡和抗胆碱药。L-多巴(左旋-二羟基-苯丙氨酸)(灭吐灵)是多巴胺的前体，它能够透过血脑障碍，并在脑中转化为多巴胺。不幸的是，L-多巴在体内的半衰期非常短，而且在长期服用之后(如服用4、5年之后)，L-多巴的效果通常变得零星并且不可预知，从而导致运动功能的波动、运动障碍以及精神病学副作用。除此之外，L-多巴还会导致B族维生素的缺失。
塞利吉林(苄甲炔胺，Eldepryl)被用作L-多巴的替代物，其通过减少脑中多巴胺的崩溃而发生作用。但不幸的是，在使用约九个月之后，其变得无效。阿朴吗啡，一种多巴胺受体兴奋剂，也被用于治疗帕金森氏病，然而在使用这种药物的时候，会引起严重的呕吐，同时会引起皮肤反应、感染、倦睡以及一些精神病学副作用。
系统施用抗胆碱药物(例如苯海索和邻甲苯海拉明)也用于治疗帕金森氏病，其通过减少脑中产生的乙酰胆碱的含量起作用，从而调整帕金森氏病患者的多巴胺/乙酰胆碱的不平衡。但是，有大约70％系统施用抗胆碱药物的病人出现了严重的神经精神病学副作用，包括幻觉，同时还有运动障碍，以及其他因为抗胆碱药的广泛分布引起的其他后果，包括幻视、吞因困难、口干以及尿潴留。见例如Playfer，J.R.，Parkinso’s Disease，Postgrad Med J，73；257-2641997和Nadeau，S.E.，Parkinson’s Disease，J Am Ger Soc，45；233-2401997。
在采用L-多巴之前的1969年，使用立体定位手术方法曾给帕金森氏病的治疗带来了一定的效果。与治疗帕金森氏病的治疗药物有关的严重已知的缺乏和缺陷，例如L-多巴长期治疗受到限制，导致了人们对神经外科疗法重新发生了兴趣。曾经证实单侧立体定位丘脑切开术对控制对侧震颤和强直有效果，但是存在导致轻偏瘫的危险。而双侧丘脑切开术则会增加导致口齿障碍和吞咽障碍的危险。采用立体定位苍白球切开术，一种部分苍白球(基底神经结)的外科部分切除术，同样也取得了一些成功。除了采用外科切除术之外，在某些病例中，还发现将高频刺激电极放置在腹中间核能抑制异常运动。已经有多种技术可以保证探针的精确定位，包括X射线计算机断层摄影术和核磁共振成象。不幸的是，这些手术方法对帕金森氏病的运动不能、言语障碍以及步态障碍等症状没有什么帮助，并且所有这些方法均导致脑损伤。癫痫癫痫发作是一种阵发性的事件，疾病的发作原因是中心神经系统神经元的聚集异常、过量、超同步释放。癫痫是一种由慢性基础性病变引起的复发性癫痫发作。在癫痫的诸种原因中，有各种癫痫症状，它们的临床和病理特征都不同，并且提出了特定的基础性病因。癫痫的发病率为每1000人中大约有5到10名患者。严重的头部创伤会使患癫痫病的可能性增加达50％。癫痫的其他原因还包括中风、感染以及遗传等。
抗癫痫药物治疗是目前对患癫痫病患者的主要治疗方法，目前有许多不同种类的药物得到应用。参见，例如Fuci，A.S.等，Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，14th Edition(1998)，page 2321。尽管人们在寻找更有效的组合抗癫痫药物，但是仍然有20％癫痫患者对药物治疗有抗药性。于是外科手术就可能成为一种选择。视频-EEC监视系统可被用于确定癫痫发作病灶的解剖学位置，以及将癫痫发作的异常电生理活动与行为表现联系起来。使用常规头皮或蝶骨头皮记录仪对这种定位通常是足够的。高分辨率MRI扫描通常用来确定结构损伤。功能性的图象研究，例如SPECT和PET是附加的试验，来帮助确定解剖上异常的明显致癫痫区的位置。一旦癫痫发作起始的假定位置得到确定，则可以用附加的研究，包括神经精神测试及颈动脉内异戊巴比妥试验(瓦德氏试验)评估语言和记忆区域，并确定手术切除致癫痫区后可能的功能性后果。在某些情况下，在实施手术的同时可以通过进行皮质成象的方法，来精确地确定手术切除的程度。这涉及清醒患者的电生理学记录和皮质刺激，以确定癫痫样障碍的程度和所涉及的皮质区的功能。
对颞叶癫痫患者最普通的外科手术方法涉及前正中(anteromedial)颞叶的切除(颞叶切除术)或者对基础海马回及扁桃体有限切除。颞区外引起的局灶性癫痫发作可以通过对病灶的新皮质切除得到抑制。但是，大约有5％的癫痫患者在实施手术后，会在临床上出现明显的并发症，还有大约30％的病人在实施颞叶切除术之后仍然会有癫痫发作。
局灶性癫痫可能会涉及脑的几乎所有部分，并且通常是由定域损害的功能异常导致的。局灶性癫痫的一种是精神性运动癫痫发作。目前的治疗方法包括使用EEG来确定预先倾向于局灶性癫痫发作的器质性脑病区的异常尖峰波，然后采用外科手术切除该病灶，以防止未来的发作。脑运动系统大脑的许多区域影响着运动效能。这样，可能因中风造成的大脑运动皮质的损伤，能够使前庭和网状脑干核去除抑制，从而产生自发性活动，并且使受目前抑制解除的下脑区影响的肌肉产生痉挛。
大脑的一个附属运动系统是基底神经节。基底神经节接受大多数来自大脑皮层的信号，并将其大多数信号传输给大脑皮层。基底神经节包括尾状核、壳、苍白球、黑质(它包括pars compacta)以及丘脑下部核。因为从基底神经节向运动皮质发出的异常信号引起大多数帕金森氏病中的异常，所以已经试图通过阻断这些信号治疗帕金森氏病。这样，就有了损害丘脑的腹外侧及前侧核，以阻断从基底神经节向皮质反馈回路的治疗方法。另外，苍白球切开术，即用外科手术方法使苍白球的一部分部分切除，也已用来有效地治疗帕金森氏病的运动失调。
据信，通过将缺乏多巴胺而病理学抑制的丘脑的运动路径中断，能够对外科手术介入有帮助。受抑制的丘脑依次对负责产生运动的皮质神经元网络进行不足的刺激。因此，手术去除对丘脑的抑制曾经用于治疗产生抗药性的运动失调。Speelman，J.D.等，ThalamicSurgery and Tremor，Mov Dis 13(3)；103-1061998。
治疗震颤以及其他帕金森氏病的颅内损害方法已经针对苍白球和豆状核袢进行。但是苍白球切开术的长期效果有时是令人失望的。通过损害下述丘脑核能对手术阻止震颤产生积极效果(1)中腹侧(Vim)或者是腹后侧(VLp)核；(2)腹前(ventrooralis anterior，Voa)核(VOA)，(Voa以及Vop已经统称为腹前核(Vla))；(3)腹后(Vop)核；(4)下丘脑核(福雷尔区切开术)，和；(5)CM-Pf丘脑核。总的来说，在治疗帕金森氏病以及其他系统用药产生抗药性的震颤时，腹外侧丘脑是选择手术的目标。Brophy，B.P.等，Thalamotomy forParkinsonian Tremor，Sterertact Funct Neurosurg，69；1-41997。丘脑对大脑皮质的刺激对几乎所有皮质的活性都是必须的。
立体定位手术(借助于神经成象和电生理学记录)曾被用来治疗晚期产生了抗药性的帕金森氏病，手术的靶是极度活跃的苍白球和下丘脑核。使用脑图谱将电极或者探针放入患者的脑中，该脑图谱象参考了计算机X射线断层造影或者磁共振成象的脑成象图。使苍白球(即腹后侧苍白球)的不同部分、基底神经节、丘脑以及下丘脑核损害，曾经被用来治疗帕金森氏病中的运动障碍。不幸的是，手术损害脑会产生对脑的语言、视觉以及认知区域损害的危险。除此之外，通过使用电极刺激大脑深处来抑制震颤可能会因为金属丝的腐蚀、铅摩擦、植入的脉冲发生器的感染、植入的脉冲发生器的故障、电振荡和铅迁移，而产生某些问题。电极刺激引起的其他并发症包括构音障碍、平衡不稳、轻瘫和步态障碍。参见例如Koller，W.C.等，《帕金森氏病的手术治疗》，J Neurol Sci 167；1-101999和Schuurman P.R.等，《抑制严重震颤的持续丘脑刺激以及丘脑切开术比较》，NEJM342(7)；461-4682000。
除了手术切除或者是刺激之外，外部放射治疗(伽马刀方式外科手术)同样也在有限的程度上被用于治疗抗药性的帕金森氏患者震颤。该方法的缺点是震颤减轻的效果在放射外科手术之后一个星期到八个月才出现，并且其长期有益效果和放射副作用在目前还是未知的。
如上所述，已经通过下丘脑切开术和/或阻断下丘脑区域中的离苍白球纤维对帕金森氏患者震颤以及其他运动失调进行治疗，也采用苍白球切开术。目前有关基底神经节线路(circuitry)的概念，提示了帕金森氏病中纹状体中多巴胺的缺失导致了苍白球外侧部分纹状体突出过度活跃。苍白球外侧活动的下降导致了下丘脑核(其主要投射(projection)位置)的抑制得到解除。增加的下丘脑活动随后使得苍白球内部过度活跃，这投射在脑桥茎核(PPN)以及腹外侧(VL)丘脑上。这样，通过投射于PPN和VL丘脑，下丘脑核中以及苍白球内部的过度活跃产生了帕金森氏患者震颤综合征、运动徐缓以及运动功能减退。使下丘脑核损害以及苍白球切开术、特别是腹后侧苍白球切开术也可以有效地治疗帕金森氏患者。肉毒杆菌毒素梭状芽胞杆菌属的种类超过127种，按照它们的形态和功能进行分组。这种厌氧性、革兰氏阳性杆菌属肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)产生有效的多肽神经毒素，即肉毒杆菌毒素，它能导致人类和动物的被称作肉毒中毒的神经性麻痹疾病。肉毒杆菌的孢子发现于土壤中，并且能在家藏的不正确消毒并且密封的罐头食品容器中生长，这是导致许多肉毒中毒的原因。肉毒中毒通常是在食用被肉毒杆菌培养物或其孢子感染的食物之后18-36小时发生作用。肉毒杆菌毒素能够不减毒地穿过肠道内层并攻击外周运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状从行走、吞咽和讲话艰难发展到呼吸肌瘫痪并死亡。
A型肉毒杆菌毒素是人类所知最致命的天然生物药物。约50皮克市售A型肉毒杆菌毒素(纯化了的神经毒素复合体)(由Allergan，Inc.，of Irvine提供，加利福尼亚，商标为BOTOX，每瓶100单元)是小鼠的LD50值(即，一个单元)。一单元BOTOX含约50皮克(约56attomole)A型肉毒杆菌毒素复合体。有趣的是，以1摩尔为基础，A型肉毒杆菌毒素是白喉致死的约18亿倍、是氰化钠致死的约6亿倍、是眼镜蛇毒素致死的约3千万倍、是霍乱致死的约1千2百万倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，pages 63-84(chapter 4)of Natural Toxins II，edited by B.R.Singh et al.，Plenum Press，New York(1976)(在这里所述的A型肉毒杆菌毒素的LD50值0.3ng等于1单元，修正为BOTOX0.05ng等于1单元)。一单元肉毒杆菌毒素定义为将该毒素腹膜内注射到重18-20克雌性Swiss Webster鼠中的LD50值。1Available from Allergan，Inc.，of Irvine，Califomia under the tradename BOTOXin 100 unit vials)已经对7种免疫学不同的肉毒杆菌神经毒素进行了特征分析，它们分别是血清型A、B、C1、D、E、F和G的肉毒杆菌神经毒素，通过用特定类型的抗体中和来区分每种毒素。不同肉毒杆菌血清型在它们所感染的动物种类方面有所不同，并且在它们所引起的瘫痪的严重性及持续时间也不同。例如，通过对在大鼠中引起瘫痪的比例进行测定，A型肉毒杆菌毒素的效力比B型肉毒杆菌的效力大500倍。此外，已经证实480U/Kg剂量的B型肉毒杆菌毒素对灵长类动物无毒，这个剂量是A型肉毒杆菌毒素灵长类LD50值的约12倍。A.Moyer E等，《B型肉毒杆菌毒素实验和临床经验》，第六章，71-85页“用肉毒杆菌毒素治疗”，Jankovic，J.等主编，(1994)，Marcel Dekker，Inc。肉毒杆菌毒素明显地与胆碱能运动神经元高度亲合性地结合，易位进入神经元并阻断乙酰胆碱的释放。
不管血清型如何，毒素中毒的分子机理相似，并且涉及至少三个步骤或者阶段。在该方法的第一步中，通过与重链H链与细胞表面受体的相互反应，毒素与靶神经元突触前膜结合；对于不同类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素来说，受体被认为是不同的。H链的羧基末端链节Hc对毒素确定细胞表面的靶向来说显得非常重要。
在第二步中，毒素透过受中毒细胞的血浆膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用被吞进细胞中，并形成了包含毒素的内体。然后，毒素逃离内涵体进入到细胞质中。该步骤被认为是通过H链氨基末端链节HN介导的，5.5或更低的pH值引发毒素在构象上的变化。已知，内体拥有一个质子泵，该质子泵的存在能够降低内体的pH值。构象上的转变暴露出毒素的疏水残基，这使得毒素能将其自身包埋在内体的膜上。然后毒素(或者是最少的轻链)通过内体膜易未进入细胞质中。
肉毒杆菌毒素活性机理的最后一步显然涉及连接重链H链以及轻链L链的二硫键的还原。在海参毒素的L链中包含了肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的全部毒性活性；L链是一种锌(Zn++)肽链内切酶，该内切酶选择性地裂解蛋白，这是识别和停靠具有浆膜胞质表面的含神经递质的泡、并融合具有浆膜的泡所必需的。破伤风神经毒素、B、D、F和G型肉毒杆菌毒素能引起一种被称为泡联合膜蛋白(VAMP)的小突触泡蛋白(一种突触膜蛋白)的降解。大多数VAMP存在于突触泡的细胞质表面，其通过这些裂解中的任何一种而被除去。血清型A和E的肉毒杆菌毒素裂解SNAP-25。血清型C1的肉毒杆菌毒素起先被认为裂解突触融合蛋白，但是后来发现它能裂解突触融合蛋白和SNAP-25。除了B型肉毒杆菌毒素(和破伤风毒素)只能裂开相同的键之外，每一种肉毒杆菌毒素能特定地裂解不同的键。
肉毒杆菌曾被用于特征为骨骼肌极度活跃的神经肌肉失调的临床治疗。A型肉毒杆菌毒素复合体已经得到美国食品与药物管理委员会(FDA)的批准，用于治疗睑痉挛、斜视和半面痉挛。非A血清型的肉毒杆菌毒素与A型肉毒杆菌毒素相比，明显具有较低的效力和(或)较短的活性持续时间。A型肉毒杆菌毒素外周肌内注射的临床效果一般在注射后的一个星期内能看到。通常，单次A型肉毒杆菌毒素肌内注射减缓症状的持续时间约为3个月。
虽然所有血清型的肉毒杆菌毒素都能在神经肌肉接点明显地抑制神经递质递乙酰胆碱的释放，但是它们通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点裂解这些蛋白质来实现这一作用。例如，A型和E型肉毒杆菌都能裂解25千道尔顿突触联合蛋白(SNAP-25)，但是它们把该蛋白不同的氨基酸序列作为靶。B、D、F和G型肉毒杆菌毒素作用于泡联合蛋白(VAMP，也被称作小突触泡蛋白)，不同血清型在不同的位点裂解蛋白。最后，C1型肉毒杆菌毒素裂解突触融合蛋白和SNAP-25。这些不同的作用机理可能影响到不同血清型肉毒杆菌毒素的相对效力和/或作用持续时间。很明显，可以在不同种类的细胞中发现肉毒杆菌毒素的底物。参见例如Biochem J.1；339(pt 1)159-651999，以及Mov Disord，10(3)3761995(胰岛B细胞至少包含SNAP-25和突触融合蛋白)。
对于所有已知的七种血清型肉毒杆菌毒素来说，其肉毒杆菌毒素蛋白质分子的分子重量是约150kD。有趣的是，肉毒杆菌毒素被肉毒杆菌以复合体的形式释放出来，该复合体包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子以及联合的非毒素蛋白质。这样，肉毒杆菌可以产生900kD、500kD和300kD的A型肉毒杆菌毒素复合体。产生的B型和C1型肉毒杆菌毒素则显然只有700kD或500kD的复合体。产生的D型肉毒杆菌毒素则同时有300kD和500kD两种类型的复合体。最后，产生的E型和F型肉毒杆菌毒素则仅有约30kD的一种复合体。据信这些复合体(即，分子重量超过约150kD)含有非毒素红细胞凝集素蛋白以及非毒素和无毒的非红细胞凝集素蛋白。这两种非毒素蛋白(与肉毒杆菌毒素分子一起包含相应的神经毒素复合体)，可以使肉毒杆菌毒素分子稳定以防止其变性，并且当毒素被消化时保护其免受酸的消化。除此之外，可能的情况是肉毒杆菌毒素复合体越大(分子重量超过约150kD)，则肉毒杆菌毒素从肉毒杆菌毒素复合体肌肉注射的部位扩散的速度就越慢。
体外研究表明，肉毒杆菌毒素抑制钾阳离子诱导的从脑干组织的初始细胞培养物中释放乙酰胆碱和去甲肾上腺素。除此之外，有报导表明肉毒杆菌毒素抑制诱导脊髓神经元初始培养物中甘氨酸和谷氨酸盐的释放，并且在脑突触体标本中肉毒杆菌毒素抑制各种神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素(Habermann E.等，“破伤风病毒和A型与C型神经毒素抑制从小鼠脑培养物中释放去甲肾上腺素”，神经化学杂志51(2)；522-5271988)、CGRP，P物质和谷氨酸盐(Aanchez-Preeto，J.等，“A型肉毒杆菌毒素阻断豚鼠大脑皮层突触谷氨酸盐的胞吐作用”，Eur J.Biochem 165；675-6811897)的释放。这样当采用适当的浓度时，大多数刺激引发的神经递质释放就被肉毒杆菌毒素所阻断。参见例如Pearce，L.B.，“肉毒杆菌毒素在基础科学和医学方面的药学特征”，Toxicon 35(9)；1373-1412，1393；Bigalke H.等，“A型肉毒杆菌神经毒素抑制培养物中小鼠脊髓神经元中非胆碱能突触的传递”，Brain Research 360；318-3241985；Habernann E.，“破伤风毒素和A型肉毒杆菌毒素对[3H]去甲肾上腺素和[3H]GABA从大鼠脑组织匀浆中的释放”，Experientia 44；224-2261988，Bigalke H.等，“破伤风毒素和A型肉毒杆菌毒素抑制各种传送子的释放和吸收，对大鼠脑和脊髓的微粒子标本的研究”，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch Pharmacol 316；244-2511981，以及；Jankovic J.等，“用肉毒杆菌毒素治疗”，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，第5页。
可以通过在发酵罐中建立和生长肉毒杆菌培养物、然后按照已知方法收集和纯化发酵的混合物来获得A型肉毒杆菌毒素。所有血清型的肉毒杆菌毒素在起始阶段都是以非活性单链蛋白形式合成的，这些单链蛋白必须被蛋白酶裂解或切口才能具有神经活性。这种细菌菌株使血清型A和G肉毒杆菌毒素具有内原性蛋白酶，并且因此使得血清型A和G以其主要活性形式从细菌培养物中回收。相反，C1、D和E型肉毒杆菌毒素是由非蛋白水解菌株合成的，因此当它们从培养物中回收时通常是无活性的。血清型B和F则可以通过蛋白水解和非蛋白水解菌株产生，因而它们可以以活性和非活性两种形式回收。但是，即使是产生例如血清型B型肉毒杆菌毒素的蛋白水解菌株也仅仅裂解所产生毒素的一部分。切口与未切口分子的准确比例取决于培养时间的长短和培养物的温度。因此，一定百分数的任何例如B型肉毒杆菌毒素的制剂可能是失活的，这可能用来解释已知的B型肉毒杆菌毒素的效力明显比A型肉毒杆菌毒素低。在临床制剂中存在一定比例的失活肉毒杆菌毒素分子将有助于制剂的整体蛋白负荷，这与对临床功效没有贡献的抗原性的增加关联。另外，与A型肉毒杆菌毒素相比，以相同的剂量水平肌肉注射B型肉毒杆菌毒素，其活性持续时间要短，并且效力也低。
高质量的A型肉毒杆菌毒素结晶可以由肉毒杆菌的霍尔A菌株获得，其特征为≥3×107U/mg，低于0.60的A260/A278，以及具有独特型式的凝胶电泳模式带。采用已知的Shantz方法能够获得A型肉毒杆菌毒素晶体，如下列文献所述Shantz E.J.等，“肉毒杆菌毒素和其他微生物神经毒素在医学上的性质与应用”，Microbiol Rev.56；80-991992。通常来说，A型肉毒杆菌毒素复合体可以通过在合适的培养基中培养A型肉毒杆菌，从厌氧性发酵物中分离和纯化而获得。一旦分离出非毒素蛋白，可以使用已知方法获得纯净的肉毒杆菌毒素，例如比效能为1-2×108LD50U/mg或更高、分子量约为150kD的纯化的A型肉毒杆菌毒素；比效能为1-2×108LD50U/mg或更高、分子量约为156kD的纯化的B型肉毒杆菌毒素；和比效能为1-2×107LD50U/mg或更高、分子量约为155kD的纯化的F型肉毒杆菌毒素。
肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合体可以从List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，Calif.；the Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)，Metabiologics(Madison，Wis.)以及Sigma Chemicals ofSt Louis，Missouri获得。
纯的肉毒杆菌毒素非常不稳定，以至于一般不用来制备药物组合物。再者，肉毒杆菌毒素复合体，例如A型毒素复合体同样也因为表面变性、受热和碱性条件极易变性。失活毒素形成致免疫的类毒素蛋白。所产生的抗体能使得毒素注射对病人不起作用。
与酶一样，肉毒杆菌毒素(它们是细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于这些毒素的三维构象。A型肉毒杆菌毒素因受热、不同的化学表面伸展以及表面干燥而脱毒。此外，已知将由已知的培养、发酵和提纯获得的毒素复合体稀释到非常非常低的、用于制备药物组合物制剂的浓度，导致毒素快速脱毒，除非存在合适的稳定剂。将毫克量的毒素稀释成为每毫升含几纳克的溶液困难非常大，因为这么大程度的稀释会导致比毒性的快速失去。由于包含有毒素的药物组合物可能会在配制后的数月或者数年使用，这些毒素可以用稳定剂例如白蛋白和明胶来保持稳定。
市售的含有肉毒杆菌毒素的药物组合物以商标BOTOX由Allergan Inc.，Irvine，Colifornia出售。BOTOX由包装在无菌真空干燥形式中的纯化的A型肉毒杆菌毒素复合体、白蛋白和氯化钠组成。A型肉毒杆菌毒素由生长在含N-Z胺和酵母提取物的培养基中的肉毒杆菌霍尔A菌株培养物制得。A型肉毒杆菌毒素复合体是通过将培养物溶液经一系列酸沉淀得到结晶复合体纯化的，结晶复合体由活性高分子量毒素蛋白和相关的红细胞凝集素蛋白组成。然后将结晶复合体再溶解于含盐水和白蛋白的溶液中，并在真空干燥之前无菌过滤(0.2微米)。真空干燥后的产品在-5℃度或更低温度的冰箱中保存。BOTOX可以在肌内注射前用新鲜的生理盐水重新配制。每一瓶BOTOX含有大约100个单位(U)纯化的A型肉毒杆菌神经毒素复合体、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，为无菌、无防腐剂的真空干燥形式。
在适当规格的注射器中，通过吸取适当量的稀释剂，使用无防腐剂的无菌标准盐水(0.9％氯化钠注射液)重新配制真空干燥的BOTOX。因为BOTOX可能因为鼓泡或者相似的剧烈搅动而变性，所以应该轻柔地将稀释液注射进小瓶。为了灭菌，BOTOX优选在将小瓶从冰箱中取出并重新配制后四个小时内施用。在这四个小时内，可以将重新配制的BOTOX储存在约2℃至约8℃的冰箱中。据报道，重新配制后存放在冰箱中的BOTOX可以将其效力至少保持约两个星期。Neurology，48249-531997。
有报道表明，A型肉毒杆菌毒素以下列临床设置使用(1)每次肌内注射(多次肌肉注射)约75-125单位BOTOX，以治疗子宫颈张力障碍。
(2)每次肌内注射5-10单位BOTOX，以治疗眉间横线(额沟browfurrows)(将5单位肌内注射到降眉间肌并将10单位肌内注射到每道皱眉肌中)。
(3)通过在耻骨直肠肌的括约肌内注射约30-80单位BOTOX来治疗便秘。
(4)通过向上眼睑跗骨前侧眼轮匝肌和下眼睑跗骨前侧眼轮匝肌每次肌内注射1-5单位BOTOX，以治疗睑痉挛。
(5)外眼肌肌内注射约1-5单位BOTOX治疗斜视，注射量取决于注射的肌肉的大小，以及所需的肌肉麻痹程度(即需要矫正的屈光度)。
(6)通过将BOTOX如下肌内注射到上肢的五块屈肌中治疗中风后的上肢痉挛状态(a)深指屈肌(flexor digitorum profundus)7.5U-30U(b)浅指屈肌(flexor digitorum sublimus)7.5U-30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris)10U-40U(d)腕桡骨屈肌(flexor carpi radialis)15U-60U(e)臂头肌(biceps brachii)50U-200U。在相同的治疗期中，上述五块肌肉都必须注射，因此在每一治疗期中，患者接受90U-360U上肢屈肌BOTOX的肌肉注射。
(7)治疗偏头痛，与赋型剂相比，以注射25 U BOTOX之后三个月内减少偏头痛的发作频率、严重程度、有关的呕吐和急性药物治疗为标准，颅骨膜注射(对称注射到眉肌、额肌和颞肌)25 U BOTOX注射液对预防性治疗偏头痛显示出了明显的效果。
除此之外，肌内注射肉毒杆菌毒素曾被用于治疗帕金森氏病患者的震颤，虽然有报导认为其效果并不可观。Marjama-Jyons，J.等，Tremor-Predominant Parkinson′s Disease，Drugs & Aging 16(4)；273-2782000。
已知，A型肉毒杆菌毒素的功效可以维持12个月(European J.Neurology 6(Supp 4)S111-S11501999)，并且在有些情况下，其功效可以长大27个月。Laryngoscope 1091344-13461999。但是，肌内注射BOTOX的持续时间通常为3到4个月。
A型肉毒杆菌毒素治疗各种临床疾病所取得的成功导致了人们对其他血清型肉毒杆菌毒素的兴趣。对市售A型肉毒杆菌制剂(BOTOX和Dysport)以及B和F型肉毒杆菌毒素(均从Wako Chemicals，Japan获得)等的研究已经展开，以确定其对局部肌肉疲软的功效、安全性以及抗原潜能。将肉毒杆菌毒素制剂注射到右腓肠肌头(0.5-200.0单位/千克)，并用小鼠趾外展评分分析(DAS)来评估肌肉的虚弱程度。由剂量反应曲线计算ED50值。对其他小鼠进行肌内注射以确定其LD50值。治疗指标可以通过LD50/ED50值来计算。将后肢接受BOTOX(5.0-10.0单位/千克)或B型肉毒杆菌(50.0-400.0单位/千克)注射液的小鼠分组，测试肌肉无力以及增加的水消耗，后者被公认为口干模型。通过对兔子每月一次肌内注射(1.5或者6.5ng/kg B型肉毒杆菌毒素或者0.15ng/kg BOTOX)来评估抗原潜能。肌肉无力峰值以及持续时间对于所有血清型均是剂量相关的。DASED50值(单位/千克)如下BOTOX6.7，Dysport24.7，B型肉毒杆菌毒素27.0-244.0，F型肉毒杆菌毒素4.3。BOTOX与B型肉毒杆菌毒素或F型肉毒杆菌毒素相比，具有更长的作用持续时间。治疗指数值如下BOTOX10.5，Dysport6.3，B型肉毒杆菌毒素3.2。注射了B型肉毒杆菌毒素的小鼠比注射BOTOX的小鼠消耗更多的水，虽然B型肉毒杆菌毒素在疲软肌肉方面具有较差的效果。注射四个月后，接受1.5ng/kg注射的4只兔子中有2只、接受6.5ng/kg注射的所有4只兔子产生了对抗B型肉毒杆菌毒素的抗体。另外的研究显示，接受BOTOX治疗的9只兔子中没有一只产生对抗A型肉毒杆菌毒素的抗体。DAS结果表明A型肉毒杆菌毒素相对效力峰值与F型肉毒杆菌毒素相等，而F型肉毒杆菌毒素则要大于B型肉毒杆菌毒素。对于作用持续时间来说，A型肉毒杆菌毒素要长于B型肉毒杆菌毒素，B型肉毒杆菌毒素作用持续时间长于F型肉毒杆菌毒素。如治疗指数值所显示，两种市售A型肉毒杆菌毒素制剂(BOTOX和Dysport)是不同的。由后肢注射B型肉毒杆菌毒素所观察到的增加的水消耗行为显示，临床显著量的这种血清型进入了鼠的全身循环。该结构同样还显示，为了达到与A型肉毒杆菌毒素相同的效果，需要提高所检测的其他血清型的剂量。增加的剂量可能会有安全问题。更进一步来说，在兔子中，B型肉毒杆菌毒素比BOTOX具有更强的抗原性，可能是因为为了达到有效剂量的B型肉毒杆菌毒素注射了更高的蛋白质负荷。Eur J Neurol1999 Nov；6(Suppl 4)S3-S10。
除了在外周区域具有药学作用以外，肉毒杆菌毒素对中央神经系统也具有抑制作用。Weigand等，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165，和Habernann，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56的工作显示肉毒杆菌毒素可以通过逆向运输进入脊柱区。这样，在外周区域注射、例如肌肉注射的肉毒杆菌毒素就可以逆向运输进入脊髓。
美国专利US 5,989,545公开了一种改性的梭状芽胞杆菌神经毒素或其片段、优选肉毒杆菌毒素，化学共轭或者是重组融合成特定的靶部分可通过对脊髓给药用于治疗疼痛。乙酰胆碱通常哺乳动物神经系统的每种神经元只能释放出单一类型的小分子神经递质。神经递质乙酰胆碱由脑中许多区域的神经元所分泌，但特别是由运动皮质的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、使骨骼肌受神经支配的运动神经元、自主神经系统(包括交感神经和副交感神经系统)神经节前神经元、副交感神经系统节后神经元和某些交感神经系统节后神经元分泌。本质上，只有神经节后交感神经纤维到汗腺、竖毛肌以及一些血管与大多数交感神经系统的神经节后神经元一样是胆碱能的，分泌神经递质去甲肾上素。在大多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。但是已知在某些外周副交感神经末梢，乙酰胆碱具有抑制效果，例如通过迷走神经抑制心率。
自主神经系统输出的信号通过交感神经系统或者副交感神经系统传送到身体各处。交感神经系统的神经节前神经元，从位于脊髓中间外侧角中的神经节前交感神经元细胞体伸出。从细胞体中伸出的神经节前交感神经纤维，与位于脊柱旁交感神经节或者脊柱旁神经节的神经节后神经元，通过神经键相连。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能的，因此向神经节施用乙酰胆碱将会使交感神经系统和副交感神经的神经节后神经元兴奋。
乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。在所有受副交感神经系统的神经节后神经元刺激的效应器细胞中、以及在受交感神经系统的神经节后胆碱能神经元刺激的效应器细胞都可以发现毒蕈碱受体。烟碱受体可以在肾上腺髓质中发现。也可以在自主神经节中发现，烟碱受体位于交感神经以及副交感神经系统的神经节前和神经节后神经元之间的突触部位的神经节后神经元的细胞表面。也可以在许多非自主神经末梢发现烟碱受体，例如在神经肌肉接点的骨骼肌纤维膜中也发现有烟碱受体。
当细胞内小而透明的泡与突触前神经元细胞膜融合时，从胆碱能神经元中释放出乙酰胆碱。各种各样非神经元分泌细胞，例如肾上腺髓质(也称为PC12细胞系)和胰岛细胞分别从它们的大致密核心小泡中释放出儿茶酚胺和甲状旁腺激素。PC12细胞系是纯系大鼠嗜铬细胞瘤细胞，广泛用作研究肾上腺交感神经发展的组织培养模型。在体外渗透(例如电穿孔)或者是将毒素直接注射进去除神经的细胞，肉毒杆菌毒素抑制从这两种细胞中释放出的以上两种物质。还已知肉毒杆菌毒素阻止从皮质突触体细胞培养物中释放神经递质谷氨酸盐。
神经肌肉接点由轴突近端与肌细胞形成于骨骼肌肉中。通过神经系统传递的信号导致在末端轴突的动作电位，同时活化离子通道，并导致从神经元内突触泡中释放神经递质乙酰胆碱(例如在神经肌肉接点的运动终板(endplate)上)。乙酰胆碱穿过细胞外间隙与肌肉终板表面上的乙酰胆碱受体蛋白结合。当产生了足够的结合时，肌细胞的动作电位引起特定的膜离子通道变化，导致了肌细胞的收缩。然后乙酰胆碱从肌细胞中释放出来，在细胞外间隙中被胆碱酯酶代谢。代谢物循环进入末端轴突，再生成乙酰胆碱。胆碱能脑系统运动和视觉丘脑的胆碱能影响都产生于脑干与基底前脑。参见例如Billet S.等，Cholinergic Projections to the Visual Thalamusand Superior Colliculus，Brain Res.，847；121-1231999和Oakman，S.A.等，the Extent of Pontomesencephalic CholinergicNeurons′Projections to the ThalamusComparison withProjections to Midbrain Dopaminergic Groups，Neurosci 94(2)；529-547；1999。这样，基于使用乙酰胆碱酯酶(AchE)染色的组织化学研究以及胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫化学逆向示踪研究，已知丘脑神经元的脑干胆碱能刺激在上升。Steriade M.等，“脑胆碱能系统“，牛津大学出版社(1990)，第一章。实际上，许多丘脑核从脑干的网状结构中获得密集的胆碱能神经分布。如上第167页。已知的脑干胆碱能细胞组存在于(1)在被称为Ch5位置的喙状桥，其位于小脑上脚周围的被盖中央区域，形成了脚桥被盖网状核，以及；(2)中脑的尾部，位于称为Ch6的区域，背外侧被盖核，它包埋在导水管周围灰质和脑室周围灰质中。Ch5以及Ch6细胞组可能几乎仅仅包含胆碱能神经元，它们一起形成了脑桥胆碱能系统。Ch5-Ch6胆碱能细胞组提供了直接上升的投射，该投射终止于许多中脑靶结构，间脑和端脑，包括上丘、顶盖前区，后连合的间质大细胞核，缰外侧核，丘脑，大细胞视叶前核，乳头体外侧核，基底前脑，嗅球，额叶前中侧皮质以及脑桥核。Stone T.W.，CNS Neurotransmitters andNeuromodulatorsAcetyicholine，CRC Press(1995)，第16页。还参见Schafer M.K.-H.等，“Cholinergic Neurons and TerminalFields Revealed by Immunochemistry for the VesicularAcetylcholine Transproter.I.Central Nervous System”，Neuroscience，84(2)；331-3591998。人Ch1-8胆碱能核的三维定位已经绘出。参见例如Tracey D.J.等，Neurotransmitters in theHuman Brain，Plenum Press(1995)，136-139页。
此外，基底前脑(前脑)与新皮质、海马状突起、扁桃体和嗅球一起提供背侧丘脑的胆碱能的神经分布。参见例如Steridae，第136页。基底前脑区，其大部分神经元是胆碱能的，包括内侧间隔核(Ch1)、斜带核的垂直分支(Ch2)、斜带核的水平分支(Ch3)，以及大细胞核基底核(Ch4)，其位于Ch3细胞组的背外侧。Ch1和Ch2提供了对海马回的胆碱能投射的主要组分。而Ch3中的细胞扇面投射到嗅球上。
再者，在丘脑中存在胆碱能神经元。参见Rico，B.等，A Populationof Cholinergic Neurons is Present in the Macaque MonkeyThalamus，Eur J Neurosci，10；2346-23521998。
脑胆碱能系统的异常，已经在许多神经精神病中被一致地确认，包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病以及具有Lewy体的痴呆。因此，在阿耳茨海默氏病中存在着对海马回和皮质过度活跃的胆碱能投射。据信在具有Lewy体的痴呆患者中，存在着广泛的新皮质胆碱能的短缺，并且据信在帕金森氏病中，存在着脑桥脚胆碱能神经元的缺失。特别是，在人脑中的体内胆碱能活动的图象已经被报导出来。Perry等，Acetylcholine in Minda Neurotransmitter Correlate ofConsciousness？，TINS 22(6)；273-2801999。
因此需要通过给药有效治疗运动失调的方法，该药物具有活性持续时间长、从选择的给药颅内靶组织扩散出来的速度低以及在治疗剂量水平有名无实的系统作用的特征。
发明概述本发明满足了该需要，并提供了通过颅内施用神经毒素有效治疗运动失调的方法，神经毒素具有活性持续时间长、从给药的颅内部位扩散出来的速度低以及在治疗剂量水平无关紧要的系统作用的特征。
下列定义适用于本发明″约″是指大约或几乎，并且在本发明所列的数值或范围中是指所述或所要求数值或范围的±10％。
对于神经毒素，″生物活性″包括分别影响合成、胞吐作用、受体结合和/或神经递质如乙酰胆碱的摄取、或者内分泌或外分泌分泌产物如胰岛素或胰液的摄取。
″局部给药″是指将药物直接施用在或施用到动物体上或动物体内的部位邻近，在该部位需要药物的生物作用。局部给药排除了系统给药途径，例如静脉内或口服给药。
″神经毒素″是指对神经元细胞表面受体具有特定亲合力的生物活性分子。神经毒素包括梭状芽胞杆菌毒素，它可以是醇的毒素，也可以是与一种至多种非毒素、毒素有关蛋白的复合物。
″颅内″是指在颅内或者在靠近脊髓背侧端，并且包括脊髓、脑干、脑桥、小脑和大脑。
本发明范围内运动失调的治疗方法可以通过向患者颅内施用神经毒素进行，从而缓解运动失调的症状。神经毒素是由选自肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、酪酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumbutyricum)和Clostridium beratti的细菌制备的，或者可以由合适的宿主(即重组改变的大肠杆菌(E.Coli))表达，该宿主编码由肉毒梭状芽胞杆菌、酪酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti制备的神经毒素。优选地，神经毒素是肉毒素，例如A、B、C1、D、E、F和G型肉毒素。
神经毒素可以对不同的脑区给药以治疗性地治疗运动失调，包括向下脑区、脑桥区、中脑桥区(mesopontine region)、苍白球和/或脑的丘脑区给药。
神经毒素可以是经改性的神经毒素，即是与天然的神经毒素相比其至少一个氨基酸缺失、被修饰或被替换的神经毒素，或者改性的神经毒素可以是重组产生的神经毒素或其衍生物或其片段。
本发明神经毒素的颅内给药可以包括将控释的肉毒素系统植入的步骤。本发明详细的具体实施方案可以是通过给患者颅内施用治疗有效量的肉毒素治疗运动失调、从而治疗运动失调症状的方法。所治疗的运动失调可以包括帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、进行性核上性麻痹、Wilson病、图雷特氏综合征、癫痫、慢性震颤、抽搐、张力障碍和痉挛状态。
本发明范围的其他具体实施方案可以是治疗运动失调的方法，该方法包括以下步骤选择具有震颤抑制剂活性的神经毒素；选择影响运动失调的颅内靶组织；和向靶组织颅内施用治疗有效量的所选神经毒素，由此治疗运动失调。
因此，本发明治疗运动失调的方法可以具有给哺乳动物颅内施用神经毒素的步骤，从而缓解哺乳动物所体验的运动失调症状。更优选的是，所用肉毒素是A型肉毒素，因为A型肉毒素具有高效能、易利用并且在治疗各种病症上有很长的临床使用历史。
出人意料地发现，肉毒素例如A型肉毒素可以以约10-3U/kg至约10U/kg的量颅内给药，以缓解人类患者所体验的运动失调。优选地，所用肉毒素以约10-2U/kg至约1U/kg的量颅内给药。更优选的是，肉毒素以约10-1U/kg至约1U/kg的量给药。最优选的是，肉毒素以约0.1单位至约5单位的量给药。重要的是，当以神经毒素水溶液的形式给药时，本发明公开的方法的运动失调缓解作用可以持续约2个月至约6个月，并且当以控释植入物的形式施用神经毒素时，运动失调缓解作用可以持续约5年。
本发明进一步优选的方法是通过选择具有震颤抑制剂活性的神经毒素、选择影响运动失调的颅内靶组织和向靶组织颅内施用治疗有效量的所选神经毒素治疗运动失调的方法。
本发明另一优选的方法是改善患者功能的方法，该方法包括给患者颅内施用神经毒素的步骤，从而改善患者的功能，这些功能的改善可以通过减少疼痛、减少卧床时间、增加步行、健康的体态和更多各式各样的生活方式中一种或多种因素的改善而确定。
描述本发明是以如下发现为基础的，即通过颅内施用神经毒素可以显著和长期持久地减轻各种不同的运动失调。颅内给药使得血脑屏障得以被绕过，并且与系统给药相比，可以将更多的毒素递送到脑。此外，神经毒素例如肉毒素系统给药是被禁忌的，因为肉毒素进入全身循环会导致严重的并发症(即肉毒中毒)。此外，既然肉毒素不能以任何有效量穿透血脑屏障，因此肉毒素的系统给药对于治疗颅内靶组织没有实用性。
本发明包括任何适宜的将神经毒素颅内施用给选择的靶组织的方法，包括在选择的靶组织中注射神经毒素水溶液和植入控释系统、例如掺有神经毒素的聚合植入物。控释植入物的应用减少了重复注射的需要。
颅内植入物是已知的。例如恶性神经胶质瘤的近程治疗可以包括定向(stereotactically)植入的、临时的碘-125间质导管。Scharfen.C.O.等，High Activity Iodine-125 Interstitial Implant ForGliomas，Int.J.Radiation Oncology Biol Phys 24(4)；583-5911992。此外，永久的、颅内低剂量125I种子导管植入物已经被用于治疗脑瘤。Gaspar等，Permanent125I Implants for RecurrentMalignant Gliomas，Int J Radiation Oneology Biol Phys43(5)；977-9821999。还参见第66章，第577-580页，Bellezza D.等，Stereotactic Interstitial Brachytherapy，Gildenberg P.L.等，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill(1998)。
再者，使用外科手术植入的、能进行生物降解的植入物，通过间质化疗，局部施用抗癌药物以治疗恶性神经胶质瘤是已知的。例如，已经发现了颅内施用含有3-二(氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)(卡莫司汀)的聚酐糯米纸囊剂的治疗应用。Brem，H.等，The Safety ofInterstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followedby Radiation Therapy in the Treatment of Newly DiagnosedMalignant GliomasPhase I Trial，J Neuro-Oncology 26111-1231995。
聚酐聚合物，Gliadel(Stolle R & D，Inc.，Cincinnati，OH)，一种聚羧基苯氧基丙烷与癸二酸的20∶80共聚物已经用于制备植入物，该植入物颅内植入以治疗恶性神经胶质瘤。可以将聚合物和BCNU一同溶解在二氯甲烷中，并喷雾干燥在微球体中。然后可以通过压缩模塑法将微球体压制成直径1.4cm、厚1.0mm的圆片，在氮气氛下包装在铝箔袋中，并通过2.2megaRads γ照射灭菌。该聚合物使得卡莫司汀在2-3周内释放，当然，聚合物的大量降解需要花费一年以上的时间。Brem，H.等，Placebo-Controlled Trial of Safety andEfficacy of Intraoperative Controlled Delivery byBiodegradable Polymers of Chemotherapy for Recurrent Gliomas，Lancet 345；1008-10121995。
在室温，通过将所需量的稳定的神经毒素(例如非重构的BOTOX)与溶解在二氯甲烷中的合适的聚合物溶液混合，可以制备植入物。然后将该溶液转入陪替氏培养皿中，并在真空干燥器中使二氯甲烷蒸发。根据所需植入物的大小，并因此根据所掺入神经毒素的量，将掺有适宜量的干燥神经毒素的植入物在模子中在约8000p.s.i.压制5秒或者在3000p.s.i.压制17秒，形成将神经毒素封进内部的植入物片。参见例如Fung L.K.等，Pharmacokinetics of InterstitialDelivery of Carmustine 4-Hydroperoxycyclophosphamide andPaclitaxel From a Biodegradable Polymer Implant in the MonkeyBrain，Cancer Research 58；672-6841998。
肉毒素在组织中的生物活性的扩散表现为剂量的函数，并且可以分等级。Jankovic J.，et al Therapy With Botulinum Toxin，MarcelDekker，Inc.，(1994)，第150页。
神经毒素例如肉毒素的局部颅内递送可以提供高的毒素局部治疗水平，并且可以显著预防任何系统毒性(许多神经毒素、例如肉毒素过多透过血脑屏障所引起的)的发生。控释聚合物长期、局部递送神经毒素到颅内部位的能力可以避开系统毒性和血脑屏障产生的限制，并使得可以对颅内靶组织有效给药。适宜的植入物，例如在题为″神经毒素植入物″的共同未决美国专利申请09/587250中所述的，使得将化疗药物通过控释聚合物直接引入脑的靶组织。所用植入物聚合物优选为疏水的，以保护掺入聚合物中的神经毒素不被水分解，直至毒素释放到靶组织环境中。
按照本发明，肉毒素通过注射或植入到例如胆碱能丘脑中局部颅内给药，对于特别是与帕金森氏病有关的震颤的治疗的丘脑切开术是高级的供选择的方案。
本发明范围内的方法包括使用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多功能定位装置，定向放置含神经毒素的植入物。注射120ml碘苯六醇、350mg碘/ml，使用2mm厚的切片进行的造影加强的计算机X射线断层造影(CT)扫描使得可以进行三维多层面采集处理计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该装置允许以磁共振成像研究为基础进行设计、将CT和MRI靶信息合并以清楚地进行靶确认。
经修改以与GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，Wis.)一起使用的Leksell定向系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，Ga.)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)定向系统(Radionics，Burlington，Mass.)可用于该目的。因此，在植入的早上，将BRW定向支架的环状基托环系在患者的头颅上。可以以3mm的间隔得到连续的CT切片，尽管具有石墨棒定位器支架的该(靶组织)区夹在托板上。计算机处理设计程序可以使用石墨棒图象CT坐标、在VAX11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行，以在CT间隙和BRW间隙之间绘图。
不受理论约束，可以对本发明所用方法的治疗作用提出机理。因此，神经毒素，例如肉毒素可以抑制集中不同CNS神经递质、特别是乙酰胆碱的神经元的胞吐作用。已知胆碱能神经元存在于丘脑中。此外，胆碱能核存在于基底核或者基底前脑中，对运动原和感觉小脑区具有保护作用。因此，本发明范围内方法的靶组织可以包括神经毒素诱导、可逆的颅内运动原去神经区(例如丘脑)以及脑胆碱能系统本身(例如基底核)，这些系统发射到颅内运动区。例如，向使胆碱能受神经支配的丘脑核(例如Vim)中注射或植入神经毒素可以导致(1)下调Vim活性，因为毒素作用于从基底核伸到丘脑中的胆碱能末端，和；(2)减弱丘脑输出量，因为毒素作用于丘脑somata(包括胆碱能的和非胆碱能的)，因而生产化学品丘脑切开术。
优选地，用于实施本发明范围方法的神经毒素是肉毒素，例如A、B、C、D、E、F或G血清型肉毒素之一。优选地，所用肉毒素是A型肉毒素，因为其在人体内具有高效能、易利用，并且已知通过肌内注射局部时，用于治疗骨骼和平滑肌病症。B型肉毒素是实施所公开方法的最不优选的神经毒素，因为与A型肉毒素相比，B型肉毒素已知具有明显低的效能和功效，不易被利用，并且人类临床应用史有限。再者，B型肉毒素载负高级蛋白会引起致免疫反应发生，并伴有B型神经毒素抗体的形成。
选择用于对本发明靶组织颅内给药的神经毒素的用量可以根据一些条件变化，例如所治疗的运动失调病症、其严重性、所涉及或者治疗的脑组织的程度、所选择神经毒素的溶解特征以及患者的年龄、性别、体重和健康状况。例如，据信，脑组织区受影响的程度是与所注射的神经毒素体积成比例的，而据信对于多数剂量范围，震颤抑制剂作用的量与所注射的神经毒素的浓度成比例。通常，确定适当的给药途径和剂量的方法由主治医师根据具体病例确定。这样的测定对于本领域普通技术人员来说是常规的(参见例如Harrison′s Principlesof Internal Medicine(1998)，edited by Anthony Fauci et al.，14th edition，published by McGraw Hill)。
已经发现，神经毒素、例如肉毒素可以按照本发明公开的方法，以约10-3U/kg至约10U/kg的量颅内给药。如果递送到小颅内核中，约10-3U/kg的剂量可以产生震颤抑制剂作用。少于约10-3U/kg剂量的颅内给药不会产生显著的或持久的治疗效果。大于10U/kg神经毒素例如肉毒素的颅内剂量则造成显著的感觉去神经危险或可取的与靶相邻神经元的运动原功能。
优选的肉毒素例如A型肉毒素颅内给药、以在接受治疗的患者中产生震颤抑制剂效应的范围是约10-2/kg至约1U/kg。少于约10-2U/kg会导致较小的、然而仍然可观察到的震颤抑制剂效应。肉毒素例如A型肉毒素颅内给药、以在接受治疗的患者中产生抗伤害感受效应的更优选的范围是约10-1U/kg至约1U/kg。少于约10-1U/kg会产生小于最佳或最长可能的持续期间的所需的治疗效应。最优选的肉毒素例如A型肉毒素颅内给药、以在接受治疗的患者中产生震颤抑制剂效应的范围是约0.1单位至约100单位。在其优选范围内，肉毒素例如A型肉毒素颅内给药可以提供戏剧性的治疗成功。
本发明的范围包括使用任何局部颅内各患者施用时震颤抑制剂效应持续期间长的神经毒素。例如由任何一种产生毒素的梭状芽胞杆菌制造的神经毒素，例如肉毒梭状芽胞杆菌、酪酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti可用于或适用于本发明方法。此外，所有的肉毒血清型A、B、C1、D、E、F和G均可有利地用于实施本发明，当然如上所述，A型是最优选的、而B型是最不优选的血清型。通过注射实施本发明可以为人提供3个月或者更长时间的震颤抑制剂效应。
重要的是，本发明方法可以提供改善的患者功能。″改善的患者功能″可以定义为通过以下因素测量的改善，例如减少疼痛、减少卧床时间、增加步行、健康的体态、更多各式各样的生活方式和/或正常肌肉张力所允许的愈合。改善的患者功能是改善生活质量(QOL)的同义词。QOL可以采用例如已知的SF-12或SF-36健康调查评分方法评定。SF-36分身体功能的八个范畴评定患者的身体和精神健康，即由于身体问题引起的作用限制、社会功能、身体疼痛、总体精神健康状况、由于情绪问题引起的作用限制、活力和总体健康知觉。可以将所得评分与对各种一般人群和患者群有效的公布的值比较。
如上所述，已经发现，通过给受折磨的患者颅内施用神经毒素，可以出人意外地有效和持久地治疗运动失调。在最优选的实施方案中，本发明是通过颅内注射或植入A型肉毒素实施的。
在本发明范围内，包括(a)通过细菌培养、毒素提取、浓缩、防腐、冻干和/或重新配制获得神经毒素；和(b)修饰或重组神经毒素，即是这样的神经毒素，它通过已知的化学/生物化学氨基酸修饰方法或者通过使用已知的宿主细胞/重组载体重组技术使一个或多个氨基酸或者氨基酸序列故意缺失、改性或者被替换，以及所制备的神经毒素的衍生物或片段。
本发明所用的肉毒素可以以冻干、在真空压力下于容器中的真空干燥形式或者以稳定的液体形式贮藏。在冻干之前，可以将肉毒素与可药用赋形剂、稳定剂和/或载体例如白蛋白结合。冻干物质可以用盐水或水重新配制。
实施例下面的实施例列出了本发明所包括的治疗运动失调的具体方法，这些实施例不是意在限制本发明的范围。
实施例1颅内靶组织定位与方法学定向方法可用于将神经毒素以含水形式或者以植入物形式精确的颅内施用到所需的靶组织。因此，可以如下进行神经毒素的颅内给药，以治疗耐药性震颤(即休息性震颤，例如可能出现在帕金森氏病中，或者动作性震颤，例如特发性震颤)、多发性硬化震颤、创伤后震颤、偏瘫后震颤(中风后痉挛状态)、与神经病有关的震颤、书写震颤和癫痫。
可以对患者进行初步MRI扫描，以获取前连合-后连合线长度及其外骨界标的定向。然后可以将支架的基托与前连合-后连合线的平面排成一行。采用CT指导，并且可以用脑室造影术作为补充。可以在2-mm CT切片上目测检验后连合，并将其用作参考点。注射的靶位置是腹外侧丘脑的腹中间核基底部分，平均坐标是后连合前的6.5mm，第三室壁外侧11mm以及前连合-后连合线上2mm。该位置预期不会侵犯到感觉丘脑或丘脑下区。
通过用电极并伴随或结合使用长针注射器高度和低频率地刺激，可以对靶组织定位进行生理学确证。可以使用直径1.6mm、并具有2mm暴露的尖的热敏电阻电极(Radionics，Burlington，Mass.)。使用Radionics损害发生器(Radionics Radiofrequency LesionGenerator Model RFG3AV)，以0.5-1.0V进行电极高频刺激(75Hz)，可以引起前臂和手的感觉异常反应。以2-3V进行刺激，会发生受影响肢体的震颤低频(5Hz)活化或崩溃。采用本发明的方法，电极不用于产生损害。在证实了靶组织定位后，可以注射神经毒素，由此引起可逆的、化学的丘脑切开术。通常注射所需单位的量(即在约0.1ml至约0.5ml水或盐水中的约0.1至约5单位A型肉毒素复合物)。可以使用低注射体积，以使毒素从靶中的扩散最小化。通常，可以预期，神经递质释放抑制作用在约2-4个月逐渐减弱。因此，可以使用一种替代的神经毒素形式，即在聚合植入物中掺入的神经毒素，在所需位置和延长的时期(即，约1年至约6年)内提供控制的、连续释放的治疗量的毒素，从而避免了反复注射毒素的需要。
可以使用几种方法对各种颅内靶、例如底丘脑核(STN)进行神经毒素的定向导向注射，以治疗帕金森氏病。因此，可以使用依赖于用于外科手术设计的三维(3D)T1-加权影像和用于直接使STN显形的多层面采集T2-加权影像的定向磁共振(MRI)方法，method relying onthree-dimensional(3D)T1-加权影像的weighted images forsurgical planning and多层面采集T2-加权影像for directvisualization of the STN，结合电生理学记录和单侧或两侧STN注射的注射指导。参见例如Bejjani，B.P.等，Bilateral SubthalamicStimulation for Parkinson′s Disease by Using Three-Dimensional Stereotactic Magnetic Resonance Imaging andElectrophysiological Guidance，J Neurosurg 92(4)；615-252000。STN可以作为上中脑中的3D卵形双凸hypointense结构目测检验。STN的中心坐标可以参照患者的前连合-后连合线、使用红核的前缘作为界标来确定。
可以同时进行通过几个平行径迹的电生理学监控，以正确地确定功能靶。微电极记录可以识别高频、特发的、运动相关的活性以及STN中的与震颤有关的细胞。将神经毒素注射到STN中可以改善对侧的僵化和运动不能，并抑制存在的震颤。可以选择中心径迹进行神经毒素注射，该中心径迹通过使用MRI成像在预定的靶上指示。预期没有外科手术并发症。在“无”和“有”药物治疗状态，患者显示明显改善的帕金森氏病患者运动性残废，并且使用抗震颤麻痹药治疗戏剧性地减少了左旋多巴引起的运动障碍和运动波动的严重性。
以计算机辅助的自动测试和负载分析系统为基础的功能神经外科学方法可用于准确和精确地注射所需的神经毒素或者植入神经毒素控释的植入物。该方法允许三维显示，并实时操作小脑结构。因此借助预先登记的多脑自动测试和负载分析系统进行所有三正交定位的神经外科手术设计是可能的，并且增加了神经毒素注射或植入的靶定界的准确度，通过减少(神经)束的数量减少外科手术过程的时间，并且易于设计更复杂的轨道。参见例如Nowinski W.L.等，Computer-AidedStereotactic Functional Neurosurgery Enhanced by the Use ofthe Multiple Brain Atlas Database，IEEE Trans Med Imaging19(1)；62-692000。
实施例2用A型肉毒素治疗帕金森氏病一名64岁惯用右手的男性表现为明显的肢体震颤、运动徐缓、僵化和姿势改变，结果是他经常跌倒。突出的捻丸样震颤在其右手上是显著的。排除了中风，并且值得注意的是其右侧症状恶化。进行帕金森氏病诊断。如上面实施例1所述，使用CAT扫描或MRI辅助定向，将2单位A型肉毒素(例如BOTOX或者约8单位DYSPORT)注射到苍白球的左侧。使患者排出48小时，并且在几(1-7)天中享受帕金森氏病患者运动症状的明显改善，这种改善在右侧更明显，左侧也是一样。其运动障碍几乎完全消失。帕金森氏病的运动失调症状在约2至约6个月保持明显的缓解。为了延长治疗的减轻作用，可以在靶组织部位放置一个或多个掺有适当量A型肉毒素的聚合植入物。
实施例3用B型肉毒素治疗帕金森氏病一名68岁惯用左手的男性表现为明显的肢体震颤、运动徐缓、僵化和姿势改变，结果是他经常跌倒。突出的捻丸样震颤在其右手上是显著的。排除了中风，并且值得注意的是其左侧症状恶化。进行帕金森氏病诊断。如上面实施例1所述，使用CAT扫描或MRI辅助定向，将10至约50单位B型肉毒素(例如Neurobloc或InnervateTM)注射到苍白球的右侧。使患者排出48小时，并且在几(1-7)天中享受帕金森氏病患者运动症状的明显改善，这种改善在左侧更明显，右侧也是一样。其运动障碍几乎完全消失。帕金森氏病的运动失调症状在约2至约6个月保持明显的缓解。为了延长治疗的减轻作用，可以在靶组织部位放置一个或多个掺有适当量B型肉毒素的聚合植入物。
实施例4用C-1G型肉毒素治疗帕金森氏病一名71岁女性承认有不能控制的和频繁的震颤。将0.1-100单位C1、D、E、F或G型肉毒素单侧注射到腹外侧丘脑以禁止震颤。如上面实施例1所述，使用CAT扫描或MRI辅助定向，用脑室造影术作为补充。使患者排出48小时，并且在几(1-7)天中享受明显的震颤缓解，该震颤在约2至约6个月保持明显的缓解。为了延长治疗的减轻作用，可以在靶组织部位放置一个或多个掺有适当量C1、D、E、F或G型肉毒素的聚合植入物。
实施例5用A型肉毒素治疗张力障碍一名16岁男孩患有严重的无行为能力的张力障碍，继而发生颅外伤，影响到近端肢体肌肉，他是在左侧单侧丘脑切开术的候选人，两侧丘脑切开术有很高的医原性构音障碍和pseudubulbar作用危险。该患者对经皮神经刺激、EMG和抗胆碱能反馈显示没有反应或者变得反应迟钝。张力障碍较稳定，该患者足以适合接受外科手术，并且明显地远侧phasic残废和强直性肢体张力障碍。
可以在局麻和脑室造影术下将合适的定向支架置于头上，并进行定向MRI。前连合(AC)与后连合(PC)的定向坐标可以用扫描仪中的计算机软件确定。基于PC的软件可用于重新绘制Schaltenbrand和Bailey以及Schaltenbrand和Wahren图谱的矢状脑图，根据需要伸长或收缩患者的AC-PC距离，并且控制在实际应用支架于患者头部的定向坐标。选择靶组织，读取其坐标，并划出适当的支架标度。在与靶相同的矢状平面上，在冠状缝处或者冠状缝的吻突处打钻孔或麻花钻孔。这使得容易地标绘用于靶确证的生理学数据，因为电极轨道横穿单一的矢状平面。丘脑的ventrocaudal核(Vc)可以选择作为生理学界标，从中线伸展15mm。Vc可以容易地通过记录个体触细胞(其中有其稀疏的感受场)或者通过在小心计划的区域进行刺激诱导感觉异常进行识别。
微电极记录针(例如用于单一纤维肌动电流描记术记录，具有约25微米直径的记录电极)可以定位于微量调节注射器的孔内，并且有利于预期的Vc中指触觉表达(tactile representation of thefingers)，并进行连续记录以找寻可辨认的神经元。微刺激可以每毫米地进行，从靶上约10mm扩展到靶下可变的距离。如果第一个微电极轨道进入例如上肢张力障碍患者的唇触觉表达，则第二个轨道可以在外侧多进行2mm。一旦遇到下肢反应，下一个轨道可以更靠近中间2mm进行。一旦发现手的触觉表达，下一个轨道可以向嘴侧进行2mm，在那里记录显示出对特定对侧关节的弯曲或特定对侧部位的压迫响应的动觉神经元。如果张力障碍限制在腿上，则上述方法可以瞄准腿的丘脑表达。
一旦定向-MRI指导的记录/刺激针电极的微刺激定位于靶，则可以注射神经毒素植入物。该植入物可以包含神经毒素、例如A型肉毒素，其中掺有可生物降解的聚合微球体或可生物降解的小丸，每种植入物形式均含有约20总单位(约1ng)的毒素，该植入物的特征在于在至少约4年内、在植入物释放位置以及在靶位置的每一侧约2-3mm的半径内连续释放治疗量的毒素。植入物基本上可以立即释放约1单位毒素，并且随后以2-4个月的周期、每周期累积再释放约1单位的量。
患者张力障碍性收缩几乎可以立即平息，并且每注射一次毒素可以在约2个月至约6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例6用B-G型肉毒素治疗张力障碍可以使用相同的针对靶的方案和途径，用约1单位至约1000单位B、C1、D、E、F或G型肉毒素的水溶液或者适当的神经毒素植入物的形式对上述实施例5的患者进行同等的治疗。通过该治疗，张力障碍性收缩在1-7天内平息，并且每注射一次毒素在约2个月至约6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例7用A型肉毒素治疗震颤一名44岁男性三年来表现出严重的丧失劳动力的震颤，这破坏了他日常生活的活动。在机体的两侧还具有不对称的运动症状，并且左旋多巴引起了肢体运动障碍。通过电刺激预定的靶细胞，定向检查对震颤的作用，来识别震颤细胞。刺激作用显著抑制了震颤。可以在动觉和/或随意震颤细胞中线中距中线约14-15mm和AC-PC线上2-3mm的位置定向指导(如实施例1所述)植入物的放置。靶位置可以是VL或Vi。
该植入物可以是其中掺有A型肉毒素的可生物降解聚合微球体的水溶液，或是A型肉毒素的可生物降解小丸，每一植入物形式含有约20总单位(约1ng)的毒素，该植入物的特征在于在至少约4年内、在植入物释放位置以及在靶位置的每一侧约2-3mm的半径内连续释放治疗量的毒素。植入物基本上可以立即释放约1单位毒素，并且随后以2-4个月的周期、每周期累积再释放约1单位的量。
患者的震颤可以在1-7天内平息，并且每注射一次毒素可以在约2个月至约6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内保持缓解。尤其是，可以显著减弱远侧肢体的运动，无论是右侧相位的还是强直的。
实施例8用B-G型肉毒素治疗震颤可以使用相同的针对靶的方案和途径，用约1单位至约1000单位B、C1、D、E、F或G型肉毒素的水溶液或者适当的神经毒素植入物的形式对上述实施例7的患者进行同等的治疗。通过该治疗，震颤可以在1-7天内平息，并且每注射一次毒素在约2-6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例9用A型肉毒素治疗癫痫惯用右手的22岁女性患者表现出癫痫病史。根据MRI和对EEG记录的研究，进行颞叶癫痫诊断。可以在颞叶前部分、沿着靠近非优势左半球一侧的颞中回，在距颞叶尖5-6cm处插入具有约5-50单位神经毒素(例如A型肉毒素)的植入物。癫痫发作基本上可以在约1-7天内减少，并且每注射一次毒素在约2-6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
实施例10用B-G型肉毒素治疗癫痫可以使用相同的针对靶的方案和途径，用约1单位至约1000单位B、C1、D、E、F或G型肉毒素的水溶液或者适当的神经毒素植入物的形式对上述实施例9的患者进行同等的治疗。通过该治疗，癫痫发作可以在1-7天内平息，并且每注射一次毒素在约2-6个月基本上保持缓解，或者根据植入物聚合物特定的释放特征和其中负载的神经毒素的量在约1-5年内基本上保持缓解。
结果是，借助3D MR成像和电生理学指导，按照本发明方法，注射神经毒素或者植入控释的神经毒素植入物可以安全有效地治疗患有各种运动失调的患者，例如严重的进展性左旋多巴-反应性帕金森氏病。合适的患者包括那些在如本发明所述颅内施用神经毒素之前，如果对化疗、通常是口服L-多巴没有完全的不应，则大大改变的患者。
本发明方法还可以用于各种运动失调，包括特发性震颤、与多法性硬化有关的震颤、创伤后震颤、偏瘫后震颤、帕金森氏病患者震颤和癫痫。
本发明治疗运动失调的颅内施用神经毒素的方法具有许多益处和优点，包括下列1.运动失调症状可以戏剧般地减少。
2.每注射一次毒素在约2至约4个月内运动失调症状可以减少，并且一旦使用控释的神经毒素植入物，运动失调症状在约1至约5年内可以减少。
3.注射或植入的神经毒素产生颅内靶组织位置特异性震颤抑制剂作用。
4.注射或植入的神经毒素显示出从颅内注射或植入位置很少或者不趋于扩散或者转运出来。
5.颅内注射或植入神经毒素很少或者没有明显的不受欢迎的副作用出现。
6.为达到可比的震颤抑制剂作用，颅内注射的神经毒素的量可以远低于通过其他给药途径(即肌内、括约肌内、口服或非肠道途径)给药所需的相同神经毒素的量。
7.本发明方法的震颤抑制剂作用可以产生可取的更大的患者移动性的副作用、更积极的态度和改善的生活质量。
8.在延长的时间内可以递送高治疗剂量的神经毒素至颅内靶组织，而没有系统毒性。
尽管结合某些优选的方法对本发明进行了详细描述，在本发明范围内仍然可能有其他具体实施方案、改型和改变。例如各种各样神经毒素可以有效地用于本发明方法。此外，本发明包括颅内费用方法，其中两种或多种神经毒素、例如两种或多种肉毒素同时或连续给药。例如，可以颅内施用A型肉毒素直至失去临床反应或者产生中和抗体，然后施用B型肉毒素。或者，可以颅内施用任何两种或多种肉毒血清型A-G的组合物，以控制所需治疗结果的起始和持续时间。再者，在施用神经毒素之前、同时或者之后，可以颅内施用非神经毒素化合物，以证明在神经毒素、例如肉毒素开始产生其更持久的震颤抑制剂作用之前附加的作用，例如加强震颤抑制或者使震颤抑制更快地开始。
本发明还包括神经毒素例如肉毒素在制备治疗运动失调药物中的应用，所述治疗是通过颅内施用神经毒素进行的。
上面列出的所有参考文献、文章、专利、申请和公布都全文引入本文作为参考。
因此，下列权利要求的精神和范围不应限于上面列出的优选的具体实施方案的描述。
权利要求
1.运动失调的治疗方法，该方法包括向苍白球或腹外侧丘脑中颅内施用肉毒素的步骤，从而减轻帕金森氏病的运动障碍。
2.权利要求1的方法，其中神经毒素是由选自肉毒梭状芽胞杆菌、酪酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti的细菌制备的。
3.权利要求1的方法，其中神经毒素是肉毒素。
4.权利要求3的方法，其中肉毒素选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒素。
5.权利要求3的方法，其中肉毒素是A型肉毒素。
6.权利要求3的方法，其中肉毒素以约10-3U/kg-10U/kg的量给药。
7.权利要求1的方法，其中症状减轻作用持续约1个月至约5年。
8.权利要求1的方法，其中神经毒素对下脑区给药。
9.权利要求1的方法，其中神经毒素对脑桥区给药。
10.权利要求1的方法，其中神经毒素对中脑桥区给药。
11.权利要求1的方法，其中神经毒素对苍白球给药。
12.权利要求1的方法，其中神经毒素对丘脑区给药。
13.权利要求1的方法，其中神经毒素是改性的神经毒素。
14.权利要求13的方法，其中改性的神经毒素与天然的神经毒素相比，其至少一个氨基酸缺失、被修饰或被替换。
15.权利要求13的方法，其中改性的神经毒素是重组产生的神经毒素或其衍生物或其片段。
16.权利要求1的方法，其中颅内施用步骤包括植入控释的肉毒素系统。
17.运动失调的治疗方法，该方法包括给给患者颅内施用治疗有效量的肉毒素的步骤，从而治疗运动失调症状。
18.权利要求17的方法，其中肉毒素是A型肉毒素。
19.权利要求17的方法，其中运动失调选自帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、进行性核上性麻痹、Wilson病、图雷特氏综合征、癫痫、慢性震颤、抽搐、张力障碍和痉挛状态。
20.帕金森氏病的治疗方法，该方法包括给给患者颅内施用治疗有效量的肉毒素的步骤，从而治疗帕金森氏病的运动失调症状。
21.权利要求19的方法，其中肉毒素是A型肉毒素。
22.运动失调的治疗方法，该方法包括以下步骤(a)选择具有震颤抑制剂活性的神经毒素；(b)选择影响运动失调的颅内靶组织；和(c)向靶组织颅内施用治疗有效量的所选神经毒素，由此治疗运动失调。
23.权利要求22的方法，其中神经毒素是肉毒素。
全文摘要
通过给人类患者颅内施用治疗有效量的神经毒素、例如A型肉毒素治疗运动失调的方法。
文档编号A61P25/16GK1446100SQ01814079
公开日2003年10月1日 申请日期2001年5月29日 优先权日2000年6月14日
发明者S·多诺万 申请人:阿勒根公司
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